一种检测布鲁氏菌的Omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用

一种检测布鲁氏菌的omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种检测布鲁氏菌的omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用。


背景技术：

2.布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，who将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。布病主要是通过直接或间接接触染病动物或动物产品而感染。人类患布病后，会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力；家畜感染布病则引起流产和不育，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。
3.准确诊断是布病防控极为重要的环节。布病诊断又分为血清学诊断和病原学诊断，相对于常用的布病血清学诊断方法，布病病原学诊断对实验室生物安全级别和实验人员要求都比较高。目前布病病原学诊断方法主要包括细菌分离、生化鉴定分型、核酸检测等，其中核酸检测又有amos-pcr、bruce-ladder pcr、real-time pcr、mlva等方法。而上述病原学诊断方法的开展都需要在专业布病实验室完成，操作人员必须经过专门培训，一次检测至少需要2小时以上。因此开发针对布病的病原学现场快速诊断方法十分必要。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供了一种检测布鲁氏菌的omp16特异性纳米抗体、表达载体及其应用，此纳米抗体能够特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白omp16，能够有效阻断布鲁氏菌阳性血清与omp16的结合，因此，利用此抗体，可以建立阻断elisa、胶体金等检测方法对布鲁氏菌病进行检测。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
6.一种检测布鲁氏菌的omp16特异性纳米抗体，该特异性纳米抗体通过以下步骤制备：
7.(1)omp16的诱导表达
8.将实验室保存的pgex4t-1-omp16质粒转化至bl21(de3)中，挑取单克隆活化至对数生长期(od600nm至0.6～0.8之间)，冷却至室温，加入终浓度为1mm的iptg，转入22℃，200r/min培养16h，诱导表达蛋白；6000r/min常温离心10min，弃掉上清，菌体使用1/20体积的pbs重悬，以超声3s，间歇3s超声破碎菌体，12000r/min，4℃离心10min，分离上清和沉淀；
9.(2)omp16蛋白的纯化
10.取超声后上清，使用0.45μm滤器过滤除杂质，放置于冰上备用；将取1ml gst resin至层析柱中，带介质自然沉降，加入10倍体积pbs平衡柱子；加入过滤后的表达上清，调整流速为0.5ml/min，吸附目的蛋白；上样结束后，加入10-20倍体积的pbs洗脱杂蛋白，至
流出液再280nm吸光度接近0，使用洗脱缓冲液(50mm tris-cl，10mm还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白，控制流速为0.5ml/min，收集流出液，sds-page检测流出液的蛋白含量，并将蛋白透析至pbs溶液中，测定蛋白浓度，分装冻存至-80℃冰箱；
11.(3)omp16特异性噬菌体的淘选
12.将纯化的omp16蛋白用pbs缓冲液稀释至200μg/ml，包被至96孔酶标板上，每孔100μl，共包被3个孔，同时设置pbs对照孔，4℃包被过夜；弃去包被液，pbs’t洗板三次后，加入200μl 2.5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；弃去封闭液，加入2.5％脱脂奶粉稀释的噬菌体5
×
10
10
pfu/孔，37℃孵育2h；弃去噬菌体上清，使用pbs’t洗板10次，pbs洗板5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1m三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1mtris-hcl(ph＝7.4)中和洗脱物；取400μl淘选产物按照文库救援的方法救援淘选噬菌体，同时检测噬菌体滴度；将救援后的噬菌体按照同样的方法进行第二轮、第三轮淘选，第二轮、第三轮淘选omp16的包被浓度分别为100、50μg/ml；
