一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用与流程

1.本技术属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用。


背景技术：

2.自弗莱明发现青霉素以来，抗生素由于其广谱性和高效性的优点，被广泛快速地应用于医疗、农业、畜牧业、养殖业等，使具有天然耐药性或者获得耐药性的病原细菌大量繁殖，也使细菌的耐药性不断增强。从而导致细菌耐药性成为一个全球性的问题。已开发抗生素类药物有上百种，开发新型抗生素的速率，远远赶不上耐药菌的进化速率，随着耐药性的增强，最终也会使细菌感染变得无药可治。据报道，抗生素会引发包括过敏反应、肾毒性、心脏毒性、肝毒性和神经毒性等不良反应，促使人类需要开发更安全、高效的替抗产品。
3.目前应用研发较多的替抗产品包括植物提取物、酸化剂、微生态制剂、噬菌体及其裂解酶等。噬菌体裂解酶是双链dna噬菌体在感染宿主细胞的后期表达的一种细胞壁水解酶。裂解酶在“杀死”细菌方面，具有以下优势：第一，裂解酶与其来源噬菌体相比，裂解谱更广，可以作用于更多病原菌；第二，裂解酶裂解速率快，通常数分钟即可完成裂解过程；第三，与抗生素、溶菌酶等其他抗菌剂联用效果更好，可以降低单一药物的副作用，并降低耐药性的产生；第四，未见耐药性相关报道。在减抗、替抗的大背景下，裂解酶体现的诸多优势，使其在农业、养殖、食品安全、医疗等领域具有较高的可开发价值。
4.葡萄球菌属是一群革兰氏阳性球菌，能引起人和动物的许多严重感染，在人类患病、畜禽疾病及各类环境微生物、食品源微生物中的检出率极高。而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的传播给临床治疗带来了巨大的挑战。我们期望能够找到一种应对葡萄球菌感染的裂解酶，从噬菌体基因组出发，挖掘更多新型、广谱的裂解酶，为农业、养殖、食品安全、医疗等领域的减抗替抗事业，开辟更多可能性。高效、广谱的噬菌体裂解酶，在葡萄球菌感染的治疗、消杀方面具有巨大的产业化价值。但是，噬菌体裂解酶在异源表达时，通常存在可溶性差、包涵体较多的难题。获得高效、广谱的噬菌体裂解酶是很有必要的。


技术实现要素：

5.为了获得高效、广谱的葡萄球菌噬菌体裂解酶，本技术提供一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用。
6.第一方面，本技术提供一种葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.第二方面，本技术提供一种编码权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶pb50的基因，所述基因序列如seq id no.2所示。
8.第三方面，本技术提供编码葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50的基因的用途，应用时采用该基因重组表达产生权利要求1所述的能裂解葡萄球菌的酶。
9.第四方面，本技术提供一种抑菌组合物，包括上述葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50。
10.第五方面，本技术提供一种抑菌剂，其主要活性成分为葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50、含有pb50表达元件的载体、含有pb50表达元件的表达盒或含有pb50表达元件的宿主细胞中的至少一种，裂解酶pb50的氨基酸序列为seq id no.1所示或者编码葡萄球菌裂解酶pb50的基因序列如seq id no.2所示。
11.优选的，抑菌谱为人源葡萄球菌和动物源葡萄球菌。
12.第六方面，本技术提供一种pcr引物组，包括特异性扩增葡萄球菌噬菌体pb50基因的引物对pet22b-pb50-f’和pet22b-pb50-r’、pet25b-pb50-f’和pet25b-pb50-r’、pet28a-pb50-f’和pet28a-pb50-r’或pet32a-pb50-f’和pet32a-pb50-r’，
13.各个引物的核苷酸序列分别为：
14.pet22b-pb50-f’：ggaattccatatgaaaacaaaaactcaagctcttgnde i酶切位点
15.pet22b-pb50-r’：ccgctcgagactaaatgtaccccatgcagcac
