一种芝麻蛋白来源且具有降血压与降血糖活性的多肽

1.本发明属于植物蛋白深加工技术领域，具体涉及一种来源于芝麻11s球蛋白异构体4 (11s globulin isoform 4，egdilafpagaahwaynng 144-152)的多肽afpagaahw、制备方法以及在制备降血压与降血糖药物方面的应用。


背景技术：

2.目前，高血压与糖尿病成为我国常见的慢性疾病之一，且呈现增长趋势。上述两种疾病并发症严重、难以治愈，给国家公共卫生与患者家庭带来沉重经济负担外，还严重影响患者的生活质量。目前，为治疗高血压与糖尿病，人类研发多种化学药物，这些药物虽然起效快，但割裂了高血压与糖尿病的交互共生作用，患有高血压与糖尿病的患者需要同时服用多种药物来控制两种疾病。另外，服用化学药物带来副作用也危害人体健康。
3.为了安全有效控制高血压与糖尿病，科研人员从食源蛋白水解液中发现兼具降血压（ace抑制）与降血糖（dpp-iv抑制）活性的多肽。相较于传统药物，这类多肽具有安全性高，兼具降压降糖活性的优点外，还可以被人体吸收利用，起到营养功能。因此，被认为是辅助高血压与糖尿病治疗的有益成分，具有广阔的市场前景与开发价值。
4.芝麻是世界主要油料作物之一，我国是芝麻的生产与消费大国，年产与消费芝麻分别在40万吨与150万吨左右。芝麻蛋白是芝麻的主要成分之一，约占芝麻的20%左右，受限于加工技术，芝麻蛋白的利用率低，目前主要用作饲料与肥料，产品附加值低。研究表明，芝麻蛋白经过酶解可以抗氧化肽、降血压肽、鳌合金属肽，同时，研究人员根据芝麻蛋白序列推测，芝麻蛋白经过适当酶解可以产生dpp-iv抑制肽。因此，将芝麻蛋白酶解生产高附加值的活性肽具有开发利用价值。
5.考虑到控制高血压与糖尿病的重要社会意义、降压与降糖市场前景广阔（2020-2030年我国糖尿病治疗药物市场增速约7%，2030年将达到1167亿元；2018年我国降压药市场规模达663.1亿元，且仍保持增长）和芝麻提质增效加工，有必要开发芝麻蛋白源兼具降血压与降血糖的多肽。


技术实现要素：

6.为满足人民健康生活的需求、预防与辅助治疗高血压与糖尿病，本发明目的在于提供一种来自芝麻蛋白的同时具有降血压和降血糖活性的多肽，该芝麻多肽具有活性高、制备工艺成熟，成本可控等优点，具有广阔的市场前景。
7.本发明还提供了上述芝麻多肽的制备方法，以及其在制备具有降血压和/或降血糖药物方面的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种芝麻蛋白来源且具有降血压与降血糖活性的多肽，该多肽由9个氨基酸组成，其序列为：ala-phe-pro-ala-gly-ala-ala-his-trp（afpagaahw，aw-9），源自芝麻11s球蛋白异构体4 (11s globulin isoform 4，q2xsw6_sesin) 。具体的，afpagaahw源自该蛋白的
144-152处，即egdilafpagaahwaynng 144-152。
9.本发明提供了上述多肽的制备方法，其可以采用本领域常规固相合成法人工制备多肽。
10.本发明还提供了一种从芝麻蛋白中提取上述多肽的方法，其包括蛋白提取、蛋白酶解、分离纯化等步骤，具体包括下述步骤：1）提取芝麻蛋白：芝麻除杂后，粉碎、石油醚脱脂、除去残余溶剂，按1:8-1:20（w/v，g/ml）加入蒸馏水，调节ph到9-11（以促进蛋白溶解），室温搅拌1-3 h，4000-5000 r/min离心20-40 min后，收集上清液，调节ph到4-5（以使蛋白沉淀），静置3-6 h、4000-5000 r/min离心20-40 min，收集沉淀，透析，冷冻干燥，获得芝麻蛋白；2）蛋白酶解：将步骤1）所得芝麻蛋白，按1g:10-25 ml（w/v）加入蒸馏水获得芝麻蛋白溶液，100℃加热20-30 min，趁热以12000-20000 r/min高速均质5-10 min，冷却至室温，将ph值调至1.5-2.5，加入混合蛋白酶，于30-50℃搅拌酶解3 