基于多位点同时敲除的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用与流程

基于多位点同时敲除的crispr/cas9载体及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及基于多位点同时敲除的crispr/cas9载体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.crispr/cas9系统是一种方兴未艾的新型基因编辑技术。与传统的基因编辑技术相比，该技术具有成本低廉、操作简单和编辑效率高等特点。crispr系统首次于1987年被日本科学家发现，其是一段被不同序列隔开的重复dna片段。2002年，研究人员将具有这种特点的序列命名为crisprs。之后的许多研究表明，这种序列与细菌的获得性免疫有关。2012年开始，科学家首次在体外证明了crispr/cas9特异性切割靶基因的功能，并对该系统进行改造和优化，使用sgrna代替了crrna和tracrrna，使crispr系统更加简单方便，改造后的系统只需要sgrna和cas9蛋白两部分即可实现对特定靶基因的切割。目前，crispr/cas9系统以其操作简单、编辑效率高、成本低的特点在动植物基因敲除与编辑中得到了广泛的利用，大大降低了基因编辑的门槛。
3.随着对crispr/cas9系统的研究不断深入，科学家们已不再满足于对单基因的编辑，同时靶向多个dna序列、多余敲除多个基因或染色特片段的多重基因组编辑技术，已经引起科学界的广泛关注并成为当今基因编辑技术的研究热点之一。目前，许多基于质粒的crispr/cas9表达系统已经构建完成，但这些系统只适用于单个sgrna的转染。当同时使用多个载体靶向多个基因座时，由于拷贝数的差异，共转染可能导致表达水平有变化。因此，科学家们尝试先将sgrna表达框装载靶点序列，然后将多个装载后的sgrna整合在同一个载体中，从而实现多个sgrna表达框的共同表达。比较上述多sgrna载体的构建我们可以发现，这些方法所能实现的sgrna串联受限于其相关引物设计门槛较高，且其多次整合的方法也较为繁琐。
4.因此，不依赖多次合成以相对简便的步骤实现sgrna多重表达的方案仍然有待进一步探索。


技术实现要素：

5.发明目的：为了解决现有技术中存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供了pcmv-cas9-4xsgrna表达载体。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了基于多位点同时敲除的crispr/cas9载体及其制备方法和应用。
7.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了pcmv-cas9-4xsgrna表达载体，所述表达载体包含cas9蛋白、egfp标记和4个表达sgrna功能域的表达载体。
8.其中，所述表达载体核苷酸序列如seq id no：2所示。
9.本发明内容还包括基于多位点同时敲除的crispr/cas9载体，所述多位点同时敲
除的crispr/cas9载体是通过将多对靶向靶点基因的双链dna片段重组至pcmv-cas9-4xsgrna载体中获得。
10.本发明内容还包括基于多位点同时敲除的crispr/cas9载体的构建方法，包括以下步骤：
11.1)构建pcmv-cas9-4xsgrna表达载体，所述的载体核苷酸序列如seq id no：2所示；
12.2)设计多对打靶位点，依据打靶位点合成多对用于合成靶向sgrna的oligo dna，将每对oligo dna退火合成双链dna；
13.3)使用酶切连接的方法将多对靶向靶点基因的双链dna片段重组至pcmv-cas9-4xsgrna载体中，即合成靶向于多个基因靶点的单个载体。
14.其中，所述多位点为4个位点，所述步骤2)中设计4个打靶位点，所述4个打靶位点合成4对oligo dna，4对oligo dna退火合成双链dna1～4，作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，基于crispr/cas9规律与u6启动子规律，设计用于实现真核生物基因敲除的打靶位点，共计23或24个核苷酸，遵循以下规律：5
’‑
g(n)nnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’，其5’端须为g，或在5’端添加g。
15.在此基础上，构建的靶向于敲除位点的oligo dna对，分别具有以下规律：
16.正向oligo dna 1，5
’‑
caccg(n)nnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’；
17.反向oligo dna 1，5
’‑
aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(n)c-3’；
18.正向oligo dna 2，5
’‑
caccg(n)nnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’；
19.反向oligo dna2，5
’‑
aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(n)c-3’；
20.正向oligo dna 3，5
’‑
caccg(n)nnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’；
21.反向oligo dna 3，5
’‑
aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(n)c-3’；
22.正向oligo dna 4，5
’‑
accg(n)nnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’；
