一种TED缺失的细胞系及其应用的制作方法

一种ted缺失的细胞系及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ted缺失的细胞系及其应用。


背景技术：

2.平原人群进入高原、高空和深海等低氧环境时，会引起头痛、头晕、乏力、睡眠不良、急性脑水肿、肺水肿等可能危及生命的缺氧反应，而长期生活在高原的居民和高空、深海中的动物通常耐受缺氧而不会发生缺氧损伤反应。
3.研究耐缺氧的分子机制对于特殊职业人群的选拔、预防和治疗缺氧损伤反应极为重要。军人、运动员等特殊职业人群的选拔不仅要关注缺氧耐受表型，同时还要关注其在缺氧环境下的体能表型，这种筛选机制中环境因素与体能因素往往互相影响，导致分子标志物筛选不准确。为探究缺氧耐受的分子机制和提高缺氧环境下核心分子标志物转化为体能表型的筛选准确性，需要发展一种稳定的本身对缺氧耐受的细胞株。
4.为获得缺氧耐受细胞株，可以从耐缺氧生物体内分离细胞，但是从耐缺氧生物体内分离细胞不仅涉及伦理问题，而且耗时长、操作繁琐，易污染、培养代数较短，不利于长期的分子机制研究。
5.293t细胞来源于人胚胎肾细胞，容易培养且转染效率高，是研究疾病分子机制较常用的细胞，不涉及伦理问题。但是293t细胞不耐受缺氧，在缺氧条件下容易死亡，不利于长期缺氧条件下耐缺氧机制的研究。目前也尚无稳定构建耐缺氧293t细胞株。
6.藏族富集性基因缺失(tibetan-enriched deletion，ted)序列是一段定位于人类2号染色体的非编码序列。
7.crispr/cas基因编辑技术是新兴的基因工程技术，其是由向导rna介导的dna切割技术，针对cas的不同已经开发出的编辑系统。基因组编辑可以精准的、定向的修饰基因组。crispr/cas编辑技术可以实现至少以下4种精准编辑：第一种是基因的定点敲除，cas蛋白在向导rna(grna)的指导下识别和切割靶点，产生双链dna断裂；断裂的dna通常以非同源末端连接(nhej)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链dna断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑，单碱基编辑是利用crispr/cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。第四种是基因组引导编辑技术。引导编辑是将逆转录酶与cas9切口酶结合，在单链引导rna引导下，按转录模板进行点突变、插入或缺失突变的编辑方法。