13.(4)纳米抗体粗提物的制备
14.随机挑取96个最后一轮淘选噬菌体单克隆至100μl lb/amp-glu培养基中，37℃200r/min培养8h；每个克隆取10μl培养物转接至500μl tb培养基中，37℃培养至对数生长期，加入10μl 100mm iptg，继续培养12-14h；12000r/min离心2min，收集菌体，-80℃、37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μl pbs 4℃孵育30min重悬菌体，离心后上清即为粗提物。
15.进一步地，步骤(3)中，文库救援的方法包括如下步骤：
16.取100μl噬菌体展示文库，接种于100ml 2
×
yt/amp-glu培养基(含有1μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)中，37℃，200r/min培养至对数生长期；加入20个moi剂量的辅助噬菌体m13k07，37℃静置30min，2800g室温离心10min，弃上清，沉淀使用200ml 2
×
yt/amp-kan(含有1μg/ml氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬，37℃，200r/min培养14-16h；3800g，4℃离心30min，收集上清，加入1/5体积的peg/nacl(200g peg6000，146g nacl加水溶解，定容至1l)，混匀，冰上静置6-8h；3800g，4℃离心30min弃上清，加入1ml pbs溶液重悬沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解，12000g 4℃离心15min，收集上清，并使用对数生长期的tg1测定救援噬菌体滴度。
17.本发明还公开了上述的一种检测布鲁氏菌的omp16特异性纳米抗体的表达载体，通过以下方法构建：
18.将nba4的基因序列通过pst i和not i两个酶切位点插入至pcmv-hrp表达载体中，构建重组质粒，pcr和测序验证重组质粒的正确性，提取无内毒素的pcmv-nba4-hrp重组质粒，使用lipo8000(碧云天)，12孔板每孔配制如下反应体系：lipo80001.6μl，pcmv-nba4-hrp 1μg，opti-mem 50μl，将质粒转染至融合度为60-70％的hek-293t细胞中，48h后收取上清检测nba4-hrp的表达及活性。
19.本发明所述的一种检测布鲁氏菌的omp16特异性纳米抗体的表达载体可用于构建基于nba4-hrp阻断elisa方法检测牛血清布鲁氏菌抗体，具体地，通过以下步骤构建：
20.(1)抗原包被：设置omp16浓度为1、2、4μg/ml，以100μl/孔包被至96孔酶标板上，4℃孵育过夜；
21.(2)封闭：pbs’t溶液洗板三次，每孔加入200μl 2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h；
22.(3)孵育一抗：将收集的nba4-hrp表达上清使用封闭液进行2、4、6、8、16、32、64倍
梯度稀释，加入至酶标板中，37℃孵育1h；
23.(4)显色和终止：加入100μltmb溶液室温显色10min，50μl 3m h2so4终止反应后，读取450nm吸光值，分析试验结果，确定阻断elisa的抗原抗体使用浓度。
24.检测时，将omp16稀释至2μg/ml，包被至96孔酶标板中，4℃过夜；加入2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h。按照血清1∶20，hpr-nba4 1∶4的比例将血清和纳米抗体混合，每孔100μl加入至酶标板中，37℃孵育1h，洗板后加入tmb和3m h2so4显色，检测450nm处吸光度。
25.本发明的纳米抗体能够特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白omp16，能够有效阻断布鲁氏菌阳性血清与omp16的结合，因此，利用此抗体，可以建立阻断elisa、胶体金等检测方法对布鲁氏菌病进行检测。
附图说明
26.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
27.图1原核表达的omp16经gst亲和层析纯化结果；
28.图中：泳道1：未诱导菌液；泳道2：iptg诱导后沉淀；泳道3：iptg诱导后上清；泳道4：洗脱杂蛋白；泳道5-9：洗脱目的蛋白。
29.图2为间接elisa检测骆驼血清中omp16抗体滴度结果。
30.图3为omp16特异性噬菌体三轮淘选滴度检测结果。
31.图4为间接ellsa检测omp16特异性纳米抗体粗提物。