23.反向oligo dna 4，5
’‑
aacnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(n)c-3’。其中，“(n)nnnnnnnnnnnnnnnnnnn”分别为打靶位点1、2、3和4。
24.其中，作为优选的技术方案之一，所述步骤3)中的具体方法为：将质粒pcmv-cas9-4xsgrna使用bbs i酶切，连接退火后的双链dna 1，即获得重组质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1；将质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1使用bsa i酶切，连接退火后的双链dna 2，即获得重组质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1-dna2；将质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1-dna2使用bsmb i酶切，连接退火后的双链dna 3，即获得重组质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1-dna2-dna3；将质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1-dna2-dna3使用sap i酶切，连接退火后的双链dna 4，即获得重组质粒pcmv-cas9-4xsgrna-dna1-dna2-dna3-dna4。
25.本发明内容还包括所述的载体在构建用于实现真核生物多个基因同时敲除的细胞系中的应用。
26.其中，将所述载体转染真核生物细胞，筛选，即得靶点敲除的细胞系。
27.其中，所述转染方法包括但不仅限于脂质体转染或电转染等。
28.本发明的设计原理和思路：本发明先将4个包含bbs i限制性内切酶的sgrna表达框串联，从而实现sgrna在载体上的共同表达，但其在合成时由于酶切位点的非特异性，会导致酶切效率低、产物错配率高、连接阳性率低等问题。因此，我们将第2、3、4个sgrna表达
框中的限制性内切酶bbs i分别替换为同为iii型限制性内切酶的bsa i、bsmb i和sap i，且这三种酶在编码cas9蛋白和相关标记蛋白的dna序列中不存在对应酶切位点，从而实现了每个sgrna表达框都存在特异的限制性内切酶，进而可以实现串联的sgrna表达框的精确编辑，提高后续靶点插入的阳性率。
29.有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明公开了一种真核生物基于crispr/cas9系统的四个位点同时敲除的sgrna载体及其构建的方法，该载体整合了cas9表达框和四个可以通过不同限制性内切酶酶切重组的sgrna，能够高效简便地在众多真核生物细胞中实现至多四个sgrna同时发挥作用，实现实现两个基因四个靶点的敲除或同时敲除四个基因四个靶点。目前，许多基于质粒的crispr/cas9表达系统已经构建完成，但这些系统只适用于单个sgrna的转染，在用作多于多个靶基因位点的敲除时，常同时使用多个载体靶向多个基因座或同一细胞进行多次转染，前者由于拷贝数的差异，共转染可能导致表达水平有变化，后者实验步骤繁琐，且对细胞伤害较大。本发明与传统的多载体共转染和多载体多次转染相比，具有不同靶点表达量接近、细胞操作简便的优势。
附图说明
30.图1、pcmv-cas9-4xsgrna载体结构图谱；
31.图2、4个sgrna串联方式以及鉴定引物ver-f、sirt3-oligo1-r、sirt3-oligo2-r、plin1-oligo1-r与plin1-oligo2-r分布示意图。
32.图3、pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1载体阳性菌液的pcr电泳鉴定，m泳道为dl2000 dna marker，泳道1、2、4鉴定为阳性克隆，泳道3鉴定为阴性克隆；
33.图4、pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2载体阳性菌液的pcr电泳鉴定，m泳道为dl2000 dna marker，泳道3鉴定为阳性克隆，泳道1、2、4鉴定为阴性克隆；
34.图5、pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2-plin1-1载体阳性菌液的pcr电泳鉴定，m泳道为dl2000 dna marker，泳道1、4鉴定为阳性克隆，泳道2、3鉴定为阴性克隆；
35.图6、pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2-plin1-1-2载体阳性菌液的pcr电泳鉴定，m泳道为dl2000 dna marker，泳道2、3鉴定为阳性克隆，泳道1、4鉴定为阴性克隆；
36.图7、s2p2组敲除后plin1基因区域典型测序结果；
37.图8、s2p2组敲除后sirt3基因区域典型测序结果；
38.图9、敲除后plin1基因蛋白表达情况western blot结果图，con组为pk15细胞系转染puc19质粒，s2p2组为pk15细胞系转染pcas9-s12-p12载体，p23组为pk15细胞系共转染pplin1-ko1、pplin1-ko2；
39.图10、敲除后plin1基因蛋白表达情况western blot灰度值分析结果，con组为pk15细胞系转染puc19质粒，s2p2为pk15细胞系转染pcas9-s12-p12载体，p23组为pk15细胞系共转染pplin1-ko1、pplin1-ko2；
40.图11、敲除后srit3基因蛋白表达情况westernblot结果图，con组为pk15细胞系转染puc19质粒，s2p2组为pk15细胞系转染pcas9-s12-p12载体，s23组为pk15细胞系共转染psirt3-ko1、psirt3-ko2。
