一种δ株2019-nCoV的表面蛋白受体结合区制备方法与流程

一种
δ
株2019-ncov的表面蛋白受体结合区制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种δ株2019-ncov的表面蛋白受体结合区制备方法。


背景技术：

2.2019-ncov为正链rna病毒，基因组大小约30kb，属于冠状病毒的β属。人体感染冠状病毒后常见症状有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等；在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡等。
3.2019-ncov的表面蛋白(s蛋白)参与和宿主细胞膜受体(ace-2)结合的功能，决定病毒的宿主范围和特异性。因此，s蛋白在疫苗开发或治疗性药物开发中是关键的靶点：1)宿主中和抗体的重要作用位点；2)疫苗设计的关键靶点。目前，表面蛋白(s)的受体结合区(rbd)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域，能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。
4.2019-ncov作为单链rna病毒，基因组不稳定，随着感染群体增加，进化出诸多优势毒株。2021年5月，世卫组织将最早在印度发现的2019-ncov变异毒株b.1.617.2命名为δ株；该突变株为潜伏期短、传播速度快、病毒载量高、核酸转阴时间长、更易发展为危重症等特点。因此，开发针对δ株2019-ncov的疫苗具有重要的经济和社会价值。
5.2019-ncov的s蛋白的rbd作为关键免疫原，采用分泌表达具有显著优势：1)分泌表达上清纯化工艺简单；2)可溶性表达；3)信号肽酶精准切割，n端无冗余met残基，产生符合预期的蛋白序列。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种δ株2019-ncov的表面蛋白(s蛋白)受体结合区(rbd)制备方法。
7.为解决上述问题，本发明采用人工改造信号肽(信号肽h，seq id no.1)引导δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌至培养上清，经过镍柱亲和层析即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于s蛋白天然信号肽(信号肽s)。
8.第一方面，本发明要求保护seq id no.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：
9.p1、提高δ株2019-ncov的s蛋白rbd在宿主细胞中的分泌表达产量；
10.p2、提高δ株2019-ncov的s蛋白rbd在宿主细胞中的分泌表达效率；
11.p3、制备δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌蛋白制品；
12.所述相关生物材料为seq id no.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。
13.进一步地，所述宿主细胞可为真核宿主细胞。如：hek293细胞，cho细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
14.在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为expi293f细胞。
15.进一步地，所述编码基因可为如下任一：
16.(a1)seq id no.2所示的dna分子；
17.(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码seq id no.1所示多肽的dna分子；
18.(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码seq id no.1所示多肽的dna分子。
19.上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
20.上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％或98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％或94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％或89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％或84％的同一性。
21.在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将seq id no.5所示dna片段(seq id no.5的第1-57位为信号肽h的编码基因，即seq id no.2)插入到pcgs3载体的多克隆位点(如hind iii和pac i)后得到的重组质粒。
22.第二方面，本发明要求保护一种融合蛋白。
23.本发明要求保护的融合蛋白为将seq id no.1所示多肽融合于δ株2019-ncov的s蛋白rbd的n端后所得。
24.进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.4的第1-242位或第1-247位所示或如seq id no.4所示。
25.seq id no.4的第1-19位为信号肽h(即seq id no.1)，第20-242位为所述δ株2019-ncov的s蛋白rbd，第243-247位为linker接头，第248-253位为组氨酸标签。
26.第三方面，本发明要求保护编码前文第二方面所述融合蛋白的核酸分子。
27.进一步地，所述核酸分子自5’端到3’端依次由seq id no.1所示多肽的编码基因和δ株2019-ncov的s蛋白rbd的编码基因组成。
28.更进一步地，所述seq id no.1所示多肽的编码基因可为如下任一：
29.(a1)seq id no.2所示的dna分子；
30.(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码seq id no.1所示多肽的dna分子；
