治疗高胆固醇血症的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及包含凤梨果实提取物的用于治疗高胆固醇血症的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.凤梨(也称为菠萝)是菲律宾产量最高的水果之一。尽管它在菲律宾菜肴中很受欢迎，但是关于植株中产生的植物化学物质及其可能带来的潜在健康益处的科学文献很少。如果发现凤梨中的特定植物化学化合物具有药用特性，这将为农业生产打开金融大门。
3.高胆固醇血症是血液中胆固醇水平高的病症。血液中过多的胆固醇可能会在冠状动脉的壁上形成斑块并导致冠心病。建议高胆固醇水平的患者减少脂肪食物的摄入量，并可能对其开具降低胆固醇水平的合成药物。这样的用于治疗高胆固醇血症的药物是羟甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制剂(也称为他汀类药物)和脂肪酶抑制剂。
4.在商业上，凤梨产品因具有帮助消化和降低胆固醇的特性而闻名并在市场上销售。例如，us6509372公开了一种通过可掺入凤梨汁中的类黄酮的药物组合物来抑制hmg-coa还原酶的方法。xie等人的一项题为“凤梨叶在小鼠中的降血脂机制：与贝特类药物不同但与他汀类药物相似(hypolipidemic mechanisms of ananas comosus l.leaves in mice:different from fibrates but similar to statins)”的研究还公开了具有类似于他汀类药物机制的凤梨叶提取物的降脂特性。
5.本发明证明了来自凤梨果肉、果核和果梗的包含特定化合物n1,n10-二阿魏酰精脒的凤梨提取物表现出降低胆固醇的治疗特性。本发明提供了一种表现出hmg-coa还原酶和脂肪酶抑制作用的天然产物，其可以与市场上出售的合成降胆固醇药物一样有效。该降胆固醇药物的天然替代品可能会导致对种植凤梨的投资加大，并增加农产品的价值。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是开发用于预防或治疗高胆固醇血症的组合物，其包含表现出hmg-coa还原酶抑制活性和脂肪酶抑制活性的化合物。本发明的另一个目的是提供来自凤梨提取物的天然治疗组合物，其将降低心血管疾病的总体风险并预防和治疗这样的病症。本发明的进一步目的是提供由凤梨果核、果肉或果梗制备用于治疗高胆固醇血症的组合物的方法。
7.因此，本发明提供了一种用于预防或治疗高胆固醇血症的组合物，其包含从凤梨中获得的提取物，所述提取物包含治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒。
8.还提供了由凤梨果核、果肉或果梗制备上述组合物的方法。
9.在相关的方面，包含从凤梨中获得的提取物的组合物可用于生产预防或治疗高胆固醇血症的药物，该提取物包含治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒。
附图说明
10.所包括的用于提供对本发明的进一步理解的附图并入本文以说明本发明的实施例。它们还与描述一起解释了本发明的原理，而不是旨在进行限制。
11.图1示出了使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(achca)作为基质获得的凝胶过滤色谱法(gfc)凤梨果肉(paf)馏分(fraction)05-07的maldi-tof质谱；
12.图2示出了根据本发明的优选提取和分离方法获得的活性馏分的高分辨率质谱(hrms)全质谱；
13.图3示出了与本发明的活性剂n1,n10-二阿魏酰精脒对应的m/z 498.2599[m h]

的串联质谱(ms/ms)裂解；
[0014]
图4示出了本发明的降胆固醇化合物n1,n10-二阿魏酰精脒的分子结构。
具体实施方式
[0015]
以下是本发明的各个实施例中使用的术语的定义。
[0016]
本文使用的术语“凤梨果肉”指去除凤梨果皮后果实内部柔软的可食用组织。这部分是果实中最常食用的部分。
[0017]
本文使用的术语“凤梨果核”指由凤梨果肉包围的果实内部中心处的坚硬部分。
[0018]
本文使用的术语“凤梨果梗”指支撑植物叶子和果实并与根相连的凤梨植株的基部。
[0019]
本文中使用的术语“馏分”是指提纯或部分提纯的提取物。
[0020]