技术实现要素：

8.本发明利用crispr/cas9技术将细胞基因中的非编码基因ted(藏族富集性缺失序列，tibetan enriched deletion，ted)序列稳定删除，获得具有耐缺氧特性的稳转细胞株。该细胞株可在缺氧条件下存活，具有易培养、转染效率高的优点，可以长期用于耐缺氧分子
机制的研究，在低氧环境模拟研究方面有较好的应用前景；更有助于提高缺氧环境下核心分子标志物转化为体能表型的筛选准确性。
9.为实现以上技术目的，本发明提供以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供了ted基因在构建耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果的细胞系或动物模型中的应用。
11.优选地，所述应用具体是指通过敲除ted基因构建细胞系使所述ted基因敲除的细胞系表现出耐缺氧特征。
12.优选地，所述敲除是指ted基因全长缺失；更具体地，所述细胞系或动物模型中有至少一条染色体缺失如seq id no.:1-3任意所示片段。
13.优选地，如本发明具体实施例所验证，所述ted缺失的纯合子或杂合子细胞系在缺氧环境下生长状态正常。
14.优选地，所述缺氧环境包括氧气含量低于5％、4％、3％、2％、1％。
15.更具体地，所述缺氧环境包括氧气含量为1％；更具体地，如具体实施例所应用的，培养环境气体组成为1％氧气，5％二氧化碳，94％氮气。
16.本发明所述ted即“藏族富集性基因缺失(tibetan-enriched deletion，ted)”所述ted序列是人类2号染色体上位于46,694,276
–
46,697,683的基因序列，所述ted是非编码序列。
17.术语“野生型”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子，所述核酸分子包括dna或rna，其核苷酸序列可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(pcr)等。优选地，如本发明所述ted野生型的序列如seq id no.:4所示。
18.另一方面，本发明提供了一种ted缺失的细胞系，所述细胞系中至少一条染色体上缺失如seq id no.:1-3任意所示片段。
19.优选地，所述细胞系为杂合子或纯合子。
20.如本发明所使用，术语“杂合子”是指同源染色体同一位点上的两个等位基因是不相同的基因型，也即本发明所述细胞系中ted的基因型有两种。
21.更具体地，所述ted缺失的细胞系中：
22.1)一条染色体上缺失如seq id no.:1所示核酸序列，另一条染色体上缺失如seq id no.:2所述核酸序列；
23.2)一条染色体上缺失如seq id no.:3所示核酸序列，另一条染色体为野生型，所述野生型上包括ted基因野生型。
24.优选地，所述ted缺失的细胞系具有以下特性：耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果。
25.另一方面，本发明提供了制备耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果的细胞或动物模型的方法，所述方法包括使用cas9蛋白和grna对细胞或动物的ted进行特异性基因编辑，所述grna的序列如seq id no.:5和/或seq id no.:6所示。
26.优选地，所述缺氧环境包括氧气含量低于5％、4％、3％、2％、1％。
27.更具体地，所述缺氧环境包括氧气含量为1％；更具体地，如具体实施例所应用的，培养环境气体组成为1％氧气，5％二氧化碳，94％氮气。
28.优选地，本发明所述基因编辑是crispr技术。
29.所述crispr技术中的基因编辑工具包括向导rna(grna)、cas蛋白(如cas9、cpf1、cas12b等)，cas蛋白在向导rna的引导下可识别并切割靶标dna。优选地，本发明所述靶标dna即ted。
30.如本领域公知，将cas蛋白或其编码序列、向导rna或其编码序列转化到细胞中，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除。
31.优选地，所述方法包括将以下任意一组成分转入到细胞中：
32.1)cas9蛋白和grna；
33.2)cas9基因和grna的编码序列。
34.优选地，所述编码序列是构建于适宜的载体中。
35.优选地，所述载体是表达载体。
36.所述术语表达载体是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。或者，所述载体可能是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。
37.优选地，所述表达载体中还可以包括可操作地连接的启动子和转录终止序列。
38.在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。
39.也即优选地，所述cas9基因和grna的编码序列是构建在载体上的。
40.术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因(dna)，cdna或mrna，作为在具有限定的核苷酸序列(即rrna，trna和mrna)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。
41.优选地，所述转入的方法包括：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(peg)介导法。
42.优选地，本发明在具体实施例中使用了电击法(电转)。
43.术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链dna的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。
44.本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pbr322(atcc37017)，pkk223-3(pharmacia fine chemicals，uppsala，sweden)，gem1(promegabiotec，madison，wi，usa)，pqe70，pqe60，pqe-9(qiagen)，pd10，psix174pbluescript iiks，pnh8a，pnh16a，pnh18a，pnh46a(stratagene)，ptrc99a，pkk223-3，pkk233-3，pdr540，prit5(pharmacia)，pkk232-8，pcm7，psv2cat，pxt1，psg(stratagene)，psvk3，pbpv，pmsg，psvl(pharmacia)，pog44等。