16.xhol i酶切位点
17.pet25b-pb50-f’：ggaattccatatgaaaacaaaaactcaagctcttgnde i酶切位点
18.pet25b-pb50-r’：ccgctcgagactaaatgtaccccatgcagcac
19.xhol i酶切位点
20.pet28a-pb50-f’：cgggatccatgaaaacaaaaactcaagctcttg
21.bamh i酶切位点
22.pet28a-pb50-r’：ccgctcgagttaactaaatg taccccatgc agcacca
23.xhol i酶切位点
24.pet32a-pb50-f’：cgggatccatgaaaacaaaaactcaagctcttg
25.bamh i酶切位点
26.pet32a-pb50-r’：ccgctcgagttaactaaatg taccccatgc agcacca
27.xhol i酶切位点，
28.引物对用于扩增的目的片段的大小为798bp。
29.第七方面，本技术提供一种葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50的制备方法，包括以下步骤：
30.以葡萄球菌噬菌体基因组为模板，加入引物，进行pcr扩增，回收葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50的编码基因，与相同酶切后的表达载体骨架连接，验证为阳性的重组表达载体pet-pb50转化表达宿主bl21(de3)后，经液体培养基培养，诱导表达，收集菌体，提取，纯化，葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。
31.优选的，所述的酶切采用nde i/xho i或者bamh i/xho i双酶切。
32.优选的，所述的表达载体骨架为pet22b、pet25b、pet28a或pet32a。
33.综上，本技术至少具有以下有益效果。
34.1、本技术的裂解酶能够快速裂解葡萄球菌，裂解酶的异源表达可溶性强，包涵体较少，解决了现有的噬菌体裂解酶在异源表达时，通常存在可溶性差、包涵体较多的技术问题。
35.2、裂解酶与其来源噬菌体相比，裂解谱更广，可以作用于更多病原菌。
36.3、裂解酶裂解速率快。
37.4、与抗生素、溶菌酶等其他抗菌剂联用效果更好，可以降低单一药物的副作用，并
降低耐药性的产生。
38.5、在减抗、替抗的大背景下，裂解酶体现的诸多优势，使其在农业、养殖、食品安全、医疗等领域具有较高的可开发价值。
39.说明书附图
40.图1：pb50在不同表达菌株中的表达情况电泳图(一)。
41.图2：pb50在不同表达菌株中的表达情况电泳图(二)。
42.图3：pb50粗酶液的抑菌效果图。
43.图4：pb50蛋白纯化电泳图。
44.图5：100ul酶液对5ml菌液的裂解效果。
45.图1中：
46.m：marker。
47.1.pet22b-pb50/bl21诱导组破碎上清。
48.2.pet22b-pb50/bl21诱导组破碎沉淀。
49.3.pet22b-pb50/bl21对照组破碎上清。
50.4.pet25b-pb50/bl21诱导组破碎上清。
51.5.pet25b-pb50/bl21诱导组破碎沉淀。
52.图2中：
53.m：marker。
54.1.pet25b-pb50/bl21诱导组破碎上清。
55.2.pet25b-pb50/bl21诱导组破碎沉淀。
56.3.pet32a-pb50/bl21诱导组破碎上清。
57.4.pet32a-pb50/bl21诱导组破碎沉淀。
58.5.pet28a-pb50/bl21诱导组破碎上清。
59.6.pet28a-pb50/bl21诱导组破碎沉淀。
60.7.pet28a-pb50/bl21诱导组破碎上清。
61.8.pet28a-pb50/bl21诱导组破碎沉淀。
62.图4中：
63.m：marker。
64.cl：粗酶液；
65.ft：穿流液；
66.w1-w4：杂蛋白洗涤液；
67.e1-e7：目的蛋白洗脱液。
具体实施方式
68.菌株、质粒、培养基与试剂
69.大肠感受态bl21(de3)：购自北京天根生化科技有限公司。
70.表达载体：购自novengen公司。
71.nb培养基：购自bd公司。胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，补水至1l。固体nb培养基：在nb培养基基础上加入15g琼脂粉。121℃高压灭菌20min。