本文中使用的术语“活性馏分”是指提纯或部分提纯的提取物，其包含n1,n10-二阿魏酰精脒，一种表现出高hmg-coa还原酶和脂肪酶抑制特性的降胆固醇化合物。
[0021]
本文使用的术语“治疗有效量”是指组合物(例如口服制剂)中的n1,n10-二阿魏酰精脒的量，当对个人给药以用于治疗与高胆固醇血症相关联或由高胆固醇血症引起的病情、疾病、失调或病症时，该量足以实现这种治疗。治疗有效量将根据接受治疗的特定病情、疾病、失调或病症及其严重程度以及接受治疗的个人的年龄、体重、身体状况和反应性而有所不同。
[0022]
本发明涉及用于预防或治疗高胆固醇血症的组合物，其包含从凤梨中获得的提取物，所述提取物包含治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒，一种表现出hmg-coa还原酶和脂肪酶抑制作用的降胆固醇化合物。本发明的组合物产生至少80％的hmg-coa还原酶或脂肪酶抑制作用。
[0023]
优选地，本发明中的凤梨提取物从凤梨果肉(paf)、凤梨果核(pac)和凤梨果梗(pas)中的至少一种中获得。
[0024]
paf、pac和pas粗提物包括n1,n10-二阿魏酰精脒，一种表现出hmg-coa还原酶和脂肪酶抑制作用的降胆固醇化合物。可用于获得凤梨粗提物的方法可以包括但不限于浸渍、消解、溶剂提取、回流提取、蒸馏、渗滤、索氏提取和加压液体提取。
[0025]
在本发明的一个实施例中，随后可以使获得的paf、pac和pas粗提物经受分离技术，以获得含有降胆固醇化合物n1,n10-二阿魏酰精脒的粗提物的活性馏分。执行这些分离技术以提纯和浓缩粗提物中的降胆固醇化合物。在优选实施例中，使获得的凤梨果肉、果核和果梗提取物经受凝胶过滤色谱法(gfc)。可使用的其它分离技术可以包括但不限于高效
液相色谱法、吸附柱色谱法、分配色谱法、膜滤法、离子交换色谱法、分子蒸馏法、气相色谱法、超临界流体色谱法和分子印迹技术。然后使这些分离技术得到的馏分经受脂肪酶和hmg-coa还原酶抑制试验，以确定含有用于治疗高胆固醇血症的降胆固醇化合物的馏分。认为对脂肪酶和hmg-coa还原酶展示强抑制作用的馏分是可能含有n1,n10-二阿魏酰精脒的活性馏分。对hmg-coa还原酶和脂肪酶活性的抑制作用通过减缓从肝脏合成胆固醇和减少可吸收甘油三酯的水解来降低胆固醇水平。这些特性在治疗高胆固醇血症方面是有益的。
[0026]
为了证实凤梨果实中存在降胆固醇化合物n1,n10-二阿魏酰精脒，本文公开了可通过优选提取和分离方法获得的凤梨提取物的质谱。
[0027]
图1是使用achca作为基质，根据所公开的提取方法获得的gfc paf馏分05-07的maldi-tof质谱。图1a示出了来自m/z 100600的全光谱，图1b示出了较窄的质量范围，其强调了在馏分gfc paf 06中的m/z 498[m h]

处存在信号。
[0028]
图2示出了根据本发明的优选提取和分离方法获得的活性馏分gfc paf馏分07的hrms全质谱。hrms数据中的主峰在m/z 498.2599[m h]

处。
[0029]
图3示出了与本发明的降胆固醇化合物n1,n10-二阿魏酰精脒对应的m/z498.2599[m h]

的ms/ms裂解。图3所示的在阳性模式下m/z 234、322、305、176和481处的碎片化离子对应于化合物n1,n10-二阿魏酰精脒，其分子结构如图4所示。基于该碎片数据，图1和图2中提供的质谱可以表明馏分gfc paf 06和gfc paf 07中存在n1,n10-二阿魏酰精脒。
[0030]
图4示出了本发明的用于治疗高胆固醇血症的组合物中降胆固醇化合物n1,n10-二阿魏酰精脒(c
27h35
n3o6)的分子结构。该化合物n1,n10-二阿魏酰精脒的测得质量为m/z 498.2599[m h]

，被确定为是根据本发明的优选提取和分离方法得到的gfc paf馏分06中的主要化合物，其示出了88.64
±
