齐墩果酸脂质体在制备改善顺铂所致生精障碍药物中的应用

1.本发明涉及生精障碍药物研发技术领域，具体涉及齐墩果酸脂质体在制备改善顺铂所致生精障碍药物中的应用。


背景技术：

2.不孕夫妇中男性不育的占比约为30～40％，造成男性不育的原因有很多，生精障碍(少精、弱精和无精)都是导致男性不育和生育能力下降的主要原因(chu f h,zhang w x,guo w b,etal.oleanolic acid-amino acidsderivativ es:design,synthesis,and hepatoprotective evaluation in vitro and in vivo[j].molecules,2018,23(2):322.doi:10.3390/molecules23020322.)。改善生精障碍在治疗男性不育中具有重要意义。
[0003]
顺铂(cisplatin，ddp)是首个投入肿瘤治疗的周期非特异性抗肿瘤药物，对肺癌、前列腺癌、淋巴癌等均有治疗作用(naasse y,charoute h,ei h ouateb,etal.chromosomal abnormalities and y chromosome microdeletions in infertile men frommorocco[j].bmc urol,2015,15:95.doi:10.1186/s12894-015-0089-3.)。在临床应用中发现其对男性生殖系统有损伤作用，其对后代存在潜在致畸形的风险，可作为生精障碍模型的诱导剂，是制备生精障碍的理想药物(kang sh,lee hj,jeong sj,et al.protective effect of bojungbangdocktang on cisplatin-induced cytotoxicity and apoptosis in mcf-10a breast endothelial cells.environ toxicol pharmacol,2009,28(3):430-438.doi:10.1016/j.etap.2009.07.007.)。目前认为，顺铂所致生精障碍的机制可能是产生过多的有毒亲电子物质，导致自由基清除酶活性下降，造成自由基堆积，引起脂质过氧化反应，使细胞膜结构破坏，造成生殖细胞损伤，从而使精子微环境发生改变(kilarka je n,mousa am,al-bader mm,et al.antioxidants enhance the recover y of three cycles ofbleomycin,etoposide,and cisplatin-induced testiculardysfunc tion,pituitary-testicular axis,and fertility in rats[j].fertil steril,2013,100(4):1151-1159.doi:10.1016/j.fertnstert.2013.06.019.)。
[0004]
齐墩果酸(oleanolicacid，oa)别名土当归酸，是五环三萜类化合物，是一种天然植物化学成分，以游离或结合成苷的形式广泛存在于植物界，具有广泛的药理作用，齐墩果酸主要用于治疗急性黄疸型肝炎和慢性病毒性肝炎。已有研究表明，齐墩果酸的水溶性较差，生物利用率低。齐墩果酸脂质体是由齐墩果酸制备获得的。
[0005]
截至目前，关于齐墩果酸以及齐墩果酸脂质体在改善顺铂所致生精障碍的研究还未见报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种齐墩果酸脂质体在制备改善顺铂所致生精障碍药物中的应用。
[0007]
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0008]
本发明的齐墩果酸脂质体在制备改善顺铂所致生精障碍药物中的应用。
[0009]
作为优选的实施方式，所述齐墩果酸脂质体的使用剂量为25～100mg/kg。
[0010]
作为优选的实施方式，所述齐墩果酸脂质体的使用剂量为100mg/kg。
[0011]
作为优选的实施方式，所述齐墩果酸脂质体的功能包括：
[0012]
(1)显著提高顺铂所致生精障碍小鼠模型精子密度和精子活力；
[0013]
(2)显著提高顺铂所致生精障碍小鼠模型附睾尾精子的曲线速度、直线速度和平均速度；
[0014]
(3)显著改善顺铂所致生精障碍小鼠模型精子畸形率；
[0015]
(4)显著提高顺铂所致生精障碍小鼠模型血清中的睾酮水平。
[0016]
作为优选的实施方式，所述齐墩果酸脂质体的制备方法为：
[0017]
(1)按齐墩果酸、大豆卵磷脂和胆固醇质量比为3:18:2的比例称取齐墩果酸、大豆卵磷脂和胆固醇，加入无水乙醇，置于磁力搅拌器上充分混匀溶解，得到类脂溶液；
[0018]
(2)取tween-80溶于pbs中，37～49℃加热得到水相溶液；
[0019]
