一种恶性疟原虫RIFIN多肽8-RIFIN及其衍生产品和应用的制作方法

一种恶性疟原虫rifin多肽8-rifin及其衍生产品和应用
技术领域
1.本发明属于生物蛋白质工程技术领域，具体涉及一种恶性疟原虫rifin多肽8-rifin及其衍生产品和应用。


背景技术：

2.蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，ppi)是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体(protein complex)的过程。研究蛋白质相互作用可以更好地揭示蛋白质的功能，解码生命活动。蛋白质间相互作用的顺利进行，才能保障细胞的正常生命活动。
3.因为高死亡率和广泛的抗疟药物的抗药性，恶性疟原虫(plasmodium falciparum)已成为最危险的疟原虫，并且在世界上疟疾最严重的大陆非洲地区占主导地位。恶性疟原虫感染导致重症疟疾发病甚至死亡的主要原因是疟原虫指数型生长使感染的红细胞增多导致严重贫血，成熟恶性疟原虫感染的红细胞与微血管内皮细胞的粘附导致微静脉血管系统堵塞，以及感染红细胞和未感染红细胞形成玫瑰花环而致血流阻塞。在其致病机制中，变异表面抗原家族的rifin蛋白(p.falciparum-encoded repetitive interspersed families of polypeptides)起了重要作用，它们能介导微静脉血管系统中感染红细胞的粘附和玫瑰花环形成，从而阻断血流，堵塞血管导致重症疟疾。rifin蛋白在感染红细胞的表面表达，是重要的免疫靶点之一，但由于重复散布的基因家族rif(repetitive interspersed family)的多基因性和基因多态性而使rifin蛋白能够逃避免疫系统的攻击。同时，rifin蛋白与免疫细胞表面抑制性受体白细胞免疫球蛋白样受体b1(leukocyte immunoglobulin-like receptor b1，lilrb1)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1，lair1)等的结合能下调免疫反应而达到免疫逃避的目的。
4.近年来，随着耐药恶性疟原虫的不断出现，研发探索新的治疗方案成为实现疟疾控制与消除计划的关键。参与恶性疟原虫免疫逃避机制的变异表面抗原家族的rifin蛋白也可能成为重要的生物治疗和疟疾疫苗蛋白候选。目前，还没有关于恶性疟原虫rifin蛋白与免疫抑制性受体lilrb1结合的关键区域的报道，这阻碍了探究恶性疟原虫利用变异表面抗原家族rifin蛋白进行免疫逃避的分子机制。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种恶性疟原虫rifin多肽8-rifin，能够特异性与免疫抑制性受体lilrb1结合，为了研究恶性疟原虫免疫逃逸以及生物治疗提供基础。
6.本发明提供了一种恶性疟原虫rifin多肽8-rifin，所述8-rifin的氨基酸序列如seq id no：1所示。
7.本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备检测恶性疟原虫的试剂盒中的应用。
8.优选的，所述恶性疟原虫的检测样本为人或动物的全血或血清。
9.本发明提供了一种基于免疫检测技术恶性疟原虫检测试剂盒，包括所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin。
10.优选的，所述免疫检测技术包括以下一种或几种方法：酶联免疫吸附方法、免疫印迹方法、免疫酶染色方法、间接荧光抗体检测方法和免疫扩散方法。
11.优选的，当基于酶联免疫吸附方法检测时，所述试剂盒包括包被有所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin的检测板、洗涤液、酶标二抗和显示液。
12.本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备防治恶性疟原虫疫苗中的应用。
13.本发明提供了一种防治恶性疟原虫疫苗，所述疫苗包括所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin和佐剂。
14.本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备特异性结合免疫抑制性受体lilrb1的试剂中的应用。