2.84％的脂肪酶抑制活性和100％的hmg-coa还原酶抑制活性。该化合物是羟基肉桂酰胺的衍生物，并且据报道是凤梨植株的果肉区域中一种独特的已知化合物。该化合物的国际理论与应用化学联合会(iupac)的名称是(e)-3-(4-羟基-3甲氧基苯基)-n-[4-[3-[[(z)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯酰基]氨基]丙氨基]丁基]丙-2-烯胺((e)-3-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-n-[4-[3-[[(z)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)prop-2-enoyl]amino]propylamino]butyl]prop-2-enamide)。其iupac国际化学标识符(inchl)是1s/c27h35n3o6/c1-35-24-18-20(6-1022(24)31)8-12-26(33)29-16-4-3-14-28-15-5-17-30-27(34)13-9-21-7-11-23(32)25(19-21)36-2/h613,18-19,28,31-32h,3-5,14-17h2,1-2h3,(h,29,33)(h,30,34)/b12-8 ,13-9-。该化合物的inchl图例是ighvufylajsile-uqxqteivsa-n。其典型简化分子线性输入规范(simplified molecular-input line-entry system,smiles)是coc1＝c(c＝cc(＝c1)c＝cc(＝o)nccccncccnc(＝o)c＝cc2＝cc(＝c(c＝c2)o)oc)o。其异构smiles是coc1＝c(c＝cc(＝c1)/c＝c/c(＝o)nccccncccnc(＝o)/c＝c\c2＝cc(＝c(c＝c2)o)oc)o。
[0031]
在本发明的组合物使用paf、pac和pas粗提物的实施例中，这些粗提物在组合物中的浓度范围为5至100mg/ml。在本发明的组合物使用来自粗提物的活性馏分的实施例中，组合物中这些活性馏分的浓度范围为1至10mg/ml。
[0032]
在优选实施例中，本发明的组合物包括治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒，其范围为组合物的0.1重量％至30重量％。
[0033]
在本发明的优选实施例中，本发明的组合物可以是以下形式：包含凤梨提取物中
所含的降胆固醇化合物n1,n10-二阿魏酰精脒的果汁、食品添加剂、食品配料、功能性食品、医用食品、膳食补充剂、营养食品、营养补充剂或口服制剂，用于治疗高胆固醇血症。在获得本发明的这些组合物的过程中，可以在配方中添加药学上可接受的载体或稀释剂。
[0034]
在本发明的更优选实施例中，果汁形式的该组合物包含治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒，范围为0.1至100mg/ml。
[0035]
根据本发明的另一个目的，本发明还公开了从凤梨果核、果肉或果梗提取物制备用于治疗高胆固醇血症的组合物的方法，该组合物具有治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒。
[0036]
一种使用凤梨果实提取物制备用于预防或治疗高胆固醇血症的组合物的方法，包括以下步骤：获得至少一个用于从其进行提取的凤梨果实；分离至少一个获得的凤梨果实的凤梨果核和凤梨果肉；减小分离的凤梨果核和凤梨果肉的大小；通过使大小减小的凤梨果核和凤梨果肉进入转速为约4000至8000rpm的果汁处理机来生产凤梨果实提取物；使生产的凤梨果实提取物经受至少一个过滤步骤；以及将过滤后的凤梨果实提取物中的n1,n10-二阿魏酰精脒浓缩至治疗有效浓度。
[0037]
一种使用凤梨果实提取物制备用于预防或治疗高胆固醇血症的组合物的方法，包括以下步骤：获得至少一个用于从其进行提取的凤梨果梗；通过去除果梗皮和木质化部分来制备该至少一个凤梨果梗；减小至少一个制备的凤梨果梗的大小；通过在蒸馏水中浸渍至少一个大小减小的凤梨果梗来获得凤梨果梗提取物；对从至少一个浸渍的凤梨果梗获得的凤梨果梗提取物进行倾析；使倾析后的凤梨果梗提取物经受至少一个过滤步骤；以及将过滤后的凤梨果梗提取物中的n1,n10-二阿魏酰精脒浓缩到治疗有效浓度。
[0038]
在优选实施例中，本发明的方法进一步包括通过添加至少一种药学上可接受的载体或稀释剂来配制该组合物的步骤。
[0039]
所公开的制备方法的优选过滤步骤包括但不限于细布过滤、重力过滤和真空过滤。
[0040]
通过液液溶剂提取、索氏提取、旋转蒸发、超临界流体提取、超声辅助提取、微波辅助提取和色谱技术，可以执行浓缩过滤后的凤梨提取物中的n1,n10-二阿魏酰精脒的步骤。
[0041]
