一种合成菌群的构建方法及其在药用植物高品质栽培中的应用

1.本发明涉及人参栽培技术领域，尤其是涉及一种合成菌群的构建方法及其在药用植物高品质栽培中的应用。


背景技术：

2.人参(panax ginseng c.a.mey)为五加科人参属多年生草本植物，是传统的名贵药材，被誉为“百草之王”、“百药之首”，在中国已有四千多年的应用历史。人参含有人参皂苷、生物碱、糖苷、多糖和多肽，具有调节神经、抗癌、抗衰老、抗糖尿病、免疫调节、抗血栓等药理作用。同时，人参也含有多种人体所需的微量元素，因此，人参作为一种药食两用的植物资源，既符合人类对健康饮食的需求，又具有极高的药用价值。
3.人参主要分布在我国东北地区，20世纪90年代后，随着市场需求量的不断增大，对人参的获取逐步从林下野生采挖变为人工栽培，其栽培模式分为伐林栽参、非林地栽参和林下护育等模式，而农田栽参属于非林地栽参的一种，是利用传统农田地进行土壤改良后进行种植，该方式虽有效解决了伐林问题，但由于在农田栽参过程中大量施用化肥、农药虽提高了单位面积产量，却导致栽培人参土壤酸化、板结、有机质含量低，养分可利用性差，微生物群落结构破坏等问题，导致人参连作障碍发生，品质不断下降。
4.根际微生物是植物整个生命周期不可或缺的组成部分，拥有的基因数量远远多于植物基因组，被誉为植物的“第二基因组”，同时也是土壤物质循环和能量流动的主要驱动者。根际微生物影响土壤团聚体结构的形成和稳定，能提高土壤有机质含量、改善土壤养分循环、促进植物生长发育、增强植物抗逆性等方面均发挥着重要作用。以往的研究多集中在单一微生物如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、荧光假单孢菌(pseudomonas fluorescens)等对植物生长的促进作用。然而，大多数单一菌种由于受环境条件、微生物之间的相互作用等因素的影响，导致单一菌种促生功能较弱、定殖和稳定性较差，因此，以单一微生物为主的菌剂在应用时仍受到一定程度的限制与制约。
5.合成微生物群落(synthetic microbial communities)简称syncoms，是合成生物学和微生物学的新兴交叉领域，是指利用微生物之间的相互作用设计并构建多菌种共存体系，从而突破功能微生物稳定定殖的技术壁垒，实现多种微生物功能互补，具有更强的稳定性以及环境友好等特点。目前，关于人参种植相关的合成微生物群落的相关内容还鲜有报道，鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一合成菌群的构建方法、合成菌群及其在药用植物高品质栽培中的应用。本发明提供了一种新的人工构建菌群的方法，本发明构建的合成菌群在人参根系定殖效果好，群落更加稳定，并且能够改善栽参土壤根际微环境，提升根际土壤有机质、铵态氮、速效磷和速效钾含量，促进人参对养分的吸收与利用和有效成分的积累，同时
降低人参病情指数，实现高品质人参栽培技术。
7.在一个方面，本发明提供了一种合成菌群的构建方法，包括以下步骤：
8.(a)分析目标植物根际土壤样品中微生物宏基因组dna信息；
9.(b)根据所述基因组dna信息确定所述菌种的相对丰度；
10.(c)根据所述菌种的相对丰度构建菌种之间的关联网络，根据关联网络分析图，选择菌株之间正相互作用较强的菌群作为合成菌群。
11.本发明的发明人发现微生物定殖率低的原因与菌群之间的相互作用有关，因此，针对这一缺点采用合成菌群技术方法进行解决。本发明利用合成生物学和微生物组学构建具有相作用且功能互补的合成菌群，选择的群落是以关联互作网络分析为基础，根据微生物功能叠加增效、功能互补而构建合成群落。
12.在一个实施方案中，在步骤(c)中，通过生物大数据平台，根据所述菌种的相对丰度构建微生物的相互作用关系；优选地，所述生物大数据平台为派森诺基因云平台(https://www.genescloud.cn/)。
13.在一个实施方案中，所述方法还包括将所构建的合成菌群进行功能鉴定，并选择功能优异的菌种按等量混合方式进行复配，获得所述最优的合成菌群。
14.在一个实施方案中，所述基因组dna信息为为根际土壤微生物组dna 的基因片段的序列信息；所述菌种的丰度为菌种的相对丰度。
15.在一个实施方案中，所述药用植物为五加科植物；优选为人参属药用植物。