41.图12、敲除后sirt3基因蛋白表达情况western blot灰度值分析结果，con组为pk15细胞系转染puc19质粒，s2p2为pk15细胞系转染pcas9-s12-p12载体，s23组为pk15细胞
系共转染psirt3-ko1、psirt3-ko2。
具体实施方式
42.下面结合附图对本发明实施方案作进一步详细的说明，但本发明所保护的范围不限于此。
43.以下凡是未注明的具体实验方法，都按照公认的实验方法与条件实施，例如，按照试剂耗材厂商提供的说明书操作，或者按照经典实验书籍《分子克隆实验指南》(第三版，j.萨姆布鲁克等著)来完成实验。
44.本实施例中的生物材料来源：puc19质粒、px458质粒购自淼灵生物科技有限公司；限制性内切酶sph i、bbs i、bsa i、bsmb i和sap i、t4连接酶均购自neb公司；pk15猪肾细胞系购自购自中国科学院细胞库，为普通市售产品；dna退火缓冲液(5x)购自solarbio有限公司；dh5α感受态细胞、质粒小提试剂盒、血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司；胶回收试剂盒takara minibest agarose gel dna extraction kit ver.4.0、pcr试剂takara ex taq dna polymerase购自宝日医生物技术(北京)有限公司；lipofectamine 3000脂质体转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；去内毒素质粒提取试剂盒endo-free plasmid mini kit ii购自omega公司。测序、序列合成与连接皆交由上海生工生物工程有限公司。
45.实施例1 4靶点基因敲除质粒pcmv-cas9-4xsgrna的合成酶切重组
46.1、设计4个具有不同iii型限制性内切酶的sgrna表达框，其分别可以由限制性内切酶bbs i、bsa i、bsmb i和sap i酶切，并将4个表达框串联，串联后的核苷酸序列如seq id no：1，使用酶zra i和afl iii切割puc19载体，包含4个sgrna表达框、cas9蛋白和相关标记蛋白的剩余序列交由生物公司合成并连接至puc19载体得到连接产物，得到的连接产物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
47.2、将连接产物用100μl dh5α感受态细胞(pfu≥108)进行转化，然后涂布于含有amp(50μg/ml)(购自solarbio公司，货号：a8180)的lb固体培养基，37℃倒置培养12h得到转化子。使用10μl无菌移液器吸头挑取菌落，加入含有amp(50μg/ml)的200ml灭菌液体lb培养基中，将菌液放入恒温摇床，37℃180rpm培养14-16h。使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，将质粒命名为pcmv-cas9-4xsgrna。
48.实施例2使用4靶点敲除质粒载体敲除pk15细胞系的sirt3基因片段和plin1基因片段
49.1、构建靶向pk15猪肾细胞系的sirt3基因片段和plin1基因片段的4sgrna载体。
50.(1)使用在线sgrna设计工具对sirt3基因第三外显子和plin1基因第四外显子分别设计二对20bp左右的oligo dna，其碱基第一位为g，在其中3对oligo dna的5’端分别加上cacc与aaac用于与bbsi酶切后的载体部分互补，在另1对oligo dna的5’端分别加上acc与aac用于与sap i酶切后的载体部分互补。对pcmv-cas9-4xsgrna质粒的串联sgrna上游设计一条鉴定引物iden-f。将设计好的序列交由生物公司合成，纯化方式为page。4对oligodna序列和鉴定上游引物idne-f的核苷酸序列如下表所示。
[0051][0052]
(2)将合成后的4对oligo dna退火形成双链dna，反应体系如下：
[0053][0054]
将配置好的上述体系混合于pcr管内，在pcr仪中95℃孵育3min，孵育后以每分钟1.5℃降温至25℃。将退火后的4组双链dna分别命名为sirt3-sgrna1、sirt3-sgrna2、plin1-sgrna1和plin1-sgrna2。
[0055]
(3)使用bbs i酶切割pcmv-cas9-4xsgrna，体系如下：
[0056][0057]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，37℃恒温水浴过夜。
[0058]
(4)将酶切产物进行0.7％凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收10000bp左右条带并纯化，将纯化产物命名为pcmv-cas9-4xsgrna-line，与sirt3-sgrna1连接，连接体系如下：
[0059][0060]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，室温孵育30min。
[0061]
(5)将连接产物转化至感受态大肠杆菌dh5α中，然后涂布于含有amp(50μg/ml)的lb固体培养基，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至含有3ml含amp的lb液体培养基中，命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1，将其置于恒温摇床中，在180rpm，37℃的条件下培养3-4h。取200μl培养后菌液用作鉴定pcr模板。pcr鉴定体系如下：
