一种从黄油的副产物酪乳中分离制备乳脂肪球膜蛋白的方法

1.本发明涉及蛋白质分离技术领域，具体涉及一种从生产黄油的副产物酪乳中提取乳脂肪球膜蛋白的制备方法。


背景技术：

2.乳脂肪球(mfg)形成于乳腺的上皮分泌细胞，其形成过程为：先在内质网上形成脂肪球前体，然后脂肪球前体穿过细胞质基质并形成较小的脂滴，再由脂质和蛋白质组成的非双分子层物质包裹起来，最终形成了真正意义上的乳脂肪球，大小为0.1～15μm。
3.乳脂肪球膜(mfgm)是乳腺细胞分泌出乳脂肪球表面的膜，本质上是一个三重结构。mfgm厚度为10-50nm，三层膜是由乳腺细胞中内质网的单层膜及其细胞膜顶部的双层膜组成。来源于内质网的部分是一种由蛋白质和极性脂质构成的单层膜结构，该层膜在脂滴分泌前覆盖在三酰甘油核心表面。乳脂肪球膜中来源于顶端质膜的部分为膜结构中的主要部分，有典型的双分子层膜的外观并且内膜表面具有高度电子致密性。
4.mfgm来源的特殊性决定了其组成的复杂性。其主要组成成分为蛋白/糖蛋白(占mfgm成分的20～60％)、甘油三酯、甘油磷脂(占mfgm成分的33％)，鞘脂类(主要是鞘磷脂)、糖脂、胆固醇、酶和其他微量成分。
5.在来源不同的牛乳中，mfgm组分中蛋白质的含量在25％～70％范围内变化，只占牛奶蛋白总量的1～2％。目前分离得到的mfgm的成分高度依赖于所使用的分离方法和分析程序，因为膜蛋白与mfgm的连接方式并不唯一，包括结合蛋白、膜外周蛋白，以及松散地附着在膜表面的蛋白。在采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离mfgm的结果中，能够看到7-8个主要膜蛋白带。但是还有很多低丰度的物种尚未被确认。
6.实际上，乳脂球膜蛋白包含100余种蛋白质，含量最丰富的8种蛋白质为黏液素1(muci)、黄嘌呤氧化还原酶(xor)、黏液素15(muc15)、cd36、嗜乳脂蛋白(btn)、乳凝集素、脂肪分化相关蛋白和脂肪酸结合蛋白。其中膜上的特异性蛋白，包括黄嘌呤氧化还原酶(xdh/xo)，脂肪滴结合蛋白(adph)，嗜乳脂蛋白(btn)，cd 36，组织糖蛋白高碘酸薛夫6/7(pas6/7)等。这些特异性蛋白质因其营养和功能特性而受到越来越多的关注，研究表明，它们可以减少心血管疾病、炎症和胃肠道感染，对胆固醇吸收、神经系统髓鞘形成和神经发育也有一定的积极作用，乳脂球膜蛋白具有丰富的开发利用价值。
7.在这些主要的乳脂球膜蛋白中，粘蛋白1(muci)是一种高分子量的跨膜糖蛋白，是黏膜物理防御的重要组成成分，可能与上皮感染和炎症反应有关。muc i广泛表达于正常腺上皮细胞,当这些细胞转为恶性时，其表达急剧增加。这些已在一些腺癌中证实，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和结肠癌。近来muc i也在一些鳞状细胞癌中检测出来，如食管癌、咽癌、喉癌、眼睑癌和口腔粘膜癌，在这些鳞癌中上调的muci表达提示这种粘蛋白在鳞状细胞癌恶性进展中起作用。
8.pas6/7是一种粘附在乳汁脂肪球膜表面的镶嵌型外周蛋白，具有免疫源性的亲脂性糖蛋白。在体内发挥多种功能，如，有利于凋亡淋巴细胞及其他凋亡细胞的清除，促进肠
粘膜的修复，增加树突状细胞外泌小体功能，促进乳腺分支的形态变化，促血管形成，调节精子与卵细胞外围的黏附等。乳凝集素还可以抗轮状病毒感染。
9.嗜乳脂蛋白(btn)是一种与脂肪滴相关的蛋白质，是免疫球蛋白家族的一员。他们可能与自闭症、多发性硬化症等病的自身免疫调节有关。
10.黄嘌呤氧化还原酶(xanthineoxidoreductase，xdh/xo)是动物机体内广泛存在的一种代谢酶，属于黄素钼蛋白家族，在乳中含量最为丰富。许多年以来，xdh/xo被认为主要参与生物体内的嘌呤代谢，但越来越多的证据表明xdh/xo具有广泛的生物学功能。xdh/xo在体内能抑制细菌生长，具有抗菌性；在体外，幼儿食用富含xdh/xo的乳汁患肠道疾病的机率低于食用配方奶粉的婴儿。xdh/xo对组织的氧化损伤也有一定的抵抗作用，在缺血再灌注时，xdh/xo能够催化生成活性氧自由基造成组织损伤，在心血管和心脏疾病中，xdh/xo均发挥了一定作用。