45.优选地，所述细胞是动物细胞，如本领域所熟知的来源于人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫的细胞。
46.优选地，所述动物是哺乳动物，如本领域所熟知的人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、
骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫。
47.更具体地，所述细胞是人类细胞，离体的人类细胞。
48.优选地，本发明所述细胞不包括胚胎细胞。
49.更优选地，所述细胞是商品化的人类细胞系。
50.优选地，所述人类细胞株包括293细胞、293t细胞、293ft细胞、293ltv细胞、293ebna细胞及其他的从293细胞分离的克隆；sw480细胞、u87mg细胞、hos细胞、c8166细胞、mt-4细胞、molt-4细胞、hela细胞、ht1080细胞、te671细胞。
51.最优选地，所述人类细胞株是293t细胞或其衍生细胞系。
52.本发明所述293t细胞是人胚肾细胞株，是生物医学技术常用的细胞系，野生型的293t细胞对缺氧环境较不耐受，限制了该细胞在模拟高原、高空、深海等低氧环境中的应用。
53.优选地，所述方法制备得到是前述ted缺失的细胞系；所述细胞系中ted的基因型选自第一ted突变型、第二ted突变型、第三ted突变型或ted野生型中的任意一种或两种。更具体地，所述细胞系具有以下特性：耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果。
54.另一方面，本发明提供了前述ted缺失的细胞系在耐缺氧分子机制的研究中的应用。
55.另一方面，本发明提供了一种ted特异性的基因编辑系统、试剂盒或组合物，所述系统、试剂盒或组合物中包括cas9蛋白和grna；所述grna的序列如seq id no.:5或seq id no.:6所示。
56.本发明中所述cas9蛋白还可以替换为其他的cas蛋白(如cas9、cpf1、cas12b、具有cas9相似活性的天然存在的蛋白或重组蛋白)。cas蛋白在向导rna(grna、sgrna)的引导下可识别ted并进行基因编辑，造成ted基因部分缺失。
57.另一方面，本发明提供了ted特异性基因编辑试剂以及上述系统、试剂盒或组合物在制备耐缺氧、缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果的产品中的应用。
58.另一方面，本发明还提供了使用本发明所提供的细胞筛选耐缺氧标志物的方法。
附图说明
59.图1是ted突变型的基因测序结果。
60.图2是ted突变型纯合子细胞的生长状态。
61.图3是ted突变型杂合子细胞的生长状态。
62.图4是ted突变型细胞在缺氧环境下的细胞损伤情况。
63.图5是ted突变型细胞中信号通路的分析结果。
具体实施方式
64.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
65.本发明所使用的实验材料
66.(1)293t细胞
67.(2)培养基：dmem高糖培养基，10％fbs
68.(3)敲除引物：
69.grna-c2:gataaaaggtctcgatata-gggg
70.grna-d1:aatactgtgctagctaaca-aggg
71.(4)测序引物：
72.上游引物:gactctttaatggcacctacagtg
73.下游引物:gtgaccatgtaaatgatctcacagc
74.实施例1、ted基因突变的293t细胞的制备
75.检测293t细胞倍增的时间、克隆形成率和支原体污染情况。实验结果确定293t细胞系倍增时间正常，无污染，可用于后续实验。
76.转染细胞，将cas9蛋白和puc-grna 质粒通过电转方法转染至悬浮的293t细胞。电转后铺2块96孔板，挑选单克隆，通过pcr扩增ted基因片段并测序，挑选ted基因敲除(大片段删除)阳性的293t细胞株。
77.测序结果(测序结果如图1所示)显示获得了一株纯合子细胞：该纯合子细胞中一条染色体上缺失片段序列如seq id no.:1所示，另一条染色体上缺失片段序列如seq id no.:2所示，两条染色体上的ted基因皆被完全敲除(ted基因的全部基因序列缺失)，故称之为纯合子(后续实验中也称之为-/-型)。对该纯合子细胞扩增，扩增培养的细胞在显微镜下的生长状态如图2所示。纯合子细胞的生长状态正常，可用于后续实验。
78.另还获得了一株杂合子细胞( /-型)，该杂合子中一条染色体未被编辑(即含有全部野生型ted的序列，ted基因野生型序列如seq id no.:4所示)，另一条染色体上缺失片段序列如seq id no.:3所示，ted基因皆被完全敲除。对该杂合子细胞( /-型)扩增，扩增培养的细胞在显微镜下的生长状态如图3所示。生长状态正常，可用于后续实验。
79.实施例2、ted基因突变株的耐缺氧特征
80.乳酸脱氢酶(ldh)是活细胞浆内酶，当细胞损伤，细胞膜通透性变化时，会将ldh释放到培养液中。因此培养液中该酶的活性与被裂解的细胞系数量成正比。
81.在缺氧环境(1％氧气，5％二氧化碳，94％氮气)下培养未经基因编辑的293t细胞(即野生型293t细胞，作为对照)和实施例1所获得的ted基因突变株( /-型和-/-型)。使用乳酸脱氢酶(ldh)试剂盒(南京建成，货号：a020-2)对缺氧环境下的细胞株进行ldh检测。
82.ldh的检测结果如图4所示：ted基因突变株 /-型和-/-型明显减轻了缺氧后的细胞损伤，提示有良好的耐缺氧效果。
83.实施例3、ted基因突变株在缺氧环境中具有的神经精神相关疾病抑制效果
84.对未经基因编辑的293t细胞和实施例1所获得的ted基因突变株( /-型和-/-型)中细胞通路的变化进行分析。
85.分析结果如图5所示，向左的信号通路代表被抑制，相较于野生型，-/-型细胞在缺氧48小时后，受抑制最明显的3条通路(gnrh secretion，long-term depression和glutamatergic synapse)均为神经精神相关疾病相关通路，而 /-型细胞无此功能。
86.以上结果对比证明，ted基因突变株-/-型在缺氧环境中体现出神经精神相关疾病
抑制效果。