一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法

1.本发明涉及奶牛的分子育种技术领域，更具体地，涉及一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法。


背景技术：

2.由单个碱基发生转换、颠换、插入或缺失而导致dna序列多态性即单核苷酸多态性是基因多态性的主要来源。snp属第三代多态性标记，是动物品系遗传变异的重要依据，已被广泛用于群体遗传学研究。以凝胶电泳为主的经典snp检测方法有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,rf lp)、单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,sscp)、变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，dgge)、等位基因特异pcr(allele specific pcr，as-pcr)。高通量测序是近年来迅速发展起来的snp检测法，包括dna测序法、dna芯片检测、基于酶切的简化基因组测序(restriction-site associated dna sequence，rad-seq)、飞行质谱仪检测法(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，maldi-tofms)、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，dhp lc)等等。对于一般的分子实验室来说，高通量测序法由于设备昂贵、所需技术熟练而不利于在普通分子实验室广泛展开研究。传统的研究方法中，sscp法存在假阴性结果且操作复杂、耗时冗长，并非理想snp检测法。
3.奶牛生产性能测定(dairy herd improvement，dhi)通过检测每头牛的生产性能，把奶牛的数量性状科学化、数据化，群体与个体水平两者兼顾，提高牧场管理水平，提高经济效应。
4.dhi报告大致分为营养指标、繁殖指标、牛奶质量及奶厅管理指标三个方面。营养指标包括日产奶量、脂蛋比、持续力、高峰奶、高峰日、校正奶、305天产奶量、成年当量等。繁殖指标包括泌乳天数、产犊间隔、尿素氮等。牛奶质量及奶厅管理指标包括体细胞数、乳脂率、乳蛋白率、隐形乳房炎比例等。基础检测指标有日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、体细胞数、乳糖率及总固体率。
5.(1)日产奶量：泌乳奶牛测试日的总产奶量，单位为千克，反应奶牛当前实际产奶水平。
6.(2)乳脂率：牛奶中所含脂肪百分比。
7.(3)乳蛋白率：牛奶中所含蛋白百分比。
8.(4)乳糖率：牛奶中所含乳糖百分比。
9.(5)体细胞数(scc)：每毫升牛奶中白细胞的含量，包括淋巴细胞、巨噬细胞、多形核噬中性细胞等，是奶牛乳房健康与否的重要标志。
10.在自然界中，乳糖仅存在于哺乳动物的乳汁中，是乳汁中三大营养物质之一，牛奶中有1/4总热量来自乳糖。正常牛奶中含有4.6％-5.0％乳糖，其高低会影响牛乳品质，同时参与维持肠道菌群的稳定，同时也提示机体发生某些病变。比如奶牛患有结核病、乳房炎
时，牛奶中乳糖含量急剧下降。乳糖由葡萄糖和半乳糖组成，其中半乳糖通过与神经酰胺结合而影响大脑发育。乳糖通过影响进入乳腺细胞的水分而影响产奶量。对乳糖调节的研究有助于解决乳糖不耐受症，通过降低牛奶中乳糖浓度可改善患者的乳糖不适反应，相比药物介导大大降低治疗成本。
11.中国专利已经公开了与荷斯坦奶牛乳蛋白率及305天产奶量相关的分子标记；与荷斯坦奶牛总产奶量及高峰奶相关的分子标记；与荷斯坦奶牛乳蛋白率及体细胞数相关的分子标记。目前尚未公开与奶牛乳糖率相关的snp标记及应用。
12.脂多糖结合蛋白因其与脂多糖易结合而得名，在肝脏产生，存在于血清，是一种血浆蛋白。lbp通过与lps结合形成复合体来控制lps反应，cd14进一步与lbp/lps复合体结合，激活toll样受体4(toll-like receptors 4，tlr4)，释放促炎因子和趋化因子，诱导炎症反应。尚未发现其与奶牛生产性能相关。


技术实现要素：

13.本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法。rflp法技术简单，可直接根据琼脂糖电泳结果判断个体基因型，固本发明利用dna直接测序法和pcr-rflp法相结合的技术，检测lbp基因snp位点多态性对中国荷斯坦奶牛乳糖性状的影响。
14.本发明以奶牛为实验对象，通过dna直接测序和pcr-rflp方法对lbp基因进行单核苷酸多态性分析，探究lbp基因多态性与奶牛生产性状的相关关系。以待测奶牛全基因组dna为模板，以引物i2为引物，pcr扩增lbp基因第二内含子区的部分序列，把限制性内切酶afl ii作用于pcr产物，用琼脂糖电泳检测酶切产物，根据条带长度鉴定奶牛lbp基因上snp位点的基因型。结果表明从该群体中，发现一个snp位点，位于lbp基因第二内含子区第1095位碱基，即i2-1095 g》a。相关性分析发现该snp位点不同基因型与乳糖性状呈极显著关系，当个体基因型为ga，其乳糖性状极显著高于gg基因型个体。该位点可作为奶牛选种选育的分子标记。
15.本发明的第一个目的是提供一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂。
16.本发明的第二个目的是提供所述的试剂在评估奶牛乳汁中乳糖含量或制备评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂盒中的应用。
