一种提高地衣芽孢杆菌产杆菌肽的方法

id no.1所示。
14.在本发明的一种实施方式中，以phy300plk为表达载体。
15.本发明还提供了氨基酸序列如seq id no.2所示的乙酰辅酶a合成酶acs在提高上述地衣芽孢杆菌产杆菌肽的产量中的应用。
16.本发明还提供了一种制备杆菌肽的方法，所述方法为，采用上述重组地衣芽孢杆菌发酵制备得到的。
17.在本发明的一种实施方式中，将所述重组地衣芽孢杆菌的种子液按照10％～15％的接种量接种至发酵培养基中，进行发酵制备得到。
18.在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将上述重组地衣芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有杆菌肽的发酵液，然后将含有杆菌肽的发酵液进行分离，获得杆菌肽。
19.在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30～37℃、转速为180～250rpm、ph为7.0～7.5。
20.在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为37℃、转速为200rpm、ph为7.0。
21.在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：豆粕粉30～50g/l、可溶性淀粉30～40g/l、caco
3 20～30g/l、(nh4)2so
4 0.5～1g/l、znso
4 5～10g/l、蛋白胨10～15g/l。
22.在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：豆粕粉50g/l、可溶性淀粉40g/l、caco
3 24g/l、(nh4)2so
4 1g/l、znso
4 5g/l、蛋白胨10g/l。
23.本发明还提供了上述地衣芽孢杆菌ath，或上述重组地衣芽孢杆菌，或上述应用，或上述制备杆菌肽的方法在制备含有杆菌肽的产品中的应用。
24.在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、保健品、饲料添加剂。
25.本发明还提供了上述高产杆菌肽地衣芽孢杆菌菌株筛选方法，包括以下步骤：
26.(1)将待筛选的菌株涂布在固体平板培养基上，待菌落形成后挑选单菌落接种于种子培养基中培养；
27.(2)将步骤(1)中得到的培养液转接至发酵培养基中发酵；
28.(3)将金黄色葡萄球指示菌涂布在lb固体平板培养基上，放入牛津杯；
29.(4)将步骤(2)中得到的发酵液离心，取上清液于步骤(3)中指示菌平板上，结果如图1所示，透明圈最大的菌株为高产菌株，选取抑菌效果最高的菌株为出发菌株。
30.本发明还提供了上述方法制备得到的杆菌肽。
31.本发明还提供了一种含有上述杆菌肽的产品。
32.在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、保健品或饲料添加剂。
33.有益效果
34.(1)本发明成功的筛选得到了一株高效抑菌的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ath，并且采用地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ath作为宿主细胞，构建得到一株重组地衣芽孢杆菌，该重组菌株有效利用乙酸，并能提高杆菌肽产量；既能降低了乙酸对地衣芽孢杆菌生长毒害作用，也能有效利用乙酸生成乙酰辅酶a，在杆菌肽的生产中具有较高的应用价值。
35.(2)本发明提供了一株重组地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs，将此重组地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs接种至含豆粕粉和5％znso4发酵培养基中发酵培养36h，取发酵上清液检测杆菌肽效价为1928iu/ml，出发菌株杆菌肽效价为1039iu/ml，提高了46.16％，同时杆菌肽a的含量为1081iu/ml，比出发菌株杆菌肽a含量678iu/ml提高了37.28％，可见使用此重组地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs产杆菌肽效率高，原料成本低，且易于操作的优势。
36.(3)采用本发明的方法，不仅降低了副产物乙酸对菌株生长的毒害作用，还能有效利用乙酸提高乙酰辅酶a合成，大大降低了生产成本，提高了产物的生产，为杆菌肽工业化生产奠定了良好的基础。
37.生物材料保藏
38.一株地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)ath，已于2022年1月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022094，分类命名为：bacillus licheniformis ath，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
附图说明
39.图1：地衣芽孢杆菌ath平板菌落图。
40.图2：地衣芽孢杆菌ath单染色镜检结果图。
41.图3：指示金黄色葡萄球菌菌株抑菌平板实验图，三个抑菌圈均为金黄色葡萄球菌菌株抑菌圈。
42.图4：发酵液中杆菌肽的抑菌圈图，三个抑菌圈均为初始地衣芽孢杆菌ath的抑菌圈。
43.图5：乙酰辅酶a合成酶编码基因bsacs扩增结果。
44.图6：重组菌株地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs的菌落pcr验证结果。
