TCP19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用

tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用。


背景技术：

2.水稻纹枯病(rice sheath blight)是一种世界性病害，由立枯丝核菌(rhizoctonia solani k
ü
hn)引起。该病菌寄主范围广，致病力强，严重影响水稻高产稳产。目前，病害防控手段以化学防治为主，但化学防治成本高、污染环境，且易导致病原菌产生抗药性。因此，采用资源节约型和环境友好型防治措施成为农业生产的迫切需求。选育和栽培抗病品种是水稻纹枯病最为经济、安全和有效的防治策略。
3.转录调控是真核生物基因表达调控的重要机制。植物在受到病原物侵袭时，入侵信号会通过一个复杂的级联途径传递到植物细胞内，激发转录因子启动下游靶基因的转录表达，作为抗病响应。目前，已有多项研究证实转录因子参与水稻抗纹枯病调控。前人研究表明，wrky家族中转录因子oswrky4、oswrky80和oswrky13均正调控水稻对纹枯病的抗性；转录因子osasr2可通过调控防御基因os2h16的表达提高对纹枯病的抗性；过表达转录因子lpa1可激活pin-formed1a提高水稻对纹枯病的抗性；lpa1可与转录因子osidd3和osidd13形成转录复合体共同调控水稻对纹枯病的抗性。但是目前关于转录因子调控水稻纹枯病的研究较少，仍有待继续深入挖掘并研究。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，tcp19转录因子负调控水稻对纹枯病的防御反应，tcp19过表达对纹枯病更敏感，敲除tcp19增强水稻对纹枯病的抗性，对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述tcp19蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，编码所述tcp19蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明还提供了一种高抗水稻纹枯病的水稻种质的创制方法，包括抑制目标水稻的基因组中tcp19蛋白的表达。
9.优选的，所述抑制的方法包括基因敲除。
10.有益效果：本发明提供了tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，实施例中通过crispr/cas9基因编辑对受体水稻中的tcp19蛋白质的编码基因进行编辑，获得tcp19敲除的转基因植株tcp19。同时通过过表达转基因技术获得tcp19过表达转基因植株tcp19-ox。通过纹枯病抗性鉴定发现，与野生型水稻对照相比，tcp19更抗病，tcp19-ox更感病。证实tcp19蛋白与水稻对纹枯病的抗性相关，tcp19敲除增强水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质，证实了本发明所述应用对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的
有效防控具有重要意义。
附图说明
11.图1为tcp19转化株系测序分析图；
12.图2为tcp19-ox转化株系分子检测图；
13.图3为tcp19和tcp19-ox转基因水稻接种纹枯病后表型。
具体实施方式
14.本发明提供了tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述tcp19蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示：mdvtgdgggggqrpnfplqllgkkeeqtcstsqtagaggggvvgangsaaaappkrtstkdrhtkvdgrgrrirmpaicaarvfqltrelghktdgetiewllqqaepaviaatgtgtipanftslnislrssgsslsipshlrlaglagprfgggaraadawdrvvglgfggaadapssatsssssplllsfhsgsvgldvsppsastspaaadlsrkrrweqemqqqqqyqqqmagytqsqipagtvwmvpssnaqaagggappggggesiwtfpqsg。
15.在本发明中，编码所述tcp19蛋白的核苷酸序列优选如seq id no.2所示：atggatgtcaccggagacggcggaggaggagggcaacggcccaatttccccctgcagctcctcgggaagaaggaggagcagacgtgctcgacgtcgcagactgccggggcgggcggcggcggcgtcgtgggcgcgaatgggtcggcggcggcggcgccgccgaagcggacgtcgacgaaggaccggcacacgaaggtggacgggcgggggcggcgcatccggatgccggcgatctgcgccgcgcgggtgttccagctgacgcgggagctcgggcacaagaccgacggcgagaccatcgagtggctgctgcagcaggcggagccggcggtgatcgcggcgaccgggacgggcaccatcccggccaacttcacctccctcaacatctccctccgctcctccggctcgtcgctctccatcccttctcacctccgccttgccggcttggctggccctcgcttcggcggcggcgcgcgggcggcggacgcgtgggaccgcgtcgtcggcctcgggttcggcggtgcggccgacgccccgtcctccgccacctcctcctcctcgtcgccgcttctgctgagcttccactccggtagcgtcggccttgacgtgtcgccgccgtcggcgtcgacctccccggccgccgccgacctctcccggaagcggcggtgggagcaagaaatgcagcagcagcagcagtaccagcagcagatggccgggtacacgcagagccaaattcctgcgggcacggtgtggatggtgccgagcagcaacgcgcaggccgccggtggcggcgctccgccgggaggcggcggcgagtcgatttggacgttcccgcagtcagggagcggcggcggcggcggcgcggcgacagtgtaccgtggcgtgccaagcggactacatttcatgaacttcccggcgacaccaatggcgctgctccccggcgggcagcagctcggcctcgccggcgccggcgggggtggcgaggggcacccggggatcctcgccgcgctcaatgcctaccgcgcacaggccgcgcagccggacgccggcgcggcggcgcagaatggagcgcaaggctcaagtcagcatcgtcagcatcagcatcacggcggcggcggcggcggcggcgacgagcggcatgagagcatgagcgccagcgactcgtag。