17.本发明的第三个目的是提供一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法。
18.本发明的第四个目的是提供一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂盒。
19.本发明的第五个目的是提供所述试剂、所述方法、或权利要求6所述试剂盒中的一种或几种在奶牛乳汁中乳糖含量的分子育种中的应用。
20.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
21.本发明按要求保护一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂，所述试剂用于检测ars-ucd1.2版本nc_037340.1：67219155的基因型，其基因型为ga的奶牛个体乳汁中乳糖含量高于基因型为gg的奶牛个体乳汁中乳糖含量。
22.还要求保护所述的试剂在评估奶牛乳汁中乳糖含量或制备评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂盒中的应用。
23.以及一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法，检测ars-ucd1.2版本nc_037340.1：
67219155的基因型，其基因型为ga的奶牛个体乳汁中乳糖含量高于基因型为gg的奶牛个体乳汁中乳糖含量。
24.优选地，使用核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物检测ars-ucd1.2版本nc_037340.1：67219155的基因型，其基因型为ga的奶牛个体乳汁中乳糖含量高于基因型为gg的奶牛个体乳汁中乳糖含量。
25.上游引物序列：5
’‑
tgaaggcttgacaacggag-3’(seq id no:1)；
26.下游引物序列：5
’‑
agacccacagaagaggcatc-3’(seq id no:2)。
27.pcr体系为：green taq mix 10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、dna模板1.0μl、ddh2o 8μl，总体积20μl。
28.pcr扩增程序为：95 5min；95 30s，60 45s，72 1min，30个循环；72 5min。
29.pcr产物经1.5％琼脂糖电泳检测，电泳条件：120v、400ma、15min。确认条带单一、长度正确、无特异性条带后进行测序。
30.更优选地，所述引物的pcr产物，使用内切酶afl ii进行酶切，酶切后电泳有624bp一条条带的为gg基因型个体，有624bp、234bp和390bp三条条带的为ga基因型个体，有234bp和390bp两条条带为aa基因型共个体。
31.pcr产物经1.5％琼脂糖电泳检测，电泳条件：120v、400ma、15min。确认条带单一、长度正确、无特异性条带后使用内切酶afl ii进行酶切，酶切体系为：pcr产物14μl、afl ii酶0.2μl、10
×
rcutsmart buffer 2μl、ddh2o 3.8μl，总体积10μl。
32.反应体系置于37℃恒温培养箱孵育2h，取5μl酶切产物经2.5％琼脂糖电泳检测条带长度进行基因型鉴定。电泳条件：80v、400ma、10min。
33.还以及，一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂盒含有所述的试剂。
34.优选地，所述试剂为核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物。
35.上游引物序列：5
’‑
tgaaggcttgacaacggag-3’(seq id no:1)；
36.下游引物序列：5
’‑
agacccacagaagaggcatc-3’(seq id no:2)。
37.更优选地，还含有pcr试剂，包括但不限于green taq mix。
38.再优选地，还含有内切酶afl ii和10
×
rcutsmart buffer。
39.进一步要求保护所述试剂、所述方法、或所述试剂盒中的一种或几种在奶牛乳汁中乳糖含量的分子育种中的应用。
40.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
41.以奶牛为对象，发现了获得了影响奶牛乳糖性状相关的分子标记，即i2-1095g》a，并且发现ga基因型个体的乳糖含量极显著高于gg基因型个体，可作为奶牛选育的分子遗传标记位点。并建立评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法，该方法技术简单、结果可靠，且相较于高通量测序，大大降低成本。可用于我国奶牛生产性能分子育种，从而能够建立优良遗传资源的奶牛群。
附图说明
42.图1为lbp目的片段pcr扩增电泳图；m为dl2,000dna marker，泳道1、2为以dna混池作模板扩增lbp目的片段的电泳结果。
43.图2为混池pcr扩增lbp目的片段的测序结果。
44.图3为单个样品dna作模板扩增lbp目的片段结果；m为dl2,000dna marker，泳道1～8为个体dna扩增目的片段结果。
45.图4为酶切pcr产物结果；m为dl2,000dna marker，泳道1～5个体基因型分别为gg、aa、ga、ga、aa。
具体实施方式
46.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
