1.本公开文本涉及用单链和双链寡核苷酸并且更具体地用包含本文所述的经修饰的核苷酸类似物的小干扰rna(sirna)进行靶向基因沉默的领域。
背景技术：
2.使用合成寡核苷酸来控制特定基因表达的概念可以追溯到20世纪70年代后期，当时首次证明了使用短合成寡核苷酸进行靶向基因沉默(stephenson等人,1978,proc natl acad sci usa,75:285-288)。继stephenson的发现之后，对用于调节基因表达的rna干扰途径以及sirna在所述过程中的作用的阐释极大地扩展了科学家对真核细胞中转录后基因表达控制的理解。
3.合成寡核苷酸包括单链寡核苷酸，诸如反义寡核苷酸(“aso”)、antimir和antagomir；以及双链寡核苷酸，诸如sirna。aso和sirna均通过沃森-克里克(watson-crick)碱基配对结合靶rna起作用，但其作用机制不同。在反义技术中，aso与靶rna形成dna-rna双链体并且通过阻断机制抑制mrna翻译或引起靶rna的核糖核酸酶h依赖性降解。在rna干扰技术中，sirna与rna诱导的沉默复合体(“risc”)结合，其中一条链(“过客链(passenger strand)”或“有义链”)被置换，并且剩余的链(“引导链”或“反义链”)与risc合作以结合互补rna(靶rna)；一旦结合，靶rna就被risc中的rna核酸内切酶argonaute(ago)切割并且然后进一步被rna核酸外切酶降解。
4.开发寡核苷酸疗法(包括sirna疗法)的最重要障碍包括(i)化合物稳定性差，(ii)体内递送至靶细胞的效率低，以及(iii)副作用，诸如“脱靶”基因沉默和意外的免疫刺激。为了解决这些障碍中的一些，研究人员尝试了各种寡核苷酸化学修饰。这些修饰可以分为三类，即(i)糖修饰，(ii)核苷酸间连接修饰，和(iii)核碱基修饰。
5.对糖基团的化学修饰包括核糖环的2
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碳原子或2
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羟基上的修饰。2
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ome(甲氧基)核苷酸类似物是最广泛使用的修饰之一。还使用2
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f(氟)核苷酸和2
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o-甲氧基乙基核苷酸。尽管大多数糖改变都定位在2
’‑
位，但也报道了其他位置诸如4
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位上的修饰(leydler等人,1995,antisense res dev,5:161-174)。
6.糖基团的其他化学修饰包括连接核苷中核糖支架的2
’‑
氧和4
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碳，产生所谓的锁核酸(“lna”)。lna也被称为双环核酸并且已显示具有增加的rna结合亲和力(koshin等人,1998,tetrahedron,54:3607-3630；prakash等人,2011,chem.biodivers,8:1616-1641)，导致所得双链寡核苷酸中所述lna的解链温度显著增加。然而，长度超过8个核苷酸的完全lna修饰的寡聚物倾向于聚集。与lna修饰的刚性性质形成对比，高度柔性的非锁定核酸(“una”)修饰也已被开发用于在寡核苷酸疗法中的应用。una核苷没有核糖的c2
’‑
c3
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键。由于其开链结构，una不受构象限制并且已被用于调节寡核苷酸的柔性(mangos等人,2003,j am chem soc,125:654-661)。在一些情况下，una插入物可以使双链体解链温度(tm)降低5℃-10℃/个插入物。bramsen等人(2010,nucleic acids research,38(17):5761-5773)已经报道了含有una和lna的sirna。
7.此外，还已开发了扩展的糖环体系并且应用于基因沉默技术。此类体系包括六元吗啉代环体系，其中核苷的核糖部分被吗啉环替代。基于吗啉代的核苷在包含它们的寡核苷酸内通过吗啉亚基的氮原子形成核苷酸间连接。基于二氨基磷酸酯吗啉代的寡核苷酸(“pmo”)已被用于反义技术(corey等人,2001,genome biology,2(5):reviews 1015.1-1015；partridge等人,1996,antisense nucleic acid drug dev,6:169-175)。然而，由于与互补rna的结合亲和力低，反义pmo需要相对较长，例如25个碱基长(corey等人，同上)。美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,698,685；和美国专利公开案us 2016us/0186174中也披露了吗啉代亚基的例子。
8.还可以通过用更稳定的部分替代3
’‑5’
磷酸二酯连接来对核苷酸间连接进行化学修饰，以降低对核酸酶降解的易感性。广泛使用的修饰是用硫代磷酸酯连接部分或完全替代磷酸二酯骨架(其中用硫原子替代氧原子)。赋予核酸增加的生物稳定性的替代骨架修饰是硼烷磷酸酯连接。在硼烷磷酸酯寡核苷酸中，非桥连磷酸二酯氧被等电子硼烷(-bh3)部分替代。
9.然而，大多数前述磷酸二酯修饰(诸如硫代磷酸酯)在核苷酸间连接中产生手性磷，导致所获得的寡核苷酸的非对映异构体混合物。由于非对映异构体寡核苷酸的数量可随每个经修饰的磷酸二酯连接而加倍，因此所得的非对映异构体数量随着经修饰的磷酸二酯连接数量的增加而呈指数增加。单独的非对映异构体可展现出不同程度的核酸酶抗性和与靶mrna不同的杂交特性。另外，非对映异构体混合物的纯化和化学分析是复杂的。因此，在一些情况下，可能希望避免使用磷酸二酯修饰(诸如硫代磷酸酯)和所得非对映异构体寡核苷酸混合物。
10.rna干扰技术的其他重大挑战是sirna的靶向递送和细胞摄取。细胞膜是带负电荷的磷脂双层并且是也带负电荷的sirna的进入屏障。一些团队已经使用n-乙酰基半乳糖胺(galnac)以使与其附接的sirna靶向肝细胞，所述肝细胞表达galnac结合去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)并且可以通过内吞作用将asgpr结合的sirna-galnac缀合物内化(参见例如，nair等人,2014,j am chem soc,136:16958-16961)。
11.尽管rna干扰技术已取得进展，但此领域仍然需要具有改善的稳定性、减少的脱靶概况和向其靶细胞的递送的sirna寡核苷酸。
技术实现要素：
12.本公开文本涉及一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含有义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸，并且其中所述反义链寡核苷酸包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物既不是所述反义链寡核苷酸的5
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突出端也不是3
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突出端，并且其中式(i-a)的核苷酸类似物如整个说明书所述。
13.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸包含从1至10个所述式(i-a)的核苷酸类似物、优选从1至5个所述式(i-a)的核苷酸类似物。
14.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸具有范围为从15至30个核苷酸、优选从20至25个核苷酸并且最优选从17至25个核苷酸的核苷酸长度。
15.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，在所述反义链寡核苷酸中，其中包含的一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物相继和/或非相继地位于所述反义链寡核苷酸的任何
位置。
16.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，其中所述反义链寡核苷酸包含与所述有义链寡核苷酸杂交的杂交区，并且其中在所述反义链寡核苷酸中，其中包含的一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物位于所述反义寡核苷酸的如下核苷酸区中，所述核苷酸区的范围为从所述反义链的5’末端核苷酸开始所述杂交区的从位置2的核苷酸至位置15的核苷酸。
17.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸包含与所述有义链寡核苷酸杂交的杂交区，并且其中在所述反义链寡核苷酸中，其中包含的一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物位于所述反义寡核苷酸的如下核苷酸区中，所述核苷酸区的范围为从所述反义链的5’末端核苷酸开始所述杂交区的从位置2的核苷酸至位置10的核苷酸，诸如所述杂交区的从位置2的核苷酸至位置8的核苷酸。
18.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸进一步包含一个或多个如本说明书中所述的式(i-b)的核苷酸类似物。
19.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，在所述反义链寡核苷酸中包含的式(i-a)和(i-b)的核苷酸类似物或其任何药学上可接受的盐中，b选自包含嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤的组。
20.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物由其(2r,6r)-立体异构体组成。
21.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链寡核苷酸包含一个或多个如本说明书中所述的式(i-a)的核苷酸类似物。
22.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链寡核苷酸包含一个或多个如本说明书中所述的式(i-b)的核苷酸类似物。
23.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链包含一个或多个如权利要求7中所定义的式(i-b)的核苷酸类似物，并且其中至少一个式(i-b)的核苷酸由5’末端或3’末端核苷酸组成，并且其中所述一个或多个式(i-b)的经修饰核苷酸是连续的。
24.在所述双链寡核苷酸的一些实施方案中，有义链包含一至三个如权利要求7中所定义的式(i-b)的核苷酸类似物，所述式(i-b)的经修饰核苷酸是连续的并且形成位于所述有义链的5’末端或3’末端的寡核苷酸段。
25.在一些实施方案中，所述双链寡核苷酸由小干扰rna(sirna)或其药学上可接受的盐组成。
26.本公开文本进一步涉及一种单链反义寡核苷酸，所述单链反义寡核苷酸与靶mrna或靶(双链)dna互补，所述单链反义寡核苷酸如整个本说明书中所定义。
27.本公开文本还涉及一种组合物，所述组合物包含如本说明书中所述的双链寡核苷酸或单链反义寡核苷酸。
28.本公开文本还涉及如本说明书中所述的双链寡核苷酸，其用作药剂。
附图说明
29.图1：sirna 2-0、1-8、3-3、3-8和3-11的体内敲低
30.纵坐标：相对于对照sirna的ttr血清水平
31.横坐标：皮下给药后天数
32.图2：sirna 2-0、1-8、3-8和3-11的体内敲低
33.纵坐标：相对于对照sirna，肝脏中的ttr mrna表达水平
34.横坐标：施用的sirna 2-0、1-8、3-8和3-11中每一种的剂量，以mg/kg计。
35.图3：sirna 2-0、1-8、3-8和3-11的体内敲低
36.纵坐标：以ng/ml表示的ttr血清水平
37.横坐标：施用的sirna 2-0、1-8、3-8和3-11中每一种的剂量，以mg/kg计。
38.图4：sirna 2-0、5-1、5-4、5-5、5-6、5-8、5-10和5-11的体内敲低
39.纵坐标：相对于对照sirna的ttr血清水平
40.横坐标：皮下sirna给药后天数
41.图5：sirna 2-0、5-1、5-4、5-5、5-6、5-8、5-10和5-11的体内敲低
42.纵坐标：相对于对照sirna的ttr血清水平
43.横坐标：皮下sirna给药后天数
44.图6：sirna 2-0、5-1、5-11和5-13的体内敲低。
45.纵坐标：相对于对照sirna，肝脏中的ttr mrna表达水平
46.横坐标：施用的sirna 2-0、5-1、5-11和5-13中每一种的剂量，以mg/kg计。
47.图7：sirna 2-0、5-1、5-11和5-13的体内敲低
48.纵坐标：以ng/ml表示的ttr血清水平。
49.横坐标：施用的sirna 2-0、5-1、5-11和5-13中每一种的剂量，以mg/kg计。
具体实施方式
50.本公开文本提供了包含一个或多个核苷酸类似物的新型双链和单链寡核苷酸。含有这些类似物的寡核苷酸具有优异的生物活性，例如，改善的体外稳定性、脱靶概况和体内作用持续时间。所改善的寡核苷酸可用于沉默(例如，减少或根除)靶基因的表达。在具体实施方案中，本公开文本涵盖包含特定核苷酸类似物的双链rna(dsrna)并且尤其是包含特定核苷酸类似物的sirna，它们可以与目的信使rna(mrna)杂交，从而减少或阻断靶目的基因的表达。
51.根据最优选的实施方案，所述特定核苷酸类似物具有被六元杂环替代的核糖环。如本公开文本中进一步详细描述的，所述特定核苷酸类似物的六元杂环基团可以是二噁烷或吗啉代环。在杂环基团是吗啉代环的情况下，氮原子是经取代的或未经取代的。在一些实施方案中，六元杂环基团可以被直链或环状基团和/或靶向部分取代。
52.定义
53.本说明书中所用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。下文或本公开文本的别处讨论了某些术语，以在描述本公开文本主题的产品和方法时提供另外的指导。
54.以下定义适用于本公开文本的上下文：
55.除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。
56.如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并且描述)针对所述值或参数本身的实施方案。在一些实施方案中，术语“约”是指给定值的
±
10％。然而，当所讨论的值是指不可分的
对象(诸如核苷酸或一旦再分就失去其身份的其他对象)时，那么“约”是指不可分对象的
±
1。
57.应理解，本文所述的本公开文本的方面和实施方案包括“具有”方面和实施方案、“包含(comprising)”方面和实施方案、“由方面和实施方案组成”以及“基本上由方面和实施方案组成”。词语“具有(have)”和“包含(comprise)”或其变型，诸如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，应理解为暗示包括所陈述的元素(诸如物质组成或方法步骤)，但不排除任何其他元素。术语“由......组成”暗示包括所陈述的一个或多个元素，排除任何另外的要素。术语“基本上由......组成”暗示包括所陈述的元素并且可能包括一个或多个其他元素，其中所述其他一个或多个元素不会实质上影响本发明的一个或多个基本和新颖特征。
58.除非另有指定，否则“烷基”意指链中具有1至20个(例如，1-5、1-10或1-15个)碳原子的直链或支链脂族烃基。“支链”意指一个或多个烷基，诸如甲基、乙基或丙基，附接到直链烷基链上。示例性直链或支链烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基和癸基。
[0059]“环烷基”意指如上定义的环状饱和烷基。例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
[0060]“烷氧基”定义为-or基团，其中r是如上定义的烷基，包括环烷基。例子是但不限于甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、丁氧基和戊氧基。
[0061]“卤素原子”是指氟、氯、溴或碘原子。在一些实施方案中，氟或氯原子可能是优选的。
[0062]
除非另有指定，否则“芳基”意指6至14个碳原子，例如6至10个碳原子的芳族单环或多环烃环体系。示例性芳基包括苯基和萘基。
[0063]“杂环(heterocycle)”或“杂环(heterocyclic)”是指含有至少一个选自氧、氮、硒、磷和硫的杂原子的饱和、部分不饱和或不饱和碳环基团。氮、硒、磷或硫可以任选被氧化，并且氮可以任选被季铵化。例如，杂环可以是稳定的环，其中所述环的至少一个成员是杂原子。在一些实施方案中，杂环可以具有3至14个(例如，5至7个或5至10个)成员，并且可以具有一个、两个或多个环(即，单环、双环或多环)。在具体实施方案中，杂原子是氧、氮和硫。杂原子的数量可以变化，例如从一个到三个。合适的杂环也公开在the handbook of chemistry and physics,第76版,crc press,inc.,1995-1996,第2-25至2-26页，将其公开内容通过引入特此并入。在一些实施方案中，杂环是非芳族杂环，包括但不限于吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二噁烷基、二氧戊环基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢硫代吡喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基、二氢硫代吡喃基和氮杂环庚烷基以及由与苯基缩合而产生的稠合体系。
[0064]“杂芳基”是指具有5至14个(例如，5至7个或5至10个)成员的芳族杂环，并且可以是单环、双环或多环。杂原子的数量典型地可以从一至三个杂原子变化，所述杂原子例如选自n和o。杂芳基的例子包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1,2,4-噻二唑基、噁二唑、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔
唑基、苯并咪唑基、异噁唑基和吡啶基-n-氧化物，以及由与苯基缩合而产生的稠合体系。在具体实施方案中，杂芳基是包含一个或多个杂原子，例如一至三个选自n和o的杂原子的5或6元杂芳基。“烷基”、“环烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”和“杂环基”还指通过除去两个氢原子而形成的相应的“亚烷基”、“亚环烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、“亚杂芳基”和“亚杂环基”。
[0065]
术语“杂环核碱基”意指当该核碱基掺入聚合物结构中时能够与互补核碱基或核碱基类似物(即，核碱基衍生物)配对形成沃森-克里克型氢键并且堆积相互作用的任何含氮杂环部分。
[0066]
根据本公开文本，除非另有指定，否则术语“杂环核碱基”在本文中是指可附接至任选经取代的二噁烷环或任选经取代的吗啉代环的任选经取代的含氮杂环基团。在一些实施方案中，杂环核碱基可以选自任选经取代的嘌呤碱基或任选经取代的嘧啶碱基。术语“嘌呤碱基”在本文中以其本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以其本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选经取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的例子包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。杂环核碱基的其他非限制性例子包括二氨基嘌呤、8-氧代-n6烷基腺嘌呤(例如，8-氧代-n6甲基腺嘌呤)、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、n4,n
4-乙醇胞嘧啶、n6,n
6-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶)、假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、1,2,4-三唑-3-甲酰胺和美国专利号5,432,272和7,125,855中所述的其他杂环核碱基，将所述专利通过引用并入本文，公开了另外的杂环碱基。在一些实施方案中，杂环核碱基可以任选地被一个或多个胺或烯醇保护基团取代。
[0067]
如本文所用的术语“保护基团(protecting group)”和“保护基团(protecting groups)”是指添加到分子中以便防止分子中的现有基团经历不希望的化学反应的任何原子或基团。“保护基团”可以是本领域已知的不稳定的化学部分，用于保护反应性基团，诸如羟基、氨基、硫醇、羧酸或磷酸基团，使其免受化学合成过程中不希望的或不合时宜的反应。保护基团典型地选择性地和/或正交地使用以在其他反应位点上反应期间保护位点，并且然后可以被去除以使未受保护的基团保持原样或可用于进一步反应。
[0068]
保护基部分的例子描述在t.w.greene和p.g.m.wuts,protective groups in organic synthesis,第3版.john wiley&sons,1999中以及j.f.w.mcomie,protective groups in organic chemistry plenum press,1973中，将这两个文献出于公开合适保护基团的有限目的均通过引用特此并入。可以以这样的方式选择保护基团部分，使得它们对某些反应条件是稳定的并且使用本领域已知的方法在方便的阶段容易去除。
[0069]
保护基团的非限制性列表包括苄基；经取代的苄基；烷基羰基和烷氧羰基(例如，叔丁氧羰基(boc)、乙酰基或异丁酰基)；芳基烷基羰基和芳基烷氧基羰基(例如，苄氧基羰基)；经取代的甲醚(例如，甲氧基甲醚)；经取代的乙醚；经取代的苄基醚；四氢吡喃醚；甲硅烷基醚(例如，三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷氧基甲基、[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基或叔丁基二苯基甲硅烷基)；酯(例如，苯甲酸酯、2-氰乙基磷酸酯)；碳酸酯(例如，甲氧基甲基碳酸酯)；磺酸酯(例