[0062][0063]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，放入pcr仪中进行pcr反应，反应程序为：98℃10s；68℃30s，进行35个循环。将pcr产物进行凝胶电泳，电泳结果如图3所示，按照图2中引物iden-f与sirt3-oligo1-r所示，阳性菌液应在300bp左右出现条带，则泳道1、2、4所对应菌液为阳性菌液。
[0064]
(6)吸取1ml阳性菌液加入10ml含有amp抗性的lb培养基中，并将其置于恒温摇床中，37℃180rpm扩大培养10-12h。使用天根质粒小提试剂盒提取阳性菌液中的质粒。
[0065]
(7)使用bbs i酶切割pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1，体系如下：
[0066][0067]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，37℃恒温水浴过夜。
[0068]
(8)将酶切产物进行0.7％凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收10000bp左右条带并纯化。将纯化产物命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-line，与sirt3-sgrna2连接，连接体系如下：
[0069][0070][0071]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，室温孵育30min。
[0072]
(9)将连接产物转化至感受态大肠杆菌dh5α中，然后涂布于含有amp(50μg/ml)的lb固体培养基，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至含有3ml含amp的lb液体培养基中，命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2，将其置于恒温摇床中，在180rpm，37℃的条件下培养3-4h。取200μl培养后菌液用作鉴定pcr模板。pcr鉴定体系如下：
[0073][0074]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，放入pcr仪中进行pcr反应，反应程序为：98
℃10s，68℃1min，进行35个循环。将pcr产物进行凝胶电泳，电泳结果如图4所示，按照图2中引物iden-f与sirt3-oligo2-r所示，阳性菌液应在700bp左右出现条带，则泳道3所对应菌液为阳性菌液。
[0075]
(10)吸取1ml阳性菌液加入10ml含有amp抗性的lb培养基中，并将其置于恒温摇床中，37℃180rpm扩大培养10-12h。使用天根质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒。
[0076]
(11)使用bsmb i酶切割pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1，体系如下：
[0077][0078][0079]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，37℃恒温水浴过夜。
[0080]
(12)将酶切产物进行0.7％凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收10000bp左右条带并纯化。将纯化产物命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2-line，与plin1-sgrna1连接，连接体系如下：
[0081][0082]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，室温孵育30min。
[0083]
(13)将连接产物转化至感受态大肠杆菌dh5d中，然后涂布于含有amp(50μg/ml)的lb固体培养基，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至含有3ml含amp的lb液体培养基中，命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2-plin1-1，将其置于恒温摇床中，在180rpm，37℃的条件下培养3-4h。取200μl培养后菌液用作鉴定pcr模板。pcr鉴定体系如下：
[0084][0085]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，放入pcr仪中进行pcr反应，反应程序为：98℃10s，68℃90s，进行35个循环。将pcr产物进行凝胶电泳，电泳结果如图5所示。按照图2中引物iden-f与plinl-oligo1-r所示，阳性菌液应在1200bp左右出现条带，则泳道1、4所对应菌液为阳性菌液。
[0086]
(14)使用bsmb i酶切割pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1，体系如下：
[0087][0088]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，37℃恒温水浴过夜。
[0089]
(15)将酶切产物进行0.7％凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收10000bp左右条带并纯化。将纯化产物命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2-plin1-1-line，与plin1-sgrna1连接，连接体系如下：
[0090][0091]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，室温孵育30min。
