一种冻虾仁致病菌污染模型的建立及应用

1.本发明属于冻虾仁致病菌检测技术领域，具体涉及一种冻虾仁致病菌污染模型的建立及应用。


背景技术：

2.鲜冻水产品有死后易腐败变质的特点，极易被致病菌污染。近年来，鲜冻水产品中经常检测出致病菌。袁玉荣等对秦皇岛市水产品中致病菌监测结果进行了分析，沙门菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌在80份鲜冻水产品样品中检出率为31.3％(袁玉荣,丁秀萍.2005～2008年秦皇岛市水产品中致病菌监测结果及分析.中国卫生检验杂志,2009,19(8):1922-1923.)；孙素梅等对北京市大兴区市售水产品中副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、创伤弧菌4种致病菌的污染状况进行了检测，发现市售水产品致病菌污染严重，46件样本阳性率为34.78％(孙素梅,吴占国,周丽敏,等.北京市大兴区水产品致病菌监测结果分析.首都公共卫生,2013,7(1):35-37.)；谢庆超等对东南沿海地区的92份生食水产品样品进行检测，致病菌总体检出率为41.30％(谢庆超,李想,赵勇,等.多重rt-pcr快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况.检验检疫学刊,2017,27(4):1-5.)；李海麟等对2013～2020年广州市市售生食动物性水产品食源性致病菌监测结果进行了分析，结果发现食源性致病菌总检出率为14.26％，生食动物性淡水产品检出率较高，达到了45.70％，可见广州市市售生食动物性水产品存在不同程度的食源性致病菌污染，致病菌污染主要以创伤弧菌、副溶血性弧菌为主(李海麟,刘于飞,张维蔚,等.2013-2020年广州市市售生食动物性水产品食源性致病菌监测结果分析.食品安全质量检测学报,2021,(12)8:3113-3117.)。可见，近年来水产品被致病菌污染较严重，存在较高食品安全隐患。
3.发明人对冻虾仁的致病菌检测方法进行研究，通过研究发现冻虾仁的常见致病菌为金黄葡萄球菌和沙门氏菌这两种致病菌。而目前能快速检测的技术有分子生物学的聚合酶链式反应(pcr)，该pcr方法在检测时，当冻虾仁被金黄葡萄球菌和沙门氏菌其中一种菌污染时，其检测出来的结果比较准确。但当冻虾仁被金黄葡萄球菌和门氏菌这两种菌交叉污染时，其检测出来的结果易造成假阳性或假阴性。因此，为适应公共卫生事件应急处理、快速反应的需要，研发冻虾仁食源性致病菌的快速、高通量检测方法，对于加强冻虾仁食源性致病菌的监测和控制具有重要意义。


技术实现要素：

4.根据现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是：提供一种冻虾仁致病菌污染模型及其应用，当冻虾仁同时被金黄葡萄球菌和沙门氏菌这两种菌污染时，能准确地进行判断。
5.本方案提供一种冻虾仁致病菌污染模型的建立，包括以下步骤：
6.步骤一、取未被金黄葡萄球菌和沙门氏菌污染的冻虾仁进行解冻,蒸馏水洗涤，然后接入金黄葡萄球菌和沙门氏菌两种致病菌，得到污染后的冻虾仁；
7.步骤二、对所述污染后的冻虾仁进行培养，得到培养后的冻虾仁；
8.步骤三、对所述培养后的冻虾仁进行冻干处理，除去水分，得到冻干的冻虾仁；
9.步骤四、在所述冻干的冻虾仁中加入有机溶剂并提取，得提取液；
10.步骤五、对所述提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液；
11.步骤六、对步骤五中的滤液进行lc-ms检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得到污染代谢标志物，污染模型建立完成。
12.同时本方案还提供了冻虾仁致病菌污染模型的应用，包括以下步骤：
13.第一步、取市售冻虾仁，进行冻干处理，除去水分，得到冻干的待检测样品；
14.第二步、在所述得到冻干的待检测样品中加入甲醇并提取，得待检测提取液；
15.第三步、对所述待检测提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液，得到待检测滤液；