如，甲苯磺酸酯或甲磺酸酯)；无环缩酮(例如，二甲基缩醛)；环状缩酮(例如，1,3-二噁烷、1,3-二氧戊环和本文所述的那些)；(例如，本文所述的那些)；无环半缩醛；环状半缩醛；环状二硫缩酮(例如，1,3-二噻烷或1,3-二硫戊环)；原酸酯(例如，本文所述的那些)和三芳基甲基(例如，三苯甲基；单甲氧基三苯甲基(mmt)；4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmt)；4,4’,4
”‑
三甲氧基三苯甲基(tmt)；和本文所述的那些)。
[0070]
优选的保护基团选自包含以下的组：乙酰基(ac)、苯甲酰基(bzl)、异丁酰基(ibu)、苯乙酰基、二甲氧基三苯甲基(dmt)、甲氧基三苯甲基(mmt)、三苯甲基(trt)、n,n-二甲基甲脒和2-氰基乙基(ce)。
[0071]
除非另有指示，否则任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写都符合其一般用法、公认缩写或iupac-iub生化命名委员会(iupac-iub commission on biochemical nomenclature)(参见，biochem.11:942-944(1972))。
[0072]
如本文所用，术语“固体支持物”(也称为树脂)意指寡核苷酸在合成过程中结合的不溶性颗粒，典型地直径为50-200μm。已经使用了许多类型的固体支持物，但已证明可控孔度玻璃(cpg)和聚苯乙烯(高度交联的聚苯乙烯珠)特别有用。可控孔度玻璃是刚性且不溶胀的，具有其中进行寡核苷酸合成的深孔(孔径在500与之间)。用于常规寡核苷酸合成的固体支持物是可商购的，并且在cpg固体支持物的情况下，典型地以20-40μmol核苷/克树脂的负载量制造。基于聚苯乙烯的固体支持物显示出较高的负载量，高达300μmol/克树脂。已附接标准核苷酸的固体支持材料是可商购的，氨基官能化的cpg和聚苯乙烯材料用于合成非商业构建块(building block)，这稍后将针对本文所述构建块进行显示。作为已经附接第一核苷酸构建块的固体支持物的替代方案，可以使用可商购的通用固体支持物材料，这将稍后在本公开文本中描述。
[0073]
如本文所用，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”包括如下文进一步详述的天然存在或经修饰的核苷酸，或替换性替代部分。经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸并且在本文中也称为“核苷酸类似物”。本领域普通技术人员应理解，核苷酸中的鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶可以被其他部分替代，而不会显著改变包含带有此类替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本公开文本的核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸替代。包括包含此类置代部分的序列作为本公开文本的实施方案。
[0074]
如本文所用，“细胞靶向部分”意指确保sirna递送增加的分子基团，所述sirna递送增加涵盖(i)sirna与所选靶受体(例如，靶蛋白)结合的特异性增加，包括sirna与表达所选靶受体的细胞结合的特异性增加；(ii)靶细胞对sirna的摄取增加；和/或(iii)sirna一旦其进入靶细胞就被适当加工的能力增加，诸如增加sirna的细胞内释放，例如通过促进sirna从转运囊泡易位进入细胞质来实现。因此，细胞靶向部分用于将寡核苷酸导向和/或递送至特定的细胞、组织、器官等。包含在核苷酸、核苷酸类似物或寡核苷酸中的细胞靶向部分赋予所述核苷酸、核苷酸类似物或寡核苷酸这样的特征，使得所述核苷酸、核苷酸类似物或寡核苷酸优先被相对于靶细胞类型的一种或多种非靶细胞类型识别、结合、内化、加工、活化等。例如，内皮细胞对肽细胞靶向部分arg-gly-asp(rgd)具有高亲和力；癌细胞和肾细胞优先与具有叶酸部分的化合物相互作用；免疫细胞对甘露糖有亲和力；并且心肌细
胞对肽wlseagpvvtvralrgtgsw(seq id no:1)具有亲和力(参见，例如，生物材料zv-8081-8087，2010)。其他细胞靶向/递送部分是本领域已知的。因此，包含细胞靶向部分的化合物优先与一种或多种靶细胞类型相互作用并且被其吸收。
[0075]
细胞靶向部分涵盖细胞靶向肽基团和细胞靶向非肽基团。
[0076]
如本文所用，“靶细胞(target cell)”或“靶细胞(targeted cell)”是指目的细胞。所述细胞可以在生物体的体外、体内、原位或者组织或器官中发现。生物体可以是动物，优选哺乳动物，更优选人类，并且最优选人类患者。
[0077]
如本文所用，术语“ttr”是指甲状腺素运载蛋白基因或蛋白。如本文所用，术语“ttr”包括人ttr，其氨基酸和核苷酸序列可在例如embl数据库中以登录号cr456908找到；小鼠ttr，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如genbank数据库中以登记号aah24702找到。ttr mrna序列的另外例子可容易地在例如genbank中获得。
[0078]
如本文所用，“靶序列”是指在靶基因或其部分的rna转录物(包括mrna)中发现的连续核苷酸序列，它是初级转录产物的rna加工产物。
[0079]
如本文所用，除非另有指示，否则在用于描述与第二核苷酸序列(例如，寡核苷酸)相关的第一核苷酸序列(例如，寡核苷酸)时，术语“互补”是指第一核苷酸序列在某些条件下与第二核苷酸序列杂交并且形成双链体结构的能力，如本领域普通技术人员将理解的。这包括在第一或第二核苷酸序列的整个长度上第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。在第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”的情况下，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以具有70％或更多的核苷酸同一性，同时保留在与其终极靶标最相关的条件下杂交的能力。然而，在两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就互补性的确定而言，此类突出端不应被视为错配。例如，包含长度为21个核苷酸的第一寡核苷酸和长度为23个核苷酸的第二寡核苷酸的双链rna(dsrna)(其中第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列)仍可以出于本公开文本的目的被称为“完全互补的”。“互补”序列还可以包括或完全由非沃森-克里克碱基对形成和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足关于其杂交能力的上述要求。术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”可以用于关于dsrna的有义链与反义链之间或dsrna的反义链与靶序列之间的碱基匹配，这由其使用上下文中可以理解。如本文所用，“基本上与mrna的至少一部分互补”的多核苷酸是指与目的mrna的连续部分基本上互补的多核苷酸。如本文所用，术语“双链rna”或“dsrna”是指核糖核酸分子的复合体，其具有包含两条反平行且基本上互补的(如上文所定义)核酸链的双链体结构。形成双链体结构的两条链可以是一个较大rna分子的不同部分，或者它们可以是单独的rna分子。在单独的rna分子的情况下，此类dsrna在文献中可以称为短干扰rna(sirna)。在两条链是一个较大分子的一部分并且因此通过形成双链体结构的第一链的3’末端与第二链的5’末端之间的不间断核苷酸链连接的情况下，连接rna链被称为“发夹环”、“短发夹rna”或“shrna”。在两条链通过形成双链体结构的第一链的3’末端与第二链的5’末端之间的不间断核苷酸链之外的手段共价连接的情况下，连接结构被称为“接头”。rna链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsrna最短链中的寡核苷酸数量减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构，dsrna还可以包含一个或多个核苷酸突出端。另外，如本文所用，术语“dsrna”可以包含对核糖核苷酸的化学修饰，
包括对多个核苷酸的实质性修饰并且包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰如用于sirna型分子中的任何此类修饰都出于本公开文本的目的被“dsrna”中所涵盖。在一些实施方案中，dsrna中的核苷酸间连接可以被修饰，例如，如本文所述。
[0080]
在本公开文本的范围内，两个核酸序列之间的“同一性百分比”意指在最佳比对之后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸残基的百分比，此百分比完全是统计学的并且两个序列之间的差异沿其长度随机分布。两个核酸序列的比较传统上通过将其最佳比对之后比较序列来进行，所述比较能够通过区段或通过使用“比对窗口”进行。除了手动比较之外，还可以借助smith和waterman(1981)的局部同源算法、借助neddleman和wunsch(1970)的局部同源算法、借助pearson和lipman(1988))的相似性搜索方法、或借助使用这些算法的计算机软件(wisconsin genetics software package(genetics computer group,575science dr.,威斯康星州麦迪逊)中的gap、bestfit、fasta和tfasta，或通过比较软件blast nr或blast p)来进行比较序列的最佳比对。
[0081]
两个核酸序列之间的同一性百分比通过比较两个最佳比对的序列来确定，其中待比较的核酸序列与参考序列相比可以具有添加或缺失，以进行两个序列之间的最佳比对。通过以下方式计算同一性百分比：确定两个序列之间、优选两个完整序列之间核苷酸残基相同的位置的数量，将相同位置的数量除以比对窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以获得两个序列之间的同一性百分比。
[0082]
如本文意图，与参考序列具有至少70％核苷酸同一性的核苷酸序列涵盖与所述参考序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸同一性的那些。
[0083]
在一些实施方案中，dsrna包含经修饰的核糖核苷，包括脱氧核糖核苷，包括例如一个或多个脱氧核糖核苷突出端、dsrna的双链部分内的一个或多个脱氧核糖核苷等。然而，不言而喻的是，在任何情况下，术语“dsrna”都不涵盖双链dna分子。
[0084]
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指当dsrna的第一链的3’末端延伸超过第二链的5’末端或相反亦然时未配对的核苷酸或从dsrna的双链体结构突出的核苷酸。“平”或“平末端”意指在dsrna的那一端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平末端”dsrna是在其整个长度上是双链的dsrna，即分子的任一端都没有核苷酸突出端。为清楚起见，在确定dsrna是否具有突出端或平末端时，不考虑与dsrna链的3’末端和/或5’末端缀合的化学帽或非核苷酸化学部分。
[0085]
如本文所用，术语“连续核苷酸”是指通过核苷酸间连接彼此连接的核苷酸，天然核苷酸或经修饰的核苷酸。因此，两个连续核苷酸通过核苷酸间连接彼此连接。此外，三个连续核苷酸意指三核苷酸段，其中第一个核苷酸通过核苷酸间连接而连接到第二个核苷酸，并且其中第二个核苷酸也通过核苷酸间连接而连接到第三个核苷酸。在寡核苷酸中相继定位的所述三核苷酸段内，所述三个核苷酸被称为“连续核苷酸”。说明性地，包含十个连续核苷酸类似物的寡核苷酸由在其序列中包含通过核苷酸间键彼此连接的一段不间断的十个核苷酸类似物的寡核苷酸组成。
[0086]
如本文所用，dsrna中的术语“反义链”或“反义链寡核苷酸”是指dsrna的含有与靶核苷酸序列基本上互补的序列的链。dsrna中的另一条链是“有义链”，也可以称为“有义链
寡核苷酸”。在双链寡核苷酸中，包括在dsrna中，反义链包含在本文中称为“杂交区”的核苷酸区，所述核苷酸区与有义链的区域配对(后者是有义链的杂交区)。反义链可以进一步包含位于5
’‑
末端和/或3
’‑
末端的与有义链未配对的区域。在其中所述dsrna由sirna组成的dsrna的实施方案中，此未配对区域常规地被称为“核苷酸突出端”或“突出端”，即“5
’‑
核苷酸突出端”或“3
’‑
核苷酸突出端”。通常，核苷酸突出端具有1至8个核苷酸的长度，其涵盖1、2、3、4、5、6、7和8个核苷酸的长度。在大多数实施方案中，核苷酸突出端具有2至3个核苷酸的长度。对称地，双链寡核苷酸(包括dsrna)的有义链包含与反义链的杂交区杂交的杂交区。有义链还可以进一步包含5
’‑
核苷酸突出端和/或3
’‑
核苷酸突出端。尽管双链寡核苷酸的反义链的杂交区与有义链的区域配对，但其在一些实施方案中可以与有义链的所述区域不完全互补，这意味着在杂交时，反义链寡核苷酸的杂交区与有义链寡核苷酸的所述配对区域之间可以存在一些错配(即，一些未配对的核苷酸)。典型地，在这些实施方案中的一些中，反义链寡核苷酸的杂交区与有义链寡核苷酸的配对区域之间可以存在一至三个错配。
[0087]
如本文所用，术语“引入细胞中”意指促进摄取或吸收到细胞中，如本领域普通技术人员所理解的。dsrna的吸收或摄取可以通过独立的扩散或活性细胞过程或通过辅助剂或装置来进行。此术语的含义不限于体外细胞；dsrna也可以“引入细胞”，其中所述细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，可以将dsrna注射到组织位点或全身施用。体内递送也可以由β-葡聚糖递送系统介导(参见，例如，tesz,g.j.等人,2011,biochem j.436(2):351-62)。体外引入细胞包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂转染。其他方法在下文中描述或是本领域中已知的。
[0088]
如本文所用，术语“抑制......的表达(inhibit the expression of)”或“抑制......的表达(inhibiting expression of)”在它们涉及靶基因的情况下是指靶基因表达的至少部分抑制，如通从靶基因转录的mrna量的减少所证明。如本文所用，术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑制”、“敲低”和其他类似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。抑制程度通常以(((对照细胞中的mrna)-(处理细胞中的mrna))/(对照细胞中的mrna))
·
100％表示。可替代地，抑制程度可以根据与靶基因转录功能相关的参数的减少来给出，例如，由细胞分泌的由靶基因编码的蛋白质的量或表现出某种表型(例如，凋亡)的细胞的数量。原则上，可以在表达靶标的任何细胞中确定靶基因沉默，无论是组成型还是通过基因组工程，以及通过任何适当的测定。然而，当需要参考以便确定给定dsrna是否在一定程度上抑制靶基因的表达并且因此被本公开文本所涵盖时，以下实施例中提供的测定应用作此类参考。
[0089]
如本文所用，在靶基因表达的上下文中，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等是指缓解或减轻由靶基因表达介导的病理过程。在本公开文本的上下文中，就其涉及下文列举的任何其他病症(由靶表达介导的病理过程除外)而言，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等是指缓解或减轻与此类病症相关的一种或多种症状。
[0090]
如本文所用，关于疾病或障碍的术语“预防”或“延迟......的进展”(及其语法变体)涉及疾病的预防性治疗，例如在怀疑患有所述疾病或处于发展所述疾病的风险中的个体中。预防可以包括但不限于预防或延迟疾病的发作或进展和/或将疾病的一种或多种症状维持在希望水平或亚病理水平。
[0091]
如本文所用，术语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在治疗、预防或管理由靶基
因表达介导的病理过程或由靶基因表达介导的病理过程的明显症状方面提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以由普通执业医师容易地确定并且可能根据诸如由靶基因表达介导的病理过程的类型和阶段、患者的病史和年龄以及抑制由靶基因介导的生物过程的其他治疗剂的施用的因素而变化。
[0092]
如本文所用，术语“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，诸如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人类。
[0093]
术语“核苷间连接”、“核苷间连接基团”、“核苷酸间连接”或“核苷酸间连接基团”在本文中可互换使用，并且是指两个核苷之间的任何接头或连接(即，杂环碱基部分和糖部分)单元，如本领域已知的，包括例如但不限于磷酸酯、磷酸酯类似物(即，磷酸二酯或磷酸三酯部分)、硫代磷酸酯、膦酸酯、胍、羟胺、羟肼基、酰胺、氨基甲酸酯、烷基、和经取代的烷基连接。“核苷间连接基团”可以涉及两个核苷之间、两个核苷类似物之间或核苷与核苷类似物之间的连接。
[0094]
核苷间连接构成核酸分子的骨架。核苷间连接基团是指连接包含在核酸分子中的两个相邻核苷残基的化学基团，其涵盖(i)连接两个相邻核苷残基的化学基团，(ii)连接核苷残基与相邻核苷类似物残基的化学基团，(iii)连接第一核苷类似物残基与第二核苷类似物残基的化学基团，所述核苷类似物残基可以相同或不同。核苷类似物残基涵盖本文公开的式(i)的化合物。在一方面，本发明sina分子的核苷酸可以通过第一核苷酸的糖部分的3
’‑
碳与第二核苷酸的糖部分的5
’‑
碳之间的连接(本文称为3’核苷间连接)连接到相邻的核苷酸。如本文所用，3
’‑5’
核苷间连接是指连接两个相邻核苷单元的核苷间连接，其中所述连接在第一核苷的糖部分的3
’‑
碳与第二核苷的糖部分的5
’‑
碳之间。在另一方面，本发明sina分子的核苷酸(包括核苷酸类似物)可以通过第一核苷酸的糖部分的2
’‑
碳与第二核苷酸的糖部分的5
’‑
碳之间的连接(本文称为2’核苷间连接)与相邻核苷酸(包括核苷酸类似物)连接。如本文所用，2
’‑5’
核苷间连接是指连接两个相邻核苷单元的核苷间连接，其中所述连接在第一核苷的糖部分的2
’‑
碳与第二核苷的糖部分的5
’‑
碳之间。
[0095]
如本文所用，术语“核苷间连接基团”涵盖含磷和不含磷的核苷间连接基团。
[0096]
在一些实施方案中，含磷的核苷间连接基团涵盖磷酸二酯、硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3
’‑
亚烷基膦酸酯、5
’‑
亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3
’‑
氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和具有正3
’‑5’
连接的硼烷磷酸酯及其2
’‑5’
连接类似物。
[0097]
传授上述含磷核苷间连接的制备的代表性美国专利包括美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，将其中每个通过引用并入本文。
[0098]
在一个实施方案中，非磷酸二酯骨架连接选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯和氨基磷酸酯骨架连接基团。
[0099]
在一个实施方案中，含磷核苷间连接基团涵盖磷酸二酯、磷酸三酯和硫代磷酸酯。
[0100]
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个不含磷原子的核苷间连接基团。此类寡核苷酸包括但不限于由短链烷基或环烷基核苷间连接基团、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间连接基团、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接基团形成的那些。这些包括具有以下的那些：硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合n、o、s和ch2组成部分的其他骨架。传授上述不含磷核苷间连接基团的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，将其中每个通过引用并入本文。
[0101]
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个非离子的中性核苷间连接基团。中性核苷间连接基团涵盖非离子连接基团，其包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、甲酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(参见例如：carbohydrate modifications in antisense research；y.s.sanghvi和p.d.cook编辑.acs symposium series 580；第3和4章,(第40-65页))。其他中性核苷间连接基团涵盖包含混合的n、o、s和ch2组分部分的非离子连接。
[0102]
双链寡核苷酸，诸如双链rna(dsrna)
[0103]
如本说明书中先前所指定，根据本发明的双链寡核苷酸(涵盖dsrna)包含有义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸，其中反义链寡核苷酸通过其中包含的杂交区与有义链寡核苷酸杂交。对称地，有义链寡核苷酸还包含与反义链寡核苷酸中包含的杂交区杂交的杂交区。在一些实施方案中，反义链寡核苷酸在其5
’‑
末端、其3
’‑
末端、或其5
’‑
末端和其3
’‑
末端两者处进一步包含未与有义链寡核苷酸杂交的核苷酸区，所述未杂交区在本文中称为“核苷酸突出端”或可替代地“突出端”。此外，有义链寡核苷酸在其5
’‑
末端、其3
’‑
末端、或其5
’‑
末端和其3
’‑
末端两者处可以进一步包含未与反义链寡核苷酸杂交的核苷酸区，所述未杂交区在本文中称为“核苷酸突出端”或可替代地“突出端”。
