用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干PCR试剂及试剂盒的制作方法

用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂及试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(h.pylori，hp)是一种革兰阴性、微需氧、弯曲状杆菌，主要寄居在人体胃部。幽门螺杆菌感染与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等发生发展密切相关，因此引起临床的广泛关注。
3.大部分成人hp感染在儿童期获得，大多发生在儿童早期，感染后一般难以自发清除而导致终生感染。因此，对于hp的筛查以及治疗研究对于降低hp的感染率，提高hp的根治率非常重要。
4.目前对于hp的筛查主要有以下几种手段：1、分离培养鉴定：幽门螺杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽门螺杆菌培养需要微需氧条件，对营养条件要求苛刻，因此检出率极低，作为常规诊断手段不易推广,且幽门螺杆菌培养需要一定的时间,不利于快速诊断。2、尿素酶依赖性试验(尿素呼气试验)：根据标志物不同分为13c呼吸试验及14c呼吸试验，临床应用广泛。缺点是费用高、易受抑菌药物和抑酸药物的影响、敏感度低。3、rut以及免疫组化染色，这两种方法都需要下胃镜取胃粘膜，对样品进行染色分析，该方法受幽门螺杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测，且给患者带来非常大的痛苦，尤其是对老人和儿童。4、免疫学检查：检测血清中或唾液和尿液中抗体(igg) 或直接检测粪便中幽门螺杆菌的抗原成分。灵敏度非常低，不能反映现症感染。5、核酸分析法：包括测序、pcr、寡核苷酸探针杂交等，但是这些检查方法检测位点少，特异性低，通量小，成本较高，且不能做定量分析。
5.通过荧光pcr法设计检测幽门螺杆菌的特异性引物及探针，直接检测幽门螺杆菌核酸，灵敏度高、特异性好，操作简单且通过多重荧光pcr技术，能够在同一反应中检测幽门螺杆菌并对其进行定量分析。荧光pcr反应的必要条件包括：荧光pcr反应缓冲系统、引物、探针、taq酶、dntp，需要低温运输和保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果，且配制过程繁琐，配制误差较大、反应重复性不好，产品储存及运输的成本较高。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，以解决荧光pcr反应试剂配制过程繁琐，配制误差较大、反应重复性不好，产品储存及运输成本较高的问题。
7.本发明的第一方面，提供了一种用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，所述冻干pcr试剂包括上游引物、下游引物、第一探针和第二探针；其中，所述上游引物序列如seq id no.1所示，所述下游引物序列如seq id no.2所示，所述第一探针序列如seq id no.3所示，所述第二探针序列如seq id no.4所示。
8.在另一优选例中，所述第一探针和所述第二探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自下组：fam、vic、cy5、和texas red；所述淬灭基团选自下组：bhq1、bhq2、bhq3、和tamra。
9.在另一优选例中，所述冻干pcr试剂还包括冻干保护剂。
10.在另一优选例中，所述冻干保护剂包括选自下组的一种或多种组分：海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、棉子糖、右旋糖酐、甘油、dtt、proclin 300、甲酰胺、和羟丙基-β-环糊精。
11.在另一优选例中，所述冻干保护剂由海藻糖、棉子糖和蔗糖组成。
12.在另一优选例中，所述冻干保护剂包括：
13.海藻糖
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2-10重量份，
14.棉子糖
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2-10重量份，和
15.蔗糖
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2-10重量份。
16.在另一优选例中，所述冻干保护剂包括：
17.海藻糖
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5重量份，
18.棉子糖
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5重量份，和
19.蔗糖
