用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送的制作方法

用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年6月11日提交的u.s.s.n 62/860,101的权益和优先权，所述专利的内容整体并入本文。


背景技术：

3.失调的血浆激肽释放酶活性可能导致促炎性和血管活性肽缓激肽(bradykinin)的过量产生。这种疾病的一实例是遗传性血管性水肿(hae)，这是一种罕见的但可能危及生命的病症，其特征是表现为皮下和粘膜下血管性水肿的不可预测和反复发作的血管扩张。在一些情况下，hae与低血浆c1抑制剂水平(i型)有关，而在其他情况下，蛋白质以正常或升高的量循环但功能失调(ii型)。c1抑制剂是血浆激肽释放酶活性的主要调控因子。hae发作的症状包括自然发生或由轻度创伤引发的面部、口和/或气道的肿胀。影响气道的水肿发作可能是致命的。除急性炎症发作以外，过量的血浆激肽释放酶活性也与慢性疾病相关，如自身免疫性疾病，包括红斑狼疮。
4.已经考虑并开发了用于治疗c1-inh缺乏或功能障碍的各种策略，包括例如抑制接触系统的成员。例如，拉那利尤单抗(lanadelumab)是已被批准用于治疗hae的血浆激肽释放酶的完全人单克隆抗体抑制剂。
5.使用体内产生包括抗体的蛋白质的载体对于疾病的治疗是期望的，但是受到各种因素的限制，包括递送至受试者后不良的抗体产生。


技术实现要素：

6.本发明提供了编码抗血浆激肽释放酶抗体的高效且稳健的重组腺相关病毒(raav)载体。本发明部分基于以下令人惊讶的发现：编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的特异性重组aav载体导致高水平功能性抗血浆激肽释放酶抗体的体内产生。具体地讲，raav导致抗血浆激肽释放酶mab在体内的稳健和持续产生，并且载体介导的抗血浆激肽释放酶抗体保留与通过传统重组表达方法(例如，cho细胞)产生的抗体蛋白质相同的靶向活性。在本发明之前，通过施用携带所需有效负载的raav载体递送抗血浆激肽释放酶抗体导致未知量的活性抗体产生。因此，在本发明之前，使用编码抗血浆激肽释放酶的raav载体治疗c1-inh缺乏或病症，包括例如遗传性血管性水肿是不可预测的或可行的。
7.在一些方面，本文提供了编码全长抗体的重组腺相关病毒(raav)载体，所述全长抗体包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。
8.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链经由接头连接。
9.在一些实施方案中，接头包含可裂解接头。
10.在一些实施方案中，接头包含不可裂解接头。
sequence)。
37.在一些实施方案中，弗林蛋白酶可裂解序列随后为接头和2a序列。
38.在一些实施方案中，接头是gsg接头。
39.在一些实施方案中，2a序列是t2a、p2a、e2a或f2a序列。
40.在一些实施方案中，2a序列是p2a序列。
41.在一些实施方案中，载体还编码分泌信号。
42.在一些实施方案中，分泌信号是天然存在的信号肽。
43.在一些实施方案中，分泌信号是人工信号肽。
44.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链产生能够与血浆激肽释放酶结合的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。
45.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体抑制血浆激肽释放酶的蛋白水解活性。
46.在一些实施方案中，抗体结合于血浆激肽释放酶活性位点。
47.在一些实施方案中，结合封闭血浆激肽释放酶活性位点。
48.在一些实施方案中，结合抑制血浆激肽释放酶的活性。
49.在一些实施方案中，抗体不结合前激肽释放酶。
50.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由相同载体表达。
51.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由不同的raav载体表达。
52.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单独的raav载体表达。
53.在一些实施方案中，载体还包含5’和3’反向末端重复序列(itr)、一个或多个增强子元件和/或poly(a)尾。
54.在一些实施方案中，一个或多个增强子元件选自转录因子结合位点和/或wpre序列的簇。
55.在一些方面，提供一种包含aav8衣壳和raav载体的重组腺相关病毒(raav)，所述载体包含：(a)5’反向末端重复序列(itr)；(b)顺式作用调控模块(crm)；(c)肝特异性启动子；(d)抗血浆激肽释放酶抗体重链序列和抗血浆激肽释放酶抗体轻链序列；(e)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)；和(f)3’itr。
56.在一些实施方案中，肝特异性启动子包含选自以下的启动子：人甲状腺素运载蛋白启动子(ttr)、经修饰的httr(httr mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝启动子1(lp1)、trm启动子、人因子ix pro/肝转录因子应答寡聚物、lsp、cmv/cba启动子(1.1kb)、cag启动子(1.7kb)、mttr、经修饰的mttr、mttr pro、mttr增强子或碱性白蛋白启动子。
57.在一些实施方案中，肝特异性启动子包含人甲状腺素运载蛋白启动子。
58.在一些实施方案中，crm是肝特异性crm。
59.在一些实施方案中，载体包含至少crm。
60.在一些实施方案中，载体包含三个crm8。
61.在一些实施方案中，wpre是经修饰的。
62.在一些实施方案中，wpre序列是wpre mut6delatg。
63.在一些方面，提供一种治疗与有需要的受试者中的活化的激肽释放酶-激肽途径的缺乏或失调相关的疾病或病症的方法，所述方法包括施用如本文所述的重组腺相关病毒载体(raav)。
64.在一些实施方案中，活化的激肽释放酶-激肽途径的缺乏或失调是与c1酯酶抑制剂缺乏相关的疾病或病症。
65.在一些实施方案中，通过静脉内、皮下或透皮施用施用所述raav载体。
66.在一些实施方案中，透皮施用通过基因枪(gene gun)进行。
67.在一些实施方案中，与活化的激肽释放酶-激肽途径的缺乏或失调或c1酯酶抑制剂的缺乏相关的病症是遗传性血管性水肿(hae)、获得性血管性水肿(aae)、具有正常c1抑制剂的血管性水肿、糖尿病性黄斑水肿、偏头痛、肿瘤学、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏病(alzheimer
′
s disease)、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔黏膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、动脉或静脉血栓形成、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、血管炎、水肿、脑水肿、肺栓塞、中风、由心室辅助装置或支架诱导的凝血、头部创伤或瘤周脑水肿、败血症，急性大脑中动脉(mca)缺血性事件、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎/血管炎或烧伤。
68.在一些实施方案中，与c1酯酶抑制剂缺乏相关的病症是hae。在一些实施方案中，病症是获得性血管性水肿(aae)。在一些实施方案中，病症是具有正常c1抑制剂的血管性水肿。在一些实施方案中，病症是糖尿病性黄斑水肿。在一些实施方案中，病症是偏头痛。在一些实施方案中，病症是癌症。在一些实施方案中，病症是神经退行性疾病。在一些实施方案中，病症是阿尔茨海默氏病。在一些实施方案中，病症是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，病症是通风。在一些实施方案中，病症是肠道疾病。在一些实施方案中，病症是口腔粘膜炎。在一些实施方案中，病症是神经性疼痛。在一些实施方案中，病症是炎性疼痛。在一些实施方案中，病症是椎管狭窄-退行性脊柱疾病。在一些实施方案中，病症是动脉或静脉血栓形成。在一些实施方案中，病症是术后肠梗阻。在一些实施方案中，病症是主动脉瘤。在一些实施方案中，病症是骨关节炎。在一些实施方案中，病症是血管炎。在一些实施方案中，病症是水肿。在一些实施方案中，病症是脑水肿。在一些实施方案中，病症是肺栓塞。在一些实施方案中，病症是中风。在一些实施方案中，病症是由心室辅助装置或支架诱导的凝血。在一些实施方案中，病症是头部创伤或肿瘤周脑水肿。在一些实施方案中，病症是败血症。在一些实施方案中，病症是急性大脑中动脉(mca)缺血性事件。在一些实施方案中，病症是再狭窄。在一些实施方案中，病症是系统性红斑狼疮肾炎/血管炎。在一些实施方案中，病症是烧伤。
69.在一些实施方案中，hae为i型、ii型或iii型。
70.在一些实施方案中，raav载体在施用后是附加型的。
71.在一些实施方案中，在施用后，抗血浆激肽释放酶抗体重链和轻链组装成功能性抗体。
72.在一些实施方案中，抗体是igg。
73.在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约2周至6周时在受试者的血浆中是可检测的。
74.在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约4周时在受试者的血浆中是可检测的。
75.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链包含：包含seq id no：17的氨基酸序列的cdr1、包含seq id no：18的氨基酸序列的cdr2和包含seq id no：19的cdr3。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体轻链包含：包含seq id no：20的氨基酸序列的cdr1、包含seq id no：21的氨基酸序列的cdr2和包含seq id no：22的cdr3。