32.图5为omp16特异性纳米抗体nba4序列分析。
33.图6为hrp-nba4与omp16的结合滴度测定结果。
34.图7为基于hrp-nba4的阻断elisa检测牛血清中omp16抗体。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
36.实施例
37.1.omp16重组蛋白的表达、纯化及骆驼血清中抗体滴度测定
38.(1)omp16的诱导表达
39.将实验室保存的pgex4t-1-omp16质粒转化至bl21(de3)中，挑取单克隆活化至对数生长期(od600nm至0.6～0.8之间)，冷却至室温，加入终浓度为1mm的iptg，转入22℃，200r/min培养16h，诱导表达蛋白。6000r/min常温离心10min，弃掉上清，菌体使用1/20体积的pbs重悬，以超声3s，间歇3s超声破碎菌体，12000r/min，4℃离心10min，分离上清和沉淀，取未诱导、诱导后上清、沉淀进行sds-page鉴定。
40.(2)omp16蛋白的纯化
41.取超声后上清，使用0.45μm滤器过滤除杂质，放置于冰上备用。将取1ml gst resin至层析柱中，带介质自然沉降，加入10倍体积pbs平衡柱子。加入过滤后的表达上清，
调整流速为0.5ml/min，吸附目的蛋白。上样结束后，加入10-20倍体积的pbs洗脱杂蛋白，至流出液再280nm吸光度接近0。使用洗脱缓冲液(50mm tris-cl，10mm还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白，控制流速为0.5ml/min，收集流出液。sds-page检测流出液的蛋白含量，并将蛋白透析至pbs溶液中，测定蛋白浓度，分装冻存至-80℃冰箱。
42.(3)骆驼血清中omp16抗体滴度测定
43.骆驼血清效价的elisa检测：将制备的omp16按照2μg/ml浓度包被至elisa板中，4℃孵育过夜。以含有0.5％的吐温-20的pbs溶液(pbs’t)为洗液，洗板三次。加入含有2.5％脱脂奶粉的pbs’t溶液，37℃封闭elisa板1h，洗板三次。使用封闭液稀释(未免疫的骆驼血清和三免后的骆驼血清(稀释倍数为103、104、105、106、107、108)，以100μl/孔加入至elisa板中，37℃孵育1h。洗板三次，以1∶2000稀释比例加入兔抗骆驼lgg多抗，37℃孵育1h。洗板三次后使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgg，37℃孵育1h。洗板三次后加入tmb室温显色10min，3m硫酸终止反应，酶标仪读取波长为450nm的吸光度，分析骆驼免疫效果。
44.2.布鲁氏菌a19疫苗株噬菌体展示文库的构建
45.2.1 rna的提取及cdna制备
46.取a19免疫后骆驼外周血淋巴细胞2
×
107，使用takara公司minibestuniversal rna extraction kit提取外周血淋巴细胞总rna，测定rna浓度和纯度。使用thermo fisher公司revertaid first strand cdna synthesis kit，oligo(dt)
18
引物获得cdna，具体反转录体系如下：
47.pbmc总rna 1μg，oligo(dt)
18
1μl，depc h2o加至12μl，混匀后65℃孵育5_min，4℃保存。在上述体系中加入以下的反应组分，具体如下5
×
reaction buffer 4μl，ribolock rnase lnhibitor(20u/μl)1μl，10mm dntp mix 2μl，reveraid m-mμlv rt(200u/μl)1μl。混匀后42℃反转录60min，70℃反应5min，终止反应。反转录产物短期保存于4℃，长期保存于-20或-80℃。
48.2.2巢式pgr扩增vhh基因
49.巢式pcr扩增vhh基因的引物序列如下：
50.第一轮pcr扩增基因大小约700bp，
51.上游引物call0015
’‑
gtcctggctgctcttctacaagg-3’；
52.下游引物call0025
’‑
ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’；
53.第二轮pcr扩增基因大小约400bp，
54.上游引物vhh-for 5
’‑
caggtgcagctgcaggagtctgggggagr-3’；
55.下游引物vhh-rev 5
’‑
ctagtgcggccgctgaggagacggtgacctgggt-3’。
56.使用北京全式金dna polymerase high fidelity进行pcr扩增，反应体系如下：cdna(或第一轮pcr回收产物)2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，hifi buffer ii 5μl，10mm dntp mix 4μl，hifi dna polymerase 1μl，h2o 34μl。