47.实施例1牛lbp基因序列扩增引物的设计及序列扩增
48.一、实验方法
49.1、样本获取及dna混池的制备
50.选用饲养环境相同的203头荷斯坦奶牛，采用颈静脉采血并进行抗凝处理，采集完的血样于-80℃储存。使用血液dna提取试剂盒(北京天根)提取个体样本的dna，得到个体全基因组dna及dna混池，dna于-20℃保存。
51.2、牛lbp基因序列扩增引物的的设计和合成
52.根据ensembl中公布的牛lbp基因序列(ensbtat00000022428.3)，利用设计引物，上游引物序列：5
’‑
tgaaggcttgacaacggag-3’(seq id no:1)；下游引物序列：5
’‑
agacccacagaagaggcatc-3’(seq id no:2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
53.3、dna混池pcr扩增及测序
54.以荷斯坦奶牛dna混池为模板进行pcr扩增，pcr体系见表1。pcr扩增程序见表2。pcr产物经1.5％琼脂糖电泳检测，电泳条件：120v、400ma、15min。确认条带单一、长度正确、无特异性条带后，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
55.4、结果分析
56.用chromas软件观察重叠峰。
57.表1.pcr反应体系
[0058][0059][0060]
表2.pcr反应程序
[0061][0062]
二、实验结果
[0063]
引物扩增的基因序列长度为624bp。电泳结果如图1，结果显示pcr产物条带单一清晰、特异性好、无拖尾现象及非特异性条带。参考dl2,000dna marker标识，所示条带长度与目的条带相符。
[0064]
pcr扩增产物测序结果如图2，发现一个重叠峰，该峰位于扩增产物237bp处。定位至lbp基因序列，该突变位点位于ars-ucd1.2版本nc_037340.1：67219155，即lbp基因组第13染色体第67219155位核苷酸，由g突变为a，即i2-1095 g》a。
[0065]
实施例2个体奶牛lbp基因序列扩增及pcr-rflp鉴定
[0066]
一、实验方法
[0067]
1、待测奶牛个体lbp基因序列扩增
[0068]
以实施例1中的203头荷斯坦奶牛的血液全基因组dna为模板，分别进行扩增，扩增体系、反应程序同实施例1。pcr产物使用1.5％琼脂糖电泳检测。电泳条件：120v、400ma、15min。
[0069]
2、pcr-rflp法基因分型
[0070]
用限制性内切酶afl ii对pcr产物进行酶切反应，酶切体系见表3，反应体系置于37℃恒温培养箱孵育2h。取5μl酶切产物经2.5％琼脂糖电泳检测条带长度进行基因型鉴定。电泳条件：80v、400ma、10min。
[0071]
表3.酶切体系
[0072][0073]
二、实验结果
[0074]
奶牛个体lbp基因扩增电泳结果如图3，电泳结果显示pcr产物条带单一清晰、特异性好、无拖尾现象及非特异性条带。参考dl2,000dna marker标识，所示条带长度与目的条带相符。符合后续进行酶切实验条件。
[0075]
限制性内切酶afl ii酶切结果如图4，酶切位点位于pcr产物第234bp，若snp位点
碱基为g，表现为624bp一条条带；若碱基为a，表现为234bp和390bp两条条带。相应地，gg基因型个体电泳结果表现为624bp一条条带；ga基因型个体电泳结果表现为624bp、234bp和390bp三条条带；aa基因型个体电泳结果表现为234bp和390bp两条条带。
[0076]
实施例3奶牛lbp基因i2-1095 g》a位点与奶牛乳品质性状的相关性分析
[0077]
一、实验方法
[0078]
根据实施例2的结果，利用popgen32统计实施例1的203头荷斯坦奶牛的基因频率、基因型频率、有效等位基因数(ne)、遗传杂合度(h)；利用pic软件计算多态信息含量(pic)；利用spss 23.0软件进行i2-1095 g》a位点与牛奶品质性状的差异显著性检验。p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著，以“平均数
±
标准误”表示性状数值。
[0079]
二、实验结果
[0080]
i2-1095 g》a位点等位基因g和a的基因频率分别为0.6814和0.3186，优势等位基因为g。该位点有三种基因型，分别为gg、ga、aa，其基因型频率分别为0.4706、0.4216、0.1078，优势基因型为ga。卡方值为0.173，p》0.05，说明该位点在群体中符合hardy-weinberg平衡状态。
[0081]
多态信息含量(polymorphism information content，pic)用于检测等位基因频率的分布，评估等位基因在群体中的多态性。当pic《0.25，表示等位基因在群体中处于低度多态；当0.25《pic《0.50，表示等位基因在群体中处于中度多态；pic》0.50，表示等位基因在群体中处于高度多态。该snp位点两个等位基因的pic值为0.34，遗传杂合度(h)值为0.4342，均介于0.25与0.50之间，表明等位基因g和a在该群体中处于中度多态。
[0082]
表4.lbp基因i2-1095 g》a位点的群体遗传参数
[0083][0084]
注：χ2值表示未达到显著水平(p》0.05)，χ
20.05
(df＝2)＝5.99
[0085]
实施例4奶牛lbp基因i2-1095 g》a位点基因型与乳品质性状关联性。
[0086]
一、实验方法
[0087]