76.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链与seq id no：1具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大序列同一性。
77.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链与seq id no：1相同。
78.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体轻链与seq id no：2具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大序列同一性。
79.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体轻链与seq id no：2相同。
80.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体轻链和/或重链包含增强抗体的半衰期和/或降低其效应子功能的一个或多个突变。
81.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链与seq id no：3具有至少约80％、85％、90％、95％或更大序列同一性。
82.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链具有seq id no：3的氨基酸序列。
附图说明
83.图1是说明使用编码抗血浆激肽释放酶抗体的raav载体的示例性基因治疗方法的示意图。图1描绘了编码向有需要的受试者静脉内(iv)施用的抗血浆激肽释放酶抗体的aav载体；载体被转译成功能性抗血浆激肽释放酶抗体，其分泌到受试者的循环中；并且抗体引起受试者中的血浆激肽释放酶的结合和抑制。iv＝静脉内；hc＝重链；lc＝轻链。
84.图2a是一系列示意图，其显示了raav构建体(从示意图系列的顶部到底部上到下)1)igg(-)对照构建体；2)抗pka igg lala构建体；3)抗pka fab构建体；和4)抗pka igg构建体。图2b是显示包含肝特异性启动子和/或增强子元件、wpre元件和人分泌信号的raav构建体的示意图。
85.图3a、图3b和图3c为分别显示在iv施用所指示载体后2周和4周时小鼠血浆中的总igg和活性igg水平的图表。使用利用抗fc抗体检测系统的elisa定量总igg，而活性igg elisa仅定量结合活性pka的所表达的igg。每个图表从左到右的样品对应于以下处理：：空载体对照(无转基因表达)；包含不相关对照抗体的编码序列的对照载体；包含具有lala突变的抗pka抗体的编码序列的载体；包含抗pka抗体fab结构域的编码序列的载体；包含全长抗pka抗体的编码序列的载体。在给药后2周和4周获得呈现在图表上的这些样本的数据。最右侧的条件对应于在血浆采集前2小时作为蛋白质样品注射的抗pka igg(具有lala突变)的水平。图3c是与图3a所示相同的图表，增加了显示治疗性igg水平和超过治疗水平的范围的叠加水平线，以用于治疗hae。blq＝低于定量。图3d是显示在静脉内施用载体(媒介物、raav8-1、raav8-2和raav8-3)后28天时小鼠血浆中的总igg和活性igg水平的图表。载体raav8-1、raav8-2和raav8-3主要衍生自图3e中所示的在启动子和/或增强子元件、分泌信号和wpre元件方面具有一些变化的raav构建体。载体raav8-1包括cb启动子和鼠分泌信号，
但无wpre元件。载体raav8-2包括httr 3xcrm8启动子和鼠分泌信号，但无wpre元件。载体raav8-3包括httr 3xcrm8启动子、人分泌信号和wpre mut6元件。图3f是显示在小鼠(n＝8)中以1x10
11
vg/kg剂量静脉内施用raav8-2载体后16周以上小鼠血浆中的活性igg水平的图表。
86.图4是从用raav8-pka igg、lala处理的小鼠血浆中检测体内表达抗体的重链和轻链的代表性蛋白质印迹(western blot)的图。在施用所指示载体后第28天时采集样品。为了比较，纯化的抗pka mab(从cho细胞的传统质粒转染表达和纯化)包括在印迹上。
87.图5a是描绘用于测量raav载体衍生抗体的离体生物活性的测定的示意图。所述测定使用在施用相应载体之前和之后获得的血浆样品中的荧光肽底物来测量血浆激肽释放酶(“pka”)活性。图5b是显示如所指示(或蛋白质igg对照的iv注射后0小时和2小时)的相应抗体施用后14天和28天时采集的血浆的离体生物活性的图表。生物活性测量为血浆激肽释放酶活性的抑制百分比。
88.图6显示在施用以下后小鼠肝切片的代表性免疫组织化学的一系列显微照片：具有lala突变的raav8抗血浆激肽释放酶抗体(“raav8 pka igg lala”)(左)；raav8空载体对照(中)；和未注射对照(右)。箭头指示特异性抗体的阳性染色。
89.图7a、图7b和图7c显示在注射包含全长igg或fab的编码序列的raav载体后4周小鼠肝切片的代表性免疫组织化学的一系列显微照片的不同放大率，如所指示。肝细胞和窦状细胞的阳性染色在图7a中分别由宽箭头和细箭头指示。
90.图8是显示来自注射有raav8抗pka igg lala载体且在施用后2周和4周后评估的小鼠的活性抗pka igg lala的百分比的图表。最右侧的条件是iv注射纯化的抗pka lala抗体，随后评估在施用前阶段(时间零)和施用后2小时的活性抗pka igg百分比。
91.图9显示测量完整和所处理抗体的分子量的质谱。这个图左侧的图表代表纯化/标准抗体。这个图右侧的图表代表在raav8处理的小鼠血浆中产生的抗pka抗体。完整抗体是指在raav8处理的小鼠血浆中产生的天然抗体。将纯化的抗pka mab加标于空白小鼠血浆中以产生纯化的完整样品。所处理的抗体是指已经经历还原、去糖基化或去糖基化和还原两者的抗pka抗体。
92.图10是显示在raav8构建体静脉内施用后28天时采集的raav8处理的小鼠血浆样品中产生的抗pka抗体的离体生物活性的图表。将在raav8处理的小鼠血浆中产生的抗pka抗体在抑制激肽释放酶-激肽途径中的效力与市售抑制剂takhzyro
tm
(拉那利尤单抗，一种血浆激肽释放酶的全人类单克隆抗体抑制剂)在抑制相同途径中的效力进行比较。依据随抗pka抗体浓度而变的血浆激肽释放酶活性的抑制百分比来测量生物活性。
93.定义
94.为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。以下术语和其他术语的其他定义阐述在整个说明书中。
95.如说明书和权利要求书中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数种指代物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
96.2a序列：如本文所用，“2a”或“2a序列”或“2a肽”是指一类自裂解肽。2a肽的实例包括t2a、p2a、e2a和f2a。t2a具有egrgslltcgdveenpgp序列(seq id no：13)；p2a具有
atnfsllkqagdveenpgp序列(seq id no：14)；e2a具有qctnyallklagdvesnpgp序列(seq id no：15)；f2a具有vkqtlnfdllklagdvesnpgp序列(seq id no：16)。适用于本文所述的raav载体的裂解有效2a肽描述于chng j.等人mabs.2015；7(2)：403-412；和kim等人plos one 2011；6(4)中，其中的每一个的内容以全文引用的方式并入本文中。
97.腺相关病毒(aav)：如本文所用，术语“腺相关病毒”或“aav”或重组aav(“raav”)包括但不限于aav 1型、aav 2型、aav 3型(包括3a型和3b型)、aav 4型、aav 5型、aav 6型、aav 7型、aav 8型、aav 9型、aav 10型、aav 11型、禽类aav、牛类aav、犬类aav、马类aav和羊类aav(参见，例如，fields等人，virology，第2卷，第69章节(第4版，lippincott-raven publishers)；gao等人，j.virology78：6381-6388(2004)；mori等人，virology 330：375-383(2004))。通常，aav可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者，并且可以染色体外状态存在而不整合到宿主细胞的基因组中。aav载体通常用于基因疗法中。在一些实施方案中，aav是经工程化的。aav可以通过本领域中已知的任何方法进行工程化。例如，在一些实施方案中，aav衣壳通过蛋白质工程化方法进行工程化。
98.施用：如本文所用，术语“施用”或“引入”在通过引起raav载体有效递送的方法或途径将编码抗体的raav载体递送至受试者的情形中可互换使用。本领域已知用于施用raav载体的各种方法，包括例如静脉内、皮下或透皮施用。raav载体的透皮施用可以通过使用“基因枪”或生物射弹粒子递送系统来执行。在一些实施方案中，raav载体经由非病毒脂质纳米粒子施用。
99.动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。
100.抗体：如本文所用，术语“抗体”或一种或多种“ab”或“mab”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(lg)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。通过“特异性结合”或“与...免疫反应”意指抗体与所需抗原的所需抗原的一个或多个区反应。抗体包括抗体片段。抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合dab(结构域抗体)、单链、f
ab
、f
ab
′
、f
(ab’)2
片段、scfv和f
ab
表达文库。抗体可以是整个抗体、或免疫球蛋白、或抗体片段。
