一种利用农杆菌瞬时转化山茶花离体花瓣进行基因表达的方法与流程

1.本发明属于分子生物学及生物技术领域，具体涉及一种利用农杆菌瞬时转化山茶花离体花瓣进行基因表达的方法。


背景技术：

2.山茶（camellia japonica linn.）是山茶科山茶属植物，在我国栽培历史悠久，是我国传统十大名花之一，具有丰富的文化内涵和极高的观赏价值。山茶花的花型多变有单瓣型、牡丹型、半重瓣型、完全重瓣型等，花色则是具有红色、粉色、白色、黄色以及复色等。山茶花瓣中含有较多的酚类物质，成分特殊，易氧化，其种子中提取的天然植物油脂还可用于制作食用油、医药、美容、保健产品等。因此，山茶是集观赏、食用、药用于一体的重要观赏木本植物。
3.当前，通过杂交育种等方式选育特色、新奇茶花品种的周期长、投入高且较为困难，亟需开展分子生物学研究，促进分子标记技术辅助育种。但由于目前山茶基因组尚未公布，且缺少成熟的分子生物学研究体系，使得山茶中的基因功能和分子育种的相关研究还少见报道，导致山茶花的花色、花型、花期等观赏性状的形成与调控机制等方面进展缓慢。为了进行快速有效的目标基因功能研究，建立山茶花瓣瞬时转化体系是一种可行性强的新研究思路，并对推进分子选育体系具有潜在的应用意义。
4.公开号为cn106222195a的中国专利，公开了一种将外源基因转化到荷花中进行瞬间表达的方法，该方法主要包括采集花蕾、准备阳性农杆菌、制备菌液、外源基因的转化及培养和瞬时表达检测步骤，将农杆菌菌株通过注射渗透法将含有外源基因的表达质粒转入到荷花花瓣的组织中，经过培养，使外源基因在花瓣中瞬时表达。本发明将外源基因转化入荷花花瓣中进行瞬间表达，不损伤花瓣组织，农杆菌易于扩散，外源基因转化后，40～48小时就可以观察实验结果，操作方法简便、转化率高，简单方便，所需时间短，能够快速检测外源目的基因，有效进行荷花功能基因的验证。
5.然而，该发明的方法仅用于荷花并不适用于山茶花，主要原因是山茶花的花瓣组织中含有大量的多酚类、黄酮类化学物质，在受到损伤的情况下极易氧化，会在短时间内造成组织褐化，不利于开展活体基因表达研究。本发明的方法提供了外源基因通过农杆菌介导的瞬时侵染方法，同时通过添加抗氧化剂优化侵染缓冲液，保证离体组织的活性。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用农杆菌瞬时转化山茶花离体花瓣进行基因表达的方法的技术方案，该方法操作简便，所需时间短，能够快速检测目的基因的表达及其功能，以解决转基因耗时长、基因功能分析不深入的问题。
7.本发明具体采用以下技术方案实现：一种利用农杆菌瞬时转化山茶花离体花瓣进行基因表达的方法，其包括以下步
luciferase reporter gene assay kit（翌圣）试剂盒说明书中提供和配制，即海肾萤光素酶底物（50
×
）用海肾萤光素酶缓冲液稀释至1
×
工作液。
14.本发明所用的山茶花瓣不受品种限制，可用白色、粉色、红色等进行瞬时转化。红色花瓣中花色素含量较高，可离体保存3～4天用于观察基因表达，白色花瓣中几乎不含有花色素，抗氧化能力较弱，可离体保存36～48h检测花瓣瞬时转化效果。
15.本发明的有益效果是：操作便捷，大大提高了效率，通过农杆菌瞬时转化离体的山茶花瓣，筛选到了合适的侵染缓冲液，增强了花瓣瞬时转化效率和检测到了外源基因表达，为更好地研究调控山茶花色、花型、花期等方面基因的功能奠定了基础。
附图说明
16.图1为本发明实施例中选取的白色花瓣山茶花品种
‘
雪月花’、
‘
玉丹’，红色花瓣品种
‘
杜鹃红山茶’。
17.图2为本发明实施例中山茶花瓣瞬时转化操作图。
18.图3为本发明实施例中山茶
‘
雪月花’花瓣转入含gus报告基因的gv3101农杆菌的gus染色结果。
19.图4为本发明实施例中山茶
‘
玉丹’花瓣转入含萤火虫荧光素酶报告基因的gv3101农杆菌的荧光信号结果，其中control：对照组；d-luc buffer1：buffer1缓冲液重悬侵染的花瓣；d-luc buffer2：buffer2缓冲液重悬侵染的花瓣。
20.图5为本发明实施例中山茶
‘
杜鹃红山茶’花瓣转入含海肾荧光素酶报告基因的gv3101农杆菌的荧光值结果，图中control：对照组；ev：含有pgreen_dualluc_3’utr_sensor的空白质粒；buffer1：含有cjmyb1-3’utr质粒，buffer1缓冲液重悬侵染的花瓣；buffer2：含有cjmyb1-3’utr质粒，buffer2缓冲液重悬侵染的花瓣。