对实施例1中的的203头荷斯坦奶牛的牛奶品质性状中产奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖、干物质、体细胞、尿素氮、校正奶这8个指标进行检测，并进行数据统计，并分析lbp基因snp位点不同基因型与乳品质性状关联性。
[0088]
二、实验结果
[0089]
在203个待测奶牛样品中，i2-1095 g》a位点3种基因型的产奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖、干物质、体细胞、尿素氮、校正奶8个指标的数据平均值如表5。
[0090]
表5.奶牛lbp基因多态性与乳品质性状相关性分析
[0091][0092]
注：小写字母不用表示差异极显著(p《0.01)，未标字母表述差异不显著(p》0.05)
[0093]
关联分析结果显示，除乳糖以外7个指标与i2-1095 g》a位点3种基因型无明显关联(p》0.05)，snp位点不同基因型与乳糖性状呈极显著相关。lbp基因i2-1095 g》a位点ga基因型个体乳糖性状极显著高于gg基因型个体(p《0.01)。
[0094]
实施例5一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法
[0095]
一、提取个体样本的dna
[0096]
二、pcr扩增及测序
[0097]
以荷斯坦奶牛dna混池为模板进行pcr扩增，
[0098]
上游引物序列：5
’‑
tgaaggcttgacaacggag-3’(seq id no:1)，
[0099]
下游引物序列：5
’‑
agacccacagaagaggcatc-3’(seq id no:2)；
[0100]
pcr体系为：green taq mix 10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、dna模板1.0μl、ddh2o 8μl，总体积20μl。
[0101]
pcr扩增程序为：95 5min；95 30s，60 45s，72 1min，30个循环；72 5min。
[0102]
pcr产物经1.5％琼脂糖电泳检测，电泳条件：120v、400ma、15min。确认条带单一、长度正确、无特异性条带后，进行测序。
[0103]
三、结果判读
[0104]
位于ars-ucd1.2版本nc_037340.1：67219155，即lbp基因组第13染色体第67219155位核苷酸，存在一个snp位点，其基因型为ga的奶牛个体乳汁中乳糖含量高于基因型为gg的奶牛个体乳汁中乳糖含量。
[0105]
实施例6一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂盒
[0106]
一、组成
[0107]
核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物和pcr试剂(green taq mix和ddh2o)。
[0108]
二、使用方法
[0109]
如实施例5。
[0110]
实施例7一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的方法
[0111]
一、提取个体样本的dna
[0112]
二、pcr扩增及测序
[0113]
以荷斯坦奶牛dna混池为模板进行pcr扩增，
[0114]
上游引物序列：5
’‑
tgaaggcttgacaacggag-3’(seq id no:1)，
[0115]
下游引物序列：5
’‑
agacccacagaagaggcatc-3’(seq id no:2)；
[0116]
pcr体系为：green taq mix 10μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、dna模板1.0μl、ddh2o 8μl，总体积20μl。
[0117]
pcr扩增程序为：95 5min；95 30s，60 45s，72 1min，30个循环；72 5min。
[0118]
pcr产物经1.5％琼脂糖电泳检测，电泳条件：120v、400ma、15min。确认条带单一、长度正确、无特异性条带。
[0119]
三、pcr-rflp法基因分型
[0120]
用限制性内切酶afl ii对pcr产物进行酶切反应，酶切体系为：pcr产物14μl、afl ii酶0.2μl、10
×
rcutsmart buffer 2μl、ddh2o 3.8μl，总体积10μl。
[0121]
反应体系置于37℃恒温培养箱孵育2h，取5μl酶切产物经2.5％琼脂糖电泳检测条带长度进行基因型鉴定。电泳条件：80v、400ma、10min。
[0122]
四、结果判读
[0123]
位于ars-ucd1.2版本nc_037340.1：67219155，即lbp基因组第13染色体第67219155位核苷酸，存在一个snp位点，其基因型为ga的奶牛个体乳汁中乳糖含量高于基因型为gg的奶牛个体乳汁中乳糖含量。
[0124]
酶切后电泳有624bp一条条带的为gg基因型个体，有624bp、234bp和390bp三条条带的为ga基因型个体，有234bp和390bp两条条带为aa基因型个。
[0125]
实施例8一种评估奶牛乳汁中乳糖含量的试剂盒
[0126]
一、组成
[0127]
核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物、pcr试剂(green taq mix和ddh2o)和酶切试剂(afl ii酶、10
×
rcutsmart buffer和ddh2o)。
[0128]
二、使用方法
[0129]
如实施例7。