57.pgr反应程序为：94℃预变性5min，变性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃40s，其中第一轮pgr扩增18个循环，第二轮pgr扩增28个循环，最后72℃总延伸10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增情况，并使用胶回收试剂胶回收400bp左右的条带，测定回收产物浓度。
58.2.3vhh噬菌体展示文库的构建
59.(1)pmecs-vhh重组载体的构建
60.将pmecs空载体和回收的vhh基因使用限制性内切酶pst i和not i进行双酶切，具体反应体系如下：10
×
buffer 5μl；quick cut pst i 1μl；quick cut not i 1μl；pmecs(或vhh)1ug；h20 up to 50μl。37℃孵育1h。回收酶切后片段，测定浓度。连接回收载体和目的片段，体系如下：10
×
t4 dna ligase buffer 50μl，pmecs酶切产物6.9ug，vhh 2.3ug，t4 dna ligase 5ug，h20 up to 500μl。16℃连接8h。回收连接产物，并测定回收浓度。
61.(2)tg1感受态细胞的制备
62.挑取tg1单菌落至10ml 2
×
yt培养基中，37℃，200r/min震荡培养至对数生长期。以1∶100比例转接至800ml 2
×
yt培养基中，37℃，200r/min震荡培养约2h至对数生长期，置于冰上30min，待菌液冷却。按照2200
×
g，4℃，离心10min的条件，使用预冷的无菌超纯水和10％甘油各洗涤细胞两次。最后一次离心，弃尽上清，加入1.6ml 10％的甘油重悬细胞，并按照每管100μl量分装保存至-80℃。
63.(3)重组质粒的电转化
64.取100μl tg1感受态与5μl重组质粒混匀，冰上静置5min。将混合物加入至预冷0.1ml电转杯中。调整电转化仪电压至1.8kv，电击细胞。使用2ml预热的soc培养基重悬细胞。将重悬后的细胞取100μl进行梯度稀释，涂布至至氨苄葡萄糖lb平板，37℃培养12-14h计算文库库容。其余细胞直接涂布至氨苄葡萄糖lb平板，37℃培养8-10h，使用50％甘油收集菌苔，冻存于-80℃备用。
65.(4)文库的阳性率及多样性鉴定
66.挑取96个转化子单克隆至lb氨苄培养基，37℃，220r/min震荡培养6h，通过使用引物mp57(5
’‑
ttatgcttccggctcgtatg-3’)和vhh-rev对转化子进行菌液pcr鉴定，计算转化子阳性率。反应体系如下：2
×
rtaq mix 10μl，mp571μl，vhh-rev 1μl，菌液1μl，ddh207μl。反应程序为94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃40s，扩增30个循环，72℃10min，阳性条带约500bp。随机选取10个阳性克隆使用mp57引物测序，比对文库的多样性。
67.3.omp16特异性纳米抗体的淘选
68.(1)噬菌体文库的救援
69.取100μl噬菌体展示文库，接种于100ml 2
×
yt/amp-glu培养基(含有1μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)中，37℃，200r/min培养至对数生长期。加入20个moi剂量的辅助噬菌体m13k07，37℃静置30min。2800g室温离心10min，弃上清，沉淀使用200ml 2
×
yt/amp-kan(含有1μg/ml氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬，37℃，200r/min培养14-16h。3800g，4℃离心30min，收集上清，加入1/5体积的peg/nacl(200g peg6000，146g nacl加水溶解，定容至1l)，混匀，冰上静置6-8h。3800g，4℃离心30min弃上清，加入1ml pbs溶液重悬沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解。12000g 4℃离心15min收集上清，并使用对数生长期的tg1测定救援噬菌体滴度。
70.(2)omp16特异性噬菌体的淘选
71.将纯化的omp16蛋白用pbs缓冲液稀释至200μg/ml，包被至96孔酶标板上，每孔100μl，共包被3个孔。同时设置pbs对照孔，4℃包被过夜。弃去包被液，pbs’t洗板三次后，加入200μl2.5％脱脂奶粉，37℃封闭2h。弃去封闭液，加入2.5％脱脂奶粉稀释的噬菌体5
