一种杂交瘤细胞株、抗人ERG蛋白单克隆抗体及其应用的制作方法

一种杂交瘤细胞株、抗人erg蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种杂交瘤细胞株、抗人erg蛋白单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.erg又称成红细胞转化特异性(e26 transformation-specific，ets)相关基因，位于21q22号染色体，属于ets转录因子家族的成员。这个家族的所有成员都是胚胎发育、细胞增殖、分化、血管生成、炎症和凋亡的关键调节者。该基因编码的蛋白质主要在细胞核中表达。它包含一个dna结合域和一个pnt结构域，该结构域与嵌合癌蛋白的自结合有关。这种蛋白在血小板与内皮下层黏附，是诱导血管细胞重塑所必需的。它还调节造血细胞和巨核细胞的分化和成熟。
3.该基因参与染色体易位，产生不同的融合基因产物。如erg可以与雄激素调节跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)发生融合，形成tmprss2-erg融合基因，导致erg蛋白在前列腺癌中的高表达。据报道，erg蛋白也可以表达于血管内皮肿瘤、上皮来源肿瘤和其他非上皮性肿瘤，在血管内皮来源肿瘤中均阳性表达，96％血管肉瘤、97.7％上皮样血管内皮瘤和所有的卡波西肉瘤中erg均阳性表达。同时erg可以调控内皮细胞凋亡和新生血管形成。此外，erg也表达于淋巴管内皮细胞和骨髓干细胞中。脑膜瘤、上皮样肉瘤、恶性横纹肌样瘤、急性骨髓性白血病和髓外骨髓肉瘤也可见erg的阳性表达。erg基因重排见于尤文肉瘤。目前血管肉瘤的标志物包括cd31(主要标志物)、cd34、d2-40和血管内皮生长因子受体(vegfrs)等潜在标志物，但这些标志物都没有理想的敏感性和特异性。erg在血管内皮细胞中的强烈表达，使其成为血管源性肿瘤的高度敏感和特异的标志物之一。
4.目前临床上主要通过免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)病理实验检测肿瘤组织中erg的表达情况。ihc实验的核心是有可以特异性结合的一抗，其性能的优劣直接决定着整个实验的灵敏度和特异性。因此，研制出一种高特异性结合erg蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明旨在提出一种杂交瘤细胞株、抗人erg蛋白单克隆抗体及其应用，以提供一种特异性好、亲和力高的抗人erg蛋白鼠单克隆抗体。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种杂交瘤细胞株，命名为oti4h7，所述杂交瘤细胞株于2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45154。
8.一种抗人erg蛋白单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌。
9.本发明所述杂交瘤细胞株的筛选方法及抗人erg蛋白单克隆抗体制备方法如下：
10.(1)重组表达载体的构建：erg基因的orf核苷酸序列如seq id no.1所示，其orf长度为1437bp，相对应的氨基酸序列如seq id no.2所示，氨基酸长度为479aa。根据erg基因
的orf全序列设计引物，通过pcr扩增获得目的片段，并将其与表达载体pcmv6-entry连接，构建erg重组表达质粒pcmv6-rerg。
11.(2)erg重组蛋白的表达与纯化：将pcmv6-rerg重组表达质粒转染至hek293t细胞，裂解离心取上清，利用ddk亲和层析柱纯化，获得纯化的erg重组蛋白。
12.(3)单克隆抗体的筛选与制备：利用上述重组erg蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，通过有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗erg特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化erg单克隆抗体。通过western-blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
13.进一步地，所述抗人erg蛋白单克隆抗体与erg蛋白特异性结合。
14.进一步地，所述抗人erg蛋白单克隆抗体的轻链可变区含105aa，包括如seq id no.3所示的氨基酸序列。
15.进一步地，所述抗人erg蛋白单克隆抗体的轻链可变区包括3个抗原决定簇，分别为如seq id no.5所示的cdr1、如seq id no.6所示的cdr2及如seq id no.7所示的cdr3，其氨基酸残基序列分别:qninvw、kvs、qqgqsy。
16.进一步地，所述抗人erg蛋白单克隆抗体的重链可变区含106aa，包括如seq id no.4所示的氨基酸序列。
17.进一步地，所述抗人erg蛋白单克隆抗体的重链可变区包括3个抗原决定簇，分别为如seq id no.8所示的cdr1、如seq id no.9所示的cdr2及如seq id no.10所示的cdr3，其氨基酸残基序列分别为gytfteyl、inpgsggt、arlggnfpn。
18.如上所述的抗人erg蛋白单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用；
19.进一步地，所述免疫检测工具用于检测erg蛋白；
20.进一步地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