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5重量份。
20.在另一优选例中，所述冻干pcr试剂还包括选自下组的一种或多种组分： taq dna聚合酶、镁离子、氯化钾、非离子型去污剂、和tris-hcl。
21.在另一优选例中，当使用所述冻干pcr试剂配制成pcr反应体系时，所述 pcr反应体系中各组分含量为：
[0022][0023]
所述pcr反应体系的体积以25μl计。
[0024]
在另一优选例中，当使用所述冻干pcr试剂配制成pcr反应体系时，所述 pcr反应体系中各组分含量为：
[0025]
[0026][0027]
所述pcr反应体系的体积以25μl计。
[0028]
进一步地，所述非离子型去污剂包括选自下组的一种或多种组分：曲拉通 x-100、吐温20、和np40。
[0029]
进一步地，所述非离子型去污剂为曲拉通x-100。
[0030]
进一步地，所述冻干pcr试剂通过如下冻干程序制备：-50℃，2.5h；-50℃， 0.2mbar，5h；0℃，0.2mbar，0.5h；10℃，0.2mbar，0.5h；20℃，0.2mbar， 1h；20℃，2h。
[0031]
本发明的第二方面，提供了一种用于幽门螺杆菌核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的冻干pcr试剂。
[0032]
本发明的第三方面，提供了一种制备用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr 试剂的方法，所述方法包括步骤：
[0033]
(1)配制液体pcr试剂
[0034]
所述液体pcr试剂的配比为每25μl的液体pcr试剂中包括：
[0035][0036]
(2)冻干
[0037]
将步骤(1)提供的液体pcr试剂冻干，从而获得所述冻干pcr试剂。
[0038]
在另一优选例中，所述步骤(2)中，冻干程序为：-50℃，2.5h；-50℃， 0.2mbar，5h；0℃，0.2mbar，0.5h；10℃，0.2mbar，0.5h；20℃，0.2mbar， 1h；20℃，2h。
[0039]
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0040]
图1为不同引物探针体系的扩增曲线；
[0041]
图2显示了不同冻干保护剂配方制备的冻干粉形态；
[0042]
图3显示了胃黏膜组织提取核酸样品pcr检测图；
[0043]
图4显示了pcr试剂冻干前后性能比较。
具体实施方式
[0044]
本发明提供了一种用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂及试剂盒，具体地，本发明经过大量的研究获得了灵敏度极高的检测幽门螺杆菌核酸的pcr 扩增试剂(引物和探针组合)，进一步的通过对冻干试剂的研究，获得了适合该pcr扩增试剂的冻干体系，从而制备获得了冻干pcr试剂，解决了荧光pcr 反应试剂配制过程繁琐，配制误差较大，反应重复性不好，产品储存及运输的成本较高的问题。
[0045]
在一个优选地实施方式中，本发明提供了一种用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，包括taq dna聚合酶、镁离子、氯化钾、非离子型去污剂、 tris-hcl、冻干保护剂、寡聚核苷酸上游引物和寡聚核苷酸下游引物和寡聚核苷酸荧光探针，寡聚核苷酸上游引物序列为5
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cgtaggagtctggaccgtgt-3’(seqid no：1)，寡聚核苷酸下游引物序列为5
’‑
cataggtcatgtgcctcttagtttgg-3
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(seq id no：2)，寡聚核苷酸荧光探针序列1为5
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agccattggaaacgatgattaataccagatactc-3’(seq id no：3)，寡聚核苷酸荧光探针序列2为5
’‑
ctcaggccggatacccgtcatagc-3’(seq id no：4)。
[0046]
进一步地，寡聚核苷酸荧光探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团，荧光基团为fam、vic、cy5、texas red中的一种或其他具有发光特性的荧光基团，淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3、tamra中的一种或其他具有荧光淬灭功能的化学基团。优选地，寡聚核苷酸荧光探针序列1和寡聚核苷酸荧光探针序列2标记有相同的荧光基团(如fam)。更优选地，寡聚核苷酸荧光探针序列1和寡聚核苷酸荧光探针序列2标记有相同的荧光淬灭基团(如bhq1)。