[0104]
在根据本公开文本的双链寡核苷酸的优选实施方案中，包含在反义链寡核苷酸中的杂交区与包含在有义链寡核苷酸中的杂交区完全互补。
[0105]
反义链寡核苷酸可以进一步包含位于其5
’‑
末端、其3
’‑
末端、或其5
’‑
末端和其3
’‑
末端两者处的与有义链未配对的区域。在其中所述dsrna由sirna组成的dsrna的反义链寡核苷酸的实施方案中，与有义链寡核苷酸未配对的所述3’末端或5’末端区域常规地被称为“核苷酸突出端”或“突出端”，即“5’核苷酸突出端”或“3’核苷酸突出端”。在根据本公开文本的双链寡核苷酸的优选实施方案中，当有义链寡核苷酸或反义链寡核苷酸中存在时，核苷酸突出端具有从1至8个核苷酸的长度，其涵盖1、2、3、4、5、6、7和8个核苷酸的长度。在大多数实施方案中，核苷酸突出端具有二至三个核苷酸的长度。
[0106]
在包含有义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸的双链寡核苷酸中并且尤其是可用作sirna的双链寡核苷酸中的反义链寡核苷酸中包含的杂交区中，如本公开文本中所述的式(i-a)的具体核苷酸类似物的存在允许所述双链寡核苷酸的高稳定性，导致体内作用的持
续时间长。此外，本文显示，在其中所述双链寡核苷酸是sirna的实施方案中，反义链寡核苷酸的杂交区中在除5
’‑
突出端或3
’‑
突出端以外的位置处一个或多个如本文所述的式(i-a)的核苷酸类似物的存在赋予所述sirna改善的抑制靶基因表达的特性、改善的其基因表达抑制特性的持续时间、并且尤其是改善的反义链寡核苷酸对靶序列的特异性。如本文实施例中所示，改善的特异性涵盖改善的反义链寡核苷酸与靶寡核苷酸杂交的特性，同时减少脱靶事件的数量。
[0107]
本文的实施例显示，包含反义链寡核苷酸和有义链寡核苷酸并且其中在反义链寡核苷酸的杂交区中并且在不同于其3
’‑
突出端或5
’‑
突出端的位置处已掺入一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物的双链寡核苷酸允许产生具有确保有效抑制靶基因所需的稳定性和特异性的sirna双链体结构。本文还显示，靶基因的有效抑制伴随着脱靶事件数量的减少。
[0108]
出乎意料地，本发明诸位发明人已显示，当式(i-a)或(i-b)的核苷酸类似物通过常规磷酸二酯键彼此连接或一个与含核糖核苷酸连接时，获得包含一个或多个本公开文本的式(i-a)或(i-b)的核苷酸类似物的sirna双链体的高代谢稳定性。出人意料地显示，当式(i-a)或(i-b)的核苷酸类似物通过寡核苷酸内的常规磷酸二酯键连接形成sirna的链时，所得sirna双链体具有更高的抗核酸酶降解稳定性，这导致与具有硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核苷酸而不是式(i-a)或(i-b)的核苷酸类似物的相同sirna相比，体内作用持续时间更长。
[0109]
当通过磷酸二酯键连接时式(i-a)或(i-b)的核苷酸类似物的体内作用持续时间的这种高增加是明显的技术优点，因为可以避免通过经修饰的核苷酸间连接磷基团诸如硫代磷酸酯的稳定化。本文中提醒，此类非常规硫代磷酸酯引入手性中心，这导致不希望的所得sirna的非对映异构体混合物。后者可能改变sirna的结合特性，潜在地导致脱靶事件增加。本文还显示，具有一个或多个式(i-a)或(i-b)的化合物的sirna在体外和体内具有良好的靶基因沉默活性，即使当sirna在不存在任何转染剂的情况下被靶细胞内化时也是如此。
[0110]
如文献中所述，将双链体去稳定化的经修饰的核苷酸掺入双链寡核苷酸的反义链中导致改善的脱靶概况并且因此导致相应sirna的副作用更少(参见例如，nucleic acid research，2010，38(17)，5761-5773)
[0111]
因此，更出人意料的是，在反义链寡核苷酸的特定位置处，即在反义链寡核苷酸的杂交区中以及在除所述反义链寡核苷酸的5
’‑
突出端或3
’‑
突出端以外的位置处，本文所述的式(i-a)的核苷酸类似物的掺入显示出在(2s,6r)-非对映异构体系列中高度双链体去稳定化特性以及对于类似物(2r,6r)-非对映异构体显著不太明显的双链体去稳定化。与预期相反，反义链寡核苷酸的杂交区中包含式(i-a)的(2r,6r)-非对映异构体类似物的sirna显示出在体外系统中显著降低的脱靶结合，同时保持其高度有效力的体内靶抑制特性。
[0112]
重要的是，其中反义链寡核苷酸的杂交区中掺入一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物的sirna在这些sirna显示发挥靶基因沉默作用的剂量范围内没有体内副作用。
[0113]
不希望受任何特定理论束缚，本发明诸位发明人认为如本文所述的式(i-a)的核苷酸类似物被赋予特定物理化学特性，为包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物的寡核苷酸赋予改善的稳定性、结合特性和脱靶概况，这在实施例中示出。这些特性在双链寡核苷酸中是特别改善的，其中所述反义链寡核苷酸的杂交区包含作为式(i-a)的核苷酸类似物的其(2r,6r)非对映异构体。
[0114]
如本公开文本中所述的式(i-a)的核苷酸类似物在本文中也可以称为式(i-a)的“非靶向”核苷酸类似物。
[0115]
双链寡核苷酸的反义链的实施方案
[0116]
本公开文本的一个重要方面是提供双链寡核苷酸，其包含有义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸，并且其中所述反义链寡核苷酸包含一个或多个如本文所述的式(i-a)的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物既不是所述反义链寡核苷酸的5
’‑
突出端核苷酸也不是3
’‑
突出端核苷酸。在一些实施方案中，所述双链寡核苷酸由与选定靶mrna杂交的sirna组成。
[0117]
如本文所用，包含在如本文所述的双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸中并且既不包含在5
’‑
突出端(当存在时)中也不包含在3
’‑
突出端(当存在时)中的核苷酸在本文中被称为“杂交核苷酸”或可替代地被称为“内部核苷酸”。
[0118]
因此，包含在如本文所述双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸中并且既不包含在5
’‑
突出端(当存在时)中也不包含在3
’‑
突出端(当存在时)中的式(i-a)的核苷酸类似物可以在本文中称为式(i-a)的“杂交核苷酸”或可替代地本文中称为式(i-a)的“内部核苷酸”。
[0119]
类似地，包含在如本文所述双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸中并且既不包含在5
’‑
突出端(当存在时)中也不包含在3
’‑
突出端(当存在时)中的核苷酸也可以在本文中称为“杂交核苷酸”或可替代地称为“内部核苷酸”。
[0120]
此外，位于根据本公开文本双链寡核苷酸的所述反义链寡核苷酸的5
’‑
突出端内或3
’‑
突出端(当存在时)内的核苷酸在本文中可以称为“突出端”核苷酸。
[0121]
在所述反义链寡核苷酸包含5
’‑
突出端和/或3
’‑
突出端的双链寡核苷酸的一些实施方案中，反义链寡核苷酸在其5
’‑
突出端或其3
’‑
突出端或其5
’‑
突出端和其3
’‑
突出端两者处不包含任何式(i-a)的核苷酸类似物。那么，所述反义链寡核苷酸中包含的式(i-a)的核苷酸类似物都是式(i-a)的杂交核苷酸类似物，参考本文先前指定的“杂交核苷酸”的定义。
[0122]
在其中所述反义链寡核苷酸包含5
’‑
突出端和/或3
’‑
突出端的双链寡核苷酸的一些其他实施方案中，反义链寡核苷酸可以进一步在其5
’‑
突出端或其3
’‑
突出端或其5
’‑
突出端和其3
’‑
突出端两者处包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物。
[0123]
在本说明书中，出于语言简化和各种公开的实施方案的特征的清晰改善的原因，可以使用如在本公开文本中所定义的术语“杂交”核苷酸或“突出端”核苷酸。
[0124]
双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸中包含的式(i-a)的杂交核苷酸类似物的数量可以变化。
[0125]
在一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸包含从1至10个式(i-a)的杂交核苷酸类似物。如本文所用，从1至10个式(i-a)的核苷酸类似物涵盖1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个式(i-a)的核苷酸类似物。
[0126]
在一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸包含从1至5个式(i-a)的杂交核苷酸类似物。
[0127]
在一些实施方案中，包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物的所述反义链寡核苷酸的范围为从9至36个核苷酸的长度，其涵盖从15至30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸的范围为从20至25个核苷酸的长度，其涵盖从17至25个核苷酸的长度。
[0128]
在一些实施方案中，本文所述的式(i-a)的杂交核苷酸类似物的(2r,6r)立体异构体是优选的。
[0129]
式(i-a)的核苷酸类似物在反义链寡核苷酸内的位置。
[0130]
一个或多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物可以位于在反义链寡核苷酸的杂交序列内的不同核苷酸位置。
[0131]
此外，在其中所述反义链寡核苷酸包含两个或更多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物的实施方案中，所述两个或更多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物可以相继和/或非相继地位于所述反义链寡核苷酸的杂交区的任何位置，因此当存在一个或两个突出端时，其5
’‑
突出端或3
’‑
突出端除外。
[0132]
在所述反义链寡核苷酸的一些实施方案中，其中包含的每个式(i-a)的杂交核苷酸类似物与不同于经修饰的式(i-a)的核苷酸的核苷酸连接。根据这些实施方案，两个或更多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物在反义链寡核苷酸的杂交序列内是分开的，即分开分布的。
[0133]
在所述反义链寡核苷酸的一些其他实施方案中，其中包含的所有式(i-a)的杂交核苷酸类似物连接在一起，因此它们反义链寡核苷酸内是相继定位的。在这些实施方案中，位于所述杂交核苷酸类似物的此连续段的5’末端的式(i-a)的杂交核苷酸类似物与不同于式(i-a)的核苷酸类似物的核苷酸连接，并且位于所述杂交核苷酸类似物的此连续段的3’末端的式(i-a)的杂交核苷酸类似物与不同于经修饰的式(i-a)的核苷酸的核苷酸连接。根据这些实施方案，相继的两个或更多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物被称为在反义链寡核苷酸内是连续的。
[0134]
在所述反义链寡核苷酸的再其他的实施方案中，式(i-a)的杂交核苷酸类似物作为分开的单一的式(i-a)的核苷酸类似物以及作为一段或多段相继的式(i-a)的杂交核苷酸类似物两者定位。如容易理解的，连接在一起的相继的式(i-a)的杂交核苷酸类似物是包含在所述反义链寡核苷酸中的连续的式(i-a)的核苷酸类似物。
[0135]
说明性地，在其中反义链寡核苷酸具有23个核苷酸的长度并且其中所有核苷酸与有义链寡核苷酸配对的双链寡核苷酸的实施方案中，所述反义链寡核苷酸可以在选自核苷酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23的核苷酸位置包含式(i-a)的杂交核苷酸类似物，核苷酸位置从反义链寡核苷酸的5’末端开始编号。
[0136]
仍然说明性地，在其中反义链寡核苷酸具有23个核苷酸的长度并且包含(i)长度为21个核苷酸的杂交区和(ii)长度为两个核苷酸的3
’‑
突出端的双链寡核苷酸的实施方案中，所述反义链寡核苷酸可以在选自核苷酸位置1、、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的核苷酸位置包含式(i-a)的杂交核苷酸类似物，核苷酸位置从反义链寡核苷酸的5’末端开始编号。在其一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸进一步在其3
’‑
突出端中包含两个式(i-a)的突出端核苷酸类似物。
[0137]
在其中反义链寡核苷酸具有23个核苷酸的长度的双链寡核苷酸的其他说明性实施方案中，所述反义链寡核苷酸可以在选自核苷酸位置2、3、4、5、6、7或8的核苷酸位置处包含式(i-a)的杂交核苷酸类似物，核苷酸位置从反义链寡核苷酸的5’末端开始编号。包含靶向核苷酸的反义链的实施方案
[0138]
在根据本公开文本的双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸的一些实施方案中，所述反
义链寡核苷酸进一步包含一个或多个靶向核苷酸类似物。
[0139]
在这些实施方案中的一些中，其中包含的一个或多个靶向核苷酸类似物中的至少一个由如本说明书别处所述的式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0140]
因此，在根据本公开文本的双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸的一些实施方案中，所述反义链寡核苷酸包含如本说明书别处所述的一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0141]
式(i-b)的靶向核苷酸类似物可以存在于根据本公开文本的双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸中的各种位置。
[0142]
在一些实施方案中，式(i-b)的靶向核苷酸类似物位于反义寡核苷酸链的3
’‑
突出端或5
’‑
突出端，诸如位于sirna的反义链寡核苷酸的3
’‑
突出端或5
’‑
突出端。
[0143]
在一些优选的实施方案中，式(i-b)的靶向核苷酸类似物位于dsrna诸如sirna的突出端。例如，式(i-b)的靶向核苷酸类似物位于sirna的反义链寡核苷酸的突出端，诸如3
’‑
突出端。
[0144]
在一些实施方案中，根据本公开文本的双链寡核苷酸的反义链寡核苷酸中存在2至10个(例如，2至5个)式(i-b)的靶向核苷酸类似物。如本文所用，2至10个式(i-b)的靶向核苷酸类似物涵盖2、3、4、5、6、7、8、9和10个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。双链寡核苷酸的有义链的实施方案
[0145]
在一些实施方案中，根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸不包含任何经修饰的式(i-a)的核苷酸。在这些实施方案中的一些中，如本文所述双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸可以包含一个或多个不同于式(i-a)的核苷酸类似物的经修饰的核苷酸，诸如甲氧基或氟修饰的核苷酸。
[0146]
在其他实施方案中，根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。在一些实施方案中，根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物，所述式(i-a)的核苷酸类似物可以位于其5
’‑
突出端、其3
’‑
突出端、其杂交区中、或位于有义链寡核苷酸中的这些位置中的两个或更多个。
[0147]
在如本文所述的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸的具体实施方案中，式(i-a)的核苷酸类似物位于所述有义链寡核苷酸的3
’‑
突出端、5
’‑
突出端、或3
’‑
突出端和5
’‑
突出端两者。在这些具体实施方案中的一些中，式(i-a)的核苷酸类似物单独地位于dsrna的有义链寡核苷酸的3
’‑
突出端，诸如单独地位于sirna的核酸链的3
’‑
突出端。
[0148]
在这些具体实施方案中的一些中，式(i-a)的核苷酸类似物位于(i)sirna的有义链寡核苷酸的3
’‑
突出端和5
’‑
突出端两者。
[0149]
在一些实施方案中，根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸中存在2至10个(例如，2至5个)式(i-a)的核苷酸类似物。如本文所用，2至10个式(i-a)的核苷酸类似物涵盖2、3、4、5、6、7、8、9和10个式(i-a)的核苷酸类似物，所述式(i-a)的核苷酸类似物可以位于其5
’‑
突出端、其3
’‑
突出端、其杂交区、或位于有义链寡核苷酸中的这些位置中的两个或更多个。
[0150]
包含靶向核苷酸的有义链的实施方案
[0151]
在根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸的一些实施方案中，所述有
义链寡核苷酸进一步包含一个或多个靶向核苷酸类似物。
[0152]
在这些实施方案中的一些中，其中包含的一个或多个靶向核苷酸类似物中的至少一个由如本说明书别处所述的式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0153]
因此，在根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链寡核苷酸包含如本说明书别处所述的一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0154]
如本文实施例所说明，式(i-b)的靶向核苷酸类似物可以存在于根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸中的各种位置。
[0155]
在一些实施方案中，式(i-b)的靶向核苷酸类似物位于有义寡核苷酸链的3
’‑
突出端或5
’‑
突出端，诸如位于sirna的有义链寡核苷酸的3
’‑
突出端或5
’‑
突出端。
[0156]
在一些优选的实施方案中，式(i-b)的靶向核苷酸类似物位于dsrna诸如sirna的突出端。例如，式(i-b)的靶向核苷酸类似物位于sirna的有义链寡核苷酸的突出端，诸如5
’‑
突出端。
[0157]
在一些实施方案中，根据本公开文本的双链寡核苷酸的有义链寡核苷酸中存在2至10个(例如，2至5个)式(i-b)的靶向核苷酸类似物。如本文所用，2至10个式(i-b)的靶向核苷酸类似物涵盖2、3、4、5、6、7、8、9和10个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0158]
在一些实施方案中，所述有义链寡核苷酸包含(i)一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物和(ii)一个或多个式(i-b)的核苷酸类似物。在这些实施方案中的一些中，有义链寡核苷酸中包含的一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物由式(i-a)的杂交核苷酸类似物组成，即在其中存在5
’‑
突出端、3
’‑
突出端、或5
’‑
突出端和3
’‑
突出端两者的实施方案中，由不位于有义链寡核苷酸的5
’‑
突出端也不位于3
’‑
突出端的式(i-a)的核苷酸类似物组成。在这些实施方案中的一些中，有义链寡核苷酸还在5
’‑
突出端、3
’‑
突出端、或5
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突出端和3
’‑
突出端两者中包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物。
[0159]
双链寡核苷酸的其他特征
[0160]
考虑到(i)其中包含的大多数核苷酸单体单元中所含的核糖部分和(ii)其中包含的核碱基的种类，包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物的双链寡核苷酸可以称为“核糖核酸”或“rna”。因此，本公开文本的某些方面涉及靶向目的mrna的双链核糖核酸(dsrna)分子。本发明的dsrna可以包含经修饰的寡核苷酸，其包含一个或多个式(i-a)的化合物。
[0161]
在一些实施方案中，dsrna包含两条链，包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中第一链和第二链充分互补以形成双链体结构。在一些实施方案中，有义链包含与反义链中的第二序列基本互补或完全互补的第一序列。在一些实施方案中，反义链中的第二序列与靶序列，例如从靶基因转录的mrna序列基本上互补或完全互补。
[0162]
在一些实施方案中，每条有义链和反义链的长度范围可以为从9-36个核苷酸。例如，每条链可以具有12-30个核苷酸之间的长度、14-30个核苷酸之间的长度、15-30个核苷酸之间的长度、25-30个核苷酸之间的长度、27-30个核苷酸之间的长度、15-26个核苷酸之间的长度、15-23个核苷酸之间的长度、15-22个核苷酸之间的长度、15-21个核苷酸的长度、15-20个核苷酸之间的长度、15-19个核苷酸之间的长度、15-18个核苷酸之间的长度、15-17个核苷酸之间的长度、17-30个核苷酸之间的长度、17-23个核苷酸之间的长度、17-21个核苷酸的长度、17-19个核苷酸之间的长度、18-30个核苷酸之间的长度、18-26个核苷酸之间