101.所识别的免疫球蛋白多肽包括k和入轻链以及其他物种中的α、γ(igg1、igg2、igg3、igg4)、δ、ε和μ重链或等效物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kda或约214个氨基酸)包含nh2末端处的约110个氨基酸的可变区和cooh末端处的k或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kda或约446个氨基酸)类似地包含可变区(约116个氨基酸)和前述重链恒定区中的一个，例如γ(约330个氨基酸)。
102.抗原结合位点：如本文所用，术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的部分。抗原结合位点由重链(“h”)和轻链(“l”)的n末端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。称为“高变区”的重链和轻链的v区内的三个高度发散的段插入到称为“框架区”或“fr”的更保守的侧翼段之间。因此，术语“fr”是指在免疫球蛋白中的高变区之
间天然存在且邻近免疫球蛋白中的高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区相对于彼此设置在三维空间中以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一个的三个高变区被称为“互补决定区”或“cdr”。
103.大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。
104.生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”是指在生物系统中并且特别是在生物体中具有活性的任何药剂的特征。例如，当施用于生物时对所述生物体具有生物作用的药剂视为生物活性的。在特定实施方案中，当肽是生物活性的情况下，共享所述肽的至少一种生物活性的所述肽的一部分通常被称为“生物活性的”部分。
105.c1酯酶缺乏症或c1酯酶病症：如本文所用，“c1酯酶缺乏症”或“c1酯酶病症”意指与健康个体相比，受试者中存在的功能性c1病症的减少量。
106.可裂解接头：如本文所用，术语“可裂解接头”包括能够由化合物裂解的任何多肽接头。例如，可裂解接头可以是酶促可裂解的多肽接头。各种酶解可裂解接头适合于本发明，包括例如弗林蛋白酶可裂解接头或凝血酶可裂解接头。
107.耦合、连接、接合或融合：如本文所用，术语“耦合”、“连接”、“接合”、“融合(fused)”和“融合(fusion)”可互换使用。这些术语是指通过任何手段，包括化学缀合或重组手段，将另外两个元件或组分接合在一起。
108.表位：如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或片段特异性结合的任何蛋白质决定子。表位决定子通常由分子的化学活性表面分组组成，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，可以针对多肽的n末端或c末端肽产生抗体。
109.功能等效物或衍生物：如本文所使用，在氨基酸序列的功能性衍生物的上下文中，术语“功能等效物”或“功能衍生物”指示保留与原始序列基本上类似的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等效物可以是天然衍生物或合成制备的。示例性的功能衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，其条件是蛋白质的生物活性是保守的。置换氨基酸期望地具有与被置换氨基酸相似的化学-物理性质。期望的相似的化学-物理性质包括电荷、膨松性、疏水性、亲水性等等中的相似性。
110.遗传性血管性水肿或hae：如本文使用的，术语“遗传性血管性水肿”或“hae”是指以无法预测和反复发作的炎症为特征的血液病症。hae通常与c1-inh缺乏相关，所述c1-inh缺乏可能是低水平的c1-inh或者具有受损或降低活性的c1-inh的结果。hae还与其他基因突变相关，如fxii中的突变等。症状包括但不限于可在身体任何部位发生的肿胀，所述部位如面部、四肢、生殖器、胃肠道和上呼吸道。
111.体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
112.体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体，如人和非人动物内发生的事
件。在基于细胞的系统的情形中，所述术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。
113.ires：如本文所用，术语“ires”是指任何合适的内部核糖体进入位点序列。
114.分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)与最初生产时(无论是天然的和/或在实验环境中)与其相关的至少一些组分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初与其相关的其他组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则所述物质是“纯的”。如本文所用，术语“分离的细胞”是指不含在多细胞生物体中的细胞。
115.免疫结合：术语“免疫结合”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(kd)表示，其中较小的kd代表较大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域中众所周知的方法进行定量。
116.接头或肽接头：如本文所用，术语“接头”或“肽接头”是指连接两个多肽结构域的氨基酸序列。例如，“接头”或“肽接头”可以分离抗体重链氨基酸序列和抗体轻链氨基酸序列。各种类型的接头适用于本发明，包括例如具有gly-ser-gly(gsg)基序的接头。
117.多肽：如本文所用，术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的氨基酸的顺序链。所述术语用于指任何长度的氨基酸链，但本领域普通技术人员将理解，所述术语并不限于长链，并且可以指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员已知的，多肽可进行加工和/或修饰。
118.预防：如本文所使用，当与疾病、病症和/或病况的发生结合使用时，术语“预防”是指降低疾病、病症和/或病况发展的风险。
119.蛋白质：如本文使用的，术语“蛋白质”指充当离散单位的一种或多种多肽。如果单个多肽是离散功能单元，并且不需要与其他多肽永久或暂时物理结合以便形成离散功能单元，那么术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用。如果离散功能单元由超过一种彼此物理结合的多肽组成，那么术语“蛋白质”是指物理上耦合并且一起充当离散单元的多个多肽。
120.受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，所述患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有或易患有疾病或病症，但是可以显示出或可以不显示出所述疾病或病症的症状。
121.基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。
122.基本同源性：短语“基本同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将了解，如果两个序列在相应位置中含有同源残基，那么其一般视
为“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是将适当地具有类似结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域普通技术人员众所周知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水”或“亲水”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸取代相同类型的另一种氨基酸通常可以认为是“同源”取代。
123.如本领域中众所周知，可以使用多种算法中任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。示例性的此类程序描述于altschul等人，basic local alignment search tool，j.mol.biol.，215(3)：403-410，1990；altschul等人，methodsinenzymology；altschul等人，
″
gapped blast and psi-blast：a new generation of protein database search programs
″
，nucleic acids res.25：3389-3402，1997；baxevanis等人，bioinformatics：a practical guide to the analysis of genes and proteins，wiley，1998；以及misener等人(编)，bioinformatics methods and protocols (methods in molecular biology，第132卷)，humana press，1999中。除识别同源序列以外，上述程序通常提供对同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列中的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在相关的残基段上同源，那么这两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关段是完整序列。在一些实施方案中，相关段是至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个残基。