15.本发明提供了所述应用中特异性结合免疫抑制性受体lilrb1的多肽在制备阻断恶性疟原虫免疫逃避的试剂或试剂盒中的应用。
16.本发明提供的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin，是恶性疟原虫rifin基因pf3d7_0900200编码的位于243-267aa的rifin肽段，氨基酸序列如seq id no：1所示，氨基酸序列长度为25个氨基酸。实验表明，与对照的突变型多肽(9-rifin)相比，本发明的多肽不仅具有较好的可特异性识别感染恶性疟病人全血的能力，且能够结合免疫抑制性受体lilrb1。这表明本发明提供的多肽8-rifin是恶性疟原虫rifin蛋白与lilrb1结合的关键区域，为进一步研究恶性疟原虫利用rifin蛋白进行免疫逃避的分子机制打下基础。
附图说明
17.图1为多肽片段8-rifin和9-rifin的质谱分析分子量结果图；
18.图2为多肽片段8-rifin和9-rifin的抗体反应结果；
19.图3为多肽片段8-rifin和9-rifin与抑制性受体lilrb1的结合反应图；
20.图4为多肽片段8-rifin与免疫后兔血清多抗的结合反应图。
具体实施方式
21.本发明提供了一种恶性疟原虫rifin多肽8-rifin，所述8-rifin的氨基酸序列如seq id no：1(yqgsqcgslsmllgkskpfctfveg)所示。
22.在本发明中，所述多肽8-rifin来自于恶性疟原虫3d7，rifin基因pf3d7_0900200编码的位于243-267aa的恶性疟原虫rifin肽段，其氨基酸序列长度为25aa。以rifin基因pf3d7_0900200编码的位于243-267aa的恶性疟原虫rifin肽段为基础进行5个氨基酸突变位点(k259n、f261y、f264l、e266n和g267e)，得到突变型的恶性疟原虫rifin多肽(9-rifin)，氨基酸序列如seq id no:2(yqgsqcgslsmllgksnpyctlvne)所示。分别开展多肽8-rifin和9-rifin与lilrb1受体结合反应的实验，结果表明，所述多肽8-rifin能够特异性结合lilrb1受体，而突变多肽(9-rifin)不能与lilrb1受体发生结合，说明本发明提供的多肽8-rifin是rifin蛋白与lilrb1受体结合的关键区域，可作为进一步研究恶性疟原虫利用
rifin蛋白进行免疫逃避的分子机制的基础，在疟疾消除和控制方面具有重要的应用价值。
23.在本发明中，所述野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、突变型的恶性疟原虫rifin多肽9-rifin分别与恶性疟病人全血、正常人血清的抗体反应，多肽8-rifin、9-rifin与恶性疟病人全血的抗体反应表现出明显的差异，多肽8-rifin对恶性疟病人全血的抗体反应阳性率明显高于多肽9-rifin。因此，本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备检测恶性疟原虫的试剂盒中的应用。所述恶性疟原虫的检测样本优选为人或动物的全血或血清。
24.在本发明中，所述野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin进行免疫原性实验，用多肽8-rifin作为免疫抗原免疫新西兰白兔制备兔多抗，用野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin与免疫兔多抗进行抗原抗体反应，结果表明8-rifin对新西兰兔有足够强的免疫原性。因此，本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备防治恶性疟原虫疫苗中的应用。
25.本发明提供了一种基于免疫检测技术恶性疟原虫检测试剂盒，包括所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin。