45.图7：杆菌肽标准品的抑菌圈图，分别为1000、800、600、400、200iu/ml梯度效价的抑菌圈。
46.图8：发酵液中杆菌肽的抑菌圈图，三个抑菌圈均为地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs的抑菌圈。
47.图9：杆菌肽标准品标准曲线。
48.图10：杆菌肽标准品的hplc液相图。
49.图11：发酵液中杆菌肽hplc液相图。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例对本发明进行进一步地阐述。
51.下述实施例中所涉及的杆菌肽标准品购自阿拉丁生物试剂公司；下述实施例中涉及的phy300plk质粒购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、bacillus subtilis subsp 168均购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。
52.下述实施例中涉及的培养基及所需溶液如下：
53.杆菌肽筛选培养基：蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、nacl 10g/l，并加入杆菌肽锌
10u/ml。
54.lb液体培养基：蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、nacl 10g/l。
55.lb固体培养基：蛋白胨10g/l、酵母浸粉5g/l、nacl 10g/l、琼脂粉15～20g/l。
56.种子培养基：种子培养基成分蛋白胨50g/l、牛肉浸膏3g/l、酵母粉2g/l，nacl 5g/l。
57.发酵培养基：豆粕粉50g/l、可溶性淀粉40g/l、caco
3 24g/l、(nh4)2so
4 1g/l、znso
4 5g/l、蛋白胨10g/l。
58.下述实施例中涉及的检测方法如下：
59.杆菌肽检测方法：选择c18色谱柱；0.05mol/l的醋酸盐缓冲液(ph 6.4)-50％乙腈溶液(75:25)为流动相；检测波长254nm；柱温30℃。
60.实施例1：地衣芽孢杆菌ath菌株的筛选
61.(1)将饲料样品置于28℃温箱中培养24h后，在80～85℃水浴锅中水浴处理15min，冷却室温后用生理盐水梯度稀释。将样品稀释液涂布于杆菌肽筛选培养基平板，37℃恒温培养24h后，挑取培养基上生长且饱满菌落于lb液体培养基进行培养。
62.(2)筛选后的单菌落如图1所示，菌落表明呈圆形，边缘不齐，较薄，表面粗糙，不透明，显灰白色，通过单染色镜检结果如图2显示菌体长约1.5～3.0μm，宽约0.6～0.8μm，且菌株革兰氏染色呈阳性。将筛选后菌株的通过16s rdna(核苷酸序列如seq id no.3所示)进行测序，菌株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，将该菌株命名为bacillus licheniformis ath，并于2022年1月19日保藏于中国典型培养物保藏中心。
63.实施例2：地衣芽孢杆菌ath的抑菌实验
64.(1)指示菌菌株的筛选
65.为了验证地衣芽孢杆菌ath的对抑菌效果，本实验选择大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌株；
66.分别将上述指示菌株在37℃过夜培养12h后，在超净工作台用无菌水稀释od＝0.8后，取200μl涂布于lb平板上，作为抑菌指示平板。
67.(2)地衣芽孢杆菌ath接种于lb液体培养基中，37℃过夜培养，将地衣芽孢杆菌ath的菌浓稀释至od600＝1.0后，在超净工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，用直径2cm的灭菌过滤纸片吸取定量菌液，分别点种于抑菌指示平板上，37℃过夜培养12h后，杆菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好(如图3所示)，其次是谷氨酸棒状杆菌、蜡样芽孢杆菌，大肠杆菌。综上所述，选择革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为指示菌，进一步分析地衣芽孢杆菌ath的抑菌效果。
68.(3)根据步骤(2)的实验结果，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，37℃过夜培养后，用无菌水稀释一定倍数，吸取200μl涂布平板，此时，金黄色葡萄球菌的菌浓为：od600＝0.8。
69.(4)将地衣芽孢杆菌ath接种于lb液体培养基中，37℃过夜培养，分离划线后将单菌落接种于种子培养基，37℃，200rpm条件下培养8～12h，制备得到种子液；将制备得到的种子液按照10％(v/v)的接种量加入到25ml发酵培养基，于温度为37℃、转速为200rpm条件下，培养36h后加入质量分数为5％znso4的溶液，继续培养至42h，离心，收集上清液。
70.(5)取牛津杯置于含有指示菌株(od600＝0.8)的lb平板上；
71.将步骤(4)得到的发酵清液在超净工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，取10μ
l除菌后的发酵液(od600＝0.8)，置于牛津杯中，37℃条件下培养12h；
72.结果如图4所示，出发菌株地衣芽孢杆菌ath产杆菌肽抑菌效果良好，并测定抑菌圈直径大小为13.8mm。
73.(6)杆菌肽标准品抑菌圈直径与效价的检测方法：
74.具体步骤如下：