h，随后调节ph至7.5-9.0，加入胰糜蛋白酶，于30-50℃超声波辅助酶解2 h，调节ph至4.0-4.5，8000-10000 r/min离心15-30 min，取上清液，4-10℃低温备用；采用氢氧化钠与盐酸溶液调节ph；所述混合蛋白酶由酶活比为4:1-7:1的胃蛋白酶和酸性蛋白酶组成；超声波辅助酶解时，超声波采用频率为20 khz或45 khz，超声波方式为聚能型，作用方式为间歇式（作用时间与停歇时间为1:1）； 3）分离纯化：将步骤2）所得上清液调节ph到7.0，经超滤分离，纳滤脱盐、浓缩，然后采用葡聚糖凝胶柱层析法分离纯化，收集保留时间在230-325 min的组分，冷冻真空干燥即得。将冷冻干燥获得的多肽样品，通过nano-lc-esi-ms/ms进行分析鉴定，鉴定具有降血压与降血糖活性的多肽的氨基酸序列为：ala-phe-pro-ala-gly-ala-ala-his-trp（afpagaahw，aw-9）。afpagaahw源自芝麻11s蛋白异构体4（q2xsw6_sesin）144-152处，即egdilafpagaahwaynng 144-152。
11.具体的，步骤2）中，100℃加热采用欧姆加热方式，电极为矩形，电源为交流电。
12.为了提高酶解效果，实现原料充分酶解，进一步优选的，步骤2）中，所述混合蛋白酶酶解与胰凝乳蛋白酶酶解均为二次连续酶解，即添加芝麻蛋白质量1% (w/w)的混合蛋白酶酶解1.5h后，再次添加芝麻质量1%的混合蛋白酶酶解1.5h；添加芝麻蛋白质量1%（w/w）的胰糜蛋白酶酶解1 h后，再次添加芝麻蛋白质量1%的胰糜蛋白酶酶解1 h。
13.进一步的，步骤2）中，胰糜蛋白酶由酶活比为5:1-9:1的胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶组成。
14.具体的，步骤3）中，超滤为二级超滤，一级超滤膜的截留分子量在10000 da，将一级超滤膜的透过液通过截留分子量为3000 da的二级超滤膜进行分离，二级超滤透过液采用截留分子量500 da的纳滤膜进行脱盐、浓缩。上述膜均可采用平膜或卷式膜。
15.进一步的，步骤3）中，葡聚糖凝胶柱层析法分离纯化条件：层析柱60
ꢀ×ꢀ
2.6 cm，流动相为蒸馏水，流速1.0 ml/min，检测波长为220 nm，上样量为4 ml，收集p4（时间230-325 min）。
16.进一步优选的，步骤3）中选用的是葡聚糖lh-20，粒径40-120
ꢀµ
m。
17.本发明还提供了上述多肽作为主要功能成分在制备降血压和/或降血糖药物、保健品、食品、日化用品等中的应用。
18.与现有技术相比，本发明具有如下优点：1）本发明所用的原料为芝麻或低温芝麻饼粕，来源广泛，有成本优势且不影响其他芝麻组分利用，同时，产品附加值高，具有开发利用价值；2）二次连续酶解酶解效果更好，蛋白降解充分，目标多肽产量高；3）本发明提供的芝麻活性多肽，安全性高（见附表2），且具有降血压和/或降血糖活性功效；4）本发明提供的芝麻多肽活性显著，不仅可以作为食品添加剂，也可以作为功能性成分应用于药物、保健品及日化用品中。
附图说明
19.图1为实施例1葡聚糖lh-20柱层析的谱图；图2为实施例2中人工合成活性多肽的hplc图；图3为实施例2中人工合成活性多肽的质谱图；图4为芝麻多肽afpagaahw与人体血管紧张素酶（1uze）的对接图；图5为芝麻多肽afpagaahw与人体dpp-iv(1rwq)的对接图。
具体实施方式
20.以下结合实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员未做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。
21.下述实施例中，如无特殊说明，所用原料均为可以直接购买到的普通市售产品。如，所用酸性蛋白酶为购买自夏盛（上海）生物科技有限公司的液体食品级酸性蛋白酶，酶活15 万u/g。
