麻黄碱-没食子酸或莽草酸缩合物及其制备方法和应用

1.本发明属于中药化学领域，涉及麻黄-诃子复方后在体内生成的新活性成分的检出、制备方法，特别是新化合物：麻黄碱-没食子酸缩合物及麻黄碱-莽草酸缩合物的制备、结构、扩张气管能力、保肝活性、抗病毒活性，以及它们在人类和家畜药物方面的应用。


背景技术：

2.多种药物联合使用以获得最佳治疗效果是中医和西医都采用的策略。理想的联合方案是通过相加或协同效应提高疗效，通过毒性分散效应或其它机制降低不良反应。对中药而言，由于每个方剂含有多种药材，每种药材含有数百种活性成分，因此药效的相加/协同作用和毒性分散效应更为重要 [徐风，杨东辉，尚明英，王璇，蔡少青. 中药药效物质的“显效形式”、“叠加作用”和“毒性分散效应”——由中药体内代谢研究引发的思考. 世界科学技术—中医药现代化. 2014, 688-703.]。除了药材本身活性成分间的相加/协同作用外，中药方剂在制备过程或给药后在人体体内也可能生成新的活性成分。
[0003]
麻黄作为中药材具有发汗、祛寒、通肺、平喘、利尿消肿等作用[国家药典委员会, 中华人民共和国药典2020版 一部333-334.]。麻黄也在我国治疗covid-19新冠肺炎中起了重要作用。“三药三方”是治疗新冠肺炎最广泛使用的中药[张伯礼.中药完全可以治愈新冠肺炎轻症普通患者”养生大世界2020年第06期; 张晓雨，刘硕，孙杨，邱瑞，陈昭，唐健元，商洪才. 从“三药三方”谈中药新药审评理念、研发思路及策略. 中国新药杂志2020, 29: 1828-1821]，根据各药材在这些方剂中的使用频次统计，麻黄为“三药三方”核心药物组的第一个[郭鹏飞，张永斌，许律捷，张宝月，赵君，刘艾林，杜冠华。整合网络药理学和分子对接技术探讨“三药三方”核心药组防治covid-19的分子机制研究. 世界中医药. 网络首发时间: 2020-10-20. https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.5529.r.20201019.1640.002.html]。麻黄中的麻黄碱类成分有拟肾上腺素作用，可扩张气管和支气管，但是，麻黄碱能穿过血脑屏障兴奋中枢神经系统，引起失眠、不安和食欲下降等不良反应[abourashed ea, el-alfy at, khan ia, walker l. ephedra in perspective
ꢀ–ꢀ
a current review. phytother res 2003;17:703
–
12.]。
[0004]
诃子是民族医药中最常用的药材，与麻黄在蒙药复方古日古木-7（含红花、诃子、麻黄等）中合用，治疗肝脏疾病 [中华人民共和国卫生部药典委员会, 中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册1998年, 第79
–
83, 97
–
101, 132
–
137, 169
–
173, 184
–
188, 194
–
195 (古日古木-7), 197, 199, 201等页]。诃子含游离及结合型（主要为可水解鞣质）的没食子酸，也含有莽草酸。
[0005]
从这两种药材主要成分的结构性质考虑，其可能发生缩合形成新的生物活性化合物，因此，进行了本发明相关的深入研究和大量实验。
[0006]
本发明以麻黄生物碱和诃子中含羧基的成分为原料，进行化学结合以寻找不良反应少、生物活性高的新型药物。本发明公开麻黄碱-没食子酸 (1)、麻黄碱-莽草酸缩合物 (2)的结构、制备方法、生物活性。缩合物1和2均为新化合物，并且可在灌胃诃子和麻黄后的
大鼠体内生成。缩合物1和2的血-脑屏障穿透性比麻黄碱大幅降低，同时有舒张气管及保肝活性等。


技术实现要素：

[0007]
因此，本发明提供通式(i)和(ii)化合物：式中：r1选自氢或甲基