21.如上所述的抗人erg蛋白单克隆抗体在制备用于标记肿瘤组织试剂盒中的应用；
22.进一步地，所述肿瘤组织包括前列腺癌、血管肉瘤、上皮样血管内皮瘤和所有的卡波西肉瘤等组织中的一种或多种。
23.一种免疫组织化学检测试剂盒，包括如上所述的抗人erg蛋白单克隆抗体，可检测组织细胞中erg蛋白的表达状况。
24.相对于现有技术，本发明所述的杂交瘤细胞株、抗人erg蛋白单克隆抗体及其应用具有以下优势：
25.本发明所述的杂交瘤细胞株可稳定分泌单克隆抗体，且与erg蛋白特异性结合，显著提高了erg蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于多种肿瘤中erg蛋白的标记。
附图说明
26.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
27.图1为本发明实施例1所述的western blot检测erg重组质粒在hek293t细胞表达的结果图；其中泳道l为转染空载体pcmv6-entry质粒的hek293t细胞裂解液的检测结果；泳
道r为转染pcmv6-rerg重组质粒的hek293t细胞裂解液的检测结果，杂交所用一抗为ddk标签抗体；
28.图2为本发明实施例1所述的sds-page电泳检测pcmv6-rerg重组蛋白的考马斯亮蓝染色结果图，用ddk亲和层析柱纯化erg蛋白，纯化后的蛋白通过sds-page电泳及考马斯亮蓝染色；
29.图3为本发明实施例3所述的免疫组化法检测血管瘤组织中erg蛋白表达的结果图，杂交所用一抗为本发明抗人erg蛋白单克隆抗体oti4h7；
30.图4为本发明实施例3所述的免疫组化法检测前列腺癌组织中erg蛋白表达的结果图，杂交所用一抗为本发明抗人erg蛋白单克隆抗体oti4h7。
具体实施方式
31.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
32.下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
33.实施例1：抗erg鼠单克隆抗体的制备
34.一、erg重组表达质粒的构建
35.根据ncbi中erg基因(nm_182918)序列设计引物，利用pcr扩增并与表达载体pcmv6-entry连接，构建erg的重组表达质粒pcmv6-rerg。
36.二、重组erg蛋白的表达与纯化
37.1、转染hek293t细胞
38.hek293t细胞以1:3传代并在培养皿中继续培养；取无血清及抗生素的dmem培养基至50ml管中，加入pei megatran1.0混匀，然后加入上述erg重组质粒dna，混匀并静置30分钟；将此混合液加入hek293t细胞培养皿中，于37℃、5％co2培养箱中培养。转染24小时后，添加2m丁酸钠。
39.2、裂解细胞
40.转染48小时后，吸去培养基，加入pbs进行漂洗，吸去pbs。加入裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂pi和pmsf(现配现用)。置于冰盒中在摇床上振荡，收集裂解液，4℃离心，收集上清。
41.3、ddk亲和层析柱纯化
42.用pvdf膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中，加入混合好的sepharose beads1ml，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；将裂解液倒入bio-rad层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样wb检测，如图1所示(图1显示：erg重组质粒在hek293t细胞中的正常表达)，以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用tbst冲洗beads 3次，滴尽后用0.1m glycine buffer(ph3.5)洗脱，第一次200μl，滴尽不收集，第二、三次各500μl，第四次250μl，收集至1.5ml离心管中，并迅速加入nah2po
4 buffer(ph11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，tween-80至终浓度为0.1％。纯化后erg重组蛋白利用sds-page鉴定，结果如图2所示。
43.三、oti4h7分泌抗erg蛋白单克隆抗体的制备与筛选
44.1、动物免疫
45.上述纯化的erg抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为30μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
46.2、细胞融合
47.骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph 8.0)1ml，加入不完全培养基及其终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容至50ml，分装到3.5cm培养皿中，置于湿盒中，于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。
48.3、筛选和克隆
49.融合7-10天内挑选杂交瘤细胞克隆，使用纯化的重组erg蛋白进行elisa测试，标记对应细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od
280
阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。
50.4、单克隆抗体的制备与纯化