26.在本发明中，所述检测试剂盒的检测机理是利用多肽8-rifin与待测样本中恶性疟原虫抗体发生特异性结合实现检测样品中是否感染恶性疟原虫的目的。本发明对免疫检测技术的具体种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的免疫检测技术即可，例如酶联免疫吸附方法、免疫印迹方法、免疫酶染色方法、间接荧光抗体检测方法和免疫扩散方法等。在本发明实施例中，以酶联免疫吸附方法为例，说明利用多肽8-rifin检测感染恶性疟原虫样品的具体效果。当基于酶联免疫吸附方法检测时，所述试剂盒优选包括包被有所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin的检测板、洗涤液、酶标二抗和显示液。本发明对所述试剂盒的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的间接检测法制备试剂盒即可。所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin的包被浓度优选为1～5μg/ml，更优选为2～3μg/ml。包被时，所述多肽8-rifin的溶剂为包被缓冲液。所述包被缓冲液优选为0.05m碳酸盐缓冲液(ph 9.6)。所述包被优选为在4℃下包被10～14h。所述包被后，优选对检测板进行封闭。所述封闭用溶液优选为含质量浓度1％的bsa的pbs溶液。所述封闭的条件为37℃下孵育2h。本发明对所述试剂盒的使用方法没有特殊限制，按照本领域所熟知的间接法酶联免疫试剂盒即可。采用所述试剂盒检测，结果表明，野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin与恶性疟病人全血的免疫反应阳性率为62.5％(75/120)，与正常人血清的免疫反应假阳性率为10.9％(5/46)，两者具有显著性差异(p《0.0001)。突变型的恶性疟原虫rifin多肽9-rifin与以上两组样本的免疫反应阳性率和假阳性率分别为29.2％(35/120)和4.3％(2/46)，两者也具有显著性差异(p＝0.0006)。以上结果说明8-rifin、9-rifin在恶性疟病人全血和正常人血清这两组样本中的igg抗体反应均有明显差异。
27.本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备防治恶性疟原虫疫苗中的应用。
28.本发明提供了一种防治恶性疟原虫疫苗，所述疫苗包括所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin和佐剂。选择多肽8-rifin片段进行新西兰兔的免疫，共免疫两只新西兰兔，每只兔进行四次免疫，获取相应免疫兔血清多抗r1和r2，此过程由上海友科生物科技有限公司完成。所得兔多抗r1和r2与野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin进行抗体反应试验，结
果表明8-rifin对新西兰兔有足够强的免疫原性。
29.本发明对所述疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的多肽疫苗的制备方法即可。
30.本发明提供了所述恶性疟原虫rifin多肽8-rifin在制备特异性结合免疫抑制性受体lilrb1的试剂中的应用。
31.在本发明中，以重组表达的免疫抑制性受体lilrb1为检测对象，基于酶联免疫吸附方法检测多肽8-rifin与受体lilrb1的结合性，结果表明，多肽8-rifin能够与lilrb1受体发生明显的结合反应，而突变多肽9-rifin与受体lilrb1几乎不发生结合反应。可见，多肽8-rifin是恶性疟原虫rifin蛋白与lilrb1结合的关键区域，研究恶性疟原虫利用rifin蛋白进行免疫逃避的分子机制的基础，在疟疾消除和控制方面具有重要的应用价值。
32.本发明提供了所述应用中特异性结合免疫抑制性受体lilrb1的多肽在制备阻断恶性疟原虫免疫逃避的试剂或试剂盒中的应用。多肽8-rifin与免疫抑制性受体lilrb1结合后阻断恶性疟原虫rifin蛋白与受体lilrb1的结合使恶性疟原虫rifin蛋白暴露，不能逃离免疫细胞识别，从而增加免疫反应几率。
33.本发明对所述试剂或试剂盒的制备没有特殊限制，采用本领域所熟知的阻断免疫逃逸的试剂或试剂盒中的应用。
34.下面结合实施例对本发明提供的一种恶性疟原虫rifin多肽8-rifin及其衍生产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
35.实施例1
36.恶性疟原虫rifin多肽8-rifin的抗体免疫反应
