一种鹿血磷脂的提取方法及应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鹿血磷脂的提取方法及应用。


背景技术：

2.鹿血，是指鹿科动物梅花鹿或马鹿的血液，分为膛血和茸血两种。作为传统名贵中药，鹿血距今已经有接近2000年的药用历史，其药用价值最早记录见于唐代孙思邈《千金翼方
·
食治》中，到了明代李时珍将其功效更具体详细阐述于《本草纲目》中，记载其有大补虚损，行血祛瘀、解痘毒药毒，治腰痛、心悸、失眠等疗效。在民间人们也一直将鹿血作为滋补之佳品。随着现代医学研究的深入，证明鹿血确有良好的滋补作用，例如抗氧化、抗衰老、补血美容、补肾益精、抗疲劳、增强免疫力等，营养十分丰富。目前常用的磷脂提取方法有有机溶剂萃取法、超临界萃取法、复合盐沉淀法、柱层析法等。有机溶剂萃取法是提取磷脂的传统方法，其原理是利用磷脂和其它待分离成分在不同有机溶剂中的溶解性不同，来实现两者之间的分离，其关键就是很难寻找合适的有机溶剂萃取剂，应对磷脂具有良好的溶解性与选择性。超临界萃取法设备成本较高，而且必须在高压下工作，样品处理量较少等缺点，因此不适合规模化生产，有较大局限性。复合盐沉淀法关键是在于选择出有效、合适的无机盐沉淀剂。柱层析法存在操作时间较长，处理样品量有限，以及操作过程涉及一些毒性有机溶剂等局限性。


技术实现要素：

3.本发明以鹿血作为原料，通过改进经典脂质提取方法folch法，使用低毒性的二氯甲烷来替代氯仿。并采用超声协同技术，建立了鹿血中磷脂的提取方法，并以提高鹿血中磷脂提取效率为目标，确定了提取过程中提取工艺条件：溶剂料液比、提取温度、提取时间等因素对鹿血磷脂提取的影响，通过采用标准的抗氧化评价方法对鹿血磷脂的抗氧化能力进行评估，为鹿血药用价值的深度开发和利用提供理论依据和技术支持。
4.本发明所采取的技术方案具体如下：
5.一种鹿血磷脂的提取方法，包括以下步骤：
6.步骤一、将鹿血冷冻干燥得到鹿血冻干粉；
7.步骤二、向鹿血冻干粉中加入体积比为2:1-4:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，混合均匀，恒温超声处理，然后离心分离，取上清液，加入双蒸水，搅拌均匀后静置，收集下层二氯甲烷，向剩余的物质中加入二氯甲烷进行二次提取；重复提取若干次，合并收集的二氯甲烷；
8.步骤三、将步骤二合并收集的二氯甲烷减压浓缩，然后将浓缩液干燥，得到混合脂质体，使用丙酮溶解混合脂质体，充分震荡萃取，然后离心分离，干燥沉淀物，得到鹿血磷脂。
9.进一步的，步骤一中，冷冻干燥的温度为-80℃～-81℃，真空度控制在20pa以下。
10.进一步的，二氯甲烷和甲醇的混合溶液与鹿血冻干粉的体积质量比为35-50ml：
1g。
11.进一步的，步骤二中，恒温的温度是35℃，超声时间为35-45min。
12.进一步的，步骤二中，二次提取后，离心分离，取上清液，加入双蒸水，搅拌均匀后静置，收集下层二氯甲烷。
13.进一步的，步骤二中，离心分离的转速为6000-8000r/min。
14.进一步的，步骤三中，使用旋转蒸发仪在25℃的条件下对合并收集的二氯甲烷进行减压浓缩。
15.进一步的，步骤三中，浓缩液和沉淀物的干燥温度均为25℃烘箱恒温干燥。
16.一种所述的方法制备的鹿血磷脂的应用，在用于清除dpph
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的药剂配方中，当小于等于6h时，6mg/ml鹿血磷脂对于dpph
·
的清除率最高，当大于6h时，4mg/ml鹿血磷脂对于dpph
·
的清除率最高。
17.本发明相对于现有技术的有益效果：
18.本发明以冻干鹿血晶为原料，提取鹿血中的磷脂组分，该提取方法很好的保存了鹿血磷脂的生物活性，对提取的鹿血磷脂成分做了详细分析，进一步研究其抗氧化能力，为探讨鹿血具有抗衰老的药理作用提供物质基础。
附图说明
19.图1为鹿血磷脂提取的工艺流程图；
20.图2为不同萃取温度对鹿血磷脂提取效率图；
21.图3为不同萃取时间对鹿血磷脂提取效率图；
22.图4为不同液料比对鹿血磷脂提取效率图；
23.图5为对照磷标准液在紫外可见吸收光谱中特定波长的最大吸光度值；
24.图6为磷标准曲线图；
25.图7为鹿血磷脂的高效液相色谱图；
26.图8为鹿血磷脂提取物对dpph
·
清除率实验结果图。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。但不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
28.实施例1
29.一种鹿血磷脂的提取方法，包括以下具体步骤：
30.步骤一、预处理工艺-冷冻干燥