的长度、18-25个核苷酸之间的长度、18-23个核苷酸之间的长度、18-22个核苷酸之间的长度、18-21个核苷酸的长度、18-20个核苷酸之间的长度、19-30个核苷酸之间的长度、19-25个核苷酸之间的长度、19-24个核苷酸之间的长度、19-23个核苷酸之间的长度、19-22个核苷酸之间的长度、19-21个核苷酸的长度、19-20个核苷酸之间的长度、20-30个核苷酸之间的长度、20-26个核苷酸之间的长度、20-25个核苷酸之间的长度、20-24个核苷酸之间的长度、20-23个核苷酸之间的长度、20-22个核苷酸之间的长度、20-21个核苷酸的长度、21-30个核苷酸之间的长度、21-26个核苷酸之间的长度、21-25个核苷酸之间的长度、21-24个核苷酸之间的长度、21-23个核苷酸之间的长度、或21-22个核苷酸之间的长度。在一些实施方案中，每条链的长度大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。在一些实施方案中，每条链的长度小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸。即，每条链可以具有上限为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36并且独立选择的下限为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的核苷酸长度的范围中任一个，其中下限小于上限。在一些实施方案中，每条链的长度是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链具有相同核苷酸数量的长度。在一些实施方案中，有义链和反义链具有不同核苷酸数量的长度。
[0163]
突出端
[0164]
在一些实施方案中，本公开文本的dsrna在有义链和反义链之一或两者的3
’‑
末端、5
’‑
末端或两个末端包含一个或多个突出端。在一些实施方案中，所述一个或多个突出端改善了稳定性，其中突出端中硫代磷酸酯基团的数量较少。
[0165]
在一些实施方案中，突出端包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个核苷酸。例如，突出端可以包含1-8个核苷酸、2-8个核苷酸、3-8个核苷酸、4-8个核苷酸、5-8个核苷酸、1-5个核苷酸、2-5个核苷酸、3-5个核苷酸、4-5个核苷酸、1-4个核苷酸、2-4个核苷酸、3-4个核苷酸、1-3个核苷酸、2-3个核苷酸、或1-2个核苷酸。在一些实施方案中，突出端的长度为一、二、三、四、五或六个核苷酸。
[0166]
在一些实施方案中，本公开文本的突出端包含一个或多个核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开文本的突出端包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，突出端包含一个或多个胸腺嘧啶。在一些实施方案中，dsrna包含位于反义链的3’末端的突出端。在一些实施方案中，dsrna包含位于反义链的5’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于反义链的3’末端的突出端和位于反义链的5’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于有义链的3’末端的突出端。在一些实施方案中，dsrna包含位于有义链的5’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于有义链的3’末端的突出端和位于有义链的5’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于dsrna的有义链和反义链的3’末端两者的突出端。
[0167]
在一些实施方案中，dsrna包含位于反义链的5’末端的突出端。在一些实施方案中，dsrna包含位于反义链的3’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于反义链的5’末端的突出端和位于反义链的3’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于有义
链的5’末端的突出端。在一些实施方案中，dsrna包含位于有义链的3’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于有义链的5’末端的突出端和位于有义链的3’末端的平末端。在一些实施方案中，dsrna包含位于dsrna的两条链的突出端。
[0168]
在一些实施方案中，突出端是有义链长于反义链的结果。在一些实施方案中，突出端是反义链长于有义链的结果。在一些实施方案中，突出端是相同长度的有义链和反义链交错的结果。在一些实施方案中，突出端与靶mrna形成错配。在一些实施方案中，突出端与靶mrna互补。
[0169]
在一些实施方案中，本公开文本的dsrna含有包含第一序列的有义链和包含第二序列的反义链，其中第一序列和第二序列基本上互补或互补。在一些实施方案中，第一序列和第二序列基本上互补或互补并且形成dsrna的双链体区。在一些实施方案中，dsrna的双链体区具有9-36个核苷酸对的长度。例如，双链体区可以具有12-30个核苷酸对之间的长度、14-30个核苷酸对之间的长度、15-30个核苷酸对之间的长度、15-26个核苷酸对之间的长度、15-23个核苷酸对之间的长度、15-22个核苷酸对之间的长度、15-21个核苷酸对之间的长度、15-20个核苷酸对之间的长度、15-19个核苷酸对之间的长度、15-18个核苷酸对之间的长度、15-17个核苷酸对之间的长度、17-30个核苷酸对之间的长度、27-30个核苷酸对之间的长度、17-23个核苷酸对之间的长度、17-21个核苷酸对之间的长度、17-19个核苷酸对之间的长度、18-30个核苷酸对之间的长度、18-26个核苷酸对之间的长度、18-25个核苷酸对之间的长度、18-24个核苷酸对之间的长度、18-23个核苷酸对之间的长度、18-22个核苷酸对之间的长度、18-21个核苷酸对之间的长度、18-20个核苷酸对之间的长度、19-30个核苷酸对之间的长度、19-25个核苷酸对之间的长度、19-24个核苷酸对之间的长度、19-23个核苷酸对之间的长度、19-22个核苷酸对之间的长度、19-21个核苷酸对之间的长度、19-20个核苷酸对之间的长度、20-30个核苷酸对之间的长度、20-26个核苷酸对之间的长度、20-25个核苷酸对之间的长度、20-24个核苷酸对之间的长度、20-23个核苷酸对之间的长度、20-22个核苷酸对之间的长度、20-21个核苷酸对之间的长度、21-30个核苷酸对之间的长度、21-26个核苷酸对之间的长度、21-25个核苷酸对之间的长度、21-24个核苷酸对之间的长度、21-23个核苷酸对之间的长度、或21-22个核苷酸对之间的长度。在一些实施方案中，dsrna的双链体区的长度大于或等于9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸对。在一些实施方案中，dsrna的双链体区的长度小于或等于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸对。即，dsrna的双链体区可以具有上限为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36并且独立选择的下限为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35的核苷酸对长度的范围中的任一个，其中下限小于上限。在一些实施方案中，双链体区具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸对的长度。如果使用多于一个dsrna，则每个dsrna的双链体区域可以具有与一个或多个另外的dsrna相同或不同的长度。
[0170]
靶向双链寡核苷酸的实施方案
[0171]
如本公开文本先前所述，在双链寡核苷酸中，反义链寡核苷酸、有义链寡核苷酸或反义链寡核苷酸和有义链寡核苷酸两者可以包含一个或多个靶向核苷酸。在一些实施方案
中，反义链寡核苷酸、有义链寡核苷酸或反义链寡核苷酸和有义链寡核苷酸两者可以包含一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0172]
因此，在一些实施方案中，根据本公开文本的靶向双链寡核苷酸包含一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0173]
在一些其他实施方案中，包含在根据本公开文本的靶向双链寡核苷酸中的靶向核苷酸选自本领域已知的靶向核苷酸。
[0174]
因此，在一些实施方案中，根据本公开文本的靶向双链寡核苷酸包含一个或多个式(i-a)的非靶向核苷酸类似物和一个或多个结构不同于式(i-b)的靶向核苷酸。
[0175]
根据这些实施方案中的一些，靶向双链寡核苷酸可以包含(i)包含一个或多个靶向核苷酸的有义链寡核苷酸，其涵盖一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物，和(ii)非靶向反义链寡核苷酸，即不包含靶向核苷酸的反义链寡核苷酸。根据这些实施方案中的其他一些，靶向双链寡核苷酸可以包含(i)不包含靶向核苷酸的非靶向有义链寡核苷酸，和(ii)包含一个或多个靶向核苷酸的靶向反义链寡核苷酸，所述靶向核苷酸涵盖一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。根据再其他的实施方案，靶向双链寡核苷酸可以包含(i)包含一个或多个靶向核苷酸的有义链寡核苷酸，所述靶核苷酸涵盖一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物；和包含一个或多个靶向核苷酸的靶向反义链寡核苷酸，所述靶向核苷酸涵盖一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物。
[0176]
在一些实施方案中，根据本公开文本的靶向双链寡核苷酸包含：
[0177]
有义链寡核苷酸，所述有义链寡核苷酸包含(i)一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物，和(ii)一个或多个式(i-b)的核苷酸类似物，以及
[0178]
反义链寡核苷酸，所述反义链寡核苷酸包含一个或多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物，即当所述反义链寡核苷酸中存在一个或两个突出端时，既不位于5
’‑
突出端也不位于3
’‑
突出端的一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物。在一些实施方案中，在其中存在一个或两个这些突出端的实施方案中，所述反义链寡核苷酸在其5
’‑
突出端或3
’‑
突出端进一步包含一个或多个式(i-a)的核苷酸类似物。
[0179]
如本公开文本的别处所公开，式(i-b)的靶向核苷酸类似物具有基团r3作为细胞靶向部分。细胞靶向部分公开在本公开文本的别处。
[0180]
在具体实施方案中，所述一个或多个式(i-b)的靶向核苷酸类似物彼此连接，从而在寡核苷酸链的选定末端形成这些靶向核苷酸类似物的连续链，即在选定反义链寡核苷酸中或选定有义链寡核苷酸中，所述一个或多个式(i-b)的核苷酸类似物是连续的。
[0181]
双链寡核苷酸的另外的实施方案
[0182]
出于说明的目的并且不限制本公开文本，双链寡核苷酸还可以包含在经修饰的有义链和/或反义链上的一个或多个其他核苷酸。
[0183]
修饰可以选自用核酸或碱基类似物的取代或插入以及碱基、糖或磷酸酯部分的化学修饰。选择的修饰可以各自且单独地选自3
’‑
末端脱氧-胸腺嘧啶、2
’‑
o-甲基、2
’‑
脱氧修饰、2
’‑
脱氧-氟、2
’‑
氨基修饰、2
’‑
烷基修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰、5
’‑
硫代磷酸酯基团修饰、5
’‑
磷酸酯或5
’‑
磷酸酯模拟修饰和胆固醇衍生物或十二烷酸双癸基酰胺基团修饰，和/或修饰的核苷酸可以是锁核苷酸、脱碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一种。优选实施方案之一可以是至少一个修饰是2
’‑
o-甲基和/或至少一个修饰是2
’‑
脱氧-氟。
[0184]
如本文所用，经修饰的寡核苷酸的其他例子可以包括以下中的一种或多种：一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的修饰，例如替代；磷酸酯部分的替代；天然存在的碱基的修饰或替代；核糖-磷酸酯骨架的替代或修饰；rna的3
’‑
末端或5
’‑
末端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或替代或部分(例如，萤光标记的部分)与rna的3
’‑
末端或5
’‑
末端的缀合。
[0185]
靶向寡核苷酸-细胞靶向部分的另外的实施方案
[0186]
本文的靶向核苷酸可以与一个或多个靶向特定细胞或组织的配体连接。此类配体也称为“细胞靶向部分”。配体涵盖使所得寡核苷酸(诸如sirna)递送到细胞中的效率增加的任何分子基团，例如通过改善特异性细胞靶向、改善寡核苷酸的细胞内化和/或改善细胞内mrna靶向。配体可以选自包含以下的组：受体特异性肽、受体特异性蛋白(例如，单克隆抗体或融合蛋白)和受体特异性小分子配体(例如，碳水化合物，诸如galnac基团)。
[0187]
配体可以是天然存在的或重组的或合成的。例如，配体可以是蛋白质、碳水化合物、脂多糖、脂质、合成聚合物、多胺、α螺旋肽、凝集素、维生素或辅因子。在一些实施方案中，配体是一种或多种染料、交联剂、多环芳族烃、肽缀合物(例如，rgd肽、触角足(antennapedia)肽、tat肽)、聚乙二醇(peg)、酶、半抗原、转运/吸收促进剂、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺或咪唑簇)、人血清白蛋白(hsa)或ldl。
[0188]
举例而言，配体可以是对共配体具有特定亲和力的一种或多种蛋白质、糖蛋白、肽或分子。此类配体可以包括促甲状腺素、促黑素、糖蛋白、表面活性蛋白a、粘蛋白碳水化合物、乳糖(例如，多价乳糖)、半乳糖(例如，多价半乳糖)、n-乙酰基-半乳糖胺(例如，多价n-乙酰基-半乳糖胺)、n-乙酰基-葡糖胺(例如，多价n-乙酰基-葡糖胺)、甘露糖(例如，多价甘露糖)、岩藻糖(例如，多价岩藻糖)、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素b12和生物素。
[0189]
在一些实施方案中，细胞靶向部分是一种或多种染料、交联剂、多环芳族烃、肽缀合物(例如，触角足肽、tat肽)、聚乙二醇(peg)、酶、半抗原、转运/吸收促进剂、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺或咪唑簇)、人血清白蛋白(hsa)或ldl。
[0190]
在一些实施方案中，配体可以是一种或多种胆固醇衍生物或亲脂性部分。任何亲脂性化合物可以包括但不限于胆固醇或胆固醇衍生物；胆酸；维生素(例如，叶酸、维生素a、维生素e(生育酚)、生物素、吡哆醛；胆汁酸或脂肪酸缀合物(包括饱和的和不饱和的(诸如月桂酰基(c12)、肉豆蔻酰基(c14)和棕榈酰基(c16)、硬脂酰基(c18)和二十二烷基(c22))、石胆酸和/或石胆酸油胺缀合物(石胆酸-油烯基，c43)；聚合物骨架或支架(诸如peg、三甘醇(teg)、六甘醇(heg)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(plga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plg)、流体动力聚合物；类固醇(诸如二氢睾酮)；萜烯(诸如三萜烯)；阳离子脂质或肽；和/或脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子可以结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(hsa)。基于脂质的配体可以用于调节(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与hsa结合更强的脂质或基于脂质的配体将不太可能靶向肾脏并且因此不太可能从体内清除。靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。
[0191]
聚氨基酸、转铁蛋白、细胞靶向配体或部分也可以是与特定细胞类型诸如肝细胞上的受体结合的抗体。示例性的细胞受体特异性单克隆抗体是以下公开的那些：xia等人
(2009,mol pharm,63(3):747-751)；cuellar等人(2015,nucleic acids research,43(2):1189-1203)；等人(2016,nat protocol,11(1):22-36)；ibtejah等人(2017,clin immunol,176:122-130)；和sugo等人(2016,j control release,237:1-13)。
[0192]
细胞靶向配体或部分还涵盖单价或多价(例如，三价)galnac基团，诸如以下公开的那些：prakash等人(2015,bioorg med chem lett,25(19):4127-4130)；zu等人(2016,mol ther-nucleic acids,e317,doi:10.1038/mnta.2016.26)；zimmermann等人(2017,mol ther,25(1):71-78)；shemesh等人(2016,mol ther nucleic acids,5:e319-doi:10.1038/mnta.2016.31)；huang等人(2016,mol ther-nucleic acids,6:116-132)；rozema等人(2007,proc natl acad sci usa,104(32):12982-12987)；rajeev等人(2015,chembiochem,16(6):903-908)；和nair等人(2014,j am chem soc,136(49):16958-16961)。
[0193]
经修饰的dsrna的制备
[0194]
本公开文本的dsrna可以化学/物理地连接至一种或多种配体、部分或缀合物。在一些实施方案中，dsrna通过接头缀合/附接到一个或多个配体。可以使用本领域已知的任何接头，包括例如多价分支接头。配体与dsrna的缀合可以改变其分布，增强其细胞吸收和/或靶向特定组织和/或被一种或多种特定细胞类型(例如，肝细胞)摄取，和/或增长dsrna剂的寿命。在一些实施方案中，疏水性配体与dsrna缀合以促进直接渗透穿过细胞膜和/或被细胞(例如，肝细胞)摄取。
[0195]
在dsrna缀合物的一些实施方案中，一个或多个核苷酸可以包含带有靶向部分的基团，诸如一个或多个核苷酸包含带有靶向部分的基团，其中靶向部分可能通过连接基团与核苷酸骨架共价连接。根据这些实施方案，dsrna的一个或多个核苷酸与包含靶向部分的带有靶向部分的基团缀合，并且其中靶向部分可以是增强组合物的细胞内递送的配体(例如，细胞穿透部分或试剂)。
[0196]
本公开文本的配体缀合的dsrna和带有序列特异性连接的核苷和核苷酸的配体-分子可以通过本领域已知的任何方法组装，包括例如，通过在合适的dna合成仪上使用标准核苷酸前体、或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、配体-核苷酸、或已经带有配体分子的核苷缀合前体、或带有非核苷配体的构建块进行组装。
[0197]
本公开文本的配体缀合dsrna可以通过本领域已知的任何方法合成，包括例如，通过使用带有侧基反应性官能团(诸如源自连接分子在dsrna上的连接的反应性官能团)的dsrna。在一些实施方案中，这种反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体、或具有与其附接的连接部分的配体反应。在一些实施方案中，所述方法通过使用已与配体适当缀合并且可以进一步附接到固体支持材料的核苷单体促进配体缀合dsrna的合成。在一些实施方案中，通过以下方式制备带有附接到dsrna的3
’‑
末端的芳烷基配体的dsrna：首先通过氨基烷基将单体构建块共价附接到可控孔度玻璃支持物上；然后，通过标准固相合成技术将核苷酸结合到与固体支持物结合的单体构建块上。单体结构单元可以是核苷或与固相合成相容的其他有机化合物。
[0198]
式(i-a)和(i-b)的核苷酸类似物的前体
[0199]
可以从在本文中可以称为核苷酸类似物前体的前体化合物开始合成式(i-a)和(i-b)的核苷酸类似物。
[0200]
式(i-a)和(i-b)的核苷酸类似物两者可以从其对于的下式(ii)的前体化合物来合成。
[0201]
如将容易理解的，式(i-a)的核苷酸类似物可以从下式(ii-a)的核苷酸类似物前体开始来制备，其中基团r3不由细胞靶向部分组成。此外，式(i-b)的核苷酸类似物可以从下式(ii-b)的核苷酸类似物前体开始来制备，其中基团r3由细胞靶向部分组成。
[0202]
本公开文本还描述了通式(ii)的核苷酸类似物前体
[0203][0204]
其中：
[0205]-b是杂环核碱基；
[0206]-p1和p2各自独立地是h、反应性磷基团或保护基团；
[0207]-y是o、nh、nr1或n-c(＝o)-r1，其中r1是：
[0208]
·
(c
1-c
20
)烷基，其任选地未经取代或被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基、(c5-c14)杂芳基、-o-z1、-n(z1)(z2)、-s-z1、-cn、-c(＝j)-o-z1、-o-c(＝j)-z1、-c(＝j)-n(z1)(z2)和-n(z1)-c(＝j)-z2，其中
[0209]
j是o或s，
[0210]
z1和z2各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0211]
·
(c3-c8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，或
[0212]
·
基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，其中
[0213]
m是意指0或1的整数，
[0214]
p是范围为从0至10的整数，
[0215]
r2是任选地被以下取代的(c1-c20)亚烷基：(c1-c6)烷基、-o-z3、-n(z3)(z4)、-s-z3、-cn、-c(＝k)-o-z3、-o-c(＝k)-z3、-c(＝k)-n(z3)(z4)、-n(z3)-c(＝k)-z4，其中
[0216]
k是o或s，
[0217]
z3和z4各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0218]
以及
[0219]
r3选自氢原子、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基或(c5-c14)杂芳基，
[0220]
或
[0221]
r3是细胞靶向部分，
[0222]-x1和x2各自独立地是氢原子、-(c1-c6)烷基，以及
[0223]-ra、rb、rc和rd各自独立地是h或(c1-c6)烷基。
[0224]
出于本公开文本的目的，术语“核苷酸前体”涵盖式(ii)的化合物。出于本公开文本的目的，术语“靶向核苷酸前体”涵盖式(ii)的化合物，其中基团r3存在且表示细胞靶向部分。
[0225]
