一种生产抗冻蛋白多肽的复合酶制剂及其应用的制作方法

1.本发明属于生物制造技术领域，具体涉及到一种生产抗冻蛋白多肽的复合酶制剂及其应用。


背景技术：

2.抗冻蛋白afps(antifreeze proteins)：一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。
3.最初是从南极与北极地区的海洋鱼类血清中发现一种能与冰晶相结合的特异性蛋白质，它能阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状态。在这些地区生活的鱼类全都具有合成这类蛋白的能力，以适应低温的生活条件。研究最多的可能是生活在南极洋面的perchlike notothenioids的体内抗冻蛋白，发现这一蛋白基因与鱼的胰蛋白酶原基因中90％以上的核苷酸碱基序列相同或许说明这两者有相近的进化关系。现在相继在昆虫、植物(如冬黑麦、沙冬青、唐古特红景天叶等)体内也发现有类似功能的抗冻蛋白。鱼类的afp基因的转化植物已获成功；与植物中类似afp基因在微生物体内克隆也获得成功。推测植物抗冻分子生物学和培植农业上抗冻新品种的前景必定是光明的。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种生产抗冻蛋白多肽的复合酶制剂。
7.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，以复合酶制剂质量份数计，其中，中性蛋白酶20～30份，丝氨酸蛋白酶20～30份，风味蛋白酶30～40份。
8.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述复合酶制剂，其中，中性蛋白酶：丝氨酸蛋白酶：风味蛋白酶质量比为3：3：4。
9.本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种生产抗冻蛋白多肽的复合酶制剂的应用。
10.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，以胶原蛋白为原料，采用复合酶制剂对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻蛋白多肽。
11.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述胶原蛋白为鳕鱼皮胶原蛋白。
12.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述复合酶制剂与胶原蛋白原料的质量比为1：8～12。
13.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述酶解，其中，酶解温度为52～58℃。
14.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述酶解，其中，酶解时间为40～50min。
15.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述酶解，其中，酶解ph为6.5～7.5。
16.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述分离纯化是通过两步超滤法完成的。
17.本发明的另一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种生产抗冻蛋白多肽的复合酶制剂的应用方法制得的产品。
18.本发明有益效果：本发明采用复合酶制剂酶解抗冻蛋白，同时优化了多酶酶解体系的反应条件，提高了多肽的得率，且制得的多肽抗冻功能优异，生物活性强。本发明制备方法简单，易于推广应用。
具体实施方式
19.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
20.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
21.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
22.本发明所用原料：
23.鳕鱼胶原蛋白：西安汇林生物科技有限公司，普通市售；中性蛋白酶(酶活50000u/g)、丝氨酸蛋白酶(酶活200000u/g)、风味蛋白酶(酶活30000u/g)：合肥盛润生物制品有限公司，普通市售；本发明中其他涉及的原料，无特殊说明，均为普通市售。
24.实施例1
25.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
26.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)，在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
27.实施例2
28.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为6.5，得到待酶解液；
29.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
30.实施例3
31.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分
搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.5，得到待酶解液；
32.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
33.实施例4
34.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
35.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在40℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，40℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
36.实施例5
37.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
38.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在40℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，40℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
39.实施例6
40.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
41.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在50℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，50℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
42.实施例7
43.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
44.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应50min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
45.实施例8
46.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
47.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.2g风味蛋白酶)在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应60min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
48.实施例9
49.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
50.称取0.4g复合酶制剂(0.12g中性蛋白酶 0.12g丝氨酸蛋白酶 0.16g风味蛋白酶)在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
51.实施例10
52.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
53.称取0.6g复合酶制剂(0.18g中性蛋白酶 0.18g丝氨酸蛋白酶 0.24g风味蛋白酶)在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
54.对比例1
55.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
56.称取0.5g复合酶制剂(0.15g中性蛋白酶 0.3g丝氨酸蛋白酶 0.15g风味蛋白酶)，在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
57.对比例2
58.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
59.称取0.5g复合酶制剂(0.3g中性蛋白酶 0.15g丝氨酸蛋白酶 0.15g风味蛋白酶)，在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，先用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，得分子量小于5000的多肽，再将滤过液用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，截留分子量为3000～5000道尔顿的多肽，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
60.对比例3
61.准确称取5g的鳕鱼皮胶原蛋白，加入15ml0.5mol/l的柠檬酸溶液进行溶胀，充分搅拌溶解后用2mol/l的naoh调节ph为7.0，得到待酶解液；
62.称取0.5g复合酶制剂在45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液混合，45℃水浴加热反应55min，结束后冷却至室温，离心取上清液，冷冻干燥，即得抗冻蛋白多肽粉。
63.实施例11
64.采用检测抗冻多肽对低温冻融细菌的保护作用来测试抗冻蛋白多肽的抗冻活性。
65.将活化的保加利亚乳酸杆菌接种到液体培养基中培养过夜作为种子液，将种子液以1:100的比例接种到新的液体培养基中，130r/min摇床培养至od
600
＝1.0。取浓度为250μg/ml待测样品900μl于离心管中，将菌液稀释104倍，吸取100μl加入至待测样品中，混匀涂布后倒置培养18h，计菌落数，以上步骤的温度条件均为37℃。将剩余的样品与菌液混合液置于-20℃低温处理24h，取出融化并涂布，37℃倒置培养18h，计菌落数。计算保加利亚乳酸杆菌的存活率。计算公式为：存活率＝低温处理后菌落数/低温处理前菌落数
66.表1为实施例1～9制得的抗冻蛋白多肽的保加利亚乳酸杆菌的存活率。
67.表1保加利亚乳酸杆菌的存活率
[0068][0069][0070]
本发明采用复合酶制剂酶解抗冻蛋白，同时优化了多酶酶解体系的反应条件，提高了多肽的得率，由表1可以看出，当复合酶制剂中的中性蛋白酶：丝氨酸蛋白酶：风味蛋白酶的质量比为3：3：4时，酶解效果最好，得到的多肽活性最高，这是由于中性蛋白酶以及丝氨酸蛋白酶属于内切酶，在水解过程中内切酶切断多肽内部的肽键，形成短链肽，其中一些含有疏水氨基酸，因而成为苦味肽，而风味蛋白酶是外切肽，外切酶每一次从多肽链的末端切断释放一个氨基酸，从而把苦肽彻底降解为氨基酸和小分子多肽，从而消除苦味，而只有合适的比例下，三者能够发挥最佳效果。
[0071]
本发明的复合酶制剂在应用时，当酶解温度为45℃，酶解时间为55min，ph为7.0时，加酶量与底物量质量比为1：10时，此时制得的多肽抗冻功能最优异，生物活性最强。采
用本发明的制备方法简单，易于推广应用。
[0072]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。