16.本发明所述调控优选包括通过基因编辑方法，对水稻基因组中的tcp19蛋白质的编码基因进行敲除和超表达，并通过纹枯病抗性鉴定，结果发现与野生型水稻对照相比，经基因敲除后的突变株更抗病，超表达的突变株更感病，证实tcp19蛋白与水稻对纹枯病的抗性相关，tcp19敲除增强水稻对纹枯病的抗性，可用于创制水稻纹枯病抗性新种质。本发明对所述tcp19敲除的方法并没有特殊限定，优选包括利用crispr/cas9基因编辑对受体水稻中的tcp19蛋白质的编码基因进行编辑。
17.本发明所述抑制tcp19蛋白表达，优选包括敲除水稻基因组中tcp19蛋白的编码基因。本发明优选通过crispr/cas9基因编辑技术进行基因敲除，实施例中优选提供tcp19基因序列给公司，由百格基因科技有限公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转
化。
18.本发明还提供了一种高抗水稻纹枯病的水稻种质的创制方法，包括抑制目标水稻的基因组中tcp19蛋白的表达。
19.本发明所述抑制的方法优选包括基因敲除，所述基因敲除的方法优选包括crispr/cas9基因编辑。本发明所述crispr/cas9基因编辑的方法优选与上述相同，在此不再赘述。
20.下面结合实施例对本发明提供的tcp19蛋白在调控水稻抗纹枯病中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
21.实施例1
22.crispr/cas9基因编辑转基因水稻植株tcp19的获得
23.1)转基因水稻的获得
24.提供tcp19基因序列(seq id no.2)给公司，由公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化，转化水稻品种zh11。最终得到t0代转基因水稻。
25.2)转基因水稻的鉴定
26.得到的转基因植株进一步经测序分析验证，如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，5#和12#植株在tcp19编码区281bp处增加了1个t碱基，而25#和26#突变体植株在281bp处增加了1个g碱基(图1中a)，图谱分析显示25#为杂合态，5#、12#和26#为纯合态(图1中b)。
27.测序引物：tcp19-f1(seq id no.3)：tcctcgggaagaaggaggag
28.tcp19-r1(seq id no.4)：aagcgagggccagccaag。
29.实施例2
30.tcp19过表达转基因水稻植株的获得
31.1)用于过表达tcp19基因的重组载体构建
32.ostcp19基因的核苷酸序列为seq id no.2第1-1164位核苷酸，编码的蛋白为ostcp19，该蛋白的氨基酸序列为seq id no.1。
33.扩增序列片段克隆入植物表达载体pga1611载体(piao hl,xuanyh,park sh,je bi,park sj,park sh,kim cm,huang j,wang gk,kim mj,kang sm,lee ij,kwon tr,kimyh,yeo us,yi g,son d,han cd.oscipk31,acbl-interactingprotein kinase is involved in germination and seedling growth under abiotic stress conditions in rice plants.mol cells.2010,30:19-27；公众可从韩国国立庆尚大学获得)骨架连接，得到ostcp19基因的过表达载体。
34.2)过表达ostcp19基因转基因水稻的获得
35.将上述获得的pga1611-ostcp19过表达载体转入农杆菌lba4404，并转化水稻品种zh11，潮霉素筛选，获得t0代转pga1611-ostcp19水稻，即为tcp19-ox过表达转基因株系，命名为tcp19-ox。具体操作由未米生物公司完成。
36.2)tcp19-ox转基因水稻植株分子鉴定
37.对上述获得的7个t0代tcp19-ox转基因水稻和野生型水稻zh11(wt)进行分子鉴定，提取各种水稻根的总rna经反转录后，用如下引物进行rt-pcr方法鉴定：
38.tcp19-f2(seq id no.5):ttggcgacctcgtattgggaa
39.tcp19-r2(seq id no.6):caaagatcgttatgtttatcggcact
40.内参基因为ubiquitin，内参引物为
41.ubiquitin-f(seq id no.7):cacggttcaacaacatccag
42.ubiquitin-r(seq id no.8):tgaagaccctgactgggaag
43.结果如图2所示，tcp19-ox转基因水稻ox12、ox17和ox31中tcp19表达量均明显比野生型高。
44.实施例3
45.tcp19转基因水稻和tcp19-ox转基因水稻接种抗纹枯病后表型观察
46.采用活体和离体接种纹枯病菌的方法进行抗性鉴定。
47.离体接种：将4℃保存的常规纹枯病菌菌株接种于pda平板培养基上，待2-3d长满皿备用。水稻生长到4-5叶期时，从顶叶剪取10cm左右的叶段，叶背朝上平铺于灭菌的用6-ba润湿的滤纸上。将长满菌的pda平板用灭菌的打孔器打孔，菌饼贴于水稻叶片中间平整部位上，每个处理10片叶段，设置3次重复。喷布无菌水对叶片进行保湿，26℃培养箱培养。每12h调查记录病斑扩展情况。
48.活体接种：用喷壶将待接菌的水稻叶鞘部位喷湿。用无菌镊子取长满纹枯病菌菌丝的木皮，插入水稻植株下数第三片叶子的叶鞘中。再次用喷壶喷湿夹有木皮的叶鞘部位，用保鲜膜缠住接菌部位进行保湿，置于正常生长条件下继续培养。72h后取下保鲜膜。每个处理3次重复。接种10～15d后调查统计。
49.tcp19突变体植株活体接种结果显示，tcp19突变体植株的病斑小于野生型病斑，26#植株表现更抗病(图3中a)；离体接种病斑面积占叶片面积显著高于突变体植株，与活体结果相一致(图3中b)。
50.tcp19-ox转基因植株离体接种结果显示过表达植株的病斑面积占叶片面积的70％以上，而野生型只有30％左右，且过表达植株的云纹状病斑更典型(图3中c)；活体接种时，病斑长度较野生型也更长(图3中d)，说明过表达植株更感纹枯病菌。
51.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。