(3)用注射器将类脂溶液缓慢注射到水相溶液中，边注射边用磁力搅拌器搅拌，待类脂溶液与水相溶液充分混匀后，将所得溶液进行旋转蒸发，使乙醇挥尽，得到乳白色悬浮液；
[0020]
(4)将乳白色悬浮液超声分散至乳悬液，过滤后进行冷冻干燥，即得齐墩果酸脂质体。
[0021]
作为优选的实施方式，步骤(2)中，取20μl tween-80溶于10mlpbs中，43℃加热得到水相溶液。
[0022]
作为优选的实施方式，步骤(3)中，将所得溶液在15r/min、45℃条件下进行旋转蒸发。
[0023]
作为优选的实施方式，步骤(4)中，将乳白色悬浮液在100hz、45℃条件下进行超声分散至乳悬液，用0.45μm滤膜过滤后进行冷冻干燥，即得齐墩果酸脂质体。
[0024]
作为优选的实施方式，所制备的齐墩果酸脂质体平均粒径为(253.39
±
10.89)nm，包封率为(96.34
±
2.31)％。
[0025]
本发明的有益效果是：
[0026]
本发明通过试验研究了齐墩果酸脂质体(oa-lips)对顺铂所致小鼠生精障碍的保护作用。通过试验证实，本发明所制备的齐墩果酸脂质体(oa-lips)各剂量组小鼠精子密度、精子活力、精子的平均路径速度、直线运动速度和睾酮水平显著高于模型组，而精子畸形率则显著低于模型组(p《0.05)。齐墩果酸脂质体(oa-lips)能够改善顺铂所致生精障碍小鼠模型的生精障碍，显著提高顺铂所致生精障碍小鼠模型的生殖能力。
[0027]
通过本发明的制备方法制备的齐墩果酸脂质体(oa-lips)，平均粒径为(253.39
±
10.89)nm，包封率为(96.34
±
2.31)％，外观呈圆形，且大小均匀，水溶性较好。
附图说明
[0028]
图1为涂片观察齐墩果酸脂质体(oa-lips)对各组小鼠精液品质的影响。
[0029]
图2为齐墩果酸脂质体(oa-lips)对各组小鼠精子畸形率的影响(
×
400)。图中，a为正常精子；b为双头精子；c为胖头精子；d为无勾精子；e为香蕉型精子；f为尾折精子。
具体实施方式
[0030]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]
一、实验动物
[0032]
spf级成年雄性icr小鼠，体质量18～22g(长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(吉)20180007)。实验前小鼠适应性饲养5d。饲养条件：温度18～22℃，湿度45％～65％，12h明暗交替，自由饮水摄食。
[0033]
二、实验试剂
[0034]
齐墩果酸购自西安通泽生物科技公司；大豆卵磷脂购自北京美亚斯公司磷脂技术有限公司；胆固醇购自天津化学试剂厂；注射用顺铂购自齐鲁制药有限公司；睾酮酶联免疫测定试剂盒购自北京博奥拓达科技有限公司。
[0035]
三、实验仪器
[0036]
synergyh1m酶标仪(美国biotek)，ev311旋转蒸发仪(北京莱伯泰科)，freezone2.5冷冻干燥机(美国labconco)，sca-h-01p精液分析自动检测系统(西班牙sca)；zeta粒度分析仪(英国马尔文)；1260infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦)。
[0037]
实施例1齐墩果酸脂质体(oa-lips)的制备
[0038]
采用乙醇注入法制备齐墩果酸脂质体(oa-lips)，精确称取300mg齐墩果酸，1800mg大豆卵磷脂和200mg胆固醇置于烧杯中，加入10ml无水乙醇，置于磁力搅拌器上充分混匀溶解，得到类脂溶液；20μl tween-80溶于10ml pbs中，43℃加热得到水相溶液；用5ml注射器将类脂溶液缓慢注射到水相溶液中，边注射边用磁力搅拌器搅拌；待类脂溶液与水相溶液充分混匀后，将获得的溶液置于圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪(ev311)上在15r/min、45℃条件下进行旋转蒸发，使乙醇挥尽，得到乳白色oa-lips悬浮液；将该乳白色oa-lips悬浮液置于超声清洗器中在100hz、45℃条件下进行超声分散至乳悬液，所得乳悬液用0.45μm滤膜过滤后进行冷冻干燥，即得齐墩果酸脂质体(oa-lips)。
[0039]
本试验所制备的齐墩果酸脂质体(oa-lips)平均粒径为(253.39
±
10.89)nm，包封率为(96.34
±
2.31)％，外观呈圆形，且大小均匀，水溶性好。
[0040]
实施例2齐墩果酸脂质体(oa-lips)对顺铂所致小鼠生精障碍的保护作用
[0041]
1、动物分组及给药
[0042]