124.基本同一性：短语“基本同一性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将了解，如果两个序列在相应位置中含有相同的残基，那么其一般视为“基本上相同的”。如本领域中众所周知，可以使用多种算法中任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的blastn以及用于氨基酸序列的blastp、空位blast和psi-blast。示例性的此类程序描述于altschul等人，basic local alignment search tool，j.mol.biol.，215(3)：403-410，1990；altschul等人，methods in enzymology；altschul等人，nucleic acids res.25：3389-3402，1997；baxevanis等人，bioinformatics：a practical guide to the analysis of genes and proteins，wiley，1998；以及misener等人(编)，bioinformatics methods and protocols(methods in molecular biology，第132卷)，humana press，1999中。除识别相同的序列以外，上述程序通常提供对同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列中的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应残基在相关的残基段上相同，那么这两个序列被认为是基本上相同的。在一些实施方案中，相关段是完整序列。在一些实施方案中，相关段是至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个残基。
125.患有：“患有”疾病、病症和/或病况的个体已诊断患有所述疾病、病症和/或病况或显现出所述疾病、病症和/或病况的一种或多种症状。
126.治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、病症和/或病状或对疾病、病症和/或病状敏感的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、病症和/或病状的症状发作的量。本领域的普通技术人员将认识到，通常通过包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。
127.治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于使特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、转佳、减轻，抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病有关的病理的风险，可以向未表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者施用治疗。
128.本文中的端点的数字范围的叙述包括涵盖在所述范围内的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4和5)。还应理解，假定其所有数字和分数由术语“约”修饰。
129.在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用，除非上下文另外明确指示，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数种指代物。
130.在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
具体实施方式
131.本公开描述了编码抗血浆激肽释放酶抗体的有效且稳健的重组腺相关病毒(raav)载体，以用于治疗血浆激肽释放酶介导的病症，如hae相关c1 inh缺乏症。人c1-inh是重要的抗炎血浆蛋白，具有广泛范围的抑制性和非抑制性生物活性。通过序列同源性、其c末端结构域的结构和蛋白酶抑制机制，其属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族(最大类别的血浆蛋白酶抑制剂)，其还包括抗凝血酶、α1-蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂、以及调控不同生理系统的许多其他结构上相似的蛋白质。c1-inh是补体系统、激肽生成的接触系统和固有凝血途径中的蛋白酶抑制剂。
132.c1-inh的低血浆含量或其功能障碍导致补体和接触血浆级联两者的活化，并且也可影响其他系统。c1-inh血浆含量降低至低于55μg/ml(正常的～25％)的水平已显示诱导c1的自发性活化。存在使得激肽释放酶激肽系统甚至在正常c1-inh活性存在的情况下可变得过度活化的其他方式。例如，在因子xii(fxii)中存在使其更容易活化并且因此更容易使前激肽释放酶随后活化成血浆激肽释放酶的已知突变。在一些实施方案中，本文所述的raav载体用于治疗患有由过度的血浆激肽释放酶活性介导的疾病或功能障碍的受试者。
133.图1中描绘说明用于递送与血浆激肽释放酶结合的抗体的raav载体方法的示意图。如图1中所示，将包含重组抗血浆激肽释放酶抗体序列的raav载体施用于受试者并导致产生融合重链和轻链转录物。随后裂解这种转录物，从而导致产生分泌到循环中的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。图2a和2b描绘了本文所述的raav载体的实施方案。
134.因此，本公开尤其提供了编码可用于治疗疾病，例如与激肽释放酶-激肽系统功能失调相关的疾病的抗体的raav载体。raav载体可以构建为编码靶向激肽释放酶-激肽系统
的选定蛋白质成员，例如血浆激肽释放酶的抗体。
135.在一些实施方案中，raav载体编码抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中，raav载体编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。
136.本公开还尤其提供使用本文所述的raav载体治疗疾病的方法。在一些实施方案中，所述疾病是与激肽释放酶-激肽级联的过度活性相关的疾病，例如c1-inh缺乏症或病症。
137.在一些实施方案中，c1-inh缺乏症或病症是hae。
138.raav载体设计
139.在一些方面，本文提供了编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的重组腺相关病毒(raav)载体。
140.在一些实施方案中，本文所述的raav载体产生融合的抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。随后裂解融合的重链和轻链转录物，以产生分泌到循环中的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。据称，在一些实施方案中，本文所述的raav载体提供了包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链序列两者的一个基因盒(genetic cassette)。在一些实施方案中，肝在施用raav载体之后充当储库。
141.在一些实施方案中，接头连接抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。各种类型的接头可用于raav载体中。在一些实施方案中，接头是甘氨酸/丝氨酸接头，即基本上由甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。在一示例性实施方案中，接头包含gs或gsg。在一些实施方案中，接头是gsg。在另一实施方案中，接头包含gly-ser-gly(gsg)基序，例如ggsg(seq id no：7)、(gs)x3(seq id no：12)、(ggsg)x2(seq id no：8)、sggsggsgg(seq id no：9)、ggsgggsgggsg(seq id no：10)、(ggggs)x3(seq id no：11)。
142.在一些实施方案中，接头是可裂解接头。众多类型的可裂解接头是本领域中已知的，例如可由酶裂解的那些接头。在一些实施方案中，接头是弗林蛋白酶或凝血酶可裂解接头。在一些实施方案中，接头是弗林蛋白酶可裂解接头。
143.在一些实施方案中，弗林蛋白酶可裂解接头随后为2a序列。各种类型的2a序列是本领域中已知的，并且包括例如t2a、p2a、e2a或f2a。在一些实施方案中，2a序列是t2a。在一些实施方案中，2a序列是p2a。在一些实施方案中，2a是e2a。在一些实施方案中，2a是f2a。
144.在一些实施方案中，aav载体具有ires序列。在一些实施方案中，接头包含ires序列。
145.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单个启动子控制。这种配置将导致产生一个融合重链和轻链，所述融合重链和轻链包含转录物，并且在裂解融合重链和轻链序列之后，产生两种多肽产物。
146.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单独启动子控制。
147.各种类型的启动子可用于本文所述的raav载体中。这些包括例如遍在的、组织特异性的和可调控的(例如，可诱导的或可抑制的)启动子。
148.在一些实施方案中，启动子是经修饰的。各种类型的经修饰启动子是本领域中已知的，并且包括例如缩短的最小启动子等。在一些实施方案中，启动子是遍在启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是肝特异性启动
子。合适的肝特异性启动子的实例包括人甲状腺素运载蛋白启动子(ttr)、经修饰的httr(httr mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝启动子1(lp1)、trm启动子、人因子ix pro/肝转录因子应答寡聚物、lsp、cmv/cba启动子(1.1kb)、cag启动子(1.7kb)、mttr、经修饰的mttr、mttr pro、mttr增强子和碱性白蛋白启动子。肝特异性启动子描述于例如zhijian wu等人，molecular therapy第16卷，第2期，2008年2月中，其内容以引用的方式并入本文。