75.根据步骤(2)中的抑菌实验结果，以金黄色葡萄球菌作为指示菌涂布lb平板；并在lb平板放置牛津杯；其中指示菌菌浓为：od600＝0.8；
76.1)将杆菌肽标品效价稀释为1000iu/ml、800iu/ml、600iu/ml、400iu/ml、200iu/ml；分别吸取10μl上述不同效价的杆菌肽溶液，置于不同的牛津杯中；在37℃培养12h，测定抑菌圈直径大小，结果如表1及图7所示；
77.2)在超净工作台中用0.22μm的微孔滤膜将步骤(4)制备得到的发酵液过滤除菌，取10μl除菌后的菌液(od值为：1.0)，置于牛津杯中；在37℃培养12h，测定抑菌圈直径大小，结果如表1所示。
78.根据表1中直径大小与杆菌肽标品效价浓度结果绘制标准曲线(如图9所示)，并拟合函数方程式。
79.表1：杆菌肽标准样品效价与抑菌圈直径大小
[0080][0081]
根据杆菌肽标品曲线及测量的出发菌株地衣芽孢杆菌ath抑菌圈直径大小，结果显示，出发菌株地衣芽孢杆菌ath杆菌肽效价为1039iu/ml，hplc检测发酵液中的杆菌肽a含量678iu/ml。
[0082]
实施例3：乙酰辅酶a合成酶表达载体的构建
[0083]
具体步骤如下：
[0084]
(1)以bacillus subtilis subsp 168的基因组dna为模板，以f和r为引物进行pcr扩增，得到异源来源的乙酰辅酶a合成酶基因bsacs(核苷酸序列如seq id no.1所示)；所用引物序列如下：
[0085]
f：5-atgggtcgcggatccgatgaacttgaaagcgttac-3’；
[0086]
r：5-cgagtgcggccgcaattaatcctccattgttgacag-3’。
[0087]
pcr扩增条件为：95℃预变性，3min；95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，90s，30个循环；72℃终延伸10min。
[0088]
pcr扩增体系为：模板0.5μl，上下游引物各0.5μl，灭菌的双蒸水23.5μl，primer stardna聚合酶25μl。
[0089]
(2)将步骤(1)获得的编码乙酰辅酶a合成酶的基因bsacs(与phy300plk质粒经限制性内切酶ecori和bami酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(escherichia coli)jm109，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有10μg
·
ml-1
氨苄霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；菌落pcr验证，挑取验证正确的转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h，菌落pcr验证，挑取验证正确的转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行pcr扩增验证(如图5所示)以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组质粒phy300plk-bsacs。
[0090]
实施例4：重组地衣芽孢杆菌的构建
[0091]
具体步骤如下：
[0092]
分别将实施例3获得的重组质粒phy300plk-bsacs电转化地衣芽孢杆菌ath，得到转化产物；分别将转化产物涂布于lb固体培养基(含有10μg
·
ml-1
氨苄霉素)，于37℃恒温培养箱中倒置培养12h，分别得到转化子；根据菌落pcr验证，结果如图6所示，得到阳性转化子，挑取验证正确的转化子接种至lb液体培养基(含有10μg
·
ml-1
氨苄霉素)中，于37℃恒温培养箱中、120～180rpm的条件下摇瓶培养12h后，得到发酵液，分别提取质粒进行pcr验证以及测序验证，验证正确即获得重组地衣芽孢杆菌：ath/phy300plk-bsacs。
[0093]
实施例5：重组地衣芽孢杆菌产杆菌肽
[0094]
具体步骤如下：
[0095]
(1)将实施例4制备得到的重组地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs在平板上划线活化，将活化后的重组地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs接入lb液体培养基，在37℃条件下，培养8～10h，制备得到种子液；
[0096]
(2)将制备得到的种子液按照10％(v/v)的接种量加入到25ml发酵培养基，于温度为37℃、转速为200rpm条件下，培养36h后加入质量分数为5％znso4的溶液，继续培养至42h后，离心收集上清液；
[0097]
(3)以金黄色葡萄球菌作为指示菌涂布lb平板；并在lb平板放置牛津杯；其中指示菌菌浓为：od600＝0.8；
[0098]
将上发酵清液在超净工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，吸取10μl滤菌的上发酵清液(od值为：1.0)，置于牛津杯中，7℃培养12h后，测定抑菌圈；
[0099]
结果显示，重组菌株抑菌圈直径大小为19.9mm(如图8所示)。
[0100]
按照实施例2的效价的检测方法，通过函数方程式测得重组地衣芽孢杆菌ath/phy300plk-bsacs的杆菌肽效价为1928iu/ml；采用hplc，检测发酵液中的杆菌肽a含量1081iu/ml(如图10～11所示)。
[0101]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。