11.脂肪酸转运蛋白(cd36)在结构中存在大量碳水化合物(约24质量％中性糖)。cd 36中与mfgm相关部分只占其总蛋白质的5％或更少，并且因为它是一种整体蛋白质，故可以通过离心在酪乳上清中使大部分蛋白质得到收集。作为胶原蛋白和血小板反应蛋白的受体，它能够在血小板活化和聚集中起到一定作用，同时也是细胞间粘附以及血小板反应蛋白介导血管生成的抑制剂。cd36也可以通过结合到凋亡细胞和细胞碎片，从而通过吞噬作用促使其消除。相关的清道夫功能在于cd 36在巨噬细胞表面可以结合氧化的低密度脂蛋白并通过内吞作用从体循环中消除它们。
12.脂肪酸结合蛋白(fabp)最初是在乳腺癌细胞生长抑制剂的筛选中进行鉴定的。该蛋白是乳腺癌细胞体外生长的有效抑制剂。经鉴定fabp蛋白的分子量为13kda，其含量占mfgm总蛋白含量的2％～3％，位置位于三酰甘油内核和乳脂肪球膜三层结构之间。
13.脂肪滴结合蛋白(adph)在盐溶液或者非离子的洗涤剂条件下不相溶，但可以被甲醇和koh溶解，其溶解性质表明脂肪酸与adph蛋白之间的连接方式为酯键连接
19.。因此，fabp能够在脂肪酸的转运过程及脂质代谢起到至关重要的作用。
14.另外，mfgm的另一类重要组成是mfgm脂质，其不仅包含含量相对较大的极性脂质，还包含含量相对较少的中性脂质。而且，在mfgm脂质中，主要组分磷脂极性脂主要分为五大类，分别为卵磷脂(pc，占总极性脂含量的35％)、磷脂酰乙醇胺(pe，占总极性脂含量的30％)、神经鞘磷脂(sm，占总极性脂含量的25％)、磷脂酰肌醇(pi，占总极性脂含量的5％)、磷脂酰丝氨酸(ps，占总极性脂含量的3％)。除此之外，葡糖苷酰鞘氨醇(glucer)、中性鞘糖脂、乳糖酰基鞘氨醇(laccer)以及神经节苷酯(gang)的含量较少。在量相对较少的mfgm中性脂质中，甘油三酯占主要成分，游离脂肪酸、1,2-甘油二酯、1,3-甘油二酯、单甘油酯和胆固醇所占的比例较小。这些复杂多样的脂质的存在对mfgm蛋白的分离造成代理很大的困扰。
15.如上所述，乳脂肪球膜蛋白约占总蛋白的1％—2％，目前它们的提取工艺都是基于从特定原料中进行膜蛋白的分离，如果直接从生牛乳中提取有效成分，不仅浪费原料，生牛乳的利用率低，且成本较高，而现在大部分研究都是以工业副产物为原料进行提取。有研究是以生产奶酪的副产物乳清酪乳为原料，利用热钙处理方法(ph值设为7.7，温度为55℃，ca
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浓度为0.205g/l乳清)提取乳脂肪球膜片段，虽然原料乳清酪乳中酪蛋白胶束被去除掉，但其中的mfgm片段含量相对于其他原料是很少的，所以提取出的总mfgm含量极低。有研
究是以生产黄油的副产物酪乳为原料，利用凝乳酶去除酪蛋白，微滤法去除残留的乳清蛋白，渗滤法去除一些残留的乳白蛋白、乳球蛋白以及乳糖和矿物质等，此方法并不能完全去除酪蛋白成分，样品蛋白纯度较低，且mfgm蛋白片段可能附着在其他蛋白分子上，一同过滤掉，使得mfgm损失率较高。中国专利cn 102863526a中是从生牦牛乳中提取乳脂肪球膜蛋白，它是利用钠离子磷酸盐缓冲溶液和聚乙二醇辛基苯基醚溶液对离心后获得的稀奶油进行洗涤，此方法虽然纯度较高，但原料利用率较低，造成浪费，适用于实验室的机理研究，不适合工厂大规模生产。因此，在本技术领域中，急需找到一种能够充分利用原料、以高产率和高纯度提取、能够规模化生产mfgm蛋白的方法。


技术实现要素：