51.以无血清培养基悬浮培养杂交瘤细胞，1周左右当细胞上清体积扩培到任务量及细胞死亡率达到60％-70％时，收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化，根据抗体亚型选择相应柱料纯化。纯化后的单抗测定浓度、分装、冻存于-20℃。
52.实施例2：单克隆抗体oti4h7可变区基因与氨基酸序列分析
53.利用race 5’/3’试剂盒(takara bio usa公司)，采用5’race(rapidamplification of cdna ends，快速扩增cdna末端)技术扩增杂交瘤细胞功能性抗体的轻链可变区与重链可变区基因序列。具体实验过程参见race 5’/3’kit使用者手册。
54.1、重组杂交瘤细胞oti4h7可变区基因及测序
55.根据所述的抗体oti4h7为igg1亚型，设计针对其ig和kappa恒定区3’端的特异性基因引物prace-h-gsp和prace-k-gsp，引物序列如下：
56.prace-h-gsp:catcdgtctatccactggcccctg
57.prace-k-gsp:cttcccaccatccagtgagcagtt
58.从杂交瘤细胞oti4h7中提取mrna，逆转录为cdna，race扩增抗体轻链和重链的dna片段，分别将扩增的轻链和重链与克隆载体puc119连接，利用蓝白斑筛选挑取阳性克隆，利用abi 3730测序仪对纯化的阳性质粒进行测序，测序引物为通用引物m13f和m13r。
59.2、单克隆抗体oti4h7可变区基因的氨基酸序列分析
60.利用imgt/v-quest在线分析软件(http://www.imgt.org)，分别对测序得到的轻链和重链的可变区核苷酸序列进行数据分析，得到鼠单克隆抗体oti4h7的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.3所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示。vl全长为105个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和11，cdr的3个结构域氨基酸数分别为6、3和6，cdr1、cdr2和cdr3的区域相应地分别为27aa-32aa，50aa-52aa和89aa-94aa，其氨基酸
序列分别:qninvw、kvs、qqgqsy。
61.通过分析，所述鼠单克隆抗体oti4h7 vh全长为116个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为25、17、38和11，cdr的3个结构域氨基酸数分别为8、8和9，cdr1、cdr2和cdr3分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-105aa，其氨基酸序列分别为gytfteyl、inpgsggt、arlggnfpn。
62.实施例3：以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验
63.以单克隆抗体oti4h7为一抗，通过ihc实验技术对血管瘤和前列腺癌组织进行检测，验证其特异性。
64.1、取福尔马林固定的血管瘤和前列腺癌组织进行石蜡包埋，使用leica组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。
65.2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯10min
×
3次，无水乙醇10min
×
3次，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min
×
3次。
66.3、修复：加入抗原修复液高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min
×
3次。
67.4、灭活：使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min
×
3次。
68.5、一抗孵育：加入1:300稀释的本发明oti4h7分泌的单克隆抗体，置于湿盒中，室温孵育90min。用pbst(0.1％tween-20)洗涤5min
×
3次。
69.6、二抗孵育：每张片子加200μl pv-8000，37℃孵育30min。使用pbst洗涤5min
×
3次。
70.7、显色：应用dab溶液显色，显色3-10min。蒸馏水洗涤。
71.8、复染：苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。
72.9、脱水和透明：75％乙醇5min，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3
×
5min；二甲苯3
×
5min，中性树胶封片。
73.10、镜检：如图3-4所示。
74.2、实验结果
75.结果表明杂交瘤细胞oti4h7分泌的抗erg蛋白单克隆抗体在所检组织上具有很好的特异性，具体体现如下，
76.(1)由图3结果可见，杂交瘤细胞oti4h7分泌的抗erg蛋白单克隆抗体在血管瘤组织上的表达，虚线箭头指示为肿瘤细胞呈现阳性表达，即有egr蛋白的表达；实线箭头指示的为间质细胞为阴性。
77.(2)由图4结果可见，杂交瘤细胞oti4h7分泌的抗erg蛋白单克隆抗体在前列腺癌组织的表达，虚线箭头指示在血管内皮上阳性表达，实线箭头指示在癌上不表达。
78.以上结果说明oti4h7分泌的单克隆抗体能特异性结合血管和血管源性肿瘤组织中的erg蛋白，使其成为血管源性肿瘤的高度敏感和特异的标志物之一。
79.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。