37.1材料
38.1.1恶性疟原虫rifin蛋白多肽8-rifin、9-rifin由金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成。
39.1.2酶标板(96孔)和封口膜，购买自thermo scientific公司。
40.1.3恶性疟原虫病人血液及正常人血液样本，从多哥疟疾流行区采集。
41.1.4主要试剂和工具酶
42.试剂名称试剂来源20
×
pbs buffersangon biotechtween-20sangon biotech可溶型单组分tmb底物溶液tiangen山羊抗人igg h&l(hrp conjugated)abcambsasolarbiodimethyl sulfoxide，analytical gradesigmana2co3上海精析化工nahco3上海精析化工h2so4国药其它试剂均为国产分析纯试剂
43.2方法
44.2.1恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin工作液的制备
45.1)制备多肽母液：将盛有1mg粉末的8-rifin和9-rifin多肽管放入4℃离心机中，12,000rpm离心15min，再按照多肽合成报告中的建议，8-rifin用500μl超纯水溶解成浓度为2mg/ml的溶解液，9-rifin用500μl二甲亚砜溶解成浓度为2g/ml的溶解液；
46.2)制备多肽工作液：用提前配制好的置于4℃冰箱里的包被缓冲液稀释8-rifin和9-rifin母液，用包被缓冲液将多肽母液稀释1000倍，分别制成2μg/ml的多肽工作液。
47.2.2恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin的抗体免疫反应
48.1)包被：在96孔板侧面做好多肽种类等标记，将制备好的2μg/ml的多肽工作液按照100μl/孔的量加入到96孔板上对应的孔中，其中每块板中的前两个孔位为100μl包被液做空白对照，并用封板膜封板，在4℃冰箱中平稳放置过夜；
49.2)洗板：每孔加200μl的1
×
pbst buffer，静置洗涤，5min，洗好后在拍板纸上拍干，每拍一次换一次拍板纸，共洗板3次；
50.3)封闭：1％bsa(1
×
pbs buffer溶解)封闭液现用现配，配好后倒入一次性加样槽中，用移液器每孔加200μl，封板膜封板，放置于37℃恒温箱中孵育2h，完成后洗板过程同步骤2)；
51.3)与恶性疟原虫病人全血及正常人血清进行反应：将恶性疟原虫病人全血用1
×
pbs buffer以1：50的比例进行稀释，将正常人血清用1
×
pbs buffer以1：100的比例进行稀释，将稀释后的样本按照每个样本在同一列做一个复孔的原则，用移液器吸取加入到96孔板中，每孔100μl，其中每块板中的最后两个样本分别加浙江省正常人血清做阴性对照和1
×
pbs buffer做空白对照，全部加好后用封板膜封板置于37℃恒温箱中孵育1.5h，反应结束后进行洗板，洗板过程同步骤2)；
52.4)与山羊抗人igg h&l(hrp conjugated)进行反应：用1
×
pbs buffer以1：10000的比例进行稀释，将稀释后的液体倒入一次性加样槽中，用移液器吸取，每孔加100μl，放置于37℃恒温箱中孵育1h，反应结束后进行洗板，洗板过程同步骤2)；
53.5)显色：提前将4℃冰箱里的可溶型单组分tmb底物溶液取出置于室温，避光放置至温度达到室温，向一次性加样槽中倒入足量的溶液，用移液器吸取，每孔加100μl后放置于37℃恒温箱中进行显色，显色时间约5～10min，用计时器进行计时确定显色时间；
54.6)终止显色：提前将配制好的终止液(2m h2so4)倒入一次性加样槽中待用，根据显色情况从37℃恒温箱中取出，取出后立即加入每孔100μl的终止液终止反应；
55.7)使用synergy|h1 microplate reader酶标仪(biotek，德国)在450nm下扫描96孔板，设置程序(温度37℃，振板5s，吸光度为450nm)进行读数并将数据导出保存。
56.3数据统计分析
57.统计学数据均采用均数
±
标准差(x
±
sd)计算，与恶性疟原虫病人全血的反应阳性率和正常人血清的反应假阳性率之间的比较采用卡方检验，野生型多肽和突变型多肽与恶性疟原虫病人全血的反应阳性率之间的比较采用卡方检验，野生型多肽和突变型多肽与恶性疟原虫病人全血反应的od值比较采用独立样本z检验，检验水准α＝0.05，数据结果采用excel进行统计分析，统计作图用graphpad prism 8软件。