16.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种从黄油副产物酪乳中分离制备乳脂肪球膜蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
17.(1)将黄油副的产物酪乳的温度控制为25至30℃；
18.(2)将加热的酪乳的ph值调节至4.5至4.7，然后通过离心，获取第一上清液；
19.(3)将所述第一上清液进行热钙处理；
20.(4)将经过热钙处理后的所述第一上清液进行离心，获得第二上清液；
21.(5)对所述第二上清液进行超声波处理，然后冷却至室温，制得待透析样品；
22.(6)将所述待透析样品进行透析处理，获得待超滤样品；
23.(7)将所述待超滤样品的ph值调节至6～8，然后进行超滤处理，收集超滤处理得到的溶液作为所述乳脂肪球膜蛋白。
24.相对于现有技术，本发明具有如下优点：
25.(1)采用本发明方法，酪蛋白的去除率可以达到95％；
26.(2)本发明方法可以避免有效蛋白被透析或过滤掉，极大地降低了乳脂肪球膜蛋白的损失率，使得提取率达到70％以上。
27.(3)选用的原料为工业上生产黄油的副产物酪乳，他们通常被丢弃或者做成动物饲料，本发明合理的利用了此原料，既能提高酪乳的利用率，且节约成本。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.如上所述，本发明提供了一种从黄油的副产物酪乳中分离制备乳脂肪球膜蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
30.(1)将黄油副产物酪乳的温度控制为25至30℃；
31.(2)将加热的酪乳的ph值调节至4.5至4.7，然后通过离心，获取第一上清液；
32.(3)将所述第一上清液进行热钙处理；
33.(4)将经过热钙处理后的所述第一上清液进行离心，获得第二上清液；
34.(5)对所述第二上清液进行超声波处理，然后冷却至室温，制得待透析样品；
35.(6)将所述待透析样品进行透析处理，获得待超滤样品；
36.(7)将所述待超滤样品的ph值调节至6～8，然后进行超滤处理，收集超滤处理得到的溶液作为所述乳脂肪球膜蛋白。
37.优选的是，在步骤(2)中，离心转速为3000至4000rpm(优选为4000rpm)，离心时间为20至30min，优选为20min，静置时间为20至30min，例如为25min。
38.更优选的是，在步骤(2)中，使用2mol/l盐酸溶液来调节ph值；优选的是，将ph值调节至4.6。
39.另外更优选的是，在步骤(3)中，在进行所述热钙处理时，将氯化钙加入至所述第一上清液中，然后将ph至7～7.7(优选为7.0)，再加热至40～60℃(例如50℃)，充分混匀，静置20～40min(例如为30min)。
40.另外更优选的是，所述氯化钙的添加量为0.02～0.16g/100g乳液；另外优选的是，所述ph采用氢氧化钠进行调节。
41.在一些实施方式中，在步骤(3)中，热钙处理的温度为60℃，ph值调至7，cacl2添加量为0.16g/100g乳液，静置时间为40min。
42.另外更优选的是，在步骤(4)中，离心转速为3000～4000rpm(优选为4000rpm)，离心时间为20～30min(例如为20min)。
43.另外更优选的是，在步骤(5)中，所述超声处理的超声频率为45～80mhz(例如为50、60或70mhz)，超声时间为1～2h(例如为1、1.5或2h)，超声温度45～55℃(例如为45、50或55℃)。
44.另外更优选的是，在步骤(6)中，所述透析采用纤维素制成的透析袋进行反渗透处理，所述反渗透处理在ph为6的条件下进行。
45.另外更优选的是，所述反渗透处理在25℃的恒温水浴中进行；优选的是，在进行所述反渗透处理的同时，利用磁力搅拌器持续搅拌，透析时间为18至30h。