本文公开的式(i)(诸如(i-a)和(i-b))和(ii)的化合物涵盖异构体，诸如其立体异构体，所述立体异构体包括其(2s,6r)立体异构体和其(2r,6r)立体异构体，如下式中具体描述，其指定式(i)和(ii)的化合物的位置编号和手性中心并且在下文中对式(i)和(ii)的化合物进行说明：
[0226][0227]
如将在本文实施例中所示，当掺入寡核苷酸中时，式(i)的化合物的(2s,6r)立体异构体和式(i)的化合物的(2r,6r)立体异构体被赋予产生允许良好抑制靶mrna的sirna的能力。
[0228]
然而，在本公开文本的双链寡核苷酸(诸如sirna)的一些实施方案中，具有构型(2r,6r)的式(i-a)的核苷酸类似物的立体异构体是优选的。
[0229]
如本文的一些实施例中所示，当核苷酸类似物(i-a)如本文所指定作为杂交核苷酸类似物掺入，例如掺入sirna的反义链寡核苷酸的杂交区中并且在一些实施方案掺入sirna的有义链寡核苷酸的杂交区中时，在双链寡核苷酸中使用由其(2r,6r)立体异构体组成的式(i-a)的核苷酸类似物允许与对应的(2s,6r)立体异构体相比所述双链寡核苷酸(例如，sirna)的体内效力更好。
[0230]
在在本文中可称为“二噁烷类似物”的式(ii)的化合物的一些实施方案中，y是o。当b由胸苷基组成时，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb1，其中b如式(ii)中所定义，例如pre-lt1。
[0231]
在本文可称为“吗啉代类似物”的式(ii)的化合物的其他实施方案中，y是nh、nr1或n-c(＝o)r1。
[0232]
在式(ii)的吗啉代类似物中，氮原子优选被官能化，以便改善所得的含吗啉代类似物的寡核苷酸并且尤其是所得的含吗啉代类似物的sirna的特性。
[0233]
在式(ii)的化合物的一些实施方案中，所述化合物是不包含细胞靶向部分的本公开文本吗啉代类似物。根据这些实施方案，基团r3(当存在时)不表示细胞靶向部分。
[0234]
因此，在式(ii)的吗啉代类似物的一些优选实施方案中，y是nh、nr1或n-c(＝o)-r1，其中r1如通式(ii)所定义。
[0235]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是：
[0236]
·
(c1-c20)烷基，其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基、(c5-c14)杂芳基、-o-z1、-n(z1)(z2)、-s-z1、-cn、-c(＝j)-o-z1、-o-c(＝j)-z1、-c(＝j)-n(z1)(z2)和-n(z1)-c(＝j)-z2，其中
[0237]
j是o或s，并且
[0238]
z1和z2各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，或
[0239]
·
(c3-c8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0240]
·
基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，其中
[0241]
m是意指0或1的整数
[0242]
p是范围为从0至10的整数
[0243]
r2是任选地被以下取代的(c1-c20)亚烷基：(c1-c6)烷基、-o-z3、-n(z3)(z4)、-s-z3、-cn、-c(＝k)-o-z3、-o-c(＝k)-z3、-c(＝k)-n(z3)(z4)、-n(z3)-c(＝k)-z4，其中
[0244]
k是o或s，
[0245]
z3和z4各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0246]
以及
[0247]
r3选自氢原子、(c1-c6)-烷基、(c1-c6)-烷氧基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基或(c5-c14)杂芳基，
[0248]
x1和x2各自独立地是氢原子、(c1-c6)烷基
[0249]
ra、rb、rc和rd各自独立地是h或(c1-c6)烷基。
[0250]
如本文意图，可以是未经取代的烷基或经取代的烷基的(c1-c20)烷基包括c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19和c20烷基。
[0251]
如本文意图，可以是未经取代的烷基或经取代的烷基的(c1-c6)烷基包括c1、c2、c3、c4、c5和c6烷基。
[0252]
如本文意图，可以是未经取代的环烷基或经取代的环烷基的(c3-c8)环烷基包括c3、c4、c5、c6、c7和c8环烷基。
[0253]
如本文意图，可以是未经取代的或经取代的杂环的(c3-c14)杂环包括c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13和c14杂环。
[0254]
如本文意图，可以是未经取代的芳基或经取代的芳基的(c6-c14)芳基包括c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13和c14芳基。
[0255]
如本文意图，可以是未经取代的杂芳基或经取代的杂芳基的(c5-c14)杂芳基包括c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13和c14杂芳基。
[0256]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的一些实施方案中，r1是任选经取代的(c1-c20)烷基，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b如通式(ii)所定义。
[0257]
在其中y是nr1的这些实施方案中的一些中，r1是未经取代的(c1-c20)烷基。
[0258]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是未经取代的(c1-c16)烷基，其包含选自包
含以下的组的烷基：甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有与对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0259]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是甲基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb2，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt2，其中b由胸苷基组成。
[0260]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是异丙基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb3，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt3，其中b由胸苷基组成；pre-lu3，其中b由尿嘧啶组成；pre-lg3，其中b由鸟嘌呤基组成；pre-lc3，其中b由胞嘧啶基组成；和pre-la3，其中b由腺嘌呤基组成。
[0261]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是丁基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb6，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt6，其中b由胸苷基组成。
[0262]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是辛基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb7，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt7，其中b由胸苷基组成。
[0263]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是直链c16-烷基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb8，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt8，其中b由胸苷基组成。
[0264]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的另外的实施方案中，r1是如通式(ii)中所定义取代的(c1-c20)烷基，其包括如通式(ii)中所定义取代的c1、c2或c3烷基。
[0265]
在这些另外的实施方案中的一些中，r1是被一个或多个选自以下的基团取代的(c1-c20)烷基：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基和(c5-c14)杂芳基，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0266]
在这些另外的实施方案中的一些中，r1是被(c6-c14)芳基取代的(c1-c20)烷基，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0267]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的一些实施方案中，r1是被(c6-c14)芳基取代的(c1-c20)烷基。这些实施方案涵盖式(ii)的化合物，其中y是nr1，r1是被芳基取代的亚甲基。这些实施方案还涵盖式(ii)的化合物，其中y是nr1，r1是被苯基取代的(c1-c20)烷基。
[0268]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的一些实施方案中，r1是被未经取代的苯基取代的甲基，ra、rb、rc、rd、x1和x2各自是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)中所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb5，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt5，其中b由胸苷基组成。
[0269]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的另外的实施方案中，r1是任选地被一个或多个
选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代的(c3-c8)环烷基，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0270]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的这些另外的实施方案中的一些中，r1是环己基。
[0271]
在其中y是nr1的式(ii)的化合物的这些另外的实施方案中的一些中，r1是未经取代的环己基，ra、rb、rc、rd、x1、x2各自是氢原子，并且p1和p2如通式(ii)所定义。
[0272]
本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb4，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt4，其中b由胸苷基组成。
[0273]
在式(ii)的吗啉代类似物的一些其他实施方案中，y是n-c(＝o)-r1，其中r1是(c1-c20)烷基，其中任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基、(c5-c14)杂芳基、-o-z1、-n(z1)(z2)、-s-z1、-cn、-c(＝j)-o-z1、-o-c(＝j)-z1、-c(＝j)-n(z1)(z2)、-n(z1)-c(＝j)-z2，其中
[0274]
j是o或s，
[0275]
z1和z2各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，并且
[0276]
r1是任选地被一个或多个选自卤素原子或(c1-c6)烷基的基团取代的(c3-c8)环烷基，并且
[0277]
p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0278]
在其中y是n-c(＝o)-r1的一些实施方案中，r1是任选经取代的(c1-c20)烷基，其包含任选经取代的(c1-c15)烷基，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0279]
根据其中y是n-c(＝o)-r1的这些实施方案中的一些，r1选自包含甲基和十五烷基的组，并且p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0280]
这些实施方案涵盖式(ii)的化合物，其中y是n-c(＝o)-r1，r1是甲基、ra、rb、rc、rd、x1、x2各自表示氢原子，并且b、p1和p2如通式(ii)中所定义。
[0281]
本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb9，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸类似物的实施方案被称为pre-lt9，其中b由胸苷基组成。这些实施方案还涵盖式(ii)的化合物，其中y是n-c(＝o)-r1，r1是十五烷基、ra、rb、rc、rd、x1、x2各自表示氢原子，并且b、p1和p2如通式(ii)中所定义。本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lb10，其中b具有与通式(ii)中相同的含义；例如，本公开文本中此类核苷酸前体的实施方案被称为pre-lt10，其中b由胸苷基组成。
[0282]
在式(ii)的化合物中，b是杂环核碱基部分。如本文所用，术语“杂环核碱基”是指与二噁烷环或吗啉代环共价连接的任选经取代的含氮杂环。在一些实施方案中，杂环核碱基可以选自任选经取代的嘌呤碱基和任选经取代的嘧啶碱基。术语“嘌呤碱基”在本文中以其本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以其本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选经取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的例子包
括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。杂环碱基的其他非限制性例子包括二氨基嘌呤、8-氧代-n6烷基腺嘌呤(例如，8-氧代-n6甲基腺嘌呤)、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、n4,n
4-乙醇胞嘧啶、n
《6》
,n
《6》-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶)、假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、1,2,4-三唑-3-甲酰胺和美国专利号us 5,432,272和us 7,125,855中所述的其他杂环碱基，将所述专利出于公开另外的杂环碱基的有限目的通过引用并入本文。在一些实施方案中，杂环碱基可以任选地被一个或多个胺或烯醇保护基团取代。在一些实施方案中，b选自包含嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤的组，其氨基(当存在时)任选地被保护基团保护。
[0283]
在优选的实施方案中，b选自包含以下的组：腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶(即，腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、鸟嘌呤基和胞嘧啶基)。腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶任选地被胺保护基团保护。胺保护基团涵盖酰基，如例如苯甲酰基、苯乙酰基和异丁酰基-保护基团，或甲脒保护基团，如例如n,n-二甲基-甲脒。
[0284]
如前所提到的，在式(ii)的化合物中，基团p1和p2各自独立地是氢原子、反应性磷基团或保护基团。
[0285]
如本文所用，“反应性磷基团”是指包含在核苷酸单元或核苷酸类似物单元中并且可以通过亲核攻击反应与包含在另一个分子中并且尤其是在另一个核苷酸单元或另一个核苷酸类似物中的羟基或胺基反应的含磷基团。通常，此类反应产生将所述第一核苷酸单元或所述第一核苷酸类似物单元与所述第二核苷酸单元或所述第二核苷酸类似物单元连接的酯型核苷间连接。
[0286]
在一些实施方案中，反应性磷基团可以选自亚磷酰胺、h-膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯或磷酸酯模拟物，包括但不限于：天然磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷硫代磷酸酯、膦酸酯、卤素取代的膦酸酯和磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸二酯、硫代磷酸三酯、二磷酸酯和三磷酸酯。保护基团涵盖羟基-、胺-和亚磷酰胺保护基团，其可以选自包含以下的组：乙酰基(ac)、苯甲酰基(bzl)、苄基(bn)、异丁酰基(ibu)、苯乙酰基、苄氧基甲基乙缩醛(bom)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(mem)、甲氧基甲基醚(mom)、p-甲氧基苄基醚(pmb)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(piv)、四氢吡喃基(thp)、三苯甲基(trt)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基](mmt)、二甲氧基三苯甲基、[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基(dmt)、三甲基甲硅烷基醚(tms)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(tbdms)、三异丙基甲硅烷氧基甲基醚(tom)、三异丙基甲硅烷基醚(tips)、甲基醚、乙氧基乙基醚(ee)n,n-二甲基甲脒和2-氰基乙基(ce)。
[0287]
在其中y、b、ra、rb、rc、rd、x1和x2如通式(ii)所定义的式(ii)的化合物的一些实施方案中，p1或p2中的一个是o-4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基(dmt)并且p1和p2中的另一个是h、反应性磷基团或保护基团。
[0288]
在其中y、b、ra、rb、rc、rd、x1和x2如通式(ii)所定义的式(ii)的化合物的一些实施方案中，p1和p2中的一个是2-氰基乙基-n,n-二异丙基亚磷酰胺基团并且p1和p2中的另一个是保护基团。
[0289]
在其中y、b、ra、rb、rc、rd、x1和x2如通式(ii)所定义的式(ii)的化合物的一些实施方案中，p1和p2中的一个是2-氰基乙基-n,n-二异丙基亚磷酰胺基团并且p1和p2中的另
一个是o-4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基。
[0290]
此外，ra、rb、rc和rd各自独立地是h或(c1-c6)烷基，并且优选h或未经取代的(c
1-c6)烷基。
[0291]
如本文所用，(c1-c6)烷基涵盖选自包含以下的组的烷基：c1、c2、c3、c4、c5和c6烷基。
[0292]
在最优选的实施方案中，x1和x2均表示氢原子。
[0293]
在最优选的实施方案中，ra、rb、rc和rd均表示氢原子。
[0294]
包含式(ii)的化合物的靶向核苷酸类似物的实施方案
[0295]
如本文先前所指定，本公开文本涵盖式(ii)的化合物，其中：
[0296]-b是杂环核碱基；
[0297]-p1和p2各自独立地是h、反应性磷基团或保护基团；
[0298]-y是nr1，其中r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，其中
[0299]
m是意指0或1的整数，
[0300]
p是范围为从0至10的整数，
[0301]
r2是任选地被以下取代的(c1-c20)亚烷基：(c1-c6)烷基、-o-z3、-n(z3)(z4)、-s-z3-cn、-c(＝k)-o-z3、-o-c(＝k)-z3、-c(＝k)-n(z3)(z4)、-n(z3)-c(＝k)-z4，其中
[0302]
k是o或s，
[0303]
z3和z4各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0304]
以及
[0305]
r3是细胞靶向部分，
[0306]-x1和x2各自独立地是氢原子、(c1-c6)烷基，以及
[0307]-ra、rb、rc和rd各自独立地是h或(c1-c6)烷基。
[0308]
这些式(ii)的化合物涵盖在本公开文本中可称为“靶向核苷酸前体”的更一般化合物家族中。其中基团r3存在并且表示细胞靶向部分的此类式(ii)的化合物在本公开文本中可以称为“式(ii)的靶向核苷酸前体”或“靶向核苷酸前体(ii)”。
[0309]
不包含表示细胞靶向部分的基团r3的式(ii)的化合物不是靶向核苷酸前体并且在本公开文本中被称为“式(ii)的非靶向核苷酸前体”或“非靶向核苷酸前体(ii)”。
[0310]
在式(ii)的靶向核苷酸前体的一些实施方案中，r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，m是0，p是0，r3是细胞靶向部分，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和r2是如式(ii)的化合物的一般定义中的。在一些实施方案中，r2是亚乙基，并且x1和x2都是氢原子。在这些实施方案中的其他一些中，r2是亚戊基，并且x1和x2都是氢原子。在一些实施方案中，r2是(c12)亚烷基，并且x1和x2都是氢原子。
[0311]