16.第四步、对待检测滤液进行lc-ms检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得代谢物；
17.第五步、检测到的代谢物与污染模型代谢标志物进行比对，如相符则说明市售冻虾仁被相应的致病菌污染。
18.通过上述方法的对比检测，可以同时对两种致病菌进行检测，有效地提高了冻虾仁致病菌的检测效率。
19.进一步，优选所述冻虾仁致病菌污染模型的建立的步骤四中加入溶剂后采用超声提取，得所述提取液。
20.进一步，优选所述冻虾仁致病菌污染模型的建立的步骤四中的溶剂为甲醇，每0.1g冻干虾仁加入1ml甲醇进行提取。因为甲醇极性与大部分代谢物相似，有利于代谢物溶解。
21.进一步，优选所述冻虾仁致病菌污染模型的建立的步骤五中过滤采用微孔滤膜，微孔滤膜为0.22μm的有机系滤膜，采用该微孔滤膜能更好的截留溶质中的胶体颗粒和悬浮微粒,防止堵塞液相柱子。
22.进一步，本方案对金黄葡萄球菌、沙门氏菌交叉污染后所得出的污染代谢标志物进行进一步限定，所述步骤六中的污染代谢标志物为：l-norleucine、dl-dipalmitoylphosphatidylcholine、4-dodecylbenzenesulfonicacid、2,2'-methylenebis(4-methyl-6-tert-butylphenol)、adenine、l(-)-carnitine、hypoxanthine、5'-s-methyl-5'-thioadenosine、myristylsulfate、palmitoyl ethanolamide、dodecyl sulfate、(r)-3-hydroxy myristicacid、adenosine和bis(2-ethylhexyl)phthalate。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本设计方案由金黄葡萄球菌、沙门氏菌组合后的混合致病菌对冻虾仁进行交叉污染，建立冻虾仁致病菌污染模型。通过培养、提取、检测以及代谢组学分析得到污染代谢标志物。再对市场上待检测的冻虾仁用污染模型同样的方法进行检测和分析，如结果与污染代谢标志物相符，则说明市售虾仁被相应的致病菌污染。该检测方法具有以下明显有益效果：
25.(1)该方法中所用的lc-ms是代谢组学运用得比较广泛和成熟的分析方法，具有高
通量、高分辨率及高灵敏度的特性，重现性好；
26.(2)该方法可用于高通量代谢指纹分析，可以同时检测出冻虾仁中两种致病菌的代谢物，确定两种致病菌污染；
27.(3)该方法检测时只需要取样、提取、检测、分析过程，中间没有培养菌的长时间等待，可在一个工作日完成，检测效率较高，能满足冻虾仁致病菌污染快速反应需要。
附图说明
28.图1为实施例1中pca聚类分析结果；
29.图2为实施例2中pca聚类分析结果；
30.图3为实施例3中鉴定培养基鉴定结果；
31.图4为实施例3中pca聚类分析结果。
具体实施方式
32.以下结合附图通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
33.实施例1
34.本实施例主要进行的是被金黄葡萄球菌和沙门氏菌组成的致病菌污染后的冻虾仁的污染模型建立。具体如下：
35.步骤一、取市售冻虾仁解冻，沥干水分，取1只冻虾仁置于灭菌烧杯中，加10ml蒸馏水震荡5min，灭菌纱布过滤，取滤液分别用金黄葡萄球菌和沙门氏菌鉴定培养基鉴定均为阴性，显示没被金黄葡萄球菌和沙门氏菌污染。金黄葡萄球菌atcc6538(购自海博生物)和沙门氏菌cmcc(b)50335(购自环凯微生物)各取少量分别用增菌液增菌后离心，收集菌体细胞，取少量菌体细胞用生理盐水稀释成1000cfu/ml，各取100μl混合后接种沥干水分的虾仁2只，得到污染后的冻虾仁；
36.步骤二，对污染后的冻虾仁在37℃培养箱中培养2h，得到培养后的冻虾仁；
37.步骤三，对所述培养后的冻虾仁进行冻干处理，除去水分，得到冻干的冻虾仁；
38.步骤四，在所述冻干的冻虾仁中加入有机溶剂并提取，得提取液；每0.1g冻干的冻虾仁加甲醇1ml，超声提取10min，超声功率密度为100w/l。
39.步骤五、对所述提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液；相关具体操作条件为：提取液离心(6000r/min，20min)，取上清液过0.22μm的有机系微孔滤膜，最后得滤液；