22.实施例1一种从芝麻蛋白中提取芝麻多肽的方法，其具体包括如下步骤：1）芝麻蛋白提取：取1kg无杂质和霉粒的芝麻，粉碎至40目，采用索氏抽提器进行脱脂，脱脂条件为：石油醚（沸程30-60℃）在65℃脱脂10 h。将脱脂后的芝麻粉按料液比（w/v）1 g:20 ml加入蒸馏水，用naoh将ph调节为10，室温搅拌120 min进行蛋白提取，随后4500 r/min离心30 min，取上清液，调节ph到4.3，静置3h，4500 r/min离心30 min，收集沉淀，采用透析袋（截留分子量3000 da）透析12h，透析期间蒸馏水更换6次。透析完毕，料液-60℃冷冻干燥，获得芝麻蛋白，密封备用。
23.2）蛋白酶解：将步骤1）所得芝麻蛋白按料液比1 g:10 ml（w/v）加入蒸馏水获得芝麻蛋白溶液，采用欧姆加热槽100℃加热25 min，趁热以15000 r/min 高速均质5 min，冷却至室温，调节ph至2.0，加入芝麻蛋白质量1.0%的混合蛋白酶（混合蛋白酶由酶活比为7:1的胃蛋白酶、酸
性蛋白酶组成），37℃搅拌酶解1.5 h后，再次加入芝麻蛋白质量1.0%的混合蛋白酶酶解1.5 h。随后调节ph至8.0，加入芝麻蛋白质量1.0%的胰糜蛋白酶（胰糜蛋白酶由酶活比6:1的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶组成），37℃酶解1h后，再次补充加入芝麻蛋白质量1.0%的胰糜蛋白酶酶解1 h。胰糜蛋白酶酶解期间，采用超声波辅助酶解，其超声波条件为：频率45 khz，超声波方式为聚能型，作用方式为间歇式（作用时间与停歇时间为1:1）。酶解结束后，调节ph至4.3，10000 r/min离心30 min，收集上清液，4-10℃低温备用。
24.3）分离纯化将步骤2）所得上清液调节至ph为7.0，采用两级超滤分离处理，一级超滤条件为：操作压力1.5 mpa，超滤膜为10000 da。一级超滤的透过液再采用二级超滤处理，二级超滤操作压力为1.5 mpa，超滤膜为3000 da。二级超滤的透过液采用纳滤进行脱盐、浓缩（纳滤膜截留分子量为500 da），浓缩至原始料液体积的10%后，加入蒸馏水恢复至原始体积，随后再次纳滤浓缩、脱盐，重复上述操作三次，随后收集纳滤截留液。上述超滤膜与纳滤膜均为卷式膜。
25.取4 ml纳滤截留液上样到葡聚糖lh-20层析柱上（60
ꢀ×ꢀ
2.6 cm），流速1.0 ml/min，流动相为蒸馏水，检测波长为220 nm，收集保留时间为230-325 min的峰p4组分（见图1），-60℃冷冻干燥24-48 h，获得芝麻多肽产品。
26.将多肽样品通过nano-lc-esi-ms/ms进行分析鉴定，鉴定具有降血压与降血糖活性的多肽的氨基酸序列为：ala-phe-pro-ala-gly-ala-ala-his-trp（afpagaahw）。
27.实施例2一种人工合成芝麻多肽的方法，其采用固相合成法人工合成。基本流程如下：首先将一个氨基被fm℃基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上了；其次将氨基被fm℃基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从c端向n端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的多肽ala-phe-pro-ala-gly-ala-ala-his-trp（afpagaahw）。合成的芝麻多肽序列的液相质谱分析图见图2和图3，此高纯度合成肽的主要离子峰质荷比为927.80，符合需要合成序列的分子量，说明固相合成成功。
28.上述采用固相合成法合成芝麻多肽的具体过程参见：
①
黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。
②
.n.休厄德、h.d.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。），该芝麻多肽也可以委托相应的多肽生物公司进行合成，因其化学合成过程不是本技术的重点所在，故本技术此处不再对化学合成过程进行详细赘述。