72.1、噬菌体的分离
73.2021年12月从潍坊诸城市养殖场的貂的肺部分离葡萄球菌噬菌体，具体操作步骤：取生物体样本5g，用10ml噬菌体缓冲液(phage buffer)浸泡30min。使噬菌体充分进入缓冲液中，4500g离心10min，小心吸取上清，用0.22μm过滤器过滤除菌。
74.2、全基因组测序
75.该上述噬菌体经纯化后进行全基因组测序。经rast在线预测，获得297个开放阅读框,挖掘到一个假设蛋白序列，命名为基因pb50。pb50基因全长798bp，编码265个氨基酸。该蛋白序列具备chap和sh3结构域。
76.3、重组表达载体的构建
77.构建pet22b-pb50、pet25b-pb50、pet28a-pb50和pet32a-pb50四个重组质粒。使其带有组氨酸纯化标签或其他促进表达的氨基酸修饰，本实施例是使其带有组氨酸纯化标签。以噬菌体基因组为模板，设计引物如下：
78.pet22b-pb50-f’：ggaattccatatgaaaacaaaaactcaagctcttg
79.nde i酶切位点
80.pet22b-pb50-r’：ccgctcgagactaaatgtaccccatgcagcac
81.xhol i酶切位点
82.pet25b-pb50-f’：ggaattccatatgaaaacaaaaactcaagctcttg
83.nde i酶切位点
84.pet25b-pb50-r’：ccgctcgagactaaatgtaccccatgcagcac
85.xhol i酶切位点
86.pet28a-pb50-f’：cgggatccatgaaaacaaaaactcaagctcttg
87.bamh i酶切位点
88.pet28a-pb50-r’：ccgctcgagttaactaaatg taccccatgc agcacca
89.xhol i酶切位点
90.pet32a-pb50-f’：cgggatccatgaaaacaaaaactcaagctcttg
91.bamh i酶切位点
92.pet32a-pb50-r’：ccgctcgagttaactaaatg taccccatgc agcacca
93.xhol i酶切位点
94.以2ul基因组为模板，分别加入引物1ul，采用prime star max进行pcr扩增目的基因。pcr程序如下：(1)98℃，2min；(2)98℃，10s，58℃，10s，72℃，5s，30个循环；(3)72℃，10min。将pcr产物进行凝胶电泳回收，确定条带大小符合预期。将pb50基因采用双酶切，t4连接酶16℃过夜连接的方法连接至4个质粒中，构建不同的重组质粒，并使用常规热激法将重组质粒转化至表达菌株bl21(de3)。采用0.1mm iptg诱导pb50蛋白表达，20℃诱导24h后，用pbs(50mm，ph7.0)洗涤菌体2次，以1/10体积的pbs重悬菌体，超声破碎释放胞内蛋白，超声条件为200w，超声3s，间歇5s，循环70次。离心收集破碎液上清和沉淀，经sds-page分析蛋白可溶性。
95.参考图1，pb50在pet22b-sa210/bl21和pet25b-sa210/bl21菌株内可以进行可溶性表达，参考图2，pb50在pet25b-sa210/bl21、pet28a-sa210/bl21和pet32a-sa210/bl21菌株内可以进行可溶性表达。在pet28a-sa210/bl21菌株内表达时，包涵体较多，约为可溶性
蛋白的2倍；在pet32a-sa210/bl21菌株内表达时，几乎都是可溶性表达；在pet22b-sa210/bl21和pet25b-sa210/bl21菌株内表达时，可溶性蛋白为包涵体的2-3倍。综合来看，pb50在不同表达菌株内都能够进行可溶性表达，质粒及酶切位点的选择，会影响可溶性蛋白和包涵体的相对比重。噬菌体裂解酶在异源表达时，通常存在可溶性差、包涵体较多，但是本技术在采用本技术的质粒及酶切位点时，裂解酶在异源表达时可溶性强，包涵体较少。
96.选择pet22b-pb50/bl21(de3)菌株进行以下步骤：
97.参考图3，将破碎液上清在一株人源葡萄球菌的固体平板上点样测试，可见明显的噬菌斑，证实pb50粗酶液具备裂解活性。
98.4、噬菌体裂解酶的纯化