58.4结果
59.恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin合成产物的质谱图如图1所示，8-rifin多肽的理论分子量为2668.09，经质谱分析的结果为2667.3，9-rifin多肽的理论分子量为
2693.05，经质谱分析的结果为2692.4，理论分子量和质谱分析的分子量结果一致。
60.恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin与恶性疟病人全血、正常人血清的抗体反应结果如图2所示，结果显示恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin与恶性疟病人全血的抗体反应表现出明显的差异，野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin对恶性疟病人全血的抗体反应阳性率明显高于突变型的恶性疟原虫rifin多肽9-rifin。
61.卡方检验结果显示野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin与恶性疟病人全血的免疫反应阳性率为62.5％(75/120)，与正常人血清的免疫反应假阳性率为10.9％(5/46)，两者具有显著性差异(p《0.0001)。突变型的恶性疟原虫rifin多肽9-rifin与以上两组样本的免疫反应阳性率和假阳性率分别为29.2％(35/120)和4.3％(2/46)，两者也具有显著性差异(p＝0.0006)。以上结果说明8-rifin、9-rifin在恶性疟病人全血和正常人血清这两组样本中的igg抗体反应均有明显差异。
62.将野生型、突变型恶性疟原虫rifin多肽和恶性疟病人全血的反应阳性率结果进行组间样本的卡方检验，可知恶性疟原虫rifin多肽8-rifin与恶性疟病人全血的免疫反应阳性率显著高于突变型9-rifin(p《0.0001)，说明在与恶性疟病人全血(igg)的反应能力上，野生型8-rifin有较强的免疫反应性，但由于氨基酸突变，突变型9-rifin与恶性疟病人全血(igg)的反应能力却大大下降。
63.实施例2
64.恶性疟原虫rifin多肽8-rifin与免疫抑制性受体lilrb1的结合反应
65.1材料
66.1.1恶性疟原虫rifin多肽8-rifin和9-rifin由金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成。
67.1.2酶标板(96孔)和封口膜，购买自thermo scientific公司。
68.1.3主要试剂和工具酶
69.[0070][0071]
2方法
[0072]
2.1恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin工作液的制备
[0073]
1)制备多肽母液：将盛有1mg粉末的8-rifin和9-rifin多肽管放入4℃离心机中，12,000rpm离心15min，再按照多肽合成报告中的建议，8-rifin用500μl超纯水溶解成浓度为2mg/ml的溶解液，9-rifin用500μl二甲亚砜溶解成浓度为2mg/ml的溶解液；
[0074]
2)制备多肽工作液：用提前配制好的置于4℃冰箱里的包被缓冲液稀释8-rifin和9-rifin母液，用包被缓冲液将多肽母液倍比稀释制备4个浓度梯度的工作液，分别为1，2，4，8μg/ml。
[0075]
2.2重组人lillrb1蛋白(fc chimera)工作液的制备
[0076]
1)制备重组人lillrb1蛋白(fc chimera)母液：用250μl的1
×
pbs buffer溶解100μg的重组人lillrb1蛋白(fc chimera)粉末，制备成浓度为400μg/ml的溶解液；
[0077]
2)制备重组人lillrb1蛋白(fc chimera)工作液：用1
×
pbs buffer稀释重组人lillrb1蛋白(fc chimera)母液，1：200稀释，制成2μg/ml的重组人lillrb1蛋白(fc chimera)工作液。
[0078]