16.在一个实施方案中，所述合成微生物菌群包含以下至少3种的微生物菌种：聚硼贪噬菌(variovorax boronicumulans)、嗜根寡养单胞菌 (stenotrophomonas rhizophila)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、噬几丁质菌(chitinophaganiastensis)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)。
17.在一个实施方案中，所述合成微生物菌群由以下6种的微生物菌种组成：聚硼贪噬菌(variovorax boronicumulans)、嗜根寡养单胞菌(stenotrophomonas rhizophila)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、噬几丁质菌(chitinophaganiastensis)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)。
18.在本发明中，由所述6种的微生物菌种组成构建的合成菌群具有固氮、解磷、解钾、产生长素和铁载体多种功能，存在功能互补。本发明选择最佳的最优合成群落，将最优合成群落接种到人参根系上，使其成功定殖。由所述6种的微生物菌种组成构建的合成菌群的群落定殖能力显著增强(菌株的定殖率高)。
19.在另一个方面，本发明提供了一种微生物组合物，所述微生物组合物包含前述的合成微生物菌群，优选地，所述微生物组合物由所述微生物菌种等量混合得到；
20.更优选地，所述组合物为片剂、颗粒剂、粉剂、溶液、混悬液或乳剂中的一种。
21.在另一个方面，本发明提供了所述的合成菌群或含有其所述的微生物组合物在改良土壤和/或促进药用植物生长及高品质栽培中的用途；优选地，所述药用植物包括人参。
22.在一个实施方案中，所述改良土壤包括使得人参根际土壤ph、有机质、总碳、总氮含量增加，有利于土壤微团聚体的形成，提高了土壤的通透性。
23.在一个实施方案中，所述的合成菌群或含有其所述的微生物组合物能够增加人参根系总根长、根系总表面积、根总体积、根平均直径和根尖数量，增加总皂苷含量，对人参生长、外在和内在品质均具有促进的作用。
24.在另一个方面，本发明提供了所述的合成菌群或所述的微生物在防治人参病害中的用途。
25.在一个实施方案中，本发明提供了所述的合成菌群或所述的微生物能够降低人参病情指数。这表明本发明的合成菌群或包含其的微生物能够抗病，提高存苗率。
26.在另一个方面，本发明提供了一种促进人参生长及高品质人参栽培的方法，所述方法包括将有效量的所述的合成菌群或所述微生物组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境；优选地，所述植物为人参属药用植物。
27.在本发明中，所述的合成菌群或所述微生物组合物具有固氮、解磷、解钾、产生长素和铁载体功能，可将其用于人参等药用植物栽培中。
28.在一个实施方案中，所述微生物组合物包含从所述微生物群体的菌株获得的组分或其组合；所述组分包含从所述微生物群体的菌株获得的上清液和/或其衍生物。
29.有益效果：
30.本发明以根际微生物的相互作用为核心，以功能叠加互补为依据人工构建群落，使其在根系稳定定殖，从根本上解决实际应用中定殖和稳定性差，功能单一的缺点；
31.本发明的合成菌群的构建方法简单高效，能构建出具有良好稳定性且功能优异的合成菌群；合成菌群的各菌种以特定配比构成组合物作为生物制剂能发挥协同增效的优势效果；
32.本发明在改良根际土壤微环境、促进人参生长和品质提升方面具有广阔的应用前景，对实现人参等药用植物栽培产业的绿色可持续发展具有重要意义。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为本发明实施例提供的林下山参根际微生物相互作用网络图；
35.图2为本发明实施例提供的微生物固氮能力；
36.图3为本发明实施例提供的微生物解磷能力；
37.图4为本发明实施例提供的微生物解钾能力；
38.图5为本发明实施例提供的微生物产生长素能力；
39.图6为本发明实施例提供的微生物产铁载体能力；图7为本发明实施例提供的人工合成菌群(syncoms)在人参根系的定殖结果(每克根系中16s rrna基因拷贝数)。