149.raav载体可以含有另外的增强子或调控元件以促进mrna的转录和/或转译(例如，增强子序列、kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列、ires等)。在一些实施方案中，载体包含5
′
和3’反向末端重复序列(itr)。在一些实施方案中，载体包含一个或多个增强子元件。在一些实施方案中，载体包含poly(a)尾。在一些实施方案中，raav载体包含肝特异性控制元件/区域(hcr)。在一些实施方案中，raav载体包含apoe增强子。在一些实施方案中，raav载体包含肝特异性核酸调控元件，例如顺式调控元件(cre)。cre描述于ep 18202888中，其内容以全文引用的方式并入本文中。示例性cre包括例如cre4和cre6。在一些实施方案中，cre4与载脂蛋白a-ii基因组合使用。在一些实施方案中，cre6与载脂蛋白c-i基因组合使用。
150.在一些实施方案中，raav载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后控制元件(wpre)。wpre的各种优化或变体形式可以与本文所述的载体一起使用，并且包括例如wpre野生型、wpre3和wpremut6delatg等。wpre和相关wpre变体描述于美国专利第10,179,918号；美国专利第7,419,829号；美国专利第9,731,033号；美国专利第8,748,169号；美国专利第7,816,131号；美国专利第8,865,881号；美国专利第6,287,814号；美国专利公开第2016/0199412号；美国专利公开第2017/0114363号；美国专利公开第2017/0360961号；美国专利公开第2019/0032078号；美国专利公报第2018/0353621号；国际公开第wo2017201527号；国际公开第wo2018152451号；国际公开第wo2013153361号；国际公开第wo2014144756号；欧洲专利第ep1017785号；和欧洲专利公开第3440191号中。上述公开中的每一个以全文引用的方式并入本文。
151.在一些实施方案中，raav载体包含wpre元件和/或转录因子结合位点簇。因此，在一些实施方案中，raav载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后控制元件(wpre)。在一些实施方案中，raav载体包含转录因子结合位点簇。
152.在一些实施方案中，raav载体包含顺式调控模块(crm)。各种类型的crm适用于本文所述的载体，并且包括例如肝特异性crm、神经元特异性crm和/或crm8。因此，在一些实施方案中，crm是肝特异性crm。在一些实施方案中，crm是神经元特异性cfm。在一些实施方案中，crm是crm8。在一些实施方案中，载体包括超过一个crm。例如，在一些实施方案中，载体包含两个、三个、四个、五个或六个crm。在一些实施方案中，载体包含三个crm，例如三个crm8。
153.raav载体包含分泌信号，所述分泌信号是天然存在和/或人工信号肽(例如，经重组工程化)。在一些实施方案中，分泌信号是天然存在的信号肽。在一些实施方案中，分泌信号是人工信号肽(例如，经重组工程化)。在一些实施方案中，分泌信号是人分泌信号。在一些实施方案中，分泌信号是鼠分泌信号。
154.在一些实施方案中，raav载体是序列优化的，以增加转录物稳定性，用于更有效的转译，并且降低免疫原性。在一些实施方案中，包括抗血浆激肽释放酶重链和轻链的raav载
体是序列优化的，以增加转录物稳定性，用于更有效的转译，并且降低免疫原性。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶重链和轻链是密码子优化的。
155.在一些实施方案中，raav载体是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10或aav11载体。在一些实施方案中，raav载体是aav 1。在一些实施方案中，raav载体是aav 2。在一些实施方案中，raav载体是aav 3。在一些实施方案中，raav载体是aav 4。在一些实施方案中，raav载体是aav 5。在一些实施方案中，raav载体是aav 6。在一些实施方案中，raav载体是aav 7。在一些实施方案中，raav载体是aav 8。在一些实施方案中，raav载体是aav 9。在一些实施方案中，raav载体是aav 10。在一些实施方案中，raav载体是aav 11。
156.在一些方面，本文提供了包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，核酸是dna。在一些实施方案中，核酸是rna。在一些实施方案中，核酸是dna或rna的组合。在一些实施方案中，本文提供了包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的核苷酸序列的载体。
157.在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，启动子是肝特异性启动子。肝特异性启动子的实例包括人甲状腺素运载蛋白启动子(ttr)和经修饰的httr(httr mod.)。上文描述了可用于各种实施方案中的各种合适的启动子。
158.在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至顺式肌动蛋白调控模块(crm)。在一些实施方案中，crm包括肝特异性crm。一些实施方案包括三个crm，例如三个crm8。上文描述了可用于各种实施方案中的各种类型的合适crm。
159.在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至土拨鼠肝炎病毒转录后控制元件(wpre)。在一些实施方案中，wpre是wpremut6。wpre的各种优化或变体形式是本领域中已知的，并且已经描述于本文中。
160.在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接至天然存在的分泌信号或人工信号肽(例如，经重组工程化)。在一些实施方案中，分泌信号是天然存在的信号肽。在一些实施方案中，分泌信号是人工信号肽(例如，经重组工程化)。在一些实施方案中，分泌信号是人分泌信号。在一些实施方案中，分泌信号是鼠分泌信号。
161.抗血浆激肽释放酶抗体
162.下表1中示出了由raav载体编码的示例性重链和轻链抗血浆激肽释放酶氨基酸序列。
163.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体被工程化为具有延长的半衰期。为此，在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体包含nhance突变(即，h433k和n434f)。在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体包含yte突变(即，m252y/s254t/t256e)。
164.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体被工程化为与fc受体具有减少的相互作用。为此，在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体包含lala突变(即，l234a和l235a)。
165.在一些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体与白蛋白或fcrn相互作用肽融合。
166.在一些实施方案中，重链和轻链序列与下表中描述的序列约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约50％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约55％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约60％相同。在一些
实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约65％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约70％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约75％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约80％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约85％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约90％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约95％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列约100％相同。在一些实施方案中，重链和轻链序列与表1中描述的序列相同。
167.表1：示例性抗血浆激肽释放酶重链和轻链氨基酸序列
[0168][0169]
*下划线指示lala突变氨基酸
[0170]
在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含ftfshyimm(seq id no：17)的重链cdr1。在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含giyssggitvyadsvkgrfti(seq id no：18)的重链cdr2。在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含rrigvprrdefdi(seq id no：19)的重链cdr3。在一些实施方案中，示
例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含ftfshyimm(seq id no：17)的重链cdr1、包含giyssggitvyadsvkgrfti(seq id no：18)的cdr2和包含rrigvprrdefdi(seq id no：19)的cdr3。
[0171]