60只spf级成年雄性icr小鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组、oa-lips低剂量组、oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组，每组10只。oa-lips低剂量组、oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组每天分别给予25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg齐墩果酸脂质体(oa-lips)灌胃，阳性对照组每天给予50mg/kg维生素e水溶液灌胃。oa-lips低剂量组、oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组和阳性对照组均连续灌胃28d。第28d，除对照组外，其余各组小鼠均给予一次10mg/kg顺铂溶液腹腔注射，对照组给予相同剂量的生理盐水腹腔注射。
[0043]
2、小鼠精子密度、精子活率及畸形率测定
[0044]
2.1试验过程
[0045]
给药3d后，眼球取血处死小鼠，剪开腹壁，暴露生殖系统，摘取双侧附睾，在含有37
℃恒温箱中预热的生理盐水表面皿中清洗，迅速放入1ml、37℃温育的生理盐水中，轻轻剪开附睾尾，置于37℃恒温箱中孵育10min，精子充分游离后，经四层擦镜纸过滤至新ep试管，取10μl加入精子计数板，于光镜下观察并拍照，遵循记头不记尾原则，sca软件自动统计精子密度及活力参数。
[0046]
将上述剩余精子悬液另取5μl涂片，空气中晾干后甲醇固定，用1％的伊红水溶液染色15min，流水冲洗，晾干，高倍镜下检查精子形态，每只小鼠检查完整的精子200～500个，每组至少应检查1000个精子。精子畸形主要表现在精子的头部，按照形态可分为：无钩、香蕉形、无定形、双头、双尾、尾折叠以及胖头等。精子畸形率(％)＝畸形精子数/计数精子总数(1000)
×
100。
[0047]
spss16.0软件进行数据处理，所有数据均用均数
±
标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，组间两两比较采用最小显著差法(lsd)检验，检验水准α＝0.05。
[0048]
2.2试验结果
[0049]
2.2.1涂片观察oa-lips对各组小鼠精液品质的影响，结果如图1所示，精液涂片后显微镜观察发现，与对照组比较，模型组小鼠活动精子的比例以及精子的密度显著下降；阳性对照组和oa-lips高剂量组活动精子的比例以及精子的密度显著升高。
[0050]
2.2.2oa-lips对各组小鼠精子活力参数的影响见表1。由表1结果可知，随着oa-lips的使用剂量增加，各组小鼠前向运动、非前向运动的精子数量逐渐升高，不活动精子数量逐渐降低。模型组小鼠前向运动精子和非前向运动精子数量显著低于对照组，而不活动精子数量显著高于对照组(p《0.05)；oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组小鼠能发生前向运动的精子数量显著高于模型组(p《0.05)；oa-lips高剂量组小鼠非前向运动精子所占比例显著高于模型组、oa-lips低剂量组和oa-lips中剂量组(p《0.05)；模型组不活动精子的比例显著高于对照组(p《0.05)；oa-lips高剂量组小鼠不活动精子数量显著低于模型组和oa-lips低剂量组(p《0.05)；模型组精子总活动率显著低于对照组(p《0.05)；oa-lips低剂量组、oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组的精子总活动率虽高于模型组，但比较差异不显著(p》0.05)。
[0051]
表1 oa-lips对各组小鼠精子活力参数的影响
[0052][0053]
注：与对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，
#
p《0.05；与oa-lips低剂量组比较，
$
p《0.05；与oa-lips中剂量组比较，
▽
p《0.05；n＝10。
[0054]
综上，用实施例1制备的齐墩果酸脂质体(oa-lips)干预顺铂引起的小鼠生精障碍，结果发现，oa-lips低、中和高剂量组中小鼠精子密度和精子活力显著增加，这表明齐墩果酸脂质体(oa-lips)可显著提高小鼠精子密度和精子活力，从而改善顺铂所致的小鼠生
精障碍。
[0055]
2.2.3oa-lips对各组小鼠精子运动学参数的影响见表2，由表2结果可知，随着oa-lips的使用剂量增加，各组小鼠精子的vcl(曲线速度)、vsl(直线速度)、vap(平均速度)、lin(线性指数)、str(直线指数)、wob(振动指数)、alh(头部侧向运动平均振幅)和bcf(鞭打频率)逐渐升高。与对照组比较，模型组小鼠精子的vcl(曲线速度)、vsl(直线速度)和wob(振动指数)显著降低(p《0.05)；与模型组比较，阳性对照组小鼠精子的wob(振动指数)显著升高(p《0.05)，oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组小鼠精子的vcl显著升高(p《0.05)，oa-lips高剂量组小鼠精子的vsl(直线速度)、lin(线性指数)、str(直线指数)、wob(振动指数)和alh(头部侧向运动平均振幅)显著升高(p《0.05)；oa-lips高剂量组小鼠精子的vsl(直线速度)和wob(振动指数)显著高于低和中剂量组(p《0.05)；oa-lips高剂量组小鼠精子的str(直线指数)显著高于阳性对照组(p《0.05)。