具体实施方式
40.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实
施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1.菌株信息
42.(1)菌株的可获得途径：
[0043][0044]
实施例2.根据微生物相互作用关系构建的合成菌群
[0045]
将164个菌株根据其在宏基因组数据中的相对丰度输入到网址(https://www.genescloud.cn/)中进行关联互作网络分析，根据构建的微生物相互作用关系，共得到module2、module4、moudule1、module5和module3共5个核心群落，初步选择出菌株之间具有正相互作用较强的菌群module1和module_4初步作为合成菌群(如图1)
[0046]
module1由草药菌属(herbiconiuxginsengi)、阿氟曼链霉菌(streptomycesscabiei)、节杆菌(arthrobacteroryzae)、柠檬两面神菌(janibactermelonis)、类诺卡氏菌(nocardioidesallogilvus)、嗜烟碱类节杆菌(paenarthrobacternicotinovorans)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、微白黄链霉菌(streptomycesalbidoflavus)、马红球菌(rhodococcushoagii)、苏黎士克罗诺杆菌(cronobacterturicensis)、红球菌(rhodococcusqingshengii)组成的合成群落。
[0047]
module4由聚硼贪噬菌(variovoraxboronicumulans)、嗜根寡养单胞菌(stenotrophomonasrhizophila)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、噬几丁质菌(chitinophaganiastensis)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)组成的合成群落。
[0048]
实施例3.微生物功能鉴定分析
[0049]
3.1人参根际微生物功能鉴定分析
[0050]
根据菌株之间的相互作用关系构建的合成群落module1和module4中各个菌种进行功能鉴定分析，具体操作如下：
[0051]
(1)固氮功能：
[0052]
取80℃保存的菌液接种到20mltsb液体培养基中活化，在180r
·
min-1
、28℃摇床中生长到菌液od600为0.8左右。于超净工作台中取10μl菌液滴在制备好的固氮固体培养基(海博)上，将所有的平板倒置，28℃培养3～7d，培养期间随时观察平板中菌落的生长状况以及是否出现透明油状菌落，透明油状菌落代表菌株具备固氮能力(如图2)。
[0053]
(2)解磷功能：
[0054]
在超净工作台中取10μl菌液滴在制备好的无机磷固体培养基(海博)、有机磷固体培养基(海博)上，将所有的平板倒置，在28℃的恒温培养箱中培养3～7d，培养期间随时观察平板中菌落的生长状况及有无解磷圈的产生，有解磷圈产生则代表菌株具备解磷能力
(如图3)。
[0055]
(3)解钾功能：
[0056]
在超净工作台中取10μl菌液滴在改良的解钾固体培养基(阿拉丁) 上，将所有的平板倒置，在28℃的恒温培养箱中培养3～7d，培养期间随时观察平板中菌落的生长状况及有无解钾圈的产生，有解钾圈产生则代表菌株具备解钾能力(如图4)。
[0057]
(4)产生长素(iaa)功能：在超净工作台中取10μl菌液接种于含终浓度为0.2g/l色氨酸的1ml kings液体培养基中，培养3d；菌株培养3 d后，12000r/min离心10min，取800μl离心后的上清置于白色瓷板上，加入等体积salkowski reagent比色液，用锡箔纸包住避光反应30min；反应后观察结果，阳性结果显示为粉红色，代表菌株能够分泌iaa，粉红颜色越深代表菌株分泌iaa能力越强(如图5)。
[0058]