[0047]
进一步地，每管冻干pcr试剂包括：0.1μm～1μm寡聚核苷酸上游引物、 0.1μm～1μm寡聚核苷酸下游引物、0.1μm～1μm寡聚核苷酸荧光探针1、0.1 μm～1μm寡聚核苷酸荧光探针2、0.1～1单位taq dna聚合酶和m/v为1％～ 10％的冻干保护剂、1～5mm镁离子、10～100mm氯化钾、0～1％(m/v)非离子型去污剂、10-100mm tris-hcl。
[0048]
进一步地，每管冻干pcr试剂包括：0.2μm寡聚核苷酸上游引物、0.2μm 寡聚核苷酸下游引物、0.1μm寡聚核苷酸荧光探针1、0.1μm寡聚核苷酸荧光探针2、0.2单位taq dna聚合酶和m/v为5％的冻干保护剂、3mm镁离子、40mm 氯化钾、0.05％(m/v)非离子型去污剂、50mm tris-hcl。
[0049]
进一步地，冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、棉子糖、右旋糖酐、甘油、dtt、proclin 300、甲酰胺、羟丙基-β-环糊精等中的一种或多种的混合。
[0050]
进一步地，冻干保护剂为2％-10％海藻糖，2％-10％棉子糖，2％-10％蔗糖。
[0051]
进一步地，冻干保护剂为5％海藻糖，5％棉子糖，5％蔗糖。
[0052]
进一步地，非离子型去污剂为曲拉通x-100、吐温20、np40等中的一种或多种组合。
[0053]
进一步地，非离子型去污剂为曲拉通x-100。
[0054]
进一步地，用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂通过如下冻干程序制备：-50℃，2.5h；-50℃，0.2mbar，5h；0℃，0.2mbar，0.5h；10℃，0.2mbar， 0.5h；20℃，0.2mbar，1h；20℃，2h。
[0055]
本发明以幽门螺杆菌16s rna基因保守序列为靶标设计寡聚核苷酸引物和寡聚核苷酸荧光探针，可特异性扩增幽门螺杆菌16s rna靶序列，从胃粘膜组织提取核酸中鉴定出幽门螺杆菌，且使用双探针法，提高检测灵敏度和阳性检出率。
[0056]
本发明优化筛选出合适的冻干保护剂配方制备冻干pcr试剂，使得其中含有的荧
光pcr反应缓冲系统、寡聚核苷酸引物、寡聚核苷酸探针、taq dna聚合酶、dntp能在常温甚至高温下稳定共存，所制备的冻干pcr试剂在常温运输后仍保持其检测效果。使得荧光pcr试剂的生产、运输、存储成本大大降低的同时，可以减少使用操作步骤、提高试剂稳定性，延长保质期和增加样品体积的灵活性，提高检测灵敏度。有助于幽门螺杆菌检测用荧光pcr试剂的全球销售和运输。
[0057]
本发明的主要优点在于：
[0058]
(1)本发明的试剂盒具有极高的检测灵敏度和阳性检出率。
[0059]
(2)本发明优化筛选出合适的冻干保护剂配方，使得制备的幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂形态稳定，冻干试剂扩增性能与液体扩增试剂无差别。
[0060]
(3)本发明制备的幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，其中含有的荧光pcr反应缓冲系统、寡聚核苷酸引物、寡聚核苷酸探针、taq dna聚合酶、 dntp能在常温甚至高温下稳定共存，所制备的冻干pcr试剂在常温运输后仍保持其检测效果。
[0061]
(4)本发明制备的幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，使得幽门螺杆菌核酸检测的pcr试剂的生产、运输、存储成本大大降低的同时，可以减少使用操作步骤、提高试剂稳定性，延长保质期和增加样品体积的灵活性，提高检测灵敏度。有助于幽门螺杆菌检测用荧光pcr试剂的全球销售和运输。
[0062]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0063]
实施例1pcr扩增体系的建立
[0064]
单探针检测体系按下表配制，分别配制两个单探针检测体系：寡聚核苷酸荧光探针1和寡聚核苷酸荧光探针2：
[0065][0066][0067]
双探针检测体系按下表配制：
[0068]
组分用量(μl)终浓度寡聚核苷酸上游引物(10μm)0.50.2μm
寡聚核苷酸下游引物(10μm)0.50.2μm寡聚核苷酸荧光探针1(10μm)0.250.1μm寡聚核苷酸荧光探针2(10μm)0.250.1μmtaq dna聚合酶(5单位)10.2单位镁离子(100mm)0.753mm氯化钾(1m)140mm非离子型去污剂(1％)1.250.05％tris-hcl(100mm)12.550mmddh2o2 total20 [0069]