2.3恶性疟原虫rifin多肽8-rifin、9-rifin与重组人lillrb1蛋白(fc chimera)的酶联免疫反应
[0079]
1)包被：在96孔板侧面做好多肽种类等标记，将制备好的1，2，4，8μg/ml的多肽工作液按照100μl/孔的量加入到96孔板上对应的孔中，其中每块板中的前两个孔位为100μl包被液做空白对照，并用封板膜封板，在4℃冰箱中平稳放置过夜；
[0080]
4)洗板：每孔加200μl的1
×
pbst buffer，静置洗涤，5min，洗好后在拍板纸上拍干，每拍一次换一次拍板纸，共洗板3次；
[0081]
5)封闭：1％bsa(1
×
pbs buffer溶解)封闭液现用现配，配好后倒入一次性加样槽中，用移液器每孔加200μl，封板膜封板，放置于37℃恒温箱中孵育2h，完成后洗板过程同步骤2)；
[0082]
3)与重组人lillrb1蛋白(fc chimera)的结合反应：将重组人lillrb1蛋白(fc chimera)母液用1
×
pbs buffer以1：200的比例进行稀释，将稀释后的样本用移液器吸取加入到96孔板中，每孔100μl，其中每块板中的最后两个样本加1
×
pbs buffer做阴性对照，全部加好后用封板膜封板置于37℃恒温箱中孵育1h，反应结束后进行洗板，洗板过程同步骤2)；
[0083]
4)与山羊抗人igg h&l(hrp conjugated)进行反应：用1
×
pbs buffer以1：10000的比例进行稀释，将稀释后的液体倒入一次性加样槽中，用移液器吸取，每孔加100μl，放置于37℃恒温箱中孵育1h，反应结束后进行洗板，洗板过程同步骤2)；
[0084]
5)显色：提前将4℃冰箱里的可溶型单组分tmb底物溶液取出置于室温，避光放置至温度达到室温，向一次性加样槽中倒入足量的溶液，用移液器吸取，每孔加100μl后放置于37℃恒温箱中进行显色，显色时间约5～10min，用计时器进行计时确定显色时间；
[0085]
6)终止显色：提前将配制好的终止液(2m h2so4)倒入一次性加样槽中待用，根据显色情况从37℃恒温箱中取出，取出后立即加入每孔100μl的终止液终止反应；
[0086]
7)使用synergy|h1 microplate reader酶标仪(biotek，德国)在450nm下扫描96孔板，设置程序(温度37℃，振板5s，吸光度为450nm)进行读数并将数据导出保存。
[0087]
3数据统计分析
[0088]
数据结果采用excel进行统计分析，统计作图用graphpad prism 8软件。
[0089]
4结果
[0090]
用野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin和突变型的恶性疟原虫rifin多肽9-rifin分别与重组人lillrb1蛋白(fc chimera)进行酶联免疫吸附试验(图3)，结果显示野生型的恶性疟原虫rifin多肽8-rifin能够与lilrb1受体发生明显的反应，通过拟合曲线的公式可以看出r2＝0.983；而其突变型9-rifin与抑制性受体lilrb1几乎不反应。
[0091]
实施例3
[0092]
恶性疟原虫rifin多肽8-rifin的免疫原性试验
[0093]
1材料
[0094]
1.1恶性疟原虫rifin多肽8-rifin由金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成。
[0095]
1.2新西兰兔多抗由上海友科生物科技有限公司制作。
[0096]
1.3酶标板(96孔)和封口膜，购买自thermo scientific公司。
[0097]
1.4主要试剂和工具酶
[0098]
试剂名称试剂来源20
×
pbs buffersangon biotechtween-20sangon biotech可溶型单组分tmb底物溶液tiangen山羊抗兔igg h&l(hrp)abcambsasolarbiodimethyl sulfoxide，analytical gradesigmana2co3上海精析化工nahco3上海精析化工h2so4国药其它试剂均为国产分析纯试剂
[0099]
2方法
[0100]
2.1恶性疟原虫rifin多肽8-rifin工作液的制备
[0101]
1)制备多肽母液：将盛有1mg粉末的8-rifin多肽管放入4℃离心机中，12,000rpm离心15min，再按照多肽合成报告中的建议，8-rifin用500μl超纯水溶解成浓度为2mg/ml的溶解液；