×
10
10
pfu/孔，37℃孵育2h。弃去噬菌体上清，使用pbs’t洗板10次，pbs洗板5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1m三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1mtris-hcl(ph＝7.4)中和洗脱物。取400μl淘选产物按照文库救援的方法救援淘选噬菌体，同时检测噬菌体滴度。将救援后的噬菌体按照同样的方法进行第二轮、第三轮淘选。第二轮、第三轮的淘选omp16的包被浓度分别为100、50μg/ml。
72.(3)纳米抗体粗提物的制备
73.随机挑取96个最后一轮淘选噬菌体单克隆至100μl lb/amp-glu培养基中，37℃200r/min培养8h。每个克隆取10μl培养物转接至500μl tb培养基中，37℃培养至对数生长期，加入10μl 100mm iptg，继续培养12-14h。12000r/min离心2min，收集菌体，-80℃、37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μl pbs 4℃孵育30min重悬菌体，离心后上清即为粗提物。
74.(4)噬菌体粗提物的的elisa检测
75.将纯化的omp16重组蛋白和对照蛋白gst分别以2μg/ml浓度包被至96孔酶标板中，4℃孵育过夜。使用pbs’t洗涤酶标板4次，加入封闭液，每孔200μl，室温封闭1h。洗板后加入100μl粗提物进行elisa反应，使用小鼠抗ha标签的抗体及hrp标记的山羊抗小鼠的二抗检测目的抗体。使用tmb室温显色10min，3m h2so4终止反应，读取450nm波长的吸光度，分析试验结果。挑取阳性克隆进行序列分析，结果获得一株omp16特异性纳米抗体序列qvqlqesgggmvqpggslrltcvgdgaffklvdmswvrqapgkrlewvasinsggdrtyyadsvkgrftisrdnakntlylqlnslktedtamyhcalgmpraagwdqvgpgtqvtvss(如图5所示)。
76.(5)重组纳米抗体识别omp16蛋白western blot鉴定
77.将布鲁氏菌a19和s2分别培养36h，12000r/min离心2min，沉淀使用pbs重悬后，煮沸灭活，超声破碎，12000r/min，4℃离心10min，去上清进行sds-page及转膜。加入纳米抗体粗提物为一抗，使用小鼠抗ha标签抗体及hrp-山羊抗小鼠lgg为二抗，孵育后ecl发光液显色，验证ellsa阳性纳米抗体粗提物结合布鲁氏菌中omp16的情况。
78.4.辣根过氧化物酶连接的纳米抗体的表达
79.将nba4的基因序列通过pst i和not i两个酶切位点插入至pcmv-hrp表达载体中，构建重组质粒，pgr和测序验证重组质粒的正确性。提取无内毒素的pcmv-nba4-hrp重组质粒。使用lipo8000(碧云天)，12孔板每孔配制如下反应体系：lipo80001.6μl，pcmv-nba4-hrp 1μg，opti-mem 50μl，将质粒转染至融合度为60-70％的hek-293t细胞中，48h后收取上清检测nba4-hrp的表达及活性。
80.5.基于nba4-hrp阻断elisa方法的建立
81.5.1棋盘法确定抗原抗体工作浓度
82.(1)抗原包被：设置omp16浓度为1、2、4μg/ml，以100μl/孔包被至96孔酶标板上，4℃孵育过夜。
83.(2)封闭：pbs’t溶液洗板三次，每孔加入200μl 2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h。
84.(3)孵育一抗：将收集的nba4-hrp表达上清使用封闭液进行2、4、6、8、16、32、64倍梯度稀释，加入至酶标板中，37℃孵育1h。
85.(4)显色和终止。加入100μltmb溶液室温显色10min，50μl 3m h2so4终止反应后，读取450nm吸光值，分析试验结果，确定阻断elisa的抗原抗体使用浓度。
86.5.2基于hrp-nba4阻断elisa检测牛血清布鲁氏菌抗体
87.将omp16稀释至2μg/ml，包被至96孔酶标板中，4℃过夜。加入2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h。按照血清1∶20，hpr-nba41∶4的比例将血清和纳米抗体混合，每孔100μl加入至酶标板中，37℃孵育1h，洗板后加入tmb和3m h2so4显色，检测450nm处吸光度。
88.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。