一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法

1.本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域，具体涉及到一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法。


背景技术：

2.细胞培养是细胞工程技术的重要内容，已发展成为生物、医学研究与应用中广泛采用的技术方法。水生动物细胞培养的研究晚于哺乳动物，且主要集中在鱼类，全世界范围内已建立超过700多种鱼类细胞系。然而在水生无脊椎动物中，除唯一一个淡水水生无脊椎动物细胞系――光滑双脐螺(bromphalaria glabrata)担轮幼虫细胞系(bge)建立的报道外，未见其他永生性细胞系成功建立的报道。许多学者尝试优化培养基，选取不同发育阶段、组织材料来建立海洋贝类细胞系，但效果并不明显。建立海洋贝类细胞系依然是一项充满挑战性和困难性的工作。
3.脉红螺rapana venosa，隶属于软体动物门(mollusca)、腹足纲(gastropoda)、前鳃亚纲(prosobranchia)、新腹足目(neogastropoda)、骨螺科(muricidae)、红螺属(rapana)，是典型的肉食性螺类，在我国渤海、黄海和东海以及日本、朝鲜、俄罗斯沿海等地均有分布，具有很高的经济价值和药用价值，畅销国内外市场。


技术实现要素：

4.对于现有技术中所存在的问题，本发明的目的是提供一种脉红螺胚胎细胞系的构建与鉴定方法。
5.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
6.一种脉红螺胚胎细胞系的构建方法，其特征在于：将脉红螺胚胎细胞于细胞完全培养基中原代培养，再将原代培养后细胞每7-10天以一分为二的比例进行传代培养，直至细胞性状稳定(大致20代左右)，进而建立脉红螺胚胎细胞系。
7.所述细胞完全培养基为以l15为基础培养基，向基础培养基中添加其体积10％的胎牛血清，其体积5％的青链霉素混合液，其体积40％的一螺层卵袋提取液。
8.所述卵袋提取液为从脉红螺一螺层卵袋中抽取营养液，提取后进行离心、过滤，待用，置于-80℃保存。
9.其中，脉红螺一螺层卵袋为脉红螺幼虫发育到一螺层幼虫时期的卵袋。
10.所述原代培养为将脉红螺胚胎细胞按50,000-100,000个/ml接种量于细胞完全培养基中于25℃细胞培养箱，进行原代培养直至细胞密度为100,000-200,000个/ml；其中，脉红螺胚胎细胞为将消毒后脉红螺产卵1天的卵袋，收集其胚胎研磨，待用。
11.所述脉红螺胚胎细胞为取脉红螺产卵1天的卵袋浸泡在超纯水浸泡5-10min；再于体积百分含量为70％的酒精水溶液浸泡5-10min。将消毒好的卵袋剪开，胚胎经无菌pbs缓冲溶液洗涤，洗涤后收集其胚胎，磨碎胚胎过滤得到细胞滤液(在过滤网上研磨，所述过滤网孔径为40μm)，待用。
12.所述传代培养为待原代培养的细胞密度达到100,000-200,000个/ml时,以一分为二的比例进行传代，每7-10天传代一次，按原代培养条件进行传代培养，直至培养至细胞性状稳定。
13.一种构建获得脉红螺胚胎细胞系的鉴定方法，以脉红螺胚胎细胞系dna为模板，分别采用贝类18s和coi引物，进行pcr扩增，分别扩增的脉红螺胚胎细胞的18s基因片段和coi基因片段，待扩增的18s基因片段产物中带有970bp条带，扩增的coi基因片段产物中带有721bp条带，同时存在这两个片段即为脉红螺胚胎细胞。
14.所述18s引物序列为：18s-1f：tacctggttgatcctgccagtag，18s-5r：cttggcaaatgctttcgc；所述coi引物序列为：lco1490：ggtcaacaaatcataaagatattgg，hco2198：taaacttcagggtgaccaaaaaatca。
15.所述pcr扩增反应条件均为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃延伸10min。