[0102]
2)制备多肽工作液：用提前配制好的置于4℃冰箱里的包被缓冲液稀释8-rifin母液，用包被缓冲液将多肽母液倍比稀释制备浓度为2μg/ml的工作液。
[0103]
2.2兔血清多抗工作液的制备
[0104]
1)由上海友科生物科技有限公司制作提供的免疫新西兰兔血清多抗，由恶性疟原虫rifin多肽8-rifin免疫两只新西兰兔，共经过四次免疫，分别于每次免疫前取血制备兔血清多抗；
[0105]
2)制备新西兰兔血清多抗工作液：用1
×
pbs buffer稀释新西兰兔血清多抗，获得
稀释梯度为1：1250、1：2500、1：5000、1：10000和1：20000的工作液。
[0106]
2.3多肽8-rifin与免疫后兔血清多抗的的酶联免疫反应
[0107]
1)包被：在96孔板侧面做好多肽种类等标记，将制备好的2μg/ml的多肽工作液按照100μl/孔的量加入到96孔板上对应的孔中，其中每块板中的前两个孔位为100μl包被液做空白对照，并用封板膜封板，在4℃冰箱中平稳放置过夜；
[0108]
6)洗板：每孔加200μl的1
×
pbst buffer，静置洗涤，5min，洗好后在拍板纸上拍干，每拍一次换一次拍板纸，共洗板3次；
[0109]
7)封闭：1％bsa(1
×
pbs buffer溶解)封闭液现用现配，配好后倒入一次性加样槽中，用移液器每孔加200μl，封板膜封板，放置于37℃恒温箱中孵育2h，完成后洗板过程同步骤2)；
[0110]
3)与免疫新西兰兔血清多抗的结合反应：将新西兰兔血清多抗用1
×
pbs buffer按照1：1250、1：2500、1：5000、1：10000和1：20000梯度进行稀释，将稀释后的样本用移液器吸取加入到96孔板中，每孔100μl，其中每块板中的最后两个样本加1
×
pbs buffer做阴性对照，全部加好后用封板膜封板置于37℃恒温箱中孵育1h，反应结束后进行洗板，洗板过程同步骤2)；
[0111]
4)与山羊抗兔igg h&l(hrp)进行反应：用1
×
pbs buffer以1：5000的比例进行稀释，将稀释后的液体倒入一次性加样槽中，用移液器吸取，每孔加100μl，放置于37℃恒温箱中孵育1h，反应结束后进行洗板，洗板过程同步骤2)；
[0112]
5)显色：提前将4℃冰箱里的可溶型单组分tmb底物溶液取出置于室温，避光放置至温度达到室温，向一次性加样槽中倒入足量的溶液，用移液器吸取，每孔加100μl后放置于37℃恒温箱中进行显色，显色时间约5～10min，用计时器进行计时确定显色时间；
[0113]
6)终止显色：提前将配制好的终止液(2m h2so4)倒入一次性加样槽中待用，根据显色情况从37℃恒温箱中取出，取出后立即加入每孔100μl的终止液终止反应；
[0114]
7)使用synergy|h1 microplate reader酶标仪(biotek，德国)在450nm下扫描96孔板，设置程序(温度37℃，振板5s，吸光度为450nm)进行读数并将数据导出保存。
[0115]
3数据统计分析
[0116]
数据结果采用excel进行统计分析，统计作图用graphpad prism 8软件。
[0117]
4结果
[0118]
用野生型恶性疟原虫rifin多肽8-rifin免疫新西兰兔，获得的兔血清多抗与多肽8-rifin进行酶联免疫反应，结果显示随着免疫次数的增加抗体反应明显增强，三免前和四免前的血清多抗稀释至10000倍仍有较为明显的反应。以上结果表明8-rifin对新西兰兔有足够强的免疫原性。
[0119]
有上述实施例结果可知，本发明公开了一种由恶性疟原虫rifin基因pf3d7_0900200编码的位于243～267aa的rifin多肽8-rifin，通过elisa方法进行抗体免疫反应及与免疫抑制性受体lilrb1结合的实验对8-rifin的功能进行了验证。与对照突变型的恶性疟原虫rifin多肽9-rifin相比，本发明的多肽不仅具有较好的可特异性识别感染恶性疟病人全血的能力，且能够结合免疫抑制性受体lilrb1，这表明本发明的多肽是恶性疟原虫rifin蛋白与lilrb1结合的关键区域，因此本发明可作为进一步研究恶性疟原虫利用rifin蛋白进行免疫逃避的分子机制的基础，在疟疾消除和控制方面具有重要的应用价值。
[0120]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。