40.步骤六、对步骤五中的滤液进行lc-ms检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得到污染代谢标志物，污染模型建立完成。具体如下：
41.取滤液上样进行lc-ms检测。lc为美国thermo scientific公司的超高效液相色谱仪，型号为uitimate3000，条件为：acquity uplc beh c18柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)，柱温30℃；流速0.35ml/min；进样量10μl。流动相a为乙腈，流动相b为0.5％甲酸；梯度洗脱条件：0～3.0min，70％a、30％b；3.0～5.0min，70％～38％a，30％～62％b；5.0～15.0min，3.8％～8％a，62％～92％b；15.0～16.5min，18％～1％a，82％～99％b；16.5～18.0min，1％a、
99％b；18.0～18.1min，1％～70％a，99％～30％b；18.1～20.0min，70％a、30％b。ms为美国thermo scientific公司生产的高分辨质谱仪，型号q exactive，加热电喷雾离子源(heated electrospray ionization,hesi)。正离子模式：温度350℃，喷雾电压3.5kv，离子传输管温度320℃，鞘气流速40arb；辅助器流速10arb；吹扫气流速0arb。负离子模式：温度350℃，喷雾电压3.1kv，离子传输管温度320℃，鞘气流速40arb，辅助器流速10arb，吹扫气流速10arb。full ms/dd ms2扫描模式，采集范围为m/z 100～1500，正负离子同时采集；一级质谱分辨率为70000，二级质谱分辨率为17500。
42.在步骤六中进行代谢组学分析时，另取少量经鉴定无污染的虾仁作为污染模型的对照样品；挑取金黄葡萄球菌和沙门氏菌分别用增菌液增菌后离心，收集菌体细胞，得到致病菌分析样品；对致病菌分析样品和污染模型的对照样品进行冻干、提取和检测，其冻干、提取和检测所用的方法与污染模型建立中所涉及的冻干、提取和检测方法一致；检测数据使用compound discoverer 3.1软件进行代谢组学分析，软件运行设定area(max.)为100000000、mzcloud best match为99.0，分析污染模型与致病菌和无污染虾仁相比代谢物的差异，得到污染代谢标志物。采用本段技术方案可以得出所得到的污染代谢标志物既不来源于无污染虾仁，也不来源于致病菌，而是来源于污染模型。
43.pca聚类分析结果如图1所示，其中：germ1为金黄葡萄球菌，germ3为沙门氏菌，normal为对照，inf为污染模型。
44.污染代谢标志物为：l-norleucine、l(-)-carnitine、hypoxanthine、adenine、2,2'-methylenebis(4-methyl-6-tert-butylphenol)、4-dodecylbenzenesulfonic acid、dl-dipalmitoylphosphatidylcholine、5'-s-methyl-5'-thioadenosine、myristyl sulfate、palmitoyl ethanolamide、dodecyl sulfate、(r)-3-hydroxy myristic acid、adenosine和bis(2-ethylhexyl)phthalate。
45.实施例2
46.本实施例主要进行的是被金黄葡萄球菌和沙门氏菌组成的致病菌污染后的冻虾仁的污染模型建立。具体如下：
47.步骤一、取市售冻虾仁解冻，沥干水分，取1只冻虾仁置于灭菌烧杯中，加10ml蒸馏水震荡5min，灭菌纱布过滤，取滤液分别用金黄葡萄球菌和沙门氏菌鉴定培养基鉴定均为阴性，显示没被金黄葡萄球菌和沙门氏菌污染。金黄葡萄球菌atcc6538(购自海博生物)和沙门氏菌cmcc(b)50335(购自环凯微生物)各取少量分别用增菌液增菌后离心，收集菌体细胞，取少量菌体细胞用生理盐水稀释成1000cfu/ml，各取100μl混合后接种沥干水分的虾仁2只，得到污染后的冻虾仁；