;
r2和r3相同或者不同，各自独立地选自氢或c
1-6
烷基，其中c
1-6
烷基是未被取代的或被c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、卤素和羰基等取代；或者，邻位的r2和r3共同形成-ch
2-；n表示0-2的整数；表示该键可以为α或β键；本发明的另一个方面，提供含有所述通式(i)及/或(ii)的化合物或组合物。
[0008]
本发明还提供所述通式(i)及/或(ii)的化合物或其组合物的药物制剂。
[0009]
本发明的又一个方面，提供所述通式(i)及/或(ii)的化合物或其组合物用作为气管/支气管松弛剂。
[0010]
本发明还提供所述通式(i)及/或(ii)化合物或其组合物在制备用于预防和/或治疗肝脏疾病的药物方面的应用。
[0011]
本发明还提供所述通式(i)及/或(ii)化合物或其组合物在制备用于预防和/或治疗病毒性疾病的药物方面的应用。
[0012]
本发明还提供所述通式(i)及/或(ii)化合物的制备方法：将羧基化合物、麻黄生物碱、酰胺键缩合剂溶解于缩合反应用溶剂中搅拌反应。反应混合物经重结晶或柱层析分离纯化得目标产物。
[0013]
本发明的创造性为：通过将麻黄生物碱与没食子酸、莽草酸或其它带羧基的化合物反应得到血脑屏障通透性降低的缩合物。这些缩合物可保持麻黄碱的松弛气管活性，有些还会产生保肝、抗病毒等其它新活性。这类缩合物在麻黄与含有没食子酸、莽草酸或其它含羧基化合物的药材复方使用时也可在体内生成，为复方中不同成分相互作用产生新的生物活性化合物提供了证据。
附图说明
[0014]
图1为麻黄碱-没食子酸(1)和麻黄碱-莽草酸(2)的结构及制备所用试剂。
[0015]
图2为化合物1和2在不同介质中的hplc-ms色谱图。（a）大鼠血浆灌胃生理盐水。（b）大鼠灌胃诃子 麻黄粉后的血浆。（c）纯品化合物1和2的甲醇溶液。
[0016]
图3为麻黄碱和化合物1-2的血脑屏障（bbb）透过性。（a-c）bbb分析中所示化合物
的hplc-ms色谱图。对于每种化合物，从上到下的三个色谱图分别是标准溶液、供体溶液和受体溶液。（d）化合物1、化合物2和麻黄碱的bbb透过率。与麻黄碱比较，***p《0.001。
[0017]
图4为化合物1-2和阳性对照（盐酸异丙肾上腺素）的气管舒张作用。
[0018]
图5为化合物1和2对taa诱导的肝发育迟缓的影响。（左）接触taa和taa 不同浓度水飞蓟素或化合物1或2的tg（fabp10a:dsred；ela3l:egfp）幼鱼肝脏。（右）不同组斑马鱼幼虫的肝脏大小。与模型组比较，**p《0.01，***p《0.001，n=10。
[0019]
图6为化合物1和2与新冠肺炎covid-19病毒感染相关蛋白靶点的对接。（a）所示化合物与病毒（右）和人类（左）不同靶蛋白的结合能。（b-d）化合物1（绿色）和化合物2（橙色）与rna依赖性rna聚合酶（rdrp）（b）、rdrp（仅nsp12和md）（c）和rdrp（ rna& mg）（d）的分子对接和相互作用。在图e中，rna链呈灰色，球形镁离子呈黄色。
[0020]
具体实施方式
[0021]
下面通过具体实施例，进一步对本发明进行阐述。这些实施例仅用于例证本发明，不应将其理解为对本发明保护范围的限制。
[0022]
实施例1：麻黄碱-没食子酸缩合物（1）及麻黄碱-莽草酸缩合物（2）的制备麻黄碱-没食子酸/莽草酸缩合物的纯品制备方法，包括以下步骤：将1 mmol没食子酸或莽草酸、1 mmol麻黄生物碱（以麻黄碱计）、1.5 mmol n-环己基-n'-（2-吗啉乙基）碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐(cmc)、1.5 mmol 1-羟基苯并三唑水合物（hobt）溶解于10 ml n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室温下搅拌过夜。用油泵在45℃减压回收dmf，残渣用c18反相硅胶柱层析，水-甲醇梯度洗脱，在14%甲醇洗脱部分得到纯品化合物1。以与化合物1相同的方法纯化化合物2，从12%甲醇洗脱部分获得纯品化合物2。