具体实施方式
21.下面结合本发明实施例中的附图进行完整、详细地说明。
22.实施例1（1）阳性农杆菌的获取将带有gus基因的pgreen_gus_competitor（addgene，55208）质粒转化至农杆菌gv3101（psoup）中，随后挑取单克隆，经pcr反应、电泳检测获取阳性农杆菌。
23.（2）菌液的制备挑取阳性单克隆菌落至带有卡那霉素抗性的lb液体培养基（10g/l的氯化钠，5g/l的酵母提取物，10g/l的胰蛋白胨，ph=7.0），并于摇床（28℃，200rpm）中过夜培养，将摇好的菌液进行5000rpm、10min常温离心，倒掉上清，收集菌体；使用两种侵染缓冲液进行重悬，一种（buffer1）是10mm的2-（n-吗啉）乙磺酸（mes-koh，ph=5.6）、10mm的氯化镁（mgcl2）、200
µ
m的乙酰丁香酮（as）、300mg/l维生素c，另一种（buffer2）是2.21mg/ml的植物ms培养基（m519）、30mg/ml的蔗糖、100
µ
m的乙酰丁香酮、300mg/l维生素c。使其菌液在600nm波长下的光密度od
600
为0.8～1.0，获得侵染菌液，随后室温下静置0.5～1h。
24.（3）花瓣的注射侵染
取光照培养箱（28
±
1℃，16h光照/8h黑暗）中培养2～3天、开放的白色
‘
雪月花’花瓣（见图1），用1ml的一次性针筒式注射器吸取步骤（2）制备的侵染菌液，将无菌针头略微倾斜地刺入花瓣基部偏上1cm左右处，缓慢推动注射器活塞，使侵染菌液注射进入山茶花瓣中（见图2）；花瓣进行离体培养，离体培养：暗17℃，光22℃，通过遮盖进行避光培养36～48h。
25.（4）gus活性检测将步骤（3）中的花瓣浸泡在gus染色液（1m的磷酸钠（ph=7.0），0.5m的edta（ph=8.0），10%的triton x-100，50mm的铁氰化钾，0.1m的x-glucdmf溶液）中进行37℃，24h染色，之后用75%无水乙醇进行8～12h脱色处理，观察花瓣的染色情况；花瓣有蓝色区域出现则表明gus基因在山茶花瓣细胞中成功表达。结果表明，本发明中使用buffer1重悬菌液注射的六片花瓣中出现一片有蓝色，使用buffer2重悬菌液注射的六片花瓣中出现两片（见图3箭头所指位置）。
26.实施例2将带有萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）、海肾荧光素酶（renilla luciferase）报告基因的pgreen_dualluc_3’utr_sensor（addgene，55206）质粒转化至农杆菌gv3101（psoup）中，农杆菌侵染白色
‘
玉丹’花瓣暗培养36h之后，注射0.3mg/ml的d-荧光素钠盐溶液（按照d-luciferin, sodium salt（翌圣）说明书配制），在lumazone pylon1300b植物活体成像系统上进行荧光活体成像分析，观察花瓣的荧光信号情况；观察到荧光信号则表明萤火虫荧光素酶基因在山茶花瓣细胞中成功表达。其他步骤同实施例1。结果表明，本发明中使用buffer1、2重悬菌液注射的花瓣中均有荧光信号出现（见图4）。
27.实施例3进一步地，将带有山茶cjmyb1基因（ncbi genbank登录号为ol347930）、海肾荧光素酶报告基因的pgreen_dualluc_3’utr_sensor质粒转化至农杆菌gv3101（psoup）中，农杆菌侵染红色
‘
杜鹃红山茶’花瓣暗培养48h之后，使用打孔器将花瓣打孔，随机分成若干份，用液氮磨样至粉末状，使用细胞裂解液裂解，之后用海肾荧光素酶反应液（按照dual luciferase reporter gene assay kit（翌圣）试剂盒说明书配制），在atilabiosystemslumipro单管型发光检测仪上进行荧光信号检测，计算其荧光值。其他步骤同实施例1。结果表明，本发明中使用buffer1重悬菌液注射的花瓣荧光值低于使用buffer2重悬菌液注射的花瓣（见图5）。
28.综上，使用buffer2重悬菌液的效果优于buffer1重悬菌液的效果。
29.杜鹃红山茶、玉丹、迷茫的春天、乔伊、基石的表达及转化结果参见表1。
[0030] 。