31.打开冻干干燥机的制冷机开关预冷30min，将冻干机预冷到-80℃～-81℃，取出冷冻好的梅花鹿血迅速装盘入箱，将有机玻璃筒罩好，按下真空机开关抽真空，冻干机真空度达20pa以下后开始冻干干燥，冻干过程中冻干箱真空度始终控制在20pa以下。将鹿血冻干48h后出箱，制得冷冻干燥的鹿血粉为红棕色，质地疏松，微有光泽，气腥。
32.步骤二、取一定量的鹿血冻干粉于烧杯中，加入一定量的二氯甲烷/甲醇(体积比为2:1)复合提取液，提取液现用现配，磁力搅拌一分钟使其充分混匀，恒温超声35-45min，
超声完毕后，8000r/min离心，取上清液，加入少量的双蒸水，搅拌均匀后静置。收集下层二氯甲烷，向余下的上清液和固形物中加入15-20ml二氯甲烷进行二次提取，重复上述提取操作两次，将收集到的二氯甲烷合并，将合并后的二氯甲烷移入圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在25℃减压浓缩，将浓缩液移入已称量好的离心管中，使用二氯甲烷洗涤圆底烧瓶两次，然后将洗涤液与浓缩液合并，得到脂质混合物。将脂质混合物于真空烘箱中25℃恒温干燥后再次称量，减去恒重后空的离心管质量即得到脂质混合物重量。
33.鹿血磷脂提取纯化及质量评价方法
34.待脂质混合物冷却后，向其中加入30-50ml丙酮，充分振荡萃取后移入已称量好的离心管中，以8000r/min高速冷冻离心3min，移出上清液，将沉淀于烘箱中25℃恒温干燥后再次称量，减去空管质量即得到鹿血磷脂重量。将干燥后的鹿血磷脂于4℃冰箱保存。
35.按公式(1)计算鹿血磷脂提取率：
[0036][0037]
式中：w1为磷脂提取率/％；m0为鹿血冻干粉的质量/g；m2为提取出鹿血磷脂的质量/g。
[0038]
按公式(2)计算相对磷脂纯度：
[0039][0040]
式中：w2为相对磷脂纯度/％；m2为提取出鹿血磷脂的质量/g；m1为提取出鹿血脂质混合物的质量/g。
[0041]
鹿血磷脂的提取条件
[0042]
选择液料比、萃取时间、萃取温度作为影响鹿血磷脂提取率主要影响参数，以鹿血磷脂提取率和相对磷脂纯度作为考察指标，各因素选取5个水平进行单因素实验，考察对鹿血磷脂提取效率的影响。
[0043]
提取条件的优化：
[0044]
温度影响：准确称取5份鹿血冻干粉各5g，加入150ml的二氯甲烷-甲醇(体积比为2:1)混合提取剂，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度下提取40min，由于磷脂在50℃时易氧化变质，故不再升温考察。丙酮冲洗干燥后得到的脂质混合物，计算鹿血磷脂提取率和相对磷脂纯度，考察超声温度对鹿血磷脂提取效率的影响。实验结果如图2所示。
[0045]
时间影响：准确称取5份鹿血冻干粉各5g，加入150ml的二氯甲烷-甲醇(体积比为2:1)混合提取剂，在30℃温度下，分别提取20min、30min、40min、50min、60min，丙酮冲洗干燥后得到的脂质混合物，计算鹿血磷脂提取率和相对磷脂纯度，考察超声时间对鹿血磷脂提取效率的影响。实验结果如图3所示。
[0046]
液料比影响：准确称取5份鹿血冻干粉各5g，分别加入50ml(10/1)，100ml(20/1)，150ml(30/1)，175ml(35/1)，200ml(40/1)的二氯甲烷-甲醇(体积比为2:1)混合提取剂，在25℃下恒温超声提取30min，丙酮冲洗干燥后得到的脂质混合物，计算鹿血磷脂提取率和相对磷脂纯度，考察料液比对鹿血磷脂提取效率的影响，实验结果如图4所示。
[0047]
所以在保证鹿血磷脂提取效率，节约成本和溶剂的条件下，选择35ml/g为鹿血磷脂提取最佳液料比，随着时间的延长，鹿血磷脂的提取率上升幅度呈现先显著增加后又趋
于平缓的趋势，当超声时间超过40min，再继续延长超声时间也无磷脂溶出；而鹿血提取相对磷脂纯度随超声时间的延长先增大而后有所降低，当超声时间为40min时，鹿血相对磷脂纯度达到最大49.75％，选择时间40min为鹿血磷脂提取的最佳超声时间。温度的影响结果表明，从20℃到35℃，磷脂的提取率和相对磷脂提取纯度均大幅增加，35℃时均达到最高，当温度达到40℃时，磷脂提取率增加不大，磷脂纯度大幅降低，磷脂不耐高温，温度过高可使磷脂氧化变质而丧失生理活性，磷脂氧化降解从而影响其纯度。因此，选择温度35℃为鹿血磷脂提取的最佳提取温度。
[0048]
磷含量的测定
[0049]
湿法消解：准确称取实验室自制鹿血磷脂0.50g，将其放入聚四氟乙烯消解罐中，向其中添加10ml硝酸，2ml硫酸，置于电热板上100℃进行消解反应。若消化液呈棕褐色，再加入少量硝酸继续消解，消解至消化液呈无色透明或略带黄色。将消化液常温冷却，加入20ml双蒸水进行除酸。冷却后将其转移到50ml容量瓶中，用双蒸水多次洗涤消化管，洗液合并于容量瓶中，加水至刻度，混匀。作为待测样品储存，同时做试剂空白实验。
[0050]
最大吸收波长的确定
[0051]