在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含rasqsisswla(seq id no：20)的轻链cdr1。在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含ykastlesgvpsrf(seq id no：21)的轻链cdr2。在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含qqyntywt(seq id no：22)的轻链cdr3。在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含rasqsisswla(seq id no：20)的轻链cdr1、包含(seq id no：21)的轻链cdr2和包含qqyntywt(seq id no：22)的轻链cdr3。
[0172]
在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含ftfshyimm(seq id no：17)的重链cdr1、包含giyssggitvyadsvkgrfti(seq id no：18)的cdr2和包含rrigvprrdefdi(seq id no：19)的cdr3。在一些实施方案中，示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含rasqsisswla(seq id no：20)的轻链cdr1、包含ykastlesgvpsrf(seq id no：21)的轻链cdr2和包含qqyntywt(seq id no：22)的轻链cdr3。
[0173]
在一些实施方案中，本文公开的cdr具有关于本文所列举的cdr的1个、2个、3个或4个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，与所叙述的cdr序列相比，本文公开的cdr含有不超过3个、2个或1个氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中，获得具有所需结合特性的亲和力成熟变体。各种亲和力成熟cdr序列呈现于wo2014152232中，其内容以全文引用的方式并入本文中。
[0174]
本公开的示例性抗血浆激肽释放酶抗体包括但不限于igg(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)、igm、iga(例如，iga1、iga2和igasec)、igd、ige、fab、fab
′
、fab
′
2、f(ab
′
)2、fd、fv、feb、scfv、scfv-fc和smip结合部分。在某些实施方案中，抗血浆激肽释放酶抗体编码拉那利尤单抗的重链和轻链序列。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体不是抗体片段。在一些实施方案中，抗体不是fab。
[0175]
在某些实施方案中，抗体是scfv。scfv可包括例如允许scfv在不同方向上定向以实现抗原结合的柔性接头。在各种实施方案中，抗体可以是细胞溶质稳定的scfv或内抗体(intrabody)，其保留其在细胞内部的还原环境中的结构和功能(参见例如fisher和delisa，j.mol.biol.385(1)：299-311，2009；以引用的方式并入本文)。在特定实施方案中，scfv根据本文所述的方法转化为igg或嵌合抗原受体。在实施方案中，抗体结合于变性蛋白质靶标和天然蛋白质靶标两者。在实施方案中，抗体结合于变性蛋白质或天然蛋白质。在一些实施方案中，抗体结合补体系统的选定成员。在一些实施方案中，抗体结合于血浆激肽释放酶。
[0176]
在包括人在内的大多数哺乳动物中，整个抗体具有至少两条重链(h)和通过二硫键连接的两条轻链(l)。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由三个结构域(ch1、ch2和ch3)和ch1与ch2之间的铰链区组成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，中间穿插着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr构成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0177]
抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样特性的其他蛋白质支架。例如，抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体，或具有抗体样特性的蛋白质支架，例如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体可以具有以下同种型中的任一种：igg(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)、igm、iga(例如，iga1、iga2和igasec)、igd或ige。
[0178]
抗体片段可以包括源自抗体的一个或多个区段。来自抗体的区段可以保留特异性结合于特定抗原的能力。抗体片段可以是例如fab、fab
′
、fab
′
2、f(ab
′
)2、fd、fv、feb、scfv或smip。抗体片段可以是例如双体抗体(diabody)、三体抗体(triabody)、亲和体(affibody)、纳米抗体(nanobody)、适体、结构域抗体、线性抗体、单链抗体，或可以由抗体片段形成的多种多特异性抗体中的任一种。
[0179]
抗体片段的实例包括：(i)fab片段：由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段：包含由铰链区处的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片段：由vh和ch1结构域组成的片段；(iv)fv片段：由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的片段；(v)dab片段：包括vh和vl结构域的片段；(vi)dab片段：作为vh结构域的片段；(vii)dab片段：作为vl结构域的片段；(viii)分离的互补决定区(cdr)；和(ix)可以任选地由一个或多个合成接头连接的两个或更多个分离的cdr的组合。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但是其可以使用重组方法，例如通过合成接头来接合，所述合成接头能够将其表达为单一蛋白质，vl和vh区配对形成单价结合部分(称为单链fv(scfv))。抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且在一些情况下，可以与完整抗体相同的方式使用。抗原结合片段可以通过重组dna技术或通过完整免疫球蛋白的酶裂解或化学裂解产生。抗体片段还可以包括上文所描述的抗体片段中的任一个，其中另外添加c末端氨基酸、n末端氨基酸或分离个别片段的氨基酸。
[0180]
如果抗体包括源自第一物种的一个或多个抗原决定区或恒定区和源自第二物种的一个或多个抗原决定区或恒定区，那么其可以被称为嵌合。嵌合抗体可以例如通过遗传工程构建。嵌合抗体可以包括属于不同物种(例如，来自小鼠和人)的免疫球蛋白基因区段。
[0181]
编码抗血浆激肽释放酶抗体的raav载体用于治疗疾病的用途
[0182]
本文描述了治疗有需要的受试者的与未调控的血浆激肽释放酶活性相关的疾病，例如c1酯酶抑制剂缺乏症或病症的方法，其包括施用编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的aav载体。在施用本文所述的raav载体后，抗血浆激肽释放酶抗体重链和轻链组装成功能性抗体。功能性抗体分泌到循环中并结合血浆激肽释放酶。
[0183]
本文所述的raav载体可用于治疗任何c1酯酶抑制剂缺乏症或病症和/或由失调的血浆激肽释放酶活性介导的病症。在一些实施方案中，病症是遗传性血管性水肿(hae)、获得性血管性水肿(aae)、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔黏膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、动脉或静脉血栓形成、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、血管炎、水肿、脑水肿、肺栓塞、中风、由心室辅助装置或支架诱导的凝血、头部创伤或瘤周脑水肿、败血症，急性大脑中动脉(mca)缺血性事件、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎/血管炎、糖尿病性黄斑水肿或烧伤。在一些实施方案中，c1酯酶抑制剂缺乏症或病症是hae。hae可以是任何类型的hae，包括haei型、ii型或iii型。
[0184]
在一些实施方案中，raav载体在施用于有需要的受试者后保持附加型。在一些实
施方案中，raav载体在施用于有需要的受试者后不保持附加型。例如，在一些实施方案中，raav载体整合到受试者的基因组中。此类整合可通过例如使用各种基因编辑技术来实现，例如锌指核酸酶(zfn)、转录活化因子样效应子核酸酶(talens)、arcus基因组编辑和/或crispr-cas系统。
[0185]
在一些实施方案中，包含本文所述的raav载体的药物组合物用于治疗有需要的受试者。含有本发明的raav载体或粒子的药物组合物含有药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。合适的药物载体的实例是本领域中众所周知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。。此类载体可以通过常规方法配制，并且以治疗有效量施用于受试者。
[0186]
经由合适的途径将raav载体施用于有需要的受试者。在一些实施方案中通过静脉内、腹膜内、皮下或皮内施用来施用，raav载体。在一些实施方案中，静脉内施用raav载体。在一些实施方案中，皮内施用包括通过使用“基因枪”或生物射弹粒子递送系统来施用。在一些实施方案中，经由非病毒脂质纳米粒子施用raav载体。例如，包含raav载体的组合物可以包含一种或多种稀释剂、缓冲剂、脂质体、脂质、脂质复合物。在一些实施方案中，raav载体包含在微球或纳米粒子内，例如脂质纳米粒子。