99.将构建好的表达菌株用0.1mm iptg低温诱导24h，收集破碎液上清。采用碧云天蛋白纯化试剂盒(购自碧云天，产品编号p2226)进行纯化。取1ml混合均匀的50％beyogold his-tag purification resin，4℃离心弃去液体；向离心管中加入非变性裂解液平衡凝胶两次；将4ml破碎液上清加入其中，4℃缓慢震荡过夜。将破碎液及混合物转移至亲和层析柱柱管中，收集穿流液。洗柱6次，每次加入0.5ml非变性洗涤液，以除去杂蛋白。洗脱目的蛋白10次，每次加入0.5ml非变性洗脱液，至穿出液中无蛋白。收集所有的穿出液，进行sds-page分析，确定纯化条件。
100.参考图4，粗酶液经4℃震荡过夜，可与凝胶完全结合，穿流液中不含目的蛋白。层析柱经四次洗涤即图4中w1-w4，可将杂蛋白完全脱除，避免杂蛋白的影响。经7-10次洗脱即图4中e1-e7，可将纯化后的目的蛋白完全洗脱下来，将有活性的穿出液于4℃，用pbs缓冲液(50mm，ph7.0)透析过夜，获得纯化后的酶液。用biovision软件，配合quantum cx5 edge 18.02a成像系统，分析获得蛋白纯度可达90％以上。
101.5、pb50蛋白抗菌活性剂抗菌速率及抗菌谱检测
102.(1)在5ml菌液中，加入100ul纯酶液混匀，10min左右菌液即可由浑浊变为明显澄清。参照图5所示，图5中左边的试管为5ml菌液的对照；右边的试管为5ml菌液，加入100ul纯酶液混匀，10min后状态图，可以看出其明显澄清，说明裂解酶裂解速率快。
103.(2)取200μl受试葡萄球菌增殖液，与融化至60℃左右的固体nb培养基混合，迅速倒板。待凝固后，用直径6mm的打孔器在培养基上打孔，吸取纯化后的pb50酶液50μl至点样孔，4℃静置约2小时，待酶液完全吸收后，放于37℃静置培养过夜，测量抑菌圈直径。具体裂解谱结果见表1。
104.表1pb50裂解酶的裂解谱
105.106.107.[0108][0109]
所有受试菌株均来自本单位，其中的标准菌株由青岛农业大学赠予。
[0110]
由表1可知，裂解酶pb50对人源、宠物源、猪源、牛源等不同来源的葡萄球菌均有较好的裂解效果，总裂解率达到89％，裂解活性较高。
[0111]
基于噬菌体的基因组分析，我们获得了一个对葡萄球菌具有高效裂解活性的蛋白。对于在人医、宠物疾病及畜牧养殖领域，由葡萄球菌引起的各类感染中，裂解酶pb50较为广谱高效的杀菌活性，对于开发新型抗葡萄球菌药物、体外控制葡萄球菌感染具有非常重大的意义。
[0112]
6、葡萄球菌噬菌体抗菌谱检测
[0113]
同样取200μl受试葡萄球菌增殖液，与融化至60℃左右的固体nb培养基混合，迅速倒板。待凝固后，用新鲜的葡萄球菌噬菌体增殖液(效价为108pfu/ml)，吸取5ul点在平板上，4℃静置约0.5小时，待完全吸收后，放于37℃静置培养过夜，记录有无噬菌斑形成。具体裂解谱结果见表2。
[0114]
表2葡萄球菌噬菌体的裂解谱
[0115]
[0116]
[0117]
[0118][0119]
所有受试菌株均来自本单位，其中的标准菌株由青岛农业大学赠予。“ ”[0120]
表示有噬菌斑，
“‑”
表示无噬菌斑。
[0121]
由表1可知，裂解酶pb50对人源、宠物源、猪源、牛源等不同来源的葡萄球菌均有较好的裂解效果，总裂解率达到89％，裂解活性较高。而相同条件下，如表2所示，其来源的葡萄球菌噬菌体对92株受试菌的裂解率仅为39％。
[0122]
6、葡萄球菌噬菌体裂解酶pb50抑菌组合物
[0123]
pb50对受试人源葡萄球菌具有很好的裂解效果，裂解率达到91.3％，因此可用于面部皮肤由葡萄球菌引起的各类感染。向含有peg-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯0.5％，甘油硬脂酸酯0.5％，氢化卵磷脂0.5％，鲸蜡硬脂醇0.8％，聚二甲基硅氧烷2.0％，氢化米糠油2％，辛酸甘油三酯5％，丙二醇4％，甘油5％，透明质酸钠0.05％，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物0.2％，去离子水54％的润肤乳混合物中，加入1％pb50纯酶液，混合均匀后采用平板涂布的方法测定抑菌效果，发现加入pb50的乳液混合物具有裂解活性，可在菌膜上形成裂解斑。
[0124]
以上均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、结构、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。