[0023]
实施例2：本发明化合物的结构确定
化合物1在负电离esi-ms质谱中出现m/z 316 [m-h]-峰，在1h-nmr谱中其h-1
′
、h-2
′
和h-3
′
均出现双信号。由于化合物1在超高效液相色谱中仅出现1个峰，经葡聚糖凝胶和制备液相等重复纯化的产物均得到相同的nmr谱。因此，推测这种反常的光谱现象是由两个构象异构体引起的，在室温相互转化很慢，两个构象的信号均可观察到，而高温测定可只出现一组信号的清晰光谱。因此，在60℃下对化合物1进行了1h-nmr测定，其光谱确实变为正常。在此温度下，h-1
′
在
훿
4.47/4.62处的双信号变为
훿
4.53处的一个。h-2
′
在
훿
3.94/4.62处的双信号在
훿
4.00处变为单信号。h-3
′
在
훿
0.84/0.91处的双信号变为
훿
0.99处的单信号。麻黄碱部分的其它信号可如表1及表2所示。没食子酸酰基的特征信号出现在
훿
6.33（h-2, 6）。在hmbc广谱中，观察到2
′‑
h和7-c之间的远程相关，表明化合物1结构如图1所示，没食子酰的c7通过酰胺键与麻黄碱的c2
′
连接。
[0024]
化合物2用正电离esi-ms测定，出现m/z 322 [m h]

。在nmr谱中，化合物2的h-1
′
、h-2
′
和h-3
′
也均出现两个信号，在60℃下测得化合物2的1hnmr正常。化合物2的氢谱和碳谱信号归属如表1及表2所示。从hmbc光谱中观察到的2
′‑
h和7-c之间的远程相关，证明化合物2的结构是如图1所示的通过酰胺键形成的莽草酸-麻黄碱缩合物。
[0025]
实施例3：本发明化合物的液-质分析将化合物1或2溶解于meoh中并通过0.22 μm过滤器微滤。滤液用超高效液相-质谱(uhplc-ms)分析，采用eclipse plus c18柱（2.1 x 50mm，1.8um），流动相a（0.1% hcooh）和b（meoh），程序为0 min 10%b、4 min 100%b和6 min 100%b。进样量为2 μl，流速为0.3 ml/min。用多重反应监测ms检测，毛细管电压为3 kv，气体温度为325 ℃，气体流量为12 l/min，雾化器压力为40 psi。化合物1的前体离子、产物离子、碎片和碰撞能分别为316、208、150和30，化合物2的前体离子、产物离子、碎片和碰撞能分别为366 [m hcoo-]-、284、80和15。
[0026]
实施例4：本发明化合物在诃子麻黄提取物及诃子麻黄粉末灌胃大鼠血浆中的检测
将完全通过200目筛网的麻黄、诃子粉末按与蒙药古日古木-7中比例相同的3:2混合，用2 ml甲醇超声提取0.1g该药材混合粉末20 min。提取液通过0.22 μm过滤器并按上述液-质分析条件检测和定量。
[0027]
将1 g诃子-麻黄混合粉末悬浮于5 ml生理盐水中灌胃大鼠。2小时后，从眼静脉丛采血500 μl，12225 g离心5分钟，并将上清血浆移到新离心管中。向血浆中加入三倍体积的1%甲酸乙腈液，混合1分钟后，12225 g下离心5分钟。将上清液移至新离心管，真空离心浓缩至干。残余物溶解在150 μl甲醇中，通过0.22 μm过滤器后用上述液-质分析条件检测定量。
[0028]
结果如图2所示，诃子-麻黄混合粉末的甲醇提取物中没有检出化合物1和2，而诃子-麻黄粉末灌胃的大鼠血浆中检出了这两个化合物，表明诃子-麻黄同时服用时可在体内生成化合物1和2。