48.步骤二，对污染后的冻虾仁在37℃培养箱中培养2h，得到培养后的冻虾仁；
49.步骤三，对所述培养后的冻虾仁进行冻干处理，除去水分，得到冻干的冻虾仁；
50.步骤四，在所述冻干的冻虾仁中加入有机溶剂并提取，得提取液；每0.1g冻干的冻虾仁加甲醇1ml，超声提取5min，超声功率密度为50w/l。
51.步骤五、对所述提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液；相关具体操作条件为：提取液离心(7000r/min，15min)，取上清液过0.22μm的有机系微孔滤膜，最后得滤液；
52.步骤六、对步骤五中的滤液进行lc-ms检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得
到污染代谢标志物，污染模型建立完成。具体如下：
53.取滤液上样进行lc-ms检测。lc为美国thermo scientific公司的超高效液相色谱仪，型号为uitimate3000，条件为：acquity uplc beh c18柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)，柱温30℃；流速0.35ml/min；进样量10μl。流动相a为乙腈，流动相b为0.5％甲酸；梯度洗脱条件：0～3.0min，70％a、30％b；3.0～5.0min，70％～38％a，30％～62％b；5.0～15.0min，3.8％～8％a，62％～92％b；15.0～16.5min，18％～1％a，82％～99％b；16.5～18.0min，1％a、99％b；18.0～18.1min，1％～70％a，99％～30％b；18.1～20.0min，70％a、30％b。ms为美国thermo scientific公司生产的高分辨质谱仪，型号q exactive，加热电喷雾离子源(heated electrospray ionization,hesi)。正离子模式：温度350℃，喷雾电压3.5kv，离子传输管温度320℃，鞘气流速40arb；辅助器流速10arb；吹扫气流速0arb。负离子模式：温度350℃，喷雾电压3.1kv，离子传输管温度320℃，鞘气流速40arb，辅助器流速10arb，吹扫气流速10arb。full ms/dd ms2扫描模式，采集范围为m/z 100～1500，正负离子同时采集；一级质谱分辨率为70000，二级质谱分辨率为17500。
54.在步骤六中进行代谢组学分析时，另取少量经鉴定无污染的虾仁作为污染模型的对照样品；挑取金黄葡萄球菌和沙门氏菌分别用增菌液增菌后离心，收集菌体细胞，得到致病菌分析样品；对致病菌分析样品和污染模型的对照样品进行冻干、提取和检测，其冻干、提取和检测所用的方法与污染模型建立中所涉及的冻干、提取和检测方法一致；检测数据使用compound discoverer 3.1软件进行代谢组学分析，软件运行设定area(max.)为100000000、mzcloud best match为99.0，分析污染模型与致病菌和无污染虾仁相比代谢物的差异，得到污染代谢标志物。采用本段技术方案可以得出所得到的污染代谢标志物既不来源于无污染虾仁，也不来源于致病菌，而是来源于污染模型。
55.pca聚类分析结果如图2所示，其中：germ1为金黄葡萄球菌，germ3为沙门氏菌，normal为对照，inf为污染模型。
56.污染代谢标志物为：l-norleucine、l(-)-carnitine、hypoxanthine、adenine、2,2'-methylenebis(4-methyl-6-tert-butylphenol)、4-dodecylbenzenesulfonic acid、dl-dipalmitoylphosphatidylcholine、5'-s-methyl-5'-thioadenosine、myristyl sulfate、palmitoyl ethanolamide、dodecyl sulfate、(r)-3-hydroxy myristic acid、adenosine和bis(2-ethylhexyl)phthalate。
57.实施例3
58.本实施例是对实施例1-2的污染模型在具体检测时的应用，具体如下：