使用所公开的制备方法从凤梨中获得提取物，其中凤梨提取物包含治疗有效量的n1,n10-二阿魏酰精脒，可以用于生产预防或治疗高胆固醇血症的药物。
[0042]
本领域技术人员将理解，他们可以自由组合本文公开的本发明的所有特征。通过附图和实施例，本发明的其他优点和特征将显而易见。
[0043]
实施例
[0044]
实施例1：植株材料的制备
[0045]
采收20至25个青黄果壳的成熟凤梨果实以及凤梨的成熟果梗。在分析之前制备样品并在3-5℃下保持几天。用凤梨切片机从果肉中去除果核，用菜刀刮掉果皮上多余的果肉。将果肉和果核样品切成大块，并放入转速为约4000至8000rpm的果汁处理机。
[0046]
去除果梗皮和木质化部分。将果梗样品切成小块，并浸渍到3至7l蒸馏水中。在浸泡大约11至20小时后，对饱和的水性提取物进行倾析。然后向样品中加入1至3l蒸馏水，并再次将其浸泡11-20小时。
[0047]
然后，果汁样品(果核、果肉或果梗)用五到十层棉布进行过滤，大约一到五个步骤
的棉花重力过滤。真空过滤也使用良好堆放的普通滤纸层和棉花层分约三到五个步骤重复进行，以便进一步去除纤维和将果汁澄清。将清澈的果汁样品(果核、果肉或果梗)分散到35至65ml锥形离心管中，并在-80℃下存储。过夜冷冻后，将样品进行冻干。将干燥的凤梨果核、果肉或果梗粗提物溶于水中，得到的浓度为60至80mg/ml。
[0048]
实施例2：用于提纯化合物的凝胶过滤色谱法(gfc)
[0049]
使用80g sephadex g-75树脂(孔径：40至120μm)通过gfc根据其分子大小从凤梨果核、果肉和果梗粗提物中分离化合物。凝胶在蒸馏水中调理约18小时。柱测得的床高在30到55cm之间，半径约为1.2-2.0cm，使得柱床体积为约250至450ml。
[0050]
350至650mg凤梨果肉(paf)提取物在0.7-1.3ml水中以0.9-1.5ml/min流速从500至900ml水中产生约3.85-7.15ml的约80-145个馏分作为流动相。收集的孔隙体积在50至90ml之间，约为柱床体积的20-40％。
[0051]
对馏分用紫外-可见(uv-vis)分光光度计进行馏分混合。基于馏分在uv-vis图谱中的相似性将它们混合。混合是基于洗脱时间，其中每个主要馏分的总体积除以其流速以获得馏分应该洗脱的时间。总体来说，提纯了总共约11.50至21.50g的gfc提取物材料。对所有混合馏分进行编号，并检测脂肪酶和hmg-coa还原酶抑制活性。
[0052]
实施例3：脂肪酶抑制试验
[0053]
通过测定甘油三酯裂解生成的甘油来确定凤梨果肉、果核和果梗粗提物的脂肪酶抑制活性。储存和制备说明书根据美国密苏里州圣路易斯市sigma的mak 046的规定方案进行。
[0054]
将10μl 100mm甘油标准溶液用990μl的脂肪酶测定缓冲液稀释来制备1mm标准溶液。将不同体积(0、2、4、6、8、10、12、14μl)的标准原液分别加入96孔板的孔中。将20μl的750mg/ml果肉、果核和果梗(100mg/ml最终浓度)加入其对应的孔中。
[0055]
加入20μl果肉、果核和果梗的gfc馏分，使其最终浓度为1mg/ml至10mg/ml，然后加入2μl脂肪酶阳性对照。将20μl 100mg/ml脂肪酶和10mg/ml orlistat
tm
分别加入孔中作为阴性对照和阳性对照。所有标准溶液和样品均通过加入脂肪酶测定缓冲液调整到50μl。向每个孔加入100μl反应混合物，该混合物由93μl脂肪酶测定缓冲液、2μl过氧化物酶底物、2μl酶混合物和3μl脂肪酶底物组成。
[0056]
在缓慢动力学模式下在37℃下孵育2小时，使用clariostar
tm
微板阅读器在570nm处每隔5分钟读取一次吸光度。相对于未经处理的脂肪酶计算百分比脂肪酶抑制作用。一个脂肪酶单位是在37℃下每分钟从甘油三酯中生成1.0μmol甘油的酶的量。
[0057]
在下表1中总结了凤梨提取物的脂肪酶抑制试验结果。
[0058]
表1所选凤梨提取物和馏分的脂肪酶抑制试验结果
[0059]
样品浓度脂肪酶抑制活性未经处理的脂肪酶(阴性对照)-0％orlistat
tm
(阳性对照)100mg/ml100
±
0.05％凤梨果肉(paf)粗提物100mg/ml100％凤梨果核(pac)粗提物100mg/ml85.60
±
1.92％凤梨果梗(pas)粗提物100mg/ml70.06％gfc paf 0310mg/ml76.56
±