[0029]
实施例5：本发明化合物的血脑屏障通透性将麻黄生物碱、没食子酸、莽草酸、化合物1和 2溶解在dmso成50.0
ꢀµ
m的储备溶液。将5.0
ꢀµ
l储备溶液与295.0
ꢀµ
l pbs（ph=7.4）混合制成供体溶液。采用平行人工膜通透性测定系统测定血脑屏障(bbb)透过性。上部96孔聚碳酸酯基过滤器供体板（multiscreentm ip，maipn4510，孔径0.45微米）的每个孔涂有5
ꢀµ
l由16.0 mg 猪极性脑脂质提取物、8.0 mg胆固醇和600.0
ꢀµ
l正十二烷组成的混合物。下部96孔聚四氟乙烯受体板中填充300.0
ꢀµ
l的 0.01 m磷酸缓冲盐溶液（ph=7.4）。将150.0
ꢀµ
l样品溶液加到供体板的孔中，固定供体和受体板，37
°
c培养4小时，吸出供体和受体板每孔的溶液用真空离心浓缩器浓缩至干，残渣用甲醇溶解微滤后用上述液质分析条件进行定量分析。用以下公式计算以pe表示的bbb透过率：pe=100%*受体孔浓度*300/[受体孔浓度*300 供体孔浓度*150]实验结果如图3所示，麻黄碱以约31.46%的透过率通过bbb，而化合物1和2的透过率均为0%。结果表明，麻黄碱与没食子酸或莽草酸结合后可显著降低其血脑屏障穿透力，提示化合物1和2难以对中枢神经系统产生影响。
[0030]
实施例6：本发明化合物的气管松弛作用体重在350至400 g之间的雄性豚鼠用二氧化碳安乐死后，迅速切开颈部皮肤，取出气管，在4℃的krebs-henseleit溶液中除去气管周围的结缔组织后，将气管切割成3-5 mm的圆环。在连续供应氧气的含有5 ml krebs溶液的37℃恒温槽中，将气管环挂在实验钩上，另一侧与张力传感器（ft-102力传感器）相连。利用分析系统（bl-420a/f）对整个生物信号采集过程进行实时监测。首先将气管环的张力调节到1-2 g，达到平衡后，向浴中加入磷酸组胺至50 μm，在气管环收缩达到最大值后加入化合物1或2 并逐步增加化合物1和2的浓度，观察其对气管收缩的影响。
[0031]
麻黄碱的舒张气管作用是期望的生物活性。豚鼠离体气管环实验结果如图4所示，化合物1和2有舒张气管作用。当化合物1或2的浓度达到200 μm时，豚鼠离体气管出现明显的松弛。舒张气管实验结束后用液-质分析实验浴中的krebs-henseleit溶液，检测到化合物1和2而没有检测到麻黄碱，说明化合物1和2本身有舒张气管作用。
[0032]
实施例5：本发明化合物对斑马鱼肝发育的保护作用转基因斑马鱼tg（fabp10a:dsred）购于国家斑马鱼中心，在2020年11月于内蒙古呼和浩特自然昼夜光线下，加热棒维持水温26-28℃，分开饲养雌雄鱼。在产卵前一晚上5-6
点，将雌雄鱼合放入产卵缸。上午8-10时产下胚胎，于下午2时用塑料移液管收集到含有e3胚胎培养基（5 mm nacl、0.17 mm kcl、0.33 mm cacl2、0.33 mm mgso4，ph 7.4）的培养皿中。将硫代乙酰胺（taa）溶解于e3胚胎培养基中使浓度为50 mm。化合物1和2以10 mm溶解于dmso中。在斑马鱼胚胎受精后小时数（h.p.f.）为48时，将其分为空白组、10 mm taa组、10 mm taa 不同浓度的化合物组，各组dmso含量均未超过0.3%。每24小时换一次新鲜培养基。在120 h.p.f.时，用三卡因麻醉幼鱼，荧光倒置显微镜观察和拍摄其形态及肝脏荧光。用image j软件计算鱼的卵黄面积和肝脏的红色荧光面积。
[0033]
结果如图5所示，taa组的斑马鱼肝脏明显小于空白组。随着培养基中化合物1或2浓度的增加，斑马鱼肝脏逐渐增大。并且，化合物1对taa所致肝脏生长抑制的恢复作用强于化合物2。
[0034]