31.(a3)与(a1)或(a2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码seq id no.1所示多肽的dna分子。
32.更进一步地，所述δ株2019-ncov的s蛋白rbd的编码基因可为如下任一：
33.(b1)seq id no.3所示的dna分子；
34.(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且相同蛋白质的dna分子；
35.(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的dna分子。
36.更加具体地，所述核酸分子可为seq id no.5的第1-726位或第1-741位所示dna分子或seq id no.5所示dna分子。
37.seq id no.5的第1-57位为所述seq id no.1所示多肽的编码基因(即seq id no.2)，第58-726位为所述δ株2019-ncov的s蛋白rbd的编码基因(即seq id no.3)，第727-741位为linker接头的编码基因，第742-759位为组氨酸标签的编码基因。
38.上述核酸分子或编码基因中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
39.上述核酸分子或编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％sds和1
×
ssc，0.1％sds各洗膜一次。
40.第四方面，本发明要求保护含有前文第三方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
41.其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第二方面中所述融合蛋白的dna，该dna不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
42.在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将seq id no.5所示dna片段(seq id no.5的第1-57位为信号肽h的编码基因，即seq id no.2)插入到pcgs3载体的多克隆位点(如hind iii和pac i)后得到的重组质粒。相应地，所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到expi293f细胞后所得。
43.第五方面，本发明要求保护前文第二方面所述融合蛋白或前文第三方面所述的核酸分子或前文第四方面所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下任一中的应用：
44.p1、提高δ株2019-ncov的s蛋白rbd在宿主细胞中的分泌表达产量；
45.p2、提高δ株2019-ncov的s蛋白rbd在宿主细胞中的分泌表达效率；
46.p3、制备δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌蛋白制品。
47.其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。
48.进一步地，所述真核宿主细胞可为hek293细胞，cho细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
49.在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为expi293f细胞。
50.第六方面，本发明要求保护一种制备δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌蛋白的方法。
51.本发明要求保护的制备δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌蛋白的方法，可包括如下步骤：
52.(a1)将前文第三方面所述的核酸分子导入宿主细胞，得到重组细胞；
53.(a2)培养所述重组细胞，从培养上清中获得δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌蛋白。
54.其中，所述核酸分子可通过前文所述重组载体导入所述宿主细胞。
55.步骤(a1)中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。如：hek293细胞，cho细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。
56.在本发明的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为expi293f细胞。
57.步骤(a2)中，所述培养为培养至细胞活率降至65％-75％时终止培养。
58.步骤(a2)中，是按照包括如下步骤的方法从所述培养上清中获得2019-ncov的s蛋白rbd分泌蛋白的：收集培养物于3500g离心30min，收集上清进行超滤浓缩和镍柱纯化。
59.本发明采用s蛋白的天然信号肽s和家鼠抗体κ链信号肽改造的人工设计信号肽h(seq id no.1)，引导δ株2019-ncov的s蛋白rbd真核细胞分泌表达。研究证明：人工合成信号肽h组的δ株2019-ncov的s蛋白rbd分泌表达量显著优于天然信号肽s组，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。本发明适用于疫苗开发中的抗原制备等应用。
附图说明
60.图1为天然信号肽s和人工合成信号肽h表达质粒构建酶切鉴定图。其中，1-2为pcgs3-s-δrbd(天然信号肽s)，3-4为pcgs3-h-δrbd(人工设计信号肽h)。
61.图2为2019-ncov的s蛋白rbd细胞分泌上清sds-page鉴定图。其中，1为天然信号肽s，2为人工设计信号肽h，3为无转染表达质粒的阴性组。
62.图3为2019-ncov的s蛋白rbd细胞分泌上清灰度分析图。其中，s为天然信号肽s分泌上清，h为人工设计信号肽h分泌上清。
63.图4为2019-ncov的s蛋白rbd蛋白纯化sds-page纯化鉴定。其中，1为无转染表达质粒的阴性组，2为s信号肽表达分泌上清，3为h信号肽表达分泌上清；4为s信号肽分泌表达纯化样品，5为h信号肽分泌表达纯化样品。
64.图5为2019-ncov的s蛋白rbd纯化样品灰度分析图。其中，s为天然信号肽s纯化样品，h为人工设计信号肽h纯化样品。