[0056]
表2 oa-lips对各组小鼠运动学参数的影响
[0057][0058][0059]
注：与对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，
#
p《0.05；与阳性对照组比较，
▼
p《0.05；与oa-lips低剂量组比较，
$
p《0.05；与oa-lips中剂量组比较，
▽
p《0.05；n＝10。
[0060]
综上，在反应精子活动力的运动学测量参数主要指标方面，oa-lips各剂量组的vcl(曲线速度)、vsl(直线速度)和vap(平均速度)显著升高，这表面齐墩果酸脂质体(oa-lips)可通过提高附睾尾精子的平均运动速度、直线运动速度和曲线运动速度，改善小鼠精子的活力。
[0061]
2.2.4oa-lips对各组小鼠精子畸形率的影响见表3，由表3结果可知，模型组小鼠精子畸形率显著高于对照组(p《0.05)；oa-lips高剂量组小鼠精子畸形率显著低于模型组、阳性对照组和oa-lips低剂量组(p《0.05)；阳性对照组和oa-lips中剂量组小鼠精子畸形率显著低于模型组(p《0.05)。由图2可知，模型组可见双头、胖头、无勾、香蕉型和尾折的畸形精子。给与oa-lips后，小鼠精子畸形率得到显著改善。
[0062]
表3 oa-lips对各组小鼠精子畸形率的影响
[0063]
分组精子畸形率(％)对照组6.78
±
0.97
模型组13.20
±
1.81
*
阳性对照组9.97
±
1.68
*#
oa-lips低剂量组11.15
±
2.80
*
oa-lips中剂量组8.86
±
2.16
#
oa-lips高剂量组7.28
±
1.35
#
▼
$
[0064]
注：与对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，
#
p《0.05；与阳性对照组比较，
▼
p《0.05；与oa-lips低剂量组比较，
$
p《0.05；与oa-lips中剂量组比较，
▽
p《0.05；n＝10。
[0065]
综上，在精子畸形检测方面，oa-lips各剂量组小鼠精子畸形率显著下降，改善了小鼠的生殖能力。
[0066]
3、小鼠血清生殖激素测定
[0067]
3.1试验过程
[0068]
将小鼠全血于3000rpm离心10min，取上清，利用酶联免疫试剂盒测定小鼠血清中睾酮水平，实验步骤按照酶联免疫试剂盒说明书完成。spss16.0软件进行数据处理，所有数据均用均数
±
标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，组间两两比较采用最小显著差法(lsd)检验，检验水准α＝0.05。
[0069]
3.2试验结果
[0070]
oa-lips对各组小鼠血清中睾酮水平的影响见表4，由表4结果可知，模型组小鼠血清中睾酮水平显著低于对照组(p《0.05)；阳性对照组、oa-lips低剂量组、oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组小鼠血清中睾酮水平显著高于模型组(p《0.05)；oa-lips中剂量组和oa-lips高剂量组小鼠血清中睾酮水平显著高于oa-lips低剂量组(p《0.05)。
[0071]
表4 oa-lips对各组小鼠血清中睾酮水平的影响
[0072]
分组睾酮(nmol/l)对照组6.24
±
0.10模型组4.78
±
0.07
*
阳性对照组5.46
±
0.13
*#
oa-lips低剂量组5.67
±
0.08
*#
oa-lips中剂量组6.06
±
0.01
#
▼
$
oa-lips高剂量组6.23
±
0.01
#
▼
$
[0073]
注：与对照组比较，*p《0.05；与模型组比较，
#
p《0.05；与阳性对照组比较，
▼
p《0.05；与oa-lips低剂量组比较，
$
p《0.05；n＝10。
[0074]
睾酮是构成雄激素的重要组分，在雄性个体中，睾酮主要由睾丸间质细胞合成分泌。睾丸间质细胞分泌的睾酮一部分进入血液循环，维持雄性第二性征；一部分作用于睾丸生精上皮细胞，参与精子发生及成熟。睾酮在雄性个体生殖系统的发育和成熟过程中不可缺失，生理剂量的睾酮能维持精子的正常发育，而睾酮水平下降或合成障碍会导致精子发育异常。本试验中，给予oa-lips后，oa-lips低、中和高剂量组小鼠血清中的睾酮水平显著提升，这表明oa-lips改善了小鼠血清中的睾酮水平下降，进而改善了小鼠的精子质量和活力，小鼠的生殖能力得到进一步改善。
[0075]
本发明公开了一种齐墩果酸脂质体在制备改善顺铂所致生精障碍药物中的应用，
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。