实施例7：本发明化合物与新冠肺炎covid-19病毒感染相关蛋白的分子对接covid-19大流行形势严峻，迫切需要寻找抗病毒感染的治疗药物。为加快新药的发现速度，科学家们开发了多种软件。d3targets-2019-ncov是为寻找抑制covid-19病毒潜在药物而开发的web服务器。通过与病毒在感染、复制和释放过程中需要的潜在靶蛋白对接，可以预测受试化合物的靶蛋白。化合物1和2通过d3targets-2019-ncov (https://www.d3pharma.com) 与covid-19病毒感染相关的86种蛋白靶点[shi yl, zhang xb, mu kj, peng c, zhu zd, wang xy, et al. d3targets-2019-ncov: a webserver for predicting drug targets and for multi-target and multi-site based virtual screening against covid-19. acta pharm sin b 2020, 10: 1239
–
1248; chen zq, zhang xb, peng c, wang ja, xu zj, chen kx, et al. d3pockets: a method and web server for systematic analysis of protein pocket dynamics. j chem inf model 2019, 59: 3353
–
3358]进行分子对接。从网站上找到与covid-19病毒感染相关的人源和病毒源蛋白，上传化合物1和2，通过网站服务器对接。结果用pymol软件可视化。
[0035]
治疗新冠肺炎的莲花清瘟胶囊、金花清肝颗粒、清肺排毒汤、化湿排毒方等中药方剂中均含有麻黄。分析对接结果显示，与构建基块麻黄碱、没食子酸和莽草酸相比，化合物1和2对covid-19感染相关的一些蛋白的结合能力显著提高，与一些靶蛋白的结合能力达到阳性对照药物瑞德西韦的水平（图6）。
[0036]
化合物1和2与病毒的rna依赖性rna聚合酶(rdrp) pdb:6m71、pdb:7bv1（仅nsp12 & md）、pdb:7bv2（ rna& mg状态）紧密结合。rdrp在冠状病毒基因组复制中起关键作用，其也是瑞德西韦[wang ml, cao ry, zhang lk, yang xl, liu j, xu my, et al. remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-ncov) in vitro. cell res 2020, 3: 1-3.]等核酸类抗病毒药物的作用靶点。二价金属离子如mg
2
、mn
2
等可大幅提高rdrp的效率[ahn dg, choi jk, taylor dr, oh jw. biochemical characterization of a recombinant sars coronavirus nsp12 rna-dependent rna polymerase capable of copying viral rna templates. arch virol 2012, 157: 2095
–
2104]。新化合物1和2与rdrp结合紧密，而且与含mg
2
（rdrp rna&mg
2
）的rna模板的结合能明显强于单体rdrp （图6b）。
[0037]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不应受限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明技术范围内，通过简单变化或替换所得的技术方案仍落入本发明的保护范围。