4.40％
gfc paf 0610mg/ml88.64
±
2.84％gfc pac 0110mg/ml22.41
±
1.57％gfc pac 0210mg/ml0％gfc pac 0310mg/ml30.64
±
2.41％gfc pas 0410mg/ml64.69
±
3.96％gfc pas 0510mg/ml57.27
±
4.10％
[0060]
脂肪酶抑制试验表明凤梨果肉粗提物表现出脂肪酶抑制作用所证实的降血脂活性。相对于相同浓度的orlistat
tm
的100
±
0.05％抑制作用，gfc paf馏分06示出88.64
±
2.84％抑制作用，其次是gfc paf馏分03示出76.56
±
4.40％抑制作用。gfc paf馏分06和gfc paf馏分03这些馏分在所检测的gfc馏分中表现出最高的脂肪酶抑制活性。我们的调查结果表明，与凤梨果肉和果梗的提取物相比，凤梨果实的果核部分具有较低的脂肪酶抑制活性。
[0061]
实施例4：羟甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制试验
[0062]
该试验基于吸光度在340nm处下降的分光光度测量，其表示在底物hmg-coa存在下，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的催化亚单位将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)氧化。所有储存和试剂制备均按方案(美国密苏里州圣路易斯市sigma的cs1090)进行。
[0063]
向所有样品均加入hmg-coa试剂盒中的测定缓冲液(1x)。根据sigma-的cs1090检测试剂盒中的制造商说明书，184μl用于空白，182μl用于活性对照，181μl用于抑制对照和样品。
[0064]
将pravastatin
tm
(2.1μg/ml)阳性对照、20μl g/ml果肉、果核(100mg/ml最终浓度)和20μl 50mg/ml果梗(5mg/ml最终浓度)粗提物加入其测定缓冲液中。还针对hmg-coa还原酶测试了较低反应浓度的提取物(20μl的250mg/ml，以获得25mg/ml最终浓度的果肉和果核粗提物)。
[0065]
在治疗中还加入4μl nadph和12μl hmg-coa底物。将hmg-coa还原酶(2μl)冰冻保存，直到将其添加到活性对照、抑制对照和样品中。
[0066]
使用clariostar
tm
平板阅读器每隔20秒，最多10分钟，监测一次340nm处的吸光度。一个单位将在37℃下每分钟将1μmol的nadph转化成nadp

。
[0067]
下表2中总结了凤梨提取物的hmg-coa还原酶抑制试验结果。
[0068]
表2所选凤梨提取物和馏分的hmg-coa还原酶抑制试验结果
[0069][0070][0071]
在凤梨粗提物中，pas粗提物表现出最高的hmg-coa还原酶抑制活性，证实为100.00
±
0.75％抑制作用。在gfc馏分中，gfc paf馏分06和gfc pac馏分04表现出最高的hmg-coa还原酶抑制活性，证实分别为100％和100
±
0.00％抑制作用。
[0072]
实施例5：所选凤梨果肉(paf)gfc馏分的maldi-tof质谱分析
[0073]
对hmg-coa还原酶和脂肪酶活性表现出较高抑制作用的gfc馏分进行maldi-tof质谱分析，以检查这些馏分的化学图谱。以α-氰基-4-羟基肉桂酸(achca)作为基质对gfc paf 05、gfc paf 06和gfc paf 07进行maldi-tof光谱分析。对从这些质谱结果获得的化学图谱进行研究，以便进一步执行高分辨率质谱法(hrms)并确定馏分中潜在活性化合物的化学结构。
[0074]
使用配备有标准esi离子源的线性阱四极杆(ltq)轨道阱cl etd质谱仪进行高分辨率和高质量准确度实验。将示出了100％hmg-coa抑制作用的5μl样品(gfc paf馏分06)通过dionex的ultimate 3000rslc系统以50μl/min的速度流动注射到80％acn/h2o 0.1％fa中。全扫描ms条件为m/z 100-2000或500-4000，在m/z 400处分辨率为60000。用ltq依次分离目标离子以进行ms/ms。电喷雾电压维持在4kv，毛细管温度设置在275℃。分析hrms和ms/ms数据以给出化合物的分子结构。