具体实施方式
65.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
66.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
67.sars-cov-2(2019-ncov)spike rbd gene：北京义翘神州科技股份有限公司；
68.pcgs3表达载体：merck公司；
69.gxl premix：takara公司；
70.即用型无缝克隆试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
71.expi293f
tm cells：thermo fisher公司；
72.expi293
tm
expression medium：thermo fisher公司；
73.expifectamine
tm
293 transfection kit：thermo fisher公司；
74.opti-mem
tm
i reduced serum medium：thermo fisher公司；
75.pageruler
tm
预染蛋白分子量标准，10至180kda：thermo fisher公司；
76.ni-nta蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
77.amicon ultra-15离心过滤装置：millipore公司；
78.amicon ultra-0.5离心过滤装置：millipore公司；
79.pbs ph7.4(1
×
)：gibco公司；
80.凝胶成像系统：protein simple公司；
81.细胞计数仪：roche公司；
82.超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；
83.电热恒温水浴锅：fisher scientific公司；
84.co2恒温摇床：crystal公司；
85.hyg-a全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；
86.dyy-6c型电泳仪：北京市六一仪器厂；
87.dycp-31dn型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；
88.微量移液器：eppendorf公司。
89.实施例1、重组表达质粒构建
90.本实施例采用2019-ncov的s蛋白的天然信号肽s和家鼠抗体κ链信号肽改造的人工合成信号肽h(seq id no.1)的编码基因分别融合到δ株2019-ncov s蛋白rbd蛋白的编码基因5’端(片段名称分别为s-δrbd和h-δrbd)，构建真核重组表达质粒。
91.采用sars-cov-2(2019-ncov)spike rbd gene(义翘神州)为模板，高保真酶gxl premix(takara)扩增目的片段，步骤如下：
92.1)h-δrbd目标片段扩增
93.引物1和引物7扩增片段1，引物6和引物9扩增片段2，引物5和引物8扩增片段3；片段1，片段2和片段3混合作为第二轮模板，使用引物2和引物5进行第二轮扩增获得h-δrbd目标片段；
94.2)s-δrbd目标片段
95.引物3和引物7扩增片段1’，引物6和引物9扩增片段2，引物5和引物8扩增片段3；片段1’，片段2和片段3混合作为第二轮模板，使用引物4和引物5进行第二轮扩增获得s-δrbd目标片段。
96.上述pcr扩增使用引物序列如下：
97.引物1：5
’‑
tggtgctgatgttctggattcctgctgctagatctagggtccaaccaacagagag-3’；
98.引物2：5
’‑
caccgtccttgacacgaagcttgccaccatggccttgcctgtttggctgttggtgctgatgttctggatt-3’；
99.引物3：5
’‑
tgctgctgcccctggtgagcagccagtgcagggtccaaccaacagagag-3’；
100.引物4：5
’‑
caccgtccttgacacgaagcttgccaccatgttcgtgttcctggtgctgctgcccctggtgagc-3’；
101.引物5：5
’‑
cagttagcctcccccttaattaattaatgatggtggtgatggtgag-3’；
102.引物6：5
’‑
gcaactacaactaccgctacagactgttcag-3’；
103.引物7：5
’‑
ctgaacagtctgtagcggtagttgtagttgc-3’；
104.引物8：5
’‑
accaggctggcagcaaaccatgtaatggagt-3’；
105.引物9：5
’‑
actccattacatggtttgctgccagcctggt-3’。
106.采用即用型无缝克隆试剂盒(生工)进行连接：pcgs3经hindiii和paci双酶切线性化，扩增目标片段s-δrbd和h-δrbd经重组克隆至pcgs3表达载体。
107.所得两种重组表达质粒的酶切鉴定结果如图1所示。由图可见，第1-2泳道为pcgs3-s-δrbd表达质粒，酶切后载体7120bp，目标基因759bp；第3-4泳道为pcgs3-h-δrbd载体为7120bp，目标基因为771bp，酶切条带大小符合预期。
108.重组表达质粒pcgs3-s-δrbd的结构描述：在pcgs3载体的酶切位点hindiii和paci之间插入seq id no.6所示dna片段后得到的重组载体(seq id no.6的5’增加kozak序列优化表达，3’端增加终止密码)。seq id no.6的第1-45位为天然s信号肽的编码基因，第46-714位为rbd编码基因，715-729为linker接头，730-747为组氨酸标签。
109.重组表达质粒pcgs3-h-δrbd的结构描述：在pcgs3载体的酶切位点hindiii和paci之间插入seq id no.5所示dna片段后得到的重组载体(seq id no.5的5’增加kozak序列优化表达，3’端增加终止密码)。seq id no.5的第1-57位为人工信号肽h的编码基因，第58-726位为rbd编码基因，727-741为linker接头，742-759为组氨酸标签。
110.seq id no.5编码seq id no.4所示蛋白质。seq id no.4的第1-19位为人工信号肽h，第20-242位为δrbd，第243-247位为linker接头，第248-253位为组氨酸标签。