在式(ii)的化合物的一些实施方案中，r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，m是0，p是选自1、2、3和4的整数，r3是细胞靶向部分，并且b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和r2是如式(ii)的化合物的一般定义中的。在一些实施方案中，r2是亚乙基，p是1，并且x1和x2都是氢原子。在一些实施方案中，r2是亚乙基，p是2，并且x1和x2都是氢原子。在一些实施方案中，r2是亚乙基，p是3，并且x1和x2都是氢原子。在一些实施方案中，r2是亚乙基，p是4，并且x1和x2都是氢原子。
[0312]
在式(ii)的化合物的一些实施方案中，r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，m是1，p是0，r3是细胞靶向部分，并且r2、b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1,x2,是如式(ii)的化合物的一般定义中的。在这些实施方案中的一些中，r2是亚丁基，x1和x2各自表示氢原子，并且b、p1、p2、ra、rb、rc和rd如通式(ii)所定义。在这些实施方案中的又一些中，r2是(c11)亚烷基，x1和x2均表示氢原子，并且b、p1、p2、ra、rb、rc和rd如通式(ii)所定义。)在这些实施方案中的再又一些中，r2是亚甲基，x1和x2均表示氢原子，并且b、p1、p2、ra、rb、rc和rd如通式(ii)所定义。
[0313]
在式(ii)的化合物的一些实施方案中，其中r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，m是1，p选自由1和2组成的整数组，r3是细胞靶向部分，r2、b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2是如式(ii)的化合物的一般定义中的。在这些实施方案中的一些中，r2是亚甲基，p是2，r3是细胞靶向部分，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2如通式(ii)所定义。在这些实施方案中的其他一些中，r2是亚甲基，p是1，r3是细胞靶向部分，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2如通式(ii)所定义。
[0314]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，ra、rb、rc和rd是氢原子。
[0315]
通常，基团r3涵盖本领域已知的任何细胞靶向部分，包括本公开文本中指定的任何细胞靶向部分，其包括为描述本公开文本中靶寡核苷酸而指定的细胞靶向部分。
[0316]
在式(ii)的化合物的一些实施方案中，r3具有式(iii)
[0317][0318]
其中
[0319]
a1、a2和a3是oh或o-c(＝o)-r4，其中r4是(c1-c6)-烷基或(c6-c10)-芳基。
[0320]
a4是oh、o-c(＝o)-r4、nhc(＝o)-r5，其中r4如上所定义并且r5是(c1-c6)-烷基，任选地被卤素原子取代。
[0321]
在一些优选的实施方案中，a1、a2和a3是o-c(＝o)-r4，其中r4是(c1-c6)-烷基或(c6-c10)-芳基。
[0322]
在一些优选的实施方案中，a1、a2和a3是o-c(＝o)-r4，r4是甲基或苯基。
[0323]
在一些优选实施方案中，a1、a2和a3是o-c(＝o)-r4，并且r4是甲基。
[0324]
在一些优选的实施方案中，a4是o-c(＝o)-r4或nhc(＝o)-r5，其中r4是(c1-c6)烷基或(c6-c10)-芳基并且r5是(c1-c6)-烷基，任选地被卤素原子取代。
[0325]
在一些优选的实施方案中，a1、a2和a3是o-c(＝o)-r4，其中r4是甲基并且a4是o-c(＝o)-r4或nhc(＝o)-r5，其中r4和r5各自是甲基。
[0326]
在一些优选的实施方案中，r3是式(iii-a)的3,4,6-三-o-乙酰基-d-n-乙酰基半乳糖胺：
[0327][0328]
本公开文本还涉及包含一个或多个核苷酸类似物的寡核苷酸，所述含一个或多个核苷酸类似物通过使用作为本文指定的式(ii)的化合物的核苷酸类似物前体而引入寡核苷酸中。
[0329]
本公开文本涉及单链寡核苷酸以及双链寡核苷酸并且尤其是sirna，其包含一个或多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物以及可能还有一个或多个式(i-b)的核苷酸类似物(如本文别处详述的)，因此所述式(i-a)的杂交核苷酸类似物既不在其反义链寡核苷酸的5
’‑
突出端也不在3
’‑
突出端(当存在时)。
[0330]
本公开文本涉及单链寡核苷酸以及双链寡核苷酸并且尤其是sirna，其在反义链寡核苷酸的杂交区中包含一个或多个式(i-a)的杂交核苷酸类似物以及可能在有义链寡核苷酸中包含一个或多个杂交核苷酸类似物(i-a)。此外，双链寡核苷酸并且尤其是sirna可以在有义链和反义链寡核苷酸的5
’‑
突出端和3
’‑
突出端或5
’‑
突出端和3
’‑
突出端(当存在时)两者包含一个或多个非靶向核苷酸类似物以及可能在有义链和反义链寡核苷酸的5
’‑
突出端和3
’‑
突出端或5
’‑
突出端和3
’‑
突出端两者包含一个或多个靶向核苷酸类似物(i-b)。
[0331]
式(i-a)和(i-b)的核苷酸类似物在下面进一步详述。
[0332]
式(i-a)和(i-b)的核苷酸类似物
[0333]
本文公开的式(ii)的化合物是核苷酸类似物构建块，也称为“核苷酸类似物前体”，其被设想为作为寡聚化合物的单体单元(特别是作为寡核苷酸的单体单元，包括作为双链rna(“dsrna”)寡聚物的单体单元并且尤其是作为sirna的单体单元)而包含。将本文在式(ii)的化合物下描述的核苷酸类似物前体掺入寡核苷酸中导致所述寡核苷酸中存在本文中描述为式(i)的化合物的相应单体单元，所述式(i)的化合物由(i)式(i-a)的核苷酸类似物或(ii)式(i-b)的核苷酸类似物组成。
[0334]
如下文进一步描述的，式(i-a)的核苷酸类似物由式(i)的化合物组成，其中基团r3不由细胞靶向部分组成。此外，式(i-b)的核苷酸类似物由式(i)的化合物组成，其中基团r3由细胞靶向部分组成。
[0335]
本公开文本还涉及式(i)的核苷酸类似物：
[0336][0337]
其中
[0338]-b是杂环核碱基；
[0339]-l1和l2中的一个是将所述式(i)的化合物与核苷酸残基连接的核苷间连接基团，并且l1和l2中的另一个是h、保护基团、磷部分或将所述式(i)的化合物与核苷酸连接的核苷间连接基团
[0340]-y是o、nh、nr1或n-c(＝o)-r1，其中r1是：
[0341]
·
(c1-c20)烷基，
[0342]
其任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基、(c5-c14)杂芳基、-o-z1、-n(z1)(z2)、-s-z1、-cn、-c(＝j)-o-z1、-o-c(＝j)-z1、-c(＝j)-n(z1)(z2)、-n(z1)-c(＝j)-z2，其中
[0343]
j是o或s，
[0344]
z1和z2各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0345]
·
(c3-c8)环烷基，其任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0346]
·
基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，其中m是意指0或1的整数，
[0347]
p是范围为从0至10的整数，
[0348]
r2是任选地被以下取代的(c1-c20)亚烷基：(c1-c6)烷基、-o-z3、-n(z3)(z4)、-s-z3、-cn、-c(＝k)-o-z3、-o-c(＝k)-z3、-c(＝k)-n(z3)(z4)和-n(z3)-c(＝k)-z4，其中k是o或s，
[0349]
z3和z4各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0350]
以及
[0351]
r3选自氢原子、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基或(c5-c14)杂芳基，
[0352]
或
[0353]
r3是细胞靶向部分，
[0354]-x1和x2各自独立地是氢原子、(c1-c6)烷基，以及
[0355]-ra、rb、rc和rd各自独立地是h或(c1-c6)烷基，
[0356]
以及其任何异构体，诸如立体异构体，或其药学上可接受的盐。
[0357]
在如本文所述的寡核苷酸的一些优选实施方案中，在式(i)的化合物中，y是o。
[0358]
在如本文所述的寡核苷酸的一些其他优选实施方案中，在式(i)的化合物中，y是nr1或n-c(＝o)-r1，其中r1如通式(i)所定义。
[0359]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是(c1-c20)烷基，任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基、(c5-c14)杂芳基、-o-z1、-n(z1)(z2)、-s-z1、-cn、-c(＝j)-o-z1、-o-c(＝j)-z1、-c(＝j)-n(z1)(z2)、-n(z1)-c(＝j)-z2，其中
[0360]
j是o或s，
[0361]
z1和z2各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，呈碱或与酸的加成盐的形式。
[0362]
在其中y是nr1的这些实施方案中的一些中，r1是未经取代的(c1-c20)烷基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2、r2、r3和b具有对于通式(i)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。
[0363]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是未经取代的(c1-c16)烷基，其包含选自包含以下的组的烷基：甲基、异丙基、丁基、辛基、十六烷基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(i)所定义的相同含义。
[0364]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是甲基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且l1和l2如通式(i)所定义。
[0365]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是异丙基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且l1和l2如通式(i)所定义。
[0366]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是被苯基取代的甲基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2、r2、r3和b具有对于通式(i)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。
[0367]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是丁基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且l1和l2如通式(i)所定义。
[0368]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是辛基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且l1和l2如通式(i)所定义。
[0369]
在其中y是nr1的一些实施方案中，r1是直链c16烷基，ra、rb、rc、rd、x1和x2是氢原子，并且l1和l2如通式(i)所定义。
[0370]
在其中y是nr1的式(i)的化合物的另外的实施方案中，r1是如通式(i)所定义取代的(c1-c20)烷基，其包括如通式(i)所定义取代的c1、c2或c3烷基。
[0371]
在这些另外的实施方案中的一些中，r1是被一个或多个选自以下的基团取代的(c1-c20)烷基：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基和(c5-c14)杂芳基。
[0372]
在这些另外的实施方案中的一些中，r1是被(c6-c14)芳基取代的(c1-c20)烷基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(i)所定义的相同含义。
[0373]
在其中y是nr1的式(i)的化合物的一些实施方案中，r1是被(c6-c14)芳基取代的(c1-c20)烷基。这些实施方案涵盖式(i)的化合物，其中y是nr1，r1是被芳基取代的亚甲基。这些实施方案还涵盖式(i)的化合物，其中y是nr1，r1是被苯基取代的(c1-c20)烷基。
[0374]
在其中y是nr1的式(i)的化合物的一些实施方案中，r1是被未经取代的苯基取代的甲基，ra、rb、rc、rd各自是氢原子，并且l1和l2如通式(i)中所定义。
[0375]
在其中y是nr1的式(i)的化合物的另外的实施方案中，r1是任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代的(c3-c8)环烷基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(i)所定义的相同含义。
[0376]
在其中y是nr1的式(i)的化合物的这些另外的实施方案中的一些中，r1是环己基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2、r2、r3和b具有对于通式(i)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。
[0377]
在其中y是nr1的式(i)的化合物的这些另外的实施方案中的一些中，r1是未经取代的环己基，ra、rb、rc、rd、x1、x2各自是氢原子，并且l1和l2如通式(i)所定义。
[0378]
在式(i)的寡核苷酸的一些其他实施方案中，y是n-c(＝o)-r1，其中r1是(c1-c20)烷基，r1选自包含甲基和十五烷基的组，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2、r2、r3和b具有对于通式(i)或其药学上可接受的盐所定义的相同含义。
[0379]
在式(i)的寡核苷酸的一些其他实施方案中，y是n-c(＝o)-r1，其中r1是任选地被一个或多个选自以下的基团取代的(c1-c20)烷基：卤素原子、(c1-c6)烷基、(c3-c8)环烷基、(c3-c14)杂环、(c6-c14)芳基、(c5-c14)杂芳基、-o-z1、-n(z1)(z2)、-s-z1、-cn、-c(＝j)-o-z1、-o-c(＝j)-z1、-c(＝j)-n(z1)(z2)和-n(z1)-c(＝j)-z2，其中
[0380]
j是o或s，并且
[0381]
z1和z2各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，并且
[0382]
l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(ii)所定义的相同含义。
[0383]
在其中y是n-c(＝o)-r1的一些实施方案中，r1是任选经取代的(c1-c20)烷基，其包含任选经取代的(c1-c15)烷基，并且l1、l2、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(i)所定义的相同含义。
[0384]
在其中y是n-c(＝o)-r1的一些实施方案中，r1是未经取代的(c1-c20)烷基，其包括未经取代的(c1-c15)烷基，并且l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和b具有对于通式(i)所定义的相同含义。
[0385]
根据其中y是n-c(＝o)-r1的这些实施方案中的一些，r1选自包含甲基和十五烷基的组，并且l1和l2以及b具有对于通式(i)所定义的相同含义。这些实施方案涵盖式(ii)的化合物，其中y是n-c(＝o)-r1，r1是甲基、ra、rb、rc、rd、x1、x2各自表示氢原子，并且b、l1和l2如通式(i)中所定义。这些实施方案还涵盖式(i)的化合物，其中y是n-c(＝o)-r1，r1是十五烷基，ra、rb、rc、rd、x1、x2各自表示氢原子，并且b、l1和l2如通式(i)中所定义。
[0386]
由式(i-a)的核苷酸类似物或式(i-b)的核苷酸类似物组成的式(i)的核苷酸类似物可以以游离碱或与酸的加成盐的形式存在。由式(i-a)的核苷酸类似物或式(i-b)的核苷酸类似物组成的式(i)的核苷酸类似物还可以以其药学上可接受的盐的形式存在，所述盐也落入本公开文本的范围。
[0387]
式(i-b)的核苷酸类似物(也称为靶向核苷酸类似物)的实施方案
[0388]
如本文先前所指定，本公开文本还涵盖式(i-b)的核苷酸类似物，其中：
[0389]-b是杂环核碱基；
[0390]-l1和l2中的一个是将所述式(i)的化合物与核苷酸残基连接的核苷间连接基团，并且l1和l2中的另一个是h、保护基团、磷部分或将所述式(i)的化合物与核苷酸残基连接
的核苷间连接基团；
[0391]-y是nr1并且r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3，其中
[0392]
m是意指0或1的整数，
[0393]
p是范围为从0至10的整数，
[0394]
r2是任选地被以下取代的(c1-c20)亚烷基：(c1-c6)烷基、-o-z3、-n(z3)(z4)、-s-z3、-cn、-c(＝k)-o-z3、-o-c(＝k)-z3、-c(＝k)-n(z3)(z4)、-n(z3)-c(＝k)-z4，其中
[0395]
k是o或s，
[0396]
z3和z4各自独立地是h、(c1-c6)烷基，所述(c1-c6)烷基任选地被一个或多个选自卤素原子和(c1-c6)烷基的基团取代，
[0397]
以及
[0398]
r3是细胞靶向部分，
[0399]-x1和x2各自独立地是氢原子、(c1-c6)烷基，以及
[0400]-ra、rb、rc和rd各自独立地是h或(c1-c6)烷基，
[0401]
呈碱或与酸的加成盐的形式，
[0402]
以及其任何异构体，诸如立体异构体，或其药学上可接受的盐。
[0403]
这些式(i-b)的化合物涵盖在本公开文本中可称为“靶向核苷酸类似物”的更一般化合物家族中。
[0404]
在其中r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3的式(i-b)的靶向核苷酸类似物的一些实施方案中，m是0，p是0，r3是细胞靶向部分，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和r2是如式(i-b)的化合物的一般定义中的。
[0405]
在一些实施方案中，r2是亚乙基，并且x1和x2都是氢原子，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd是如式(i-bi)的化合物的一般定义中的。
[0406]
在这些实施方案中的其他一些中，r2是亚戊基，并且x1和x2都是氢原子，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd是如式(i-b)的化合物的一般定义中的。
[0407]
在这些实施方案中的其他一些中，r2是(c12)亚烷基，并且x1和x2都是氢原子，b、p1、p2、ra、rb、rc、rd是如式(i-b)的化合物的一般定义中的。
[0408]
在其中r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3的式(i-b)的化合物的一些实施方案中，m是0，p选自由1、2、3和4组成的整数组，r3是细胞靶向部分，并且b、l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2和r2是如式(ii)的化合物的一般定义中的。在这些实施方案中的一些中，r2是亚乙基，p是1，并且x1和x2都是氢原子。在这些实施方案中的再另外的实施方案中，r2是亚乙基，p是2，并且x1和x2都是氢原子。在这些实施方案中的又另外的实施方案中，r2是亚乙基，p是3，并且x1和x2都是氢原子。在这些实施方案中的再其他的实施方案中，r2是亚乙基，p是4，并且x1和x2都是氢原子。
[0409]
在其中r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3的式(i-b)的化合物的一些实施方案中，m是1，p是0，r3是细胞靶向部分，并且r2、b、l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2是如式(i-b)的化合物的一般定义中的。
[0410]
在这些实施方案中的一些中，r2是亚丁基，x1和x2均表示氢原子，并且b、l1、l2、ra、rb、rc和rd如通式(i-b)所定义。
[0411]
在这些实施方案中的又一些中，r2是(c11)亚烷基，x1和x2均表示氢原子，并且b、
l1、l2、ra、rb、rc和rd如通式(i-b)所定义。
[0412]
在这些实施方案中的再另外一些中，r2是亚甲基，x1和x2均表示氢原子，并且b、l1、l2、ra、rb、rc和rd如通式(i-b)所定义。
[0413]
在其中r1是基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch
2-ch2)p-r3的式(ii)的化合物的一些实施方案中，m是1，p选自由1和2组成的整数组，r3是细胞靶向部分，r2、b、l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1,x2,是如式(i-b)的化合物的一般定义中的。
[0414]
在这些实施方案中的一些中，r2是亚甲基，p是2，r3是细胞靶向部分，b、l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2如通式(i-b)所定义。
[0415]
在这些实施方案中的其他一些中，r2是亚甲基，p是1，r3是细胞靶向部分，b、l1、l2、ra、rb、rc、rd、x1、x2如通式(i-b)所定义。
[0416]
通常，基团r3涵盖本领域已知的任何细胞靶向部分，包括本公开文本中指定的任何细胞靶向部分，其包括为描述本公开文本中靶寡核苷酸而指定的细胞靶向部分。
[0417]
