快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法

1.本发明属于植物病毒检测技术领域，涉及快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法。


背景技术：

2.黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。黄瓜花叶病毒(cmv)是一种植物病毒，它能攻击包括百香果在内的多种植物，就可能感染的物种而言，它是分布最广的植物病毒。它主要通过蚜虫传播，有时通过种子传播。与所有植物病毒一样，对感染的植物没有治疗方法。对付这种病毒的最好办法是培育抗病品种并根除受感染的作物以防止传播，所以开发出一种能够实现田间快速检测该病毒的方法成为了重中之重。
3.百香果cmv病毒病发病时叶片带浅黄色斑驳，病叶皱缩，严重时叶片反卷。部分果实畸形硬化，果肉少或无，植株生长不良，产量低，品质差。它的可怕之处在于目前无法通过药物治愈，植株显症后不是直接销毁，就是收果后缓期销毁，因为植株发病后打药成本会不断增加，产量和品质却越来越差，严重影响果农收益。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法，利用rna恒温快速扩增荧光型试剂盒(mira)可以在田间实现短时、准确的批量检测cmv病毒。
5.为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案为：
6.本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒，包括cmv引物，所述cmv引物的序列为：
7.cmv-f 5
′‑
cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg-3
′
，
8.cmv-r 5
′‑
ctaggataaccttgaattgctccatccacgc-3
′
。
9.优选地，还包括cmv探针，所述cmv探针的序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；所述cmv探针共有四个修饰位点：距离5
′
端的≥35nt的中部位置标记一个dspacer thf，作为核酸外切酶的识别位点；thf位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2-4nt；thf距离3
′
末端≥15nt，并且3
′
末端标记一个修饰基团。
10.更优选地，所述修饰基团选自胺基、磷酸基团或c3-spacer。
11.优选地，所述cmv探针的序列为tacctgggatgtgcccacccgaac[fam-dt]c[thf][bhq1-dt]tcgacattgtattt[c3-spacer]。
[0012]
本发明还提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的方法，包括：
[0013]
1)向反应管中加入上游引物、下游引物、探针、rnase-free水、核酸模板和缓冲液；
[0014]
上游引物的序列为：5
′‑
cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg-3
′
，
[0015]
下游引物的序列为：5
′‑
ctaggataaccttgaattgctccatccacgc-3
′
，
[0016]
探针序列为：tacctgggatgtgcccacccgaac[fam-dt]c[thf][bhq1-dt]tcgacattgtattt[c3-spacer]；
[0017]
2)混匀后，将反应液甩至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中，恒温42℃，反应时间30min；
[0018]
3)将反应后的产物至于荧光检测仪中。在阴性对照呈现无荧光，阳性对照呈现荧光的情况下，若样品呈现荧光，说明此样品存在cmv病毒的感染；若样品无荧光，说明此样品不存在cmv病毒的感染。
[0019]
优选地，步骤1)中通过以下方法获取核酸模板：取5-10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5ml的离心管中，加入15-25μl rnase free水，用研磨棒将其研磨至匀浆状，吸取2μl至新的离心管中并稀释至50μl作为核酸模板使用；
[0020]
优选地，步骤1)每10μl反应体系中，加入0.4μl上游引物、0.4μl下游引物、0.24μl探针、2.08μl rnase-free水、0.5μl核酸模板和6.38μl缓冲液。
[0021]
优选地，步骤1)中引物和探针浓度分别为10μm和5μm。
[0022]
优选地，步骤3)中阴性对照的模板为rnase-free水，阳性对照的模板为cmv质粒。
[0023]
本发明的有益效果在于：
[0024]
本发明提供的快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法，可以在田间实现短时、准确的批量检测cmv病毒，操作方法简单易行，具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需30min)等特点，可以实现常温操作，常温反应以及常温保存，非常适合田间大规模快速检测。
附图说明
[0025]
图1.本发明检测cmv不同稀释倍数的荧光图。
[0026]
图2.本发明检测cmv特异性的荧光图。
具体实施方式
[0027]
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0028]
海南大学代谢实验室为了帮助农户解决田间快速鉴定百香果病毒病的问题，在全省进行调研，了解到cmv病毒病在海南省百香果种植中分布较广，危害较重。本技术针对cmv病毒设计特异性引物，在潍坊安普未来生物科技有限公司的技术支持下，证实利用rna恒温快速扩增荧光(multienzyme isothermal rapid amplification，mira)型试剂盒可以在田间实现短时、准确的批量检测cmv病毒。以下检测试剂(如a buffer、b buffer)来自rna恒温快速扩增试剂盒(荧光型)试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司)。
[0029]
实施例
[0030]
一、mira法检测cmv具体步骤：
[0031]
1.引物设计：根据cmv保守序列设计引物。
[0032]
表一cmv引物序列
[0033][0034]
2.探针设计：探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点：距离5
′
端的≥35nt的中部位置标记一个dspacer(四氢呋喃，thf)，作为核酸外切酶的识别位点；thf位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为2-4nt；thf距离3
′
末端≥15nt，并且3
′
末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或c3-spacer。
[0035]
表二cmv探针序列
[0036][0037]
3.取样：取小片(约5g)百香果新鲜的嫩叶置于1.5ml的离心管中(rna专用)，加入15-25μl rnase free，用研磨棒将其研磨至匀浆状，吸取2μl至新的离心管中并稀释至50μl作为核酸模板使用。
[0038]
4.检测操作步骤：
[0039]
1)每个干粉反应管加入29.4μl a buffer(注意：a buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响)、2μl上游引物、2μl下游引物和1.2μl探针(引物和探针浓度分别为10μm和5μm)，混匀后平均分装至5个反应管，每管6.92微升上述混匀液；
[0040]
2)向每个反应管中依次加入2.08μl rnase-free水和0.5μl核酸模板；
[0041]
3)最后向反应管中加入0.5μl b buffer并充分混合；
[0042]
4)混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中。恒温42℃，反应时间30min。
[0043]
5)将反应后的产物至于荧光检测仪中。在阴性对照(rnase-free水)呈现无荧光，阳性对照(cmv质粒，浓度为93ng/μl)呈现荧光的情况下，若样品呈现荧光，说明此样品存在cmv病毒的感染；若样品无荧光，说明此样品不存在cmv病毒的感染。
[0044]
二、灵敏度测试
[0045]
对cmv质粒(浓度600ng/ul)先进行10倍梯度稀释，稀释107倍后以2倍梯度稀释测试其灵敏度(表三，图1)。发现mira法比rt-pcr法检测cmv的灵敏度要高达320倍。
[0046]
表三mira法检测cmv不同稀释倍数的荧光值
[0047][0048]
三、特异性测试
[0049]
用百香果常见的三种病毒病夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus，temv)、西番莲斑驳病毒(passiflora mottle virus，pamv)、豇豆蚜传花叶病毒(cowpea aphid-borne mosaic virus，cabmv)、东亚西番莲病毒(east asian passiflora virus，eapv)和豌豆花叶病毒(pea mosaic virus，pmv)检测cmv引物的特异性，由图2发现，cmv的引物具有特异性，适用于田间快速检测cmv病毒病。
[0050]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。