59.第一步、取市售冻虾仁解冻，沥干水分，取1只置于灭菌烧杯中，加10ml蒸馏水震荡5min，灭菌纱布过滤，取滤液分别用金黄葡萄球菌和沙门氏菌鉴定培养基鉴定为阳性，表明被金黄葡萄球菌和沙门氏菌污染(图3，其中：a为金黄葡萄球菌鉴定培养基鉴定结果，b为沙门氏菌鉴定培养基鉴定结果)。对冻虾仁进行冻干处理，除去水分，得到冻干的待检测样品。
60.第二步、在所述得到冻干的待检测样品中加入甲醇并提取，得待检测提取液；每0.1g冻干物质加甲醇1ml；为了提高提取速度采用超声提取，超声提取10min，超声功率密度为100w/l。
61.第三步、对所述待检测提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液，得到待检测滤液；具体采用离心参数为：转速6000r/min，时间20min；取上清
液过0.22μm的有机系微孔滤膜。
62.第四步、对待检测滤液进行lc-ms检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得代谢物。具体操作如下：
63.lc为美国thermo scientific公司的超高效液相色谱仪，型号为uitimate3000，条件为：acquity uplc beh c18柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)，柱温30℃；流速0.35ml/min；进样量10μl。流动相a为乙腈，流动相b为0.5％甲酸；梯度洗脱条件：0～3.0min，70％a、30％b；3.0～5.0min，70％～38％a，30％～62％b；5.0～15.0min，3.8％～8％a，62％～92％b；15.0～16.5min，18％～1％a，82％～99％b；16.5～18.0min，1％a、99％b；18.0～18.1min，1％～70％a，99％～30％b；18.1～20.0min，70％a、30％b。ms为美国thermo scientific公司生产的高分辨质谱仪，型号q exactive，加热电喷雾离子源(heated electrospray ionization,hesi)。正离子模式：温度350℃，喷雾电压3.5kv，离子传输管温度320℃，鞘气流速40arb；辅助器流速10arb；吹扫气流速0arb。负离子模式：温度350℃，喷雾电压3.1kv，离子传输管温度320℃，鞘气流速40arb，辅助器流速10arb，吹扫气流速10arb。full ms/dd ms2扫描模式，采集范围为m/z 100～1500，正负离子同时采集；一级质谱分辨率为70000，二级质谱分辨率为17500。
64.另取少量经鉴定无污染的虾仁作为对照样品；挑取金黄葡萄球菌和沙门氏菌分别用增菌液增菌后离心，收集菌体细胞，得到等致病菌分析样品；对致病菌分析样品和对照样品进行冻干、提取和检测，其冻干、提取和检测所用的方法与本实施例中所涉及的冻干、提取和检测方法一致；检测数据使用compound discoverer 3.1软件进行代谢组学分析，软件运行设定area(max.)为100000000、mzcloud best match为99.0，分析待检测样品与待检测致病菌和无污染虾仁相比代谢物的差异，得到代谢物。采用本段技术方案可以得出所得到的污染代谢物既不来源于无污染虾仁，也不来源于致病菌，而是来源于待检测样品。
65.pca聚类分析结果如图4所示，其中：germ1为金黄葡萄球菌，germ3为沙门氏菌，normal为对照，inf为污染模型。
66.检测到的代谢物为：l-norleucine、dl-dipalmitoylphosphatidylcholine、2,2'-methylenebis(4-methyl-6-tert-butylphenol)、l(-)-carnitine、hypoxanthine、4-dodecylbenzenesulfonic acid、adenine、(r)-3-hydroxy myristic acid、5'-s-methyl-5'-thioadenosine、myristyl sulfate、palmitoyl ethanolamide、dodecyl sulfate、adenosine和bis(2-ethylhexyl)phthalate。
67.第五步、将本实施例步骤四中的代谢物与实施例1-2中的污染代谢标志物进行比对，两者相同。