[0187]
在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约2周至6周时在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约2周时在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约3周时在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约4周时在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约5周时在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约6周时在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后约2周至6周时在受试者的肝细胞中是可检测的。
[0188]
在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少3个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年后在受试者的血浆中是可检测的。因此，在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少3个月在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少6个月在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少12个月在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少2年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少3年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少4年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少5年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少6年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少7年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少8年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后至少9年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽
释放酶抗体在施用raav载体后至少10年在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用raav载体后的受试者生命的剩余时间内在受试者的血浆中是可检测的。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致活性抗pka抗体的产生程度与施用静脉内递送的纯化抗pka igg后发现的程度相同。在一些实施方案中，与施用静脉内递送的纯化抗pka igg相比，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生更大量的活性抗pka抗体。
[0189]
在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少60％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少65％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少70％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少75％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少80％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少85％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少90％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少95％的活性抗pka抗体。在一些实施方案中，包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的所施用raav导致产生至少99％的活性抗pka抗体。
[0190]
在一些实施方案中，在向受试者施用aav载体后，在循环中可检测的血浆激肽释放酶igg的水平比在向受试者直接施用纯化的血浆激肽释放酶抗体后可检测的igg大约4倍至10倍。在一些实施方案中，在向受试者施用aav载体后，可检测的活性血浆激肽释放酶igg的水平满足或超过人治疗水平。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用raav载体后的水平是人治疗水平的约2倍至35倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约2倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约3倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约4倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约5倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约6倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约6倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约7倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约8倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约9倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约10倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约15倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约20倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约25倍。在一些实施方案中，
活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约30倍。在一些实施方案中，活性血浆激肽释放酶igg在施用后的水平是人治疗水平的约35倍。
[0191]
因此，与向有需要的受试者单次施用纯化的抗血浆激肽释放酶抗体相比，施用包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的raav载体导致持续的稳健表达。
[0192]
在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约50％至95％。因此，在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约50％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约55％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约60％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约65％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约70％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约75％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约75％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约80％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约85％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约90％。在一些实施方案中，所施用raav载体产生抗血浆激肽释放酶抗体，其能够将血浆激肽释放酶活性抑制约95％。
[0193]
实施例
[0194]
本发明的其他特征、目的和优点在下述实施例中是显而易见的。然而，应该理解，尽管指示了本发明的实施方案，但实施例仅给出用于说明而不是限制。在本发明的范围内的各种改变和修改根据实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。
[0195]
实施例1.载体设计
[0196]
这个实施例中提供了产生包含抗激肽释放酶抗体的编码序列和其变体的raav表达构建体(raav载体)的示例性方法和设计。在这个研究中，使用重组aav载体(raav8)。raav载体的基本设计由侧接反向末端重复序列(itr)(5
’‑
itr和3
’‑