体系配制完成，每个反应孔加入5μl模板，混合成25μl反应体系，按如下程序进行pcr扩增反应：95℃，1分钟；95℃，5秒钟，60℃，30秒钟，40 个循环，fam通道检测荧光。
[0070]
如图1所示：同一样本分别用单探针—寡聚核苷酸荧光探针1和寡聚核苷酸荧光探针2检测的ct值和荧光值基本一样；而用双探针—寡聚核苷酸荧光探针1和寡聚核苷酸荧光探针2组合检测的ct值小、荧光值高。
[0071]
实施例2冻干体系的建立
[0072]
不同冻干保护剂配方制备检测幽门螺杆菌的冻干pcr试剂
[0073]
冻干保护剂配方组合如下表：
[0074][0075]
按冻干保护剂配方，分别配制冻干保护剂母液：
[0076]
配方1：50％(m/v)海藻糖；
[0077]
配方2：50％(m/v)(海藻糖 蔗糖)；
[0078]
配方3：50％(m/v)(海藻糖 棉子糖)；
[0079]
配方4：50％(m/v)(海藻糖 蔗糖 棉子糖)。
[0080]
其中，m/v指质量浓度，表示每单位体积中质量是多少，单位为“kg/l”。
[0081]
用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂配制如下：
[0082]
组分用量(μl)终浓度寡聚核苷酸上游引物(10μm)0.50.2μm寡聚核苷酸下游引物(10μm)0.50.2μm寡聚核苷酸荧光探针1(10μm)0.250.1μm寡聚核苷酸荧光探针2(10μm)0.250.1μmtaq dna聚合酶(5单位)12.5单位镁离子(100mm)0.753mm
氯化钾(1m)140mm非离子型去污剂(1％)1.250.05％tris-hcl(100mm)12.550mm冻干保护剂母液(50％)2.55％ddh2o4.5 total25 [0083]
将上述试剂混合，混合均匀后，制得终反应体积为25μl的pcr试剂。
[0084]
根据需求配制所需体积混合液(25μl
×
n)，混合均匀后分装到8联排pcr管中，不盖盖放入冻干机制备冻干pcr试剂，按以下程序进行：-50℃，2.5h；-50℃，0.2mbar，5h；0℃，0.2mbar，0.5h；10℃，0.2mbar，0.5h；20℃，0.2mbar，1h；20℃，2h。
[0085]
冻干结束后，在氮气环境下封装冻干pcr试剂，制得用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂。
[0086]
对各冻干保护剂配方制备的冻干pcr试剂的形态、形态维持时间(空气中)、粉末性能及复溶性进行比较如下：
[0087][0088]
注： ：复溶时间长，需震荡； ：复溶时间长，不需震荡； ：加水即复溶。
[0089]
冻干保护剂配方4制备的冻干pcr试剂形态好且形态维持时间长，不含残余水分能碾成粉末，复溶性好，可以作为制备幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂的冻干保护剂配方。
[0090]
实施例3幽门螺杆菌的检测
[0091]
准备了一份幽门螺杆菌感染和一份正常人的胃粘膜病理切片，用ffpedna/rnakit(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)提取dna，备用。
[0092]
本实施例采用的冻干pcr试剂为实施例2中用配方4制备的用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂。
[0093]
取3管冻干pcr试剂，分别加入25μl提取的dna样本或无菌水对照，复溶后总体积为25μl，震荡混匀，使冻干粉完全溶解。
[0094]
按如下程序进行pcr扩增反应：95℃，1分钟；95℃，5秒钟，60℃，30秒钟，40个循环，fam通道检测荧光。
[0095]
如图3所示：空白对照和阴性对照无检测ct，且扩增曲线呈水平扩增曲线；幽门螺杆菌感染样本有检测ct值，扩增曲线呈典型的“s”扩增曲线，结合引物探针设计原理，表明实施例2制得的用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂能够对幽门螺杆菌进行有效、特异
的检测。
[0096]
实施例4比较冻干前后pcr试剂检测性能变化
[0097]
本实施例采用的冻干pcr试剂为实施例2中用配方4制备的用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，对照试剂为冻干前液体pcr试剂。
[0098]
本实施例所用幽门螺杆菌样本为实施例3中幽门螺杆菌感染的胃粘膜病理切片提取dna。
[0099]
检测方法同实施例3，检测结果如图4所示：使用5％海藻糖，5％棉子糖， 5％蔗糖作为冻干保护剂制备的用于幽门螺杆菌核酸检测的冻干pcr试剂，冻干前后pcr试剂检测性能基本无变化。
[0100]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。