46.另外更优选的是，所述透析袋的分子截留量为14kda。
47.另外更优选的是，在步骤(7)中，所述超滤处理采用错流式过滤装置进行，过滤膜为聚砜膜，过滤板的分子截留量为30～100kda，优选为100kda；料液比为1:2～1:8(例如为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6或1:7)；跨膜压力为0.14至0.16mpa(例如为0.15mpa)；流量为450至500l/h。
48.在一些具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：
49.(1)取来自工厂新鲜的黄油副产物酪乳，将温度控制为25～30℃；
50.(2)将步骤(1)加热的酪乳用2mol/l盐酸溶液调节ph值至4.6，然后将乳液离心处理，转速为3000～4000rpm，离心时间为20～30min，收集上清液；
51.(3)取步骤(2)的上清液进行热钙处理，加入氯化钙至乳液中，利用氢氧化钠调节ph至7～7.7，加热至40～50℃，添加量为0.02～0.16g/100g乳液，充分混匀，静置20～40min；
52.(4)取步骤(3)热钙处理后的样品进行离心处理，转速为3000～4000rpm，离心时间为20～30min，收集上清液；
53.(5)取步骤(4)收集的上清液进行超声波处理，超声频率为45～80mhz，超声时间为1～2h，超声温度45～55℃，将超声处理后的样品冷却至室温；
54.(6)取步骤(5)冷却至室温的样品用纤维素制成的透析袋(分子截留量为14kda)进行反渗透处理，恒温水浴25℃，利用磁力搅拌器持续搅拌24h；
55.(7)取步骤(6)经反渗透处理后的样品调节ph值至6～8，然后进行超滤处理：错流式过滤装置，过滤膜为聚砜膜，过滤板选用分子截留量为30～100kda，料液比为1:2～1:8，跨膜压力选用0.15mpa，流量为500l/h，收集过滤后的溶液，即为得到纯度较高的乳脂肪球膜蛋白。
56.mfgm来源的特殊性使其所含有的蛋白质与脂质含有独特的营养特性，并且能够在体系稳定性方面发挥一定作用。而mfgm在工业中的富集与分离纯化一直是一项难点。本发明人对不同工业副产物中mfgm蛋白的含量及种类进行对比分析。发现黄油乳清虽然是无水奶油生产过程中的副产物，却含有丰富的mfgm蛋白，可以作为进一步分离富集mfgm蛋白的原材料。现有技术中也有对mfgm蛋白的分离提取工艺和mfgm材料的功能特性做了深入分析，也报道了不同的膜组分分析方法。其中，微滤法是目前工业上唯一得到应用的分离方法，但是在分离的过程中会造成部分小分子游离蛋白的损失。本发明人发现，超滤膜孔径的大小刚好能够对大分子mfgm蛋白与乳蛋白进行分离，而目前对超滤法分离mfgm蛋白质的研究很少且都只停留在宏观层面进行研究，因此结合定量分析的方法对富集过程中mfgm蛋白的变化及不同膜组分分离效果的研究是十分有意义的。
57.实施例
58.下文将通过实施例对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
59.实施例1
60.本实施例从黄油副产物酪乳中提取乳脂肪球膜蛋白，具体步骤如下：
61.一、取来自工厂新鲜的黄油副产物酪乳，将其加热至30℃；
62.二、将步骤一加热的酪乳用2mol/l盐酸溶液调节ph值至4.6，然后将乳液离心处理，转速为4000r，离心时间为20min，收集上层清液；
63.三、取步骤二的上层清液进行热钙处理，加热至60℃，利用盐酸溶液调节ph至7，加入cacl2至乳液中，添加量为0.16g/100g乳液，充分混匀，静置40min；
64.四、取步骤三热钙处理后的样品进行离心处理，转速为4000，离心时间为20min，收集上层清液；
65.五、取步骤四收集的上层清液进行超声波处理，超声频率为80mhz，超声时间为1h，超声温度45℃，将超声处理后的样品冷却至室温；