[0092]
(16)将连接产物转化至感受态大肠杆菌dh5α中，然后涂布于含有amp(50μg/ml)的lb固体培养基，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至含有3ml含amp的lb液体培养基中，命名为pcmv-cas9-4xsgrna-sirt3-1-2-plin1-1-2，将其置于恒温摇床中，在180rpm，37℃的条件下培养3-4h。取200μl培养后菌液用作鉴定pcr模板。pcr鉴定体系如下：
[0093][0094][0095]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，放入pcr仪中进行pcr反应，反应程序为：98℃10s，68℃2min，进行35个循环。将pcr产物进行凝胶电泳，电泳结果如图6所示。按照图2中引物iden-f与plin1-oligo2-r所示，阳性菌液应在1600bp左右出现条带，则泳道2、3所对应菌液为阳性菌液。
[0096]
(17)吸取阳性菌液，混合于200ml含amp抗性的液体lb培养基中，封口后至于恒温摇床，在37℃180rpm的条件下培养14～16h。使用去内毒素质粒提取试剂盒endo-free plasmid mini kit ii提取菌液中的质粒，命名为pcas9-s12-p12。
[0097]
2、pk15的sirt3与plin1基因片段敲除细胞系的获得
[0098]
(1)将pk15细胞系接种至6孔板中，每个孔接种1.5-2
×
105个细胞。将6孔板放置于37摄氏度5％co2浓度的细胞培养箱中培养12h左右，使细胞在转染前汇合度达到70-90％。按照lipofectamine 3000说明书的方法，将pcas9-s12-p12质粒转染6孔板中的细胞。24h后弃去含转染试剂的细胞培养基。
[0099]
(2)使用流式细胞仪分选富集表达egfp荧光的转染后细胞，成功构建sirt3与plin1基因片段敲除的细胞系。
[0100]
3、sirt3与plin1基因片段敲除细胞系敲除效率的检测。
[0101]
(1)使用bbsi限制性内切酶酶切px458载体，体系如下：
[0102][0103]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，37℃恒温水浴过夜。将酶切产物进行0.7％凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收10000bp左右条带并纯化。将回收产物分别与sirt3-sgrna1、sirt3-sgrna2、plin1-sgrna1、plin1-sgrna2连接，连接体系如下：
[0104][0105]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，室温孵育30min。将连接产物转化至感受态大肠杆菌dh5α中，然后涂布于含有amp(50μg/ml)的lb固体培养基，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至含有3ml含amp的lb液体培养基中，分别命名为psirt3-ko1、psirt3-ko2、pplin1-ko1、pplin1-ko2，将其置于恒温摇床中，在180rpm，37℃的条件下培养3-4h。取200μl培养后菌液用作鉴定pcr模板。pcr鉴定体系如下：
[0106][0107]
将配置好的上述试剂混合于pcr管内，放入pcr仪中进行pcr反应，反应程序为：98
℃10s，68℃2min，进行35个循环。将pcr产物进行凝胶电泳。吸取阳性菌液，混合于200ml含amp抗性的液体lb培养基中，封口后至于恒温摇床，在37℃180rpm的条件下培养14～16h。使用去内毒素质粒提取试剂盒endo-free plasmid mini kit ii提取菌液中的质粒，分别命名为psirt3-ko1、psirt3-ko2、pplin1-ko1、pplin1-ko2。
[0108]
(2)将pk15细胞分组，分别分为con组、s2p2组、s23组、p23组，con组与s2p2组分别转染puc19载体、pcas9-s12-p12载体，s23组进行psirt3-ko1、psirt3-ko2载体共转染，p23组进行进行pplin1-ko1、pplin1-ko2载体共转染。
[0109]
(3)提取细胞系的dna，使用引物分别扩增sirt3与plin1基因，引物对序列分别如下表所示。
[0110][0111]
(4)将扩增后的基因使用纯化试剂盒纯化，将纯化后的pcr产物连接至pgem-t载体。将连接产物转化至dh5α大肠杆菌感受态细胞。通过蓝白斑实验筛选出成功连接的菌落，挑取后置于2ml含有amp抗性的lb液体培养基中，置于恒温摇床中，于37℃180rpm的条件下培养2-4h。将培养后的菌液分装并送交生物公司测序。s2p2组部分测序结果如图7、8所示，其结果显示sirt3与plin1基因位点处发生不同程度的突变与缺失。通过计算各组基因突变或缺失的样本的比率计算各组dna突变率，s2p2组sirt3基因突变率为33％，plin1基因突变率33％；s23组sift3基因突变率为26％；p23组plin1基因突变率为24％。与使用共转染的方式相比，靶向于四靶点的单载体转染后其基因突变效率相对较高，且其同时实现了两种基因共四个靶点的敲除。
[0112]
(5)提取各组细胞系的蛋白，使用western blot的方法检测细胞系中plin1与sirt3基因的表达差异。wb显影结果如图9、11所示，将其进行灰度值分析，其结果如图10、12所示。结果显示，s2p2组的sirt3与plin1基因与con组相比，其表达量均发生不同程度的降低。s2p2组与s23组的sirt3基因表达量相比，没有显著区别；s2p2组与p23组的sirt3基因表达量相比，没有显著区别。s2p2组在sirt3基因敲除的同时，实现了plin1基因的敲除，相较于传统转染方式相比具有一定的优势。