在式(i-b)的化合物的一些实施方案中，r3具有式(iii)：
[0418][0419]
其中a1、a2和a3是oh，
[0420]
a4是oh或nhc(＝o)-r5，其中r5是(c1-c6)烷基，任选地被卤素原子取代。
[0421]
在一些实施方案中，r3是式(iii-b)的n-乙酰基-半乳糖胺：
[0422][0423]
根据本公开文本，提及“galnac”或“n-乙酰基半乳糖胺”包括β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-d-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-d-吡喃半乳糖两者。在某些实施方案中，β-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-d-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-d-吡喃半乳糖两者可以互换使用。
[0424]
在式(i-b)的寡核苷酸中，b是杂环核碱基部分。如本文所用，术语“杂环核碱基”是指与二噁烷环或吗啉代环共价连接的任选经取代的含氮杂环。在一些实施方案中，杂环核碱基可以选自任选经取代的嘌呤碱基、任选经取代的嘧啶碱基。术语“嘌呤碱基”在本文中以其本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以其本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选经取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的例
子包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。杂环碱基的其他非限制性例子包括二氨基嘌呤、8-氧代-n6烷基腺嘌呤(例如，8-氧代-n6甲基腺嘌呤)、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、n4,n
4-乙醇胞嘧啶、n
《6》
,n
《6》-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶)、假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、1,2,4-三唑-3-甲酰胺和美国专利5,432,272和7,125,855中所述的其他杂环碱基，将所述专利出于公开另外的杂环碱基通过引用并入本文。
[0425]
在一些实施方案中，b选自包含嘧啶、经取代的嘧啶、嘌呤和经取代的嘌呤的组。
[0426]
在优选的实施方案中，b选自包含以下的组：腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶(即，腺嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基、鸟嘌呤基和胞嘧啶基)。
[0427]
如已经提到的，在包含式(i-b)的核苷酸类似物的寡核苷酸中，基团l1和l2中的一个基团是将式(i)的化合物连接到核苷酸残基(即，连接到相邻的核苷酸残基)的核苷间连接基团，并且l1和l2基团中的另一个基团是h、保护基团、或将式(i-b)的化合物连接到核苷酸残基(即，连接到相邻的核苷酸残基)的核苷间连接基团。
[0428]
另外，本文所述的掺入一个或多个其中靶向部分附接至吗啉氮(galnac残基)的式(i)的化合物的双链寡核苷酸的例子显示出稳健的递送至肝脏，导致体内敲低靶mrna和相应蛋白质水平。
[0429]
出乎意料地，当将式(i)的靶向化合物和式(i)的非靶向化合物组合在一个双链寡核苷酸内时，其已展现出双链寡核苷酸的体内行为(特别是体内作用持续时间)的显著改善；这也可以在有义链不含任何硫代磷酸酯基团的情况下显示。
[0430]
有义链、反义链或有义链和反义链两者并且尤其是有义链中掺入有一个或多个式(i)的化合物的sirna还在体内发挥有效的靶基因沉默活性。靶基因沉默活性可以根据以下来控制：(i)其中存在的式(i)的化合物的一个或多个实施方案，(ii)其中存在的式(i)的化合物的数量，和(iii)sirna的有义链或反义链中一个或多个式(i)的化合物的位置。
[0431]
重要的是，掺入有一个或多个式(i)的化合物的sirna在这些sirna显示发挥靶基因沉默作用的剂量范围内没有体内副作用。
[0432]
出于说明的目的并且不限制本公开文本，双链寡核苷酸还可以包含在经修饰的有义链和/或反义链上的一个或多个核苷酸。
[0433]
修饰可以选自用核酸或碱基类似物的取代或插入以及碱基、糖或磷酸酯部分的化学修饰。选择的修饰可以各自且单独地选自3
’‑
末端脱氧-胸腺嘧啶、2
’‑
o-甲基、2
’‑
脱氧修饰、2
’‑
脱氧-氟、2
’‑
氨基修饰、2
’‑
烷基修饰、硫代磷酸酯修饰、氨基磷酸酯修饰、5
’‑
硫代磷酸酯基团修饰、5
’‑
磷酸酯或5
’‑
磷酸酯模拟修饰和胆固醇衍生物或十二烷酸双癸基酰胺基团修饰，和/或修饰的核苷酸可以是锁核苷酸、脱碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一种。优选实施方案之一可以是至少一个修饰是2
’‑
o-甲基和/或至少一个修饰是2
’‑
脱氧-氟。
[0434]
如本文所用，经修饰的寡核苷酸的其他例子可以包括以下中的一种或多种：一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的修饰，例如替代；磷酸酯部分的替代；天然存在的碱基的修饰或替代；核糖-磷酸酯骨架的替代或修饰；rna的3
’‑
末端或5
’‑
末端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或替代或部分(例如，萤光标记的部分)与rna的3
’‑
末端或5
’‑
末端的缀合。
[0435]
用于合成式(ii)的核苷酸类似物前体的方法
[0436]
式(ii)的核苷酸类似物前体可以根据本文公开文本中说明的详细方法制备。
[0437]
本公开文本涉及一种用于制备式(ii-1)的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0438]
a)式(x)的化合物的氧化
[0439][0440]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如本文通式(ii)中所定义的保护基团
[0441]
通过式(x)的化合物与氧化试剂诸如高碘酸钠(nalo4)反应，由此获得以下式(xi)的化合物：
[0442]
以及
[0443]
b)使式(xi)的化合物在式(xii)的化合物的存在下经受还原胺化步骤r1-nh2(xii)
[0444]
其中r1如本文通式(i)中所定义，
[0445]
以获得式(ii-1)的化合物：
[0446][0447]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如通式(ii)中所定义的保护基团。
[0448]
本公开文本还涉及一种用于制备式(ii-2)的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0449]
a)式(x)的化合物的氧化
[0450][0451]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如本文通式(ii)中所定义的保
护基团
[0452]
通过式(x)的化合物与氧化试剂诸如高碘酸钠(nalo4)反应，由此获得以下式(xi)的化合物：
[0453]
以及
[0454]
b)使式(xi)的化合物在胺(如例如氨或二硼酸铵)的存在下经受还原胺化步骤以获得式(xiii)的化合物：
[0455][0456]
c)使式(xiii)的化合物在式(xiv)的化合物的存在下经受酰胺偶联步骤
[0457]
r1-c(＝o)-oh(xiv)
[0458]
其中r1如本文通式(ii)中所定义，
[0459]
以获得式(ii-2)的化合物
[0460][0461]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如本文通式(ii)中所定义的保护基团，并且r1如通式(ii)中所定义。
[0462]
d)使式(xiii)的化合物在醛或酮的存在下经受还原胺化步骤以获得式(ii-1)的化合物
[0463][0464]
本公开文本还涉及一种用于制备式(ii-3)的化合物的方法
[0465][0466]
包括以下步骤：使式(xv)的化合物
[0467][0468]
其中a1、a2、a3和a4如本文式(iii)或(iii-a)中所定义，-y-cho通过还原胺化反应转移为-y-ch2-，其等于x，并且x是式-(ch2-ch2-o)p-r2-的基团，其中p和r2如通式(i)中所定义，
[0469]
与式(xiii)的化合物反应
[0470][0471]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如通式(ii)中所定义的保护基团，通过还原胺化，获得式(ii-3)的化合物
[0472][0473]
上述方法在本公开文本中方案2中说明。
[0474]
本公开文本还涉及一种用于获得式(ii-4)的化合物的方法
[0475][0476]
包括以下步骤：
[0477]
a)使式(xvi)的化合物
[0478][0479]
其中a1、a2、a3和a4如本文式(iii)或(iii-a)中所定义，并且x是式-(ch2-ch2-o)p-r2-的基团，其中p和r2如通式(i)中所定义，
[0480]
与式(xiii)的化合物反应
[0481][0482]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如通式(ii)中所定义的保护基团，在肽偶联条件下反应以获得式(ii-4)的化合物。
[0483]
上述方法在本公开文本中方案2中说明。
[0484]
本公开文本进一步涉及一种用于制备式(ii-5)的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0485]
a)将式(xi)的化合物还原
[0486][0487]
其中b是杂环核碱基，并且p1和p2各自独立地表示如本文通式(ii)中所定义的保护基团，以便获得式(xvii)的化合物
[0488][0489]
b)将式(xvii)的化合物在磺酰化剂(例如，对甲苯磺酰氯ts-cl、甲磺酰氯ms-cl)的存在下转移，以便获得式(xviii)的化合物
[0490][0491]
其中ts表示甲苯磺酰基，
[0492]
c)使式(xviii)的化合物经受碱性条件，以便获得式(ii-5)的化合物
[0493][0494]
上述方法在本公开文本中方案3中说明。
[0495]
本公开文本还涉及一种用于制备式(ii-5)的化合物的替代方法，所述方法包括以下步骤：
[0496]
a)将式(xvii)的化合物
[0497][0498]
在过量磺酰化剂(例如，对甲苯磺酰氯ts-cl、甲磺酰氯ms-cl)的存在下转移，以便获得式(xix)的化合物
[0499][0500]
其中ts表示甲苯磺酰基，
[0501]
b)通过去除基团p1将式(xix)的化合物脱保护以获得式(xx)的化合物
[0502][0503]
c)使式(xx)的化合物经受碱性条件，以便获得式(xxi)的化合物
[0504]
以及
[0505]
d)用保护基团p1替代甲苯磺酰基，以便获得式(ii-5)的化合物
[0506][0507]
上述方法在本公开文本中方案3中说明。
[0508]
式(ii)、(ii-1)、(ii-2)、(ii-3)、(ii-4)和(ii-5)的化合物可以根据本文公开的以下方案1至8中说明的详细方法制备。
[0509]
从可商购的核糖衍生物g1开始，两个伯oh-基团可以按照标准文献方案通过选择性苄基化来区分。所得苄基醚g2的标准保护基团修饰导致产生完全保护的核糖类似物g3，其可以在核碱基b(例如：t、u、c
bzl
、i、g
ibu
、a
bzl
)的存在下用作糖基供体，产生核苷衍生物g4(tetrahedron,1998,54,3607-3630)。
[0510][0511]
方案1：式(ii)的化合物的合成，其中y是nh、nr1和nc(＝o)r1
[0512]
从核苷类似物g4开始，通过标准程序对保护基模式的修饰导致产生中间体g5，其中两个伯醇以及核糖支架的c2’和c3’上的未保护的oh-基团上是如通式(ii)中定义的正交保护基团p1和p2。g5化合物中二羟基官能团的顺式取向允许使用naio4作为氧化剂氧化裂解c2’与c3’之间的c-c键。所得二醛可以分离为一水合物g6，通过与还原剂(诸如nacnbh3)的还原胺化反应将其转化为所希望的吗啉支架。使用胺底物诸如氨或二硼酸铵导致产生吗啉中间体g7，其中在吗啉支架中具有游离nh-基团。与相应的醛或酮在例如nacnbh3的存在下的第二还原胺化反应产生烷基化吗啉g8，其中r1如通式(ii)中所定义。可替代地，中间体g6可以在适当的胺r1-nh2(其中r1如通式(ii)中所定义)的存在下经受还原胺化反应，导致直接产生烷基化吗啉g8。通过游离吗啉构建块g7与相应的羧酸r1-cooh之间的标准肽偶联反应获得类似物酰化吗啉，导致产生酰胺中间体g9。
[0513]
化合物g7、g8和g9由本公开文本中所述的式(ii)的化合物的实施方案组成。
[0514]
类似于方案1中针对形成通式(ii)的化合物而描述的合成，本文所述的通式(ii)的靶化合物可以通过使用中间体g7作为胺试剂进行还原胺化或肽偶联反应来制备。
[0515]
使用全乙酰化n-乙酰基半乳糖胺g11作为受保护的细胞靶向部分，通式(ii)的化合物的合成描述于以下方案2中。
[0516][0517]
方案2：具有酰胺(g14)和胺(g15)附接、受保护的galnac作为细胞靶向部分和不同的x接头基团的通式(ii)化合物的合成，其中在g15合成中，x由(g13)中的接头片段-y-cho产生并且在还原胺化后转化为-y-ch
2-。
[0518]
在下文中，x定义为包含在如通式(ii)的化合物中定义的基团-[c(＝o)]m-r2-(o-ch2-ch2)p-r3中的基团-r2(och2-ch2)p-。
[0519]
在标准糖基化条件下用ω-羟基羧酸酯(ho-x-coobn)处理全乙酰化galnac-衍生物g11在酯裂解后导致产生羧酸g12，其在吗啉衍生物g7的存在下在肽偶联条件下形成所希望的酰胺g14。可替代地，用ω-羟基-苄基醚(ho-x-obn)进行g11的糖基化在苄基醚裂解和
相应醇的氧化后提供醛中间体g13。用吗啉g7作为胺组分进行还原胺化导致形成烷基化吗啉g15。化合物g14和g15是如本公开文本中所述的式(ii)的化合物。
[0520]
二噁烷系列(y是o)中的通式(ii)的化合物的合成路线如方案3所示。
[0521][0522]
方案3：通式(ii)的化合物(其中y是o)的合成路线
[0523]
始于已经描述的顺式二醇中间体g5以及将其氧化裂解为构建块g6(参见方案1)，用还原剂诸如硼氢化钠处理导致产生二醇中间体g16，其中在2
’‑
和3
’‑
c处具有两个伯oh-基团。在碱性条件下，在化学计量量的磺酰化剂诸如对甲苯磺酰氯的存在下，2
’‑
oh-官能团可以选择性地甲苯磺酰化，形成单甲苯磺酸酯g17。在使用例如在meoh中的naoh或naome水溶液的碱性条件下，g17经受在3
’‑
c处伯甲苯磺酸酯被游离oh基团的亲核取代，这导致形成所希望的二噁烷支架g18。
[0524]
化合物g18由如本公开文本所述的通式(ii)的化合物组成。
[0525]
可替代地，二醇中间体g16可以用例如过量的对甲苯磺酰氯进行双磺酰化并且增加反应时间，导致产生双甲苯磺酸酯g19。在将正交保护基团p1或p2中的一个脱保护后，获得的伯醇g20在亲核取代下与g17(参见方案3)类似地反应并且形成所希望的二噁烷支架g21。剩余的甲苯磺酸酯可以用苯甲酸钠替代，再次产生完全保护的二噁烷支架g18，其中在伯羟基上具有正交保护基p1和p2。
[0526][0527]
方案4：式(ii)的化合物(其中y是o)的替代合成
[0528]
所描述的具有正交保护基团p1和p2的通式(ii)的构建块(g8、g9、g14、g15和g18)最终转化为相应的dmt保护的亚磷酰胺，允许它们在自动化寡核苷酸合成中用作核苷酸前体。
[0529]
为此目的，完全保护的通式(ii)的化合物(g8、g9、g14、g15和g18)通过标准保护基团修饰转化为单-dmt-保护的中间体g22。通过标准方案对g22构建块中的游离oh-基团进行亚磷酸化导致最终dmt保护的亚磷酰胺g23，作为核苷酸前体用于自动化寡核苷酸合成。
[0530][0531]
方案5：用于自动化寡核苷酸合成的通式(ii)的化合物的最终亚磷酰胺构建块的合成
[0532]
化合物g23是式(ii)的化合物，其中基团p1是dmt保护基团，并且基团p2是由亚磷酰胺基团组成的反应性磷基团。
[0533]
根据导致产生中间体g22的保护基团修饰，可以合成通式(ii)的化合物的(2s,6r)-和(2r,6r)-非对映异构体。
[0534][0535]
方案6：通式(ii)的化合物g23的非对映异构体结构
[0536]
寡核苷酸单链的3
’‑
末端的起始核苷酸可以通过标准程序用通用固体支持材料制备(参见实验部分，寡核苷酸的合成)在自动化合成中与第一核苷酸支架的相应亚磷酰胺g23反应来制备。
[0537]
包含式(i-a)以及可能还有(i-b)的核苷酸类似物的寡核苷酸的制备
[0538]
用于根据本公开文本用途的寡核苷酸(其在本文中也可以称为“经修饰的寡核苷酸”)可以根据任何有用的技术(包括本文所述的方法)通过以下方式来制备：使用一个或多个式(ii)的核苷酸类似物前体作为有待掺入在最终寡核苷酸的生长链的一个或多个选定位置的一些起始构建块，从而产生包含一个或多个式(i)的核苷酸类似物的寡核苷酸，所述一个或多个式(i)的化合物位于最终寡核苷酸的一个或多个选定位置。
[0539]
式(ii)的核苷酸类似物前体可以如本公开文本中所述合成。
[0540]
本公开文本的经修饰的寡核苷酸可以是双链的，其具有或不具有突出端，或包含至少一个双链部分。双链修饰寡核苷酸可以由其中包含第一核苷酸序列(例如，有义核苷酸序列)的单一寡核苷酸链和与第一核苷酸序列互补并且与其杂交的第二核苷酸序列(例如，反义核苷酸序列)形成，并且其中第二核苷酸序列也与寻求抑制的靶rna序列互补。根据这些实施方案，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在经修饰的寡核苷酸内的不同链上；或在同一条链上但被间隔物或适当长度的附加核苷酸序列隔开，以便一旦第一核苷酸序列与第二核苷酸序列杂交就形成发夹环。
[0541]
在一些实施方案中，本发明的经修饰的寡核苷酸是单链的，并且可以包含双链rna(诸如sirna)的有义链或反义链。
[0542]
本发明寡核苷酸(诸如包含一个或多个式(i)的核苷酸类似物的那些)可以使用本领域已知的方案化学合成。参见例如，caruthers等人,1992,methods in enzymology,211:3-19；thompson等人,国际pct公开号wo 99/54459；wincott等人,1995,nucleic acids res.,23:2677-2684；wincott等人,1997,methods mol.bio.,74:59；brennan等人,1998,biotechnol bioeng.,61:33-45；和brennan,美国专利6,001,311。寡核苷酸的合成利用了常见的核酸保护基团和偶联基团，诸如在5
’‑
末端的二甲氧基三苯甲基以及在3
’‑
末端的亚磷酰胺。在某些实施方案中，根据美国专利6,995,259；6,686,463；6,673,918；6,649,751；6,989,442；和7,205,399中所述的方法合成、脱保护和分析包含式(i)的核苷酸类似物的寡核苷酸。在非限制性合成实施例中，在394applied biosystems,inc./thermo fischer scientific inc.合成仪上进行小规模合成。
[0543]
可替代地，包含一个或多个式(i)的核苷酸类似物的寡核苷酸可以单独合成并且在合成后连接在一起，例如，通过连接(moore等人,1992,science 256:9923；draper等人,国际pct公开号wo 93/23569；shabarova等人,1991,nucleic acids research 19:4247；bellon等人,1997,nucleosides&nucleotides,16:951；bellon等人,1997,bioconjugate chem.,8:204)或通过合成和/或脱保护后的杂交。根据本公开文本的各种经修饰的寡核苷酸还可以使用scaringe等人的美国专利5,889,136；6,008,400；和6,111,086的传授来合成。
[0544]
组合物
[0545]
本公开文本的某些方面涉及包含如本文所述dsrna的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)可用于治疗与靶基因的表达或活性相关的疾病或障碍。
[0546]
本公开文本的组合物(例如，药物组合物)基于递送方式配制，包括例如被配制用于通过肠胃外递送而递送至肝脏的组合物。
[0547]
本公开文本的组合物(例如，药物组合物)可以以足以抑制靶基因表达的剂量施用。在一些实施方案中，dsrna的合适剂量在0.01mg/kg-400mg/kg受体体重的范围内。
[0548]
本领域普通技术人员应理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和定时，所述因素包括但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的一种或多种其他疾病。此外，用治疗有效量的药物组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。如本文公开的dsrna的有效剂量和体内半衰期的估计
值可以使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试进行。
[0549]
本公开文本的dsrna分子可以配制在药学上可接受的载体或稀释剂中。药学上可接受的载体可以是液体或固体，并且可以根据考虑到的计划施用方式进行选择，以便提供所希望的体积、稠度和其他相关的运输和化学特性。可以使用任何已知的药学上可接受的载体或稀释剂，包括例如水、盐水溶液、粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖和其他糖、明胶或硫酸钙)、润滑剂(例如，淀粉、聚乙二醇或乙酸钠)、崩解物(例如，淀粉或淀粉乙醇酸钠)、钙盐(例如，硫酸钙、氯化钙、磷酸钙等)和润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。
[0550]
本公开文本的dsrna分子可以配制成含有与其他分子、分子结构或核酸混合物混合、包封、缀合或以其他方式关联的dsrna的组合物(例如，药物组合物)。例如，包含一个或多个如本文所述的dsrna的组合物可以含有其他治疗剂，诸如其他脂质降低剂(例如，他汀类)。在一些实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)进一步包含递送载体(如本文所述)。
[0551]
载体和dsrna递送
[0552]
本公开文本的dsrna可以直接或间接递送。在一些实施方案中，通过向受试者施用包含dsrna的组合物(例如，药物组合物)来直接递送dsrna。在一些实施方案中，通过施用一种或多种本文所述的载体来间接递送dsrna。
[0553]
递送
[0554]
本公开文本的dsrna可以通过本领域已知的任何方法来递送，包括例如通过调整递送用于dsrna的核酸分子的方法(参见例如，akhtar,s.等人(1992)trends cell.biol.2(5):139-144；wo 94/02595)，或通过本领域已知的另外方法(参见例如，kanasty,r.等人(2013)nature materials 12:967-977；wittrup,a.和lieberman,j.(2015)nature reviews genetics 16:543-552；whitehead,k.等人(2009)nature reviews drug discovery 8:129-138；gary,d.等人(2007)121(1-2):64-73；wang.j.等人(2010)aaps j.12(4):492-503；draz,m.等人(2014)theranostics 4(9):872-892；wan,c.等人(2013)drug deliv.and transl.res.4(1):74-83；erdmann,v.a.和barciszewski,j.(编辑)(2010)“rna technologies and their applications”,springer-verlag berlin heidelberg,doi 10.1007/978-3-642-12168-5；xu,c.和wang,j.(2015)asian journal of pharmaceutical sciences 10(1):1-12)。
[0555]
在一些实施方案中，本公开文本的dsrna由包含dsrna的递送载体递送。在一些实施方案中，递送载体是脂质体、阳离子脂质复合体(lipoplex)、复合体或纳米颗粒。
[0556]
脂质体配制品
[0557]
脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。在一些实施方案中，脂质体是由排列成一个或多个球形双层或双层的两亲性脂质构成的囊泡。水性部分含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优点。脂质体的优点包括，例如，从天然磷脂获得的脂质体具有生物相容性和可生物降解性；脂质体可以掺入宽范围的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护包封在其内部隔室中的药物免于代谢和降解(rosoff,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编辑),1988,marcel dekker,inc.,纽约州纽约,第1卷,第245页)。脂质体配制品制备中的重要考虑因素
是脂质表面电荷、囊泡尺寸和脂质体的水体积。例如，工程化阳离子脂质体和空间稳定脂质体可以用于递送dsrna。参见例如，podesta等人(2009)methods enzymol.464,343-54；美国专利5,665,710。
[0558]
核酸-脂质颗粒
[0559]
在一些实施方案中，本公开文本的dsrna被完全包封在脂质配制品中，例如以形成核酸-脂质颗粒，例如splp、psplp或snalp。如本文所用，术语“snalp”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包括splp。如本文所用，术语“splp”是指包含包封在脂质囊泡内的质粒dna的核酸-脂质颗粒。核酸-脂质颗粒，例如snalp，典型地含有阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇和防止颗粒聚集并且增加循环时间的脂质(例如，peg-脂质缀合物)。snalp和splp可用于全身应用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后展现出延长的循环寿命，并且在远端部位(例如，与施用部位物理分离的部位)积聚。splp包括“psplp”，其包括如pct公开号wo 00/03683中所阐述的包封的缩合剂-核酸复合体。
[0560]
在一些实施方案中，当存在于核酸-脂质颗粒中时，dsrna在水溶液中对被核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于，例如，美国专利5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；和6,815,432；和pct公开号wo 96/40964。
[0561]
在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒包含阳离子脂质。可以使用本领域已知的任何阳离子脂质或其混合物。在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒包含非阳离子脂质。可以使用本领域已知的任何非阳离子脂质或其混合物。在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒包含缀合的脂质(例如，以防止聚集)。可以使用本领域已知的任何缀合脂质。
[0562]
另外的配制品
[0563]
为了在体内成功递送dsrna分子而考虑的重要因素包括：(1)被递送分子的生物稳定性，(2)防止非特异性作用，以及(3)被递送分子在靶组织中的积累。dsrna的非特异性作用可以通过局部施用来最小化，例如通过直接注射或植入组织中或局部施用配制品。对于全身施用dsrna以治疗疾病，可以使用药物递送系统修饰或替代地递送dsrna；这两种方法都可以防止dsrna在体内被内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。rna或药物载体的修饰还可以允许dsrna组合物靶向靶组织并且避免不希望的脱靶效应。如上所述，dsrna分子可以通过化学缀合至诸如胆固醇的亲脂性基团来修饰，以增强细胞摄取并且防止降解。在一些实施方案中，dsrna使用药物递送系统(诸如纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送。带正电荷的阳离子递送系统促进dsrna分子(带负电荷荷)的结合，并且还增强在带负电荷的细胞膜上的相互作用以允许细胞有效摄取dsrna。阳离子脂质、树枝状大分子或聚合物可以与dsrna结合或诱导形成包住dsrna的囊泡或胶束(参见例如，kim s.h.等人(2008)journal of controlled release129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止了dsrna的降解。用于制备和施用阳离子-dsrna复合体的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，dsrna与环糊精形成复合体用于全身施用。
[0564]
使用dsrna的方法
[0565]
本公开文本的某些方面涉及用于抑制哺乳动物中靶基因表达的方法，所述方法包括施用有效量的一种或多种本公开文本dsrna、一种或多种本公开文本载体、或包含一种或多种本公开文本dsrna的本公开文本组合物(例如，药物组合物)。本公开文本的某些方面涉及治疗和/或预防一种或多种靶基因介导的疾病或障碍的方法，所述方法包括施用一种或
多种本公开文本dsrna和/或一种或多种本公开文本载体和/或包含一种或多种本公开文本dsrna的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，下调受试者中的靶基因表达减轻受试者的靶基因介导的疾病或障碍的一种或多种症状。
[0566]
在一些实施方案中，治疗后与治疗前水平相比，受试者中靶基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、或约100％。在一些实施方案中，治疗后与治疗前水平相比，靶基因的表达被抑制至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、或至少约100倍。在一些实施方案中，在受试者的肝脏中，靶基因被抑制。
[0567]
在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者具有或已经被诊断患有靶基因介导的障碍或疾病。在一些实施方案中，受试者怀疑患有靶基因介导的障碍或疾病。在一些实施方案中，受试者处于发展靶基因介导的障碍或疾病的风险。
[0568]
如从公开文本的内容可理解，如本文所述的dsrna的主要特征在于其中包含的一个或多个式(ii)的核苷酸类似物的存在，所述式(ii)的核苷酸类似物具有其“糖样”基团的特定结构特征。如本文所述的dsrna通常被设想用于靶向包含在靶目的核酸中的选定核酸序列。尤其是，本文所述的由sirna组成的dsrna的实施方案包含与包含在靶目的核酸中的核酸序列特异性杂交的反义链。本文所述的dsrna或组合物(例如，药物组合物)可以用于治疗靶基因介导的障碍或疾病。特别地，本文所述的dsrna或组合物(例如，药物组合物)并且尤其是包含一个或多个靶向核苷酸类似物并且尤其是一个或多个式(ii)的靶向核苷酸类似物的dsrna可以用于治疗靶基因介导的障碍或疾病，其中需要靶向肝脏。
[0569]
本公开文本的某些方面还涉及一种将核酸递送至肝细胞的方法，所述方法包括使肝细胞与本文所述的dsrna接触。
[0570]
本文所述的dsrna或组合物(例如，药物组合物)可以通过本领域已知的任何手段施用，包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、皮下、经肺、透皮和气道(气雾剂)施用。典型地，当治疗患有高脂血症的哺乳动物时，dsrna分子通过肠胃外手段全身施用。在一些实施方案中，dsrna和/或组合物通过皮下施用来施用。在一些实施方案中，dsrna和/或组合物通过静脉内施用来施用。在一些实施方案中，dsrna和/或组合物通过经肺施用来施用。
[0571]
当疾病状态的一个或多个参数在统计学上有显著改善或者没有恶化或发展出他们原本预期的症状时，dsrna的治疗或预防作用是明显的。例如，在可测量的疾病参数的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的有利变化可以指示有效治疗。也可以使用本领域已知的给定疾病或障碍的实验动物模型来判断给定dsrna或包含dsrna的组合物的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状在统计学上显著减少时，证明了治疗功效。
[0572]
试剂盒和制品
[0573]
本公开文本的某些方面涉及一种制品或试剂盒，其包含一种或多种dsrna、一种或
多种载体或一种或多种组合物(例如，一种或多种如本文所述可用于治疗和/或预防如上所述的靶基因介导的障碍或疾病的药物组合物)。制品或试剂盒可以进一步包含容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、iv溶液袋等。所述容器可以由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器容纳组合物本身或与另一种有效治疗或预防疾病的组合物的组合，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内输液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的dsrna。标签或包装插页指示组合物用于治疗靶标介导的障碍或疾病。此外，所述制品或试剂盒可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的dsrna；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含第二治疗剂。本公开文本的此实施方案中的制品或试剂盒可以进一步包含包装插页，所述包装插页指示组合物可以用于治疗特定疾病。可替代地或另外地，所述制品或试剂盒可以进一步包含含有药学上可接受的缓冲液(诸如注射用细菌抑制水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(ringer’s solution)和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。所述制品或试剂盒可以进一步包含从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射筒。
[0574]
核酸序列公开在本说明书中并且尤其是在用作参考的本文实施例中。相同的序列也呈现在根据用于专利事务目的的标准要求格式化的序列表中。若与标准序列表有序列差异，则应参考本说明书中描述的序列。
[0575]
在不限制本公开文本的情况下，下文出于说明目的描述了本公开文本的多个实施方案。
[0576]
实施例
[0577]
命名法是根据iupac规则建立的。
[0578]
除非另有指示，否则已使用以下lc-ms方法：
[0579]
a：
[0580]
柱：waters acquity uplc beh c18，1.7μm，2.1x50mm
[0581]
洗脱剂：(h2o 0.05％fa)/(acn 0.035％fa)95:5(0min)至5:95(2min)至5:95(2.6min)至95:5(2.7min)至95:5(3.0min)，0.9ml/min 55℃。
[0582]
b-1：
[0583]
柱：phenomenex luna c18，3.0μm，2.0x10mm
[0584]
洗脱剂：(h2o 0.05％tfa)/acn 93:7(0min)至5:95(1.20min)至5:95acn(1.40min)至93:7(1.50min)；1.1ml/min，室温。
[0585]
b-2：
[0586]
柱：phenomenex luna c18，3.0μm，2.0x10mm
[0587]
洗脱剂：(h2o 0.05％tfa)/acn 93:7(0min)至5:95(1.00min)至5:95acn(1.45min)至93:7(1.50min)；1.1ml/min，室温。
[0588]
b-3：
[0589]
柱：phenomenex luna c18，3.0μm，2.0x10mm
[0590]
洗脱剂：(h2o 0.05％tfa)/acn 20:80(0min)至5:95(0.60min)至5:95acn(1.45min)至80:20(1.50min)；1.1ml/min，室温。
[0591]
c：
[0592]
柱：waters acquity uplc beh c18，1.7μm，2.1x50mm
[0593]
洗脱剂：(h2o 0.05％fa)/(acn 0.035％fa)98:2(0min)至98:2(0.2min)至2:98(3.8min)至2:98(4.3min)至98:2(4.5min)，1.0ml/min，55℃。
[0594]
d：
[0595]
柱：chromolith@flash rp-18e 2x25mm
[0596]
洗脱剂：(h2o 0.0375％tfa)/(acn 0.01875％tfa)95:5(0min)至5:95(0.80min)至5:95(1.20min)至95:5(1.21min)至95:5(1.55min)，1.5ml/min，50℃。
[0597]
e：
[0598]
柱：kinetex evo c18e 2.1x30mm，5μm
[0599]
洗脱剂：(h2o 0.0375％tfa)/(acn 0.01875％tfa)95:5(0min)至5:95(0.80min)至5:95(1.20min)至95:5(1.21min)至95:5(1.55min)，1.5ml/min，50℃。
[0600]
所用缩写：
[0601]-acoh：乙酸
[0602]-fa：甲酸
[0603]-acn：乙腈
[0604]-dcm：二氯甲烷
[0605]-dma：二甲基乙酰胺
[0606]-dce：二氯乙烷
[0607]-dmf：二甲基甲酰胺
[0608]-dmso：二甲基亚砜
[0609]-etoac：乙酸乙酯
[0610]-etoh：乙醇
[0611]-et2o：乙醚
[0612]-iproh：异丙醇
[0613]-thf：四氢呋喃
[0614]-meoh：甲醇
[0615]-nmp：n-甲基-2-吡咯烷酮
[0616]-pe：石油醚
[0617]-pyr：吡啶
[0618]-ipr：异丙基
[0619]-ibu：异丁酰基
[0620]-chex：环己基
[0621]-mtb：甲基-叔丁基
[0622]-dipea：二异丙基乙胺
[0623]-dmap：4-(二甲基氨基)-吡啶
[0624]-dbu：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
[0625]-hbtu：(2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓-六氟磷酸盐)
[0626]-tbtu：o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲鎓四氟硼酸盐
[0627]-ddtt：3-((n,n-二甲基-氨基亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-5-硫酮
[0628]-net3：三乙胺
[0629]-nem：n-乙基-吗啉
[0630]-bsa：n,o-双-三甲基甲硅烷基乙酰胺
[0631]-tmsotf：三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐
[0632]-ts：对甲苯磺酰基
[0633]-tf：三氟甲磺酰基
[0634]-三氟甲磺酸盐
[0635]-tfa：三氟乙酸
[0636]-dcaa：二氯乙酸
[0637]-tea：三乙基铵
[0638]-tips：三异丙基甲硅烷基
[0639]-tbdms：叔丁基二甲基甲硅烷基
[0640]-dmt：4,4
’‑
二甲氧基三苯甲基
[0641]-bzl：苯甲酰基
[0642]-bn：苄基
[0643]-bom：苄氧基甲基
[0644]-ac：乙酰基
[0645]-i
bu：异丁酰基
[0646]-boc：叔丁基氧基羰基
[0647]-fmoc：芴基甲氧基羰基
[0648]-fmoc-osu：n-(9-芴基甲氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺
[0649]-ce：氰基乙基
[0650]-cpg：可控孔度玻璃
[0651]-t：胸腺嘧啶
[0652]-u：尿嘧啶
[0653]-c：胞嘧啶
[0654]-a：腺嘌呤
[0655]-g：鸟嘌呤
[0656]-i：次黄嘌呤次黄嘌呤
[0657]-t
bom
：n-苄氧基甲基-胸腺嘧啶
[0658]-u
bom
：n-苄氧基甲基-尿嘧啶
[0659]-u
bzl
：n-苯甲酰基-尿嘧啶
[0660]-c
bzl
：n-苯甲酰基-胞嘧啶
[0661]-a
bzl
：n-苯甲酰基-腺嘌呤
[0662]-g
ibu
：n-异丁酰基-鸟嘌呤
[0663]-galnac：d-n-乙酰基半乳糖胺
[0664]-fr：流速
[0665]-hplc：高压液相色谱法
[0666]-ms-tof：质谱-飞行时间
[0667]-lc-ms：高压液相色谱-质谱法
[0668]-r
t
：保留时间
[0669]-rt：室温
[0670]-hal：卤素
[0671]-elsd：蒸发光散射检测器
[0672]-quant.：定量
[0673]-sat.：饱和
[0674]-i.vac.：在真空中
[0675]-n.d.：未确定
[0676]-tlc：薄层色谱法
[0677]-h：小时
[0678]-min：分钟
[0679]-tm：解链温度
[0680]-r：核糖核苷酸
[0681]-d：脱氧-核糖核苷酸
[0682]-m：2
’‑
ome-核苷酸
[0683]-f：2
’‑
脱氧-氟-核苷酸
[0684]-ss：有义链
[0685]-as：反义链
[0686]-ds：双链
[0687]-chol：胆固醇
[0688]-po：磷酸二酯连接
[0689]-*或ps：硫代磷酸酯连接
[0690]-mpk：mg/kg
[0691]-m：摩尔
[0692]-#：编号，n
°
[0693]-fbs：胎牛血清
[0694]-atp：三磷酸腺苷
[0695]-pre-lb：前体核苷酸
[0696]-pre-lgb：靶向前体核苷酸
[0697]-lb：核苷酸类似物
[0698]-lgb：靶向核苷酸类似物
[0699]
a：式(i)的核苷酸类似物的合成，其中x是nh、nr1、nc(＝o)r1
[0700]
合成方案1
[0701][0702]
1a：乙酸[(2s,3s,4r,5r)-4-乙酰氧基-3-苄氧基-2-(苄氧基甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)四氢呋喃-2-基]甲酯
[0703]
在ar气氛下将42,5g(87,4mmol)起始材料g3和22,3g(174,7mmol)胸腺嘧啶溶解在500ml干acn中。在添加106,6g(128,2ml，524,1mmol)bsa后，将溶液在80℃下搅拌1h。将溶液冷却至50℃后，添加31,8g(25,9ml，141,5mmol)tmsotf并且在80℃下继续加热1h。在真空中蒸发溶剂，并且将残余物溶解在etoac中并且用饱和nahco
3-溶液、h2o和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将有机层蒸发并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的10％至100％乙酸乙酯)，产生所希望的呈无色泡沫的胸苷衍生物1a(40,9g，84,7％)。
[0704]
lcms-方法a：
[0705]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,82
[0706]
电离方法：es-：[m-h]-＝551,3
[0707]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:8.55(s,1h)7.51-7.17(m,12h),6.23(d,j＝5.27hz,1h),5.44(t,j＝5.65hz,1h),4.72-4.35(m,6h),4.19(d,j＝12.17hz,1h),3.79(d,j＝10.16hz,1h),3.53(d,j＝10.16hz,1h