111.实施例2、sds蛋白电泳图灰度分析
112.sds蛋白电泳图灰度分析采用image j软件。操作步骤为image
→
type
→
32-bit转化为灰度图；process
→
subtract background
→
ok去除背景色；矩形工具选择泳道
→
analyze
→
gel
→
select first lane确定分析泳道，重复选择多条泳道同时分析；analyze
→
gel
→
plot lane生成峰面积；线性工具选择目标条带对应峰图，wand工具计算对应峰图面积，即可求得表达量占总蛋白百分比。
113.实施例3、rbd蛋白瞬转表达
114.一、宿主细胞
115.从液氮罐中取宿主细胞expi293f的种子库细胞，于37℃水浴迅速解冻，将解冻后的细胞悬液无菌转移至装有30ml预热的完全生长培养基的125ml药瓶中，摇床培养条件：37℃，8％co2，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％。15-30min后取细胞悬液检测细胞密度与活率。
116.待细胞活率恢复90％以上，细胞密度达3-5
×
106cells/ml，按0.3-0.5
×
106cells/ml进行接种扩增。
117.二、细胞转染
118.将实施例1构建的pcgs3-s-δrbd和pcgs3-h-δrbd分别转染宿主细胞。
119.1、转染前一天
120.转染前24h将细胞以2.5-3
×
106cells/ml重新接种，培养24h。
121.2、转染当天
122.(1)细胞密度应达到4.5-5.5
×
106cells/ml，活率应≥95％。用新鲜预热的完全生长培养基将细胞稀释至3
×
106cells/ml。
123.(2)准备转染试剂和dna复合物
124.1)dna稀释
125.用无菌水将质粒(实施例1构建的pcgs3-s-δrbd和pcgs3-h-δrbd)稀释至1μg/μl，按照1ml细胞转染1μg质粒的量，取转染50ml细胞所需质粒的量，即50μl质粒加入3ml opti-mem
tm i reduced serum medium备用。
126.2)转染试剂稀释
127.使用前将转染试剂expifectamine293
tm reagent轻轻上下颠倒混匀，取转染50ml细胞所需转染试剂的量，即160μl expifectamine293
tm reagent于2.8ml opti-memtm i reduced serum medium中轻轻上下颠倒混匀，室温静置5min。
128.3)将稀释好的转染试剂加入质粒中轻轻上下颠倒混匀，室温反应10～20min。将混合好的转染试剂和dna复合物缓慢加入细胞培养物中。37℃，8％co2，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％条件培养。
129.3、转染后第一天
130.在转染后18-22h，按照转染50ml细胞的量添加增强剂。即，取300μlexpifectamine
tm
293 transfection enhancer 1与3ml expifectamine
tm
293transfection enhancer 2混匀后缓慢加入细胞培养物中。
131.4、培养上清收集
132.转染后每天监测细胞活率，第4天当活率降至65％-75％时终止培养，收集培养物于3500g离心30min收集上清，sds-page鉴定及灰度分析证明信号肽h组rbd蛋白的表达量比信号肽s组增加41.16％(图2和图3)。综上可知：与天然信号肽相比，本发明的人工信号肽h具有更高的δ株2019-ncov的s蛋白rbd的分泌表达量产量。
133.实施例4、蛋白纯化
134.1、超滤浓缩
135.收样上清(即实施例3步骤4中“收集培养物于3500g离心30min”后所得上清)进行4℃，amicon ultra-15离心过滤装置(millipore公司)6000g离心20min超滤浓缩，最终细胞上清浓缩至20-30ml。
136.2、镍柱纯化
137.步骤1获得的超滤浓缩上清和binding/wash buffer按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育。两倍柱体积的binding/wash buffer平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱。将超滤浓缩上清和binding/wash buffer混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱；如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中。两倍柱体积的binding/wash buffer清洗柱子并收集流穿液，直到流穿液的吸光度280nm接近基线。两倍柱体积的elution buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线，收集洗脱液待纯化。
138.3、超滤置换
139.镍柱纯化后的蛋白溶液加amicon ultra-15离心过滤装置(millipore公司)，分批
10000g离心3min，直至溶液剩余约150μl。轻轻加入300μl pbs(ph7.4)，10000g离心至剩余150μl，重复三次。pbs(ph7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约1-2ml，留样5μl用于蛋白浓度测定和sds-page蛋白电泳检测。实验证明，两种信号肽产物sds-page检测纯化样品纯度均大于95％，和天然信号肽s相比，人工信号肽h纯化产物sds-page条带位置相同，说明人工信号肽h在分泌时切除，符合预期(图4和图5)。
140.采用铝盐；或cpg；或脂质体；或油性佐剂即可产生2019-ncov免疫组合物，用于预防新型肺炎。
141.综合以上各实施例的结果，本发明采用s蛋白天然信号肽s和人工设计信号肽h(seq id no.1)引导δ株2019-ncov的s蛋白rbd真核细胞分泌表达。本发明人工合成信号肽h分泌表达水平显著由于天然信号肽s，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。
142.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。