(5)产铁载体功能：在超净工作台中取10μl菌液滴在制备好的cas 检测平板(海博)，将所有的平板倒置，在28℃的恒温培养箱中培养3～7d，培养期间随时观察平板中菌落的生长状况及有无晕黄圈的产生，有晕黄圈产生则代表菌株具备产铁载体能力(如图6)。
[0059]
根据每个微生物具有固氮、解磷、解钾、产生长素和铁载体功能分析，最终筛选出module 4做为具有稳定相互作用且功能全面叠加互补的合成群落(syncoms)，见表1。
[0060]
表1.人参根际微生物功能鉴定分析
[0061][0062]
实施例4.人工合成菌群(syncoms)定殖
[0063]
4.1菌液制备：
[0064]
取-80℃保存的各菌株的菌液接种到20ml tsb液体培养基中活化，在 180r
·
min-1 28℃摇床中培养3～7天，至菌液混浊；吸取2μl浑浊菌液于分光光度计600nm波长处测吸光值(od值)，使用无菌水将所有菌液od 值调整为0.2后，等体积比例混合制得混合菌液。
[0065]
4.2人工合成菌群(syncoms)在人参根系的定殖：
[0066]
将农田土放入直径为18cm的花盆中，每盆装1.5kg土。准备好选择大小一致，芽孢未损坏且表面消毒的一年生人参苗，使用荧光假单孢菌处理，syncoms混合菌液处理将参苗提前浸泡30min，之后进行移栽，每盆栽种5株，对照接种无菌水，荧光假单孢菌和接syncoms
混合菌液处理各重复3次，在栽种完后分别取25ml单菌、混合菌液进行灌根处理。在人参生长过程中每14d、28d、56d进行灌根处理，人参生长84d收获，使用fastdna
tm spin kit(mp biomedicals,llc,usa)提取人参根系微生物基因组dna，每克根系中16s rrna基因拷贝数(如图7)，基因拷贝数高说明菌株的定殖率强，syncoms定殖率明显高于单菌和对照。
[0067]
结果表明，构成本发明人工合成菌群的各菌株在人参根系的定殖率明显更高。
[0068]
实施例5.人工合成菌群(syncoms)对农田土壤的影响
[0069]
分别将对照、单菌处理和syncoms混合菌液处理的人参幼苗取出，去掉大块附着在人参根系的土壤，用小刷子取人参根际土壤，测定根际土壤 ph、总碳、总氮含量及土壤团聚体结构(表2)。与对照和单菌处理相比， syncoms处理的人参根际土壤ph升高、有机质、总碳、总氮含量增加；同时，syncoms处理显著促进土壤在0.25-2mm团聚体粒级形成，而降低了 《0.25mm团聚体粒级。
[0070]
表2.syncoms对农田栽培人参根际土壤的影响
[0071][0072]
结果表明，构成本发明的人工合成菌群能提高农田土壤通透性，从而改善农田土壤结构，促进农田土壤养分矿化、使农田栽培人参土壤肥力得到提升。
[0073]
实施例6.人工合成菌群(syncoms)对人参根系生长和品质的影响
[0074]
分别将对照、单菌处理和syncoms混菌处理的人参幼苗取出，用无菌水冲洗根部，通过根系扫描仪(winrizo)测定人参根系形态并称重；然后将人参根系置于65℃烘干至恒重，测定根干重和总皂苷含量(表3)。与对照和单菌处理相比，syncoms处理后人参根系总根长、根系总表面积、根总体积、根平均直径和根尖数量显著增加，根鲜重和根干重均增加；与对照和单菌处理相比，syncoms处理后人参根系总皂苷含量显著提高。
[0075]
表3.syncoms对农田栽培人参生长和品质的影响
[0076][0077]
结果表明，syncoms对人参根系生长具有显著地促进作用，可改善人参根系形态，提高人参品质。
[0078]
实施例6.人工合成菌群(syncoms)对人参抗病性的影响
[0079]
分别将对照、单菌和syncoms混菌处理的人参幼苗取出，洗去根部泥土，按照发病指数对人参发病情况进行调查。发病率＝病株数/株数总和
×
100，病情指数＝[∑(各级病株数
×
代表值)/(总株数
×
最高病级代表值)]
×
100(见表4)。与对照、单菌处理相比，syncoms处理的人参存苗率提高，同时根系发病率和病情指数降低。
[0080]
表4.syncoms对农田栽培人参病害发生情况的影响
[0081][0082]
结果表明，syncoms具有抗病作用，能够显著降低发病率和病情指数。
[0083]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。