16.本发明的有益效果：
17.本发明方法构建的脉红螺胚胎细胞系可以进行连续传代，目前已成功传代超过20代。该细胞系主要特点是：细胞系为悬浮细胞，可以连续传代，生长速度快。细胞系经分子标记鉴定比对后，确定为脉红螺胚胎细胞。所获细胞系为贝类生理、分子遗传学以及发育生物学提供宝贵的实验材料，具有广泛的研究及应用价值。
附图说明
18.图1为本发明所述脉红螺胚胎细胞原代培养第1天的形态图。
19.图2为本发明所述脉红螺第20代胚胎细胞的形态图。
20.图3为脉红螺胚胎细胞系18s基因核苷酸序列比对图。
21.图4为脉红螺胚胎细胞系coi基因核苷酸序列比对图。
具体实施方式
22.下面结合附图对本发明做进一步详述。
23.实施例1：配置细胞完全培养基
24.使用无菌注射器从脉红螺一螺层卵袋中抽取营养液，将营养液置于无菌离心管中，4000g离心20min，收集上清液经0.22μm孔径的滤膜过滤，得卵袋提取液，于-20℃备用。
25.将市售solarbio标准l15培养基作为基础培养基，在基础培养基中加入占总体积10％的胎牛血清，5％的青链霉素混合液和40％的卵袋提取液，配置成完全培养基。
26.实施例2：
27.1)脉红螺胚胎细胞原代培养
28.选取产卵一天的脉红螺卵袋，使用超纯水浸泡5min，去除表面寄生虫，使用70％酒精水溶液浸泡5min消毒。将消毒好的卵袋置于直径为3.5cm的一次性无菌培养皿中。使用无菌剪刀剪开脉红螺卵袋，将脉红螺胚胎置于40μm筛网上，使用无菌pbs冲洗两次，使用无菌研磨棒将胚胎磨碎。将细胞滤液接种到完全培养基中，接种密度为80,000个/ml，静置培养，培养温度为25℃。原代培养1天后，对胚胎细胞进行观察，其形态如图1所示。由图1可见细胞呈油滴状，局部有少量细胞团。
29.2)传代培养
30.原代细胞开始增殖后，细胞数目增多，悬浮在培养基中。根据细胞密度待密度达到160,000个/ml，进行传代培养，约8天传代一次，以一分为二的比例进行传代。传代时更换新鲜上述配制的细胞完全培养基，传代培养条件与上述步骤1)记载原代培养条件一致。脉红螺胚胎细胞第20代形态如图2所示，细胞形态呈油滴状，即可认为获得脉红螺胚胎细胞系。
31.实施例3：细胞种属的分子鉴定
32.取第6代脉红螺胚胎细胞，使用基因组dna提取试剂盒提取dna。以胚胎细胞dna为模板，分别利用18s和coi通用引物进行pcr扩增。18s引物序列为：18s-1f：tacctggttgatcctgccagtag，18s-5r：cttggcaaatgctttcgc；coi引物序列为：lco1490：ggtcaacaaatcataaagatattgg，hco2198：taaacttcagggtgaccaaaaaatca。pcr反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃延伸10min。pcr产物送北京擎科生物科技有限公司进行一代测序。
33.扩增的脉红螺胚胎细胞18s基因片段长度为970bp，利用blast在ncbi数据库中进行比对，与数据库中脉红螺的18s基因(基因id：hq834011.1)一致性为99.68％。扩增的脉红螺胚胎细胞coi基因片段长度为721bp，利用blast在ncbi数据库中进行比对，与数据库中脉红螺的coi基因(基因id：km213962.1)一致性为99.00％。18s和coi核苷酸比对结果分别如图3和4所示，证明该细胞为脉红螺细胞。
34.综上可见，本发明创新的通过在细胞培养基中添加脉红螺一螺层卵袋提取液，成功进行脉红螺胚胎细胞的原代和传代培养，建立脉红螺胚胎细胞系。并通过分子鉴定证明该细胞系为脉红螺细胞。
35.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不改变本发明基本原理的前提下，可以进行适当的改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。