66.六、取步骤五冷却至室温的样品用纤维素制成的透析袋(分子截留量为14kda)进行反渗透处理，恒温水浴25℃，利用磁力搅拌器持续搅拌24h；
67.七、取步骤六经反渗透处理后的样品调节ph值至6，然后进行超滤处理：框式过滤装置，过滤膜为聚砜膜，过滤板选用分子截留量为50kda，料液比是1：2，跨膜压力选用0.15mpa，流量为500l/h，收集过滤后的溶液，即为得到纯度较高的乳脂肪球膜蛋白。
68.实施例2
69.一、取来自工厂新鲜的黄油副产物酪乳，将其加热至30℃；
70.二、将步骤一加热的酪乳用2mol/l盐酸溶液调节ph值至4.6，然后将乳液离心处理，转速为4000r，离心时间为20min，收集上层清液；
71.三、取步骤二的上层清液进行热钙处理，加热至60℃，利用盐酸溶液调节ph至7，加入cacl2至乳液中，添加量为0.16g/100g乳液，充分混匀，静置40min；
72.四、取步骤三热钙处理后的样品进行离心处理，转速为4000，离心时间为20min，收集上层清液；
73.五、取步骤四上层清液用纤维素制成的透析袋(分子截留量为14kda)进行反渗透处理，恒温水浴25℃，利用磁力搅拌器持续搅拌24h；
74.六、取步骤五经反渗透处理后的样品调节ph值至6，然后进行超滤处理：错流式过滤装置，过滤膜为聚砜膜，过滤板选用分子截留量为100kda，料液比是1:2，跨膜压力选用0.15mpa，流量为500l/h，收集过滤后的溶液，即为得到纯度较高的乳脂肪球膜蛋白。
75.实施例3
76.一、取来自工厂新鲜的黄油副产物酪乳，将其加热至30℃；
77.二、将步骤一加热的酪乳用2mol/l盐酸溶液调节ph值至4.6，然后将乳液离心处理，转速为4000r，离心时间为20min，收集上层清液；
78.三、取步骤二的上层清液进行热钙处理，加热至60℃，利用盐酸溶液调节ph至7，加入cacl2至乳液中，添加量为0.16g/100g乳液，充分混匀，静置5min；
79.四、取步骤三热钙处理后的样品进行离心处理，转速为4000，离心时间为20min，收集上层清液；
80.五、取步骤四收集的上层清液进行超声波处理，超声频率为80mhz，超声时间为1h，超声温度45℃，将超声处理后的样品冷却至室温；
81.六、取步骤五经超声处理后的样品调节ph值至6，然后进行超滤处理：框式过滤装置，过滤膜为聚砜膜，过滤板选用分子截留量为100kda，料液比是1:2，跨膜压力选用0.15mpa，流量为500l/h，收集过滤后的溶液，即为得到纯度较高的乳脂肪球膜蛋白。
82.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sds-page)并结合液-质联用技术鉴定，对实施例1得到的乳脂肪球膜蛋白和实施例2和3得到的乳脂肪球膜蛋白进行分析。结果发现，实施例1制得的乳脂肪球膜蛋白在凝胶电泳的条带中的颜色较实施例2和3的深。且从lc/ms中可以看出，实施例1制得的乳脂肪球膜中几种主要蛋白btn的相对丰度值为6.3e 010，adph的相对丰度值为4.2e 010，pas6/7的相对丰度值为6.8e 010；而在实施例2和实施例3制得的乳脂肪球膜蛋白中，btn的相对丰度值分别为4.1e 010，3.9e 010；adph分别为3.7e 010，3.2e 010；pas6/7则分别为3.8e 010，4.3 010。通过高效液相色谱法可以看出，实施例1得到的杂峰峰面积仅为实施例2的60％和实施例3的63％，并且可以看出α
32-cn和κ-cn低含量酪蛋白组分已经基本消失。经计算，实施例1制得的乳脂肪球膜的纯度为94.7％，而实施例2的纯度为85.6％，实施例3仅为82.3％。
83.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。