准确吸取磷标准使用液0、3.00ml分别置于具塞试管中，分别加入2.0ml钼酸铵溶液摇匀，静置。之后再加入1ml亚硫酸钠溶液(200g/l)，1ml 10％抗坏血酸溶液摇匀，室温静置20min显色，以第一份为空白对照校正调零，采用紫外-可见分光光度法，于波长500-900nm区间进行扫描，实验结果显示，样品在波长823.5nm处有紫外最大吸收，见图5。
[0052]
准确吸取磷标准使用液0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml，相当于含磷量5.0μg、10.0μg、20.0μg、30.0μg、40.0μg、50.0μg，置于具塞试管中，分别向其中添加2.0ml钼酸铵溶液摇匀，静置，再添加1ml亚硫酸钠溶液(200g/l)、1ml10％抗坏血酸溶液摇匀，室温静置25min显色，使用紫外-可见分光光度计在钼蓝特征吸收波长823.5nm处分别测定不同浓度溶液的吸光度值，绘制磷标准曲线。
[0053]
不同浓度磷含量溶液反应后对应的吸光度值如下表1所示。
[0054][0055]
根据表1绘制磷标准曲线，以磷浓度为横坐标，特定波长下的吸光度值为纵坐标，通过线性拟合绘制磷标准曲线。结果如图6所示，测定后得到的标准曲线线性关系良好，其回归方程为y＝0.2251x 0.0441，r2＝0.9979(n＝6)。
[0056]
表2样品消化液中总磷含量的确定
[0057][0058]
[0059]
由表2可以看出提取物中含磷量与已知磷脂的含磷量相接近，说明提取物中的主要组分是磷脂。
[0060]
鹿血磷脂组分分析：
[0061]
进一步通过高效液相色谱分析了提取的鹿血磷脂的组分，结果显示主要有两种磷脂，其中一种磷脂的保留时间值为34.22，另一种磷脂成分为37.40，如图7所示。
[0062]
鹿血磷脂抗衰老活性研究
[0063]
采用dpph
·
清除能力实验：称取dpph
·
标准品于10ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，即得浓度为0.048mg/ml的dpph
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的标准溶液，避光、低温保存备用。分别制备样品溶液和空白溶液，1.0mldpph
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标准溶液和1.0ml各浓度样品与对照品溶液充分混合、摇匀后，室温避光反应，分别反应0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h，于517nm处测定吸光度值，平行测定3次，分别得到相应反应时间的a1和a0，利用下式计算鹿血磷脂对dpph
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自由基的清除率：
[0064][0065]
式中：
[0066]
p——鹿血磷脂对dpph自由基的清除率，％；
[0067]
a0——1.0mldpph
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标准溶液与1.0ml无水乙醇混合液的吸光度值；
[0068]
a1——1.0mldpph
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标准溶液与1.0ml样品溶液混合液的吸光度值；
[0069]
结果如图8所示，不同浓度的鹿血磷脂提取物溶液对dpph自由基清除均具有一定的效果。短期效果来看(反应30min)，当鹿血磷脂提取物浓度为6.00mg/ml时，清除dpph自由基的效果最强，其dpph自由基清除率为45.39％。而后再继续增大鹿血磷脂提取物浓度，其dpph自由基清除效果反而降低。长期效果来看，随着作用时间的延长，6.00mg/ml的鹿血磷脂随着时间的延长对dpph自由基清除速率变缓，趋势趋于平缓；而低浓度2.00mg/ml和4.00mg/ml的鹿血磷脂对dpph自由基的清除效果随时间的延长逐步增大，当8h时，4.00mg/ml对dpph
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的清除率超过了6.00mg/ml的鹿血磷脂dpph
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的清除率，达到70.69％。因此得出结论，在实验反应时间和浓度范围内，6.00mg/ml的鹿血磷脂对dpph
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的短效清除效果最好；4.00mg/ml的鹿血磷脂对dpph
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的长效清除效果最好。可以看出，4mg/ml的鹿血磷脂其自由基清除率最高。