29.降血压与降血糖活性应用试验下述应用试验中，ace抑制能力（降血压）与dpp-iv抑制能力（降血糖）的测定参照如下进行。多肽溶液为将冻干或人工合成的芝麻多肽，加入蒸馏水稀释，配成一定浓度的水溶液。
30.1）ace抑制能力测定：取20 μl 1 mg/ml的afpagaahw多肽溶液与40 μl 血管紧张素转换酶（ace）（12.5 mμ/ml）和40 μl 4.66 mmol/l 马尿酰-组氨酰-亮氨酸（hhl）溶液（含0.6 mol/l 氯化钠的
0.4 mmol/l ph8.5磷酸缓冲液）混合，在37℃反应1 h后，加入150 μl 1.2 mol/l naoh终止反应，接着加入40 μl 2%的邻苯二甲醛（opa）甲醇溶液室温反应20 min，随后加入40 ml 6 mol/l hcl终止反应。将反应液按1:15 加入蒸馏水稀释后，倒入荧光比色皿，设定激发波长340 nm，发射波长455 nm，狭缝宽度5 nm，测定荧光强度。随后按照下面公式进行计算：式中：a是含有afpagaahw、ace和hhl溶液的荧光强度，b是ace和hhl溶液的荧光强度，c是多肽和hhl溶液的荧光强度，d是hhl溶液的荧光强度。
31.2）dpp-iv抑制能力测定：取甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（gly-pro-p-nitroanilide）加入到100 mmol/l ph8的tris-hcl缓冲液中配成1.6 mmol/l的溶液，取25 μl加入到96孔板中，加入25 μl 1 mg/ml 的afpagaahw溶液 (溶剂是100 mmol/l ph8的tris-hcl缓冲液)或在37℃预热10 min，加入50 μl 8 u/l的二肽基肽酶iv (dpp-iv)，混匀后，在37℃反应60 min，加入100 μl 1 mol/l ph4.0的乙酸缓冲液终止酶反应，采用酶标仪测定405 nm的吸光度。对照组试验中，采用25 μl 100 mmol/l ph8 tris-hcl 代替afpagaahw溶液，其他条件相同。按照下式计算抑制率，式中as是afpagaahw存在的吸光度，ac采用等体积的tris-hcl缓冲液替代afpagaahw的吸光度，a
se
是采用等体积tris-hcl缓冲液替代dpp-iv的吸光度，a
ce
是采用tris-hcl替代dpp-iv和hpspr的吸光度。
32.芝麻多肽的活性应用，ace抑制率作为降血压指标，dpp-iv抑制率为降血糖指标，测试分析实施例1从芝麻蛋白中提取的芝麻多肽和实施例2采用人工合成的芝麻多肽afpagaahw的降血压和降血糖活性，基本一致，均显示较强的降血压与降血糖能力（见表1）。
33.表1、实施例1和2所得芝麻多肽afpagaahw的降血压与降血糖活性注：测定ace抑制活性时，afpagaahw溶液浓度为0.06 mg/ml，测定dpp-iv抑制率时，afpagaahw溶液浓度为0.125 mg/ml。
34.表2、实施例1和2所得芝麻多肽afpagaahw生理特性
注：括号中数字为预测概率，采用admetsar(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)预测生理特性。
35.由表2可以看出：afpagaahw安全性高，预测无毒性、无致癌性，同时不会影响人体正常的生理机能。由图4可知，afpagaahw通过氢键或疏水作用影响ace中glu384，tyr523，gln281，lys511，his353，his513，zn
2
701，his383活性位点，从而改变了ace的空间位置，影响与血管紧张素的结合，起到降压作用。由图5可知，afpagaahw通过氢键与疏水作用与dpp-iv中的glu205，arg125，tyr631活性位点作用，影响dpp-iv的机能，起到降糖功能。
36.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。