itr)的表达盒构成。这些itr通过载体产生细胞中的aav复制蛋白rep和相关因子介导载体基因组的复制和包装。通常，表达盒含有启动子、编码序列、polya和/或标签。使用标准分子生物学技术来设计和制备编码人抗血浆激肽释放酶(pka)-igg抗体(拉那利尤单抗)的表达构建体。将抗pka抗体重链(hc)的编码序列和抗pka抗体轻链(lc)的编码序列插入启动子、鸡b-肌动蛋白启动子(cb)的下游。在另一示例性方法和设计中，启动子( /-增强子)是包含crm8/httr的肝特异性启动子。在一些实施方案中，表达盒还包括wpre元件和人分泌信号(ss)。在hc和lc之间插入包含编码弗林蛋白酶可裂解位点(f/2a)的寡核苷酸的短接头。将168bp sv40 pol a序列和dna滴度序列插入igg lc的下游。图2a和2b例示表达构建体的示意性图示。然后将表达构建体接合至aav载体并通过测序进行测试。将载体包装在病毒粒子中并储存。
[0197]
可以执行上述方案的任何数量的变化。可以通过用片段抗原结合(fab)的编码序列替换hc和lc的编码序列；用具有防止与fc受体相互作用的亮氨酸-丙氨酸突变(lala)的
变体替换抗pka编码序列来获得替代构建体(图2a和2b)。另外，可以使用超过一个启动子，和/或可在lc的上游引入ires序列。
[0198]
实施例2.raav驱动的抗-pka抗体在体内的表达
[0199]
下文描述的示例性研究旨在测试抗pka抗体的raav驱动的表达。使小鼠注射有表达以下的raav载体：(a)阴性对照载体((-)ve对照)；或测试样品(b)抗pka igg lala构建体；(c)抗pka fab；(d)抗pka igg；或阳性对照(纯化的抗血浆激肽释放酶抗体)，如表2中所述。
[0200]
表2.使用编码抗血浆激肽释放酶抗体的raav载体的示例性体内研究
[0201][0202]
在raav注射后2周和4周采集血浆，并且通过elisa测定血浆中的总人igg浓度。结果描述在图3a至3c中。注射有对照raav的小鼠未显示总人igg水平的任何增加。另一方面，血浆中的总人igg浓度在接受抗pka igg lala和抗pka igg的小鼠中较高(图3a至3c)。当测试活性igg的水平时，获得相似的结果，如图3a和3b中所示。此外，图3c证实，在注射有raav构建体之后，抗pka igg抗体的增加水平比人中的治疗水平大近30倍。
[0203]
下文描述的另一示例性研究评估了通过包含crm8/httr、分泌信号和wpre元件中的一者或多者的raav表达构建体的抗pka抗体表达。通过尾静脉注射以5x10
11
vg/kg剂量向小鼠施用三种raav表达构建体：raav8-1、raav8-2和raav8-3。以两个载体剂量(5x10
11
vg/kg和5x10
10
vg/kg)测试raav8-3构建体的表达水平。载体raav8-1包含鸡b-肌动蛋白启动子(cb)和鼠分泌信号，但无wpre元件。载体raav8-2包含httr 3xcrm8启动子和鼠分泌信号，但无wpre元件。载体raav8-3包含httr 3xcrm8启动子和人分泌信号，以及wpremut6元件。
[0204]
在注射raav后28天时采集血浆，并且通过elisa测定血浆中的总人igg和活性人igg水平。结果描绘于图3d中。仅注射有媒介物的小鼠未显示出人类igg水平的任何增加。另一方面，血浆中的总的和活性人igg浓度在接受raav8-1、raav8-2和raav8-3构建体的小鼠中较高。与raav8-1相比，血浆中的总的和活性人igg水平两者在接受raav8-2和raav8-3构建体的小鼠中更高，从而指示肝特异性启动子和增强子元件在增强igg表达中的贡献。与接受raav8-2构建体的小鼠相比，接受raav8-3构建体的小鼠的血浆中的总的和活性人igg水
平不仅更高，还相对稳定，从而指示wpre元件在稳定mrna中的贡献。当以较低剂量5x10
10
vg/kg将raav8-3构建体注射到小鼠中时，接受raav8-3构建体的小鼠的血浆中的igg水平的稳定表达也是显而易见的。图3d中所示的raav8-3构建体的igg表达数据指示稳定的igg表达。。
[0205]
下文描述的另一示例性研究旨在测试通过raav8-2构建体在小鼠中进行抗pka抗体表达的持续时间。raav8-2构建体经由尾静脉注射(n＝8)以1x10
11
vg/kg剂量注射至小鼠，并且在16周(4个月)的时间段内测量血浆中的活性igg表达水平。如上所述，载体raav8-2包含httr 3xcrm8启动子和鼠分泌信号，但无wpre元件。
[0206]
在注射raav8-2后2周、4周、6周、8周、10周、12周、14周和16周时采集血浆，并且通过elisa测定血浆中的活性人igg水平。注射有raav8-2载体的小鼠继续表达活性人igg持续超过16周。活性人igg在小鼠血浆中长达16周的表达谱描绘于图3f中。
[0207]
图4示出了在第28天时采集的鼠血浆样品中的抗pka igg lala重链和轻链蛋白的成功处理和表达。将样品在还原的8-6％tris-甘氨酸凝胶中电泳之后进行蛋白质印迹，并且使用兔抗人igg h&l抗体以1∶5000的稀释度进行免疫印迹反应。
[0208]
实施例3.通过raav驱动的抗pka抗体抑制pka
[0209]
为了确定pka抑制水平，使用荧光测定，如图5a的示意图中所描绘。在注射后14天和28天时，从注射有对照或表达抗pka抗体的raav的小鼠中采集血浆。如图5b中所证实，注射有抗pka igg lala和抗pka igg的小鼠在第14天和第28天时显示出对pka活性的稳健抑制。
[0210]
实施例4：小鼠肝中raav8/抗pka igg或fab的表达
[0211]
在本研究中，使小鼠注射有raav8/抗pka igg或fab，并且在4周之后进行安乐死。处理来自肝的组织标本以用于免疫组织化学(ihc)。图6显示仅在注射表达抗pka-lala载体的载体的小鼠中针对抗人igg的阳性免疫染色(抗fab结构域检测)(左图像)。空载体注射的小鼠组织(中间)和未注射的小鼠均未显示出免疫染色。图7a至7c分别显示了来自注射有抗pka igg lala、抗pka igg和抗pka fab载体的小鼠的肝样品的高、中和低放大率ihc图像。如箭头所示，在肝细胞和肝窦状细胞中观察到阳性染色。
[0212]
实施例5：施用raav后抗pka抗体的持续产生
[0213]
进行研究以评估在施用包含抗pka igg lala重链和轻链序列的raav8后产生的抗pka抗体的活性百分比。对于这些研究，使小鼠注射有1e10vg和1e11 vg剂量的raav抗pka igg lala载体，然后在施用raav载体后2周之后和4周之后评估活性抗pka igg lala的存在。作为这些研究的阴性对照，评估来自未免疫小鼠的样品(时间零，图8中的“n/a”)的活性抗pka igg lala存在。作为这些研究的阳性对照，在注射后2小时用纯化的抗pka igg评估来自用纯化的抗pka igg lala免疫的小鼠的样品。来自这些研究的结果呈现于图8中。
[0214]
结果显示，施用包含抗pka igg lala重链和轻链序列的raav在整个评估时间点(2周和4周)内引起活性抗pka igg lala的持续产生。令人惊讶的是，相对于通过iv递送的纯化的蛋白质，肝产生的raav抗体具有相同的活性百分比。本研究证实了使用包含抗pka igg lala重链和轻链序列的raav以获得在单次施用raav后活性抗pka igg lala的持续表达的可行性。
[0215]
实施例6：完整和所处理抗体的lc-ms分析
[0216]
本研究比较了两种抗pka抗体的质谱：1)纯化的或标准抗pka抗体，和2)raav8处理的小鼠血浆样品中产生的抗pka抗体。在下述四个条件下比较这两种抗体的质谱：1)当两种抗pka抗体均完整时，即当抗体在小鼠血浆中时；2)当两种抗pka抗体都使用二硫苏糖醇(dtt)还原时；3)当两种抗pka抗体都去糖基化时；和4)当两种抗pka抗体都去糖基化和还原时。为了比较其完整形式的两种抗pka抗体，将纯化的抗pka抗体添加到空白小鼠血浆中，然后与raav8处理的小鼠血浆样品中的抗pka抗体进行比较。
[0217]
图9描绘了在如上所述的四种不同条件下在raav8处理的小鼠血浆中产生的纯化的抗pka抗体和抗pka抗体的质谱。图左侧的图表代表纯化的/标准抗体。图右侧的图表代表在raav8处理的小鼠血浆样品中产生的抗pka抗体。如可以清楚地看到，纯化的抗pka抗体的分子量和光谱与在类似的去糖基化条件下在raav8处理的小鼠血浆样品中产生的抗pka抗体的分子量和光谱相同。例如，去糖基化的纯化的抗pka抗体(左图，自上而下的第三图表)和从经raav8处理的小鼠血浆中获得的去糖基化的抗pka抗体(右图，自上而下的第三图表)均显示相同的光谱和分子量。去糖基化的和还原的纯化的抗pka抗体(左图、下图)以及从raav8处理的小鼠血浆中获得的去糖基化的和还原的抗pka抗体(右图、下图)也显示轻链和重链两者的相同光谱和质量。
[0218]
实施例7：在raav8处理的小鼠血浆中产生的抗pka抗体的离体效力的评估
[0219]
本研究说明在raav8构建体静脉内施用后28天时采集的raav8处理的小鼠血浆样品中产生的抗pka抗体的离体生物活性。在本研究中，在外源抑制剂takhzyro
tm
的存在下，通过添加鞣花酸(eilagic acid)在对照未处理的小鼠血浆样品中活化激肽释放酶-激肽途径。takhzyro
tm
(拉那利尤单抗-flyo(lanadelumab-flyo))是fda批准的完全人单克隆抗体药物，用于预防12岁或更年长患者的遗传性血管性水肿(hae)发作。通过添加pka特异性前荧光底物(pfr-amc)和随时间推移进行的后续荧光测量来监测血浆中的pka活性。为了测试在raav8处理的小鼠血浆样品中产生的抗pka抗体的生物活性，通过向来自这些小鼠的血浆中添加鞣花酸类似地活化激肽释放酶-激肽途径，并且测量pka活性。具体地，在进行鞣花酸和pfr-amc添加之前，将来自个别raav8处理的小鼠的给药后血浆连续稀释到来自相同小鼠的给药前血浆样品中，以便测量剂量反应。
[0220]
依据随来自这些稀释系列的抗pka抗体浓度而变的血浆激肽释放酶活性的抑制百分比来测量生物活性，其中较高水平的抗体导致较低的pka活性％。图10描绘了本研究的结果。结果证实，在raav8处理的小鼠中产生的抗pka抗体的剂量反应与takhzyro
tm
(fda批准的药物)的剂量反应相同。这证实在raav8处理的小鼠血浆中产生的抗pka抗体具有与takhzyro
tm
药物产品不可区分的极高完整性。
[0221]
等效物和范围
[0222]
本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所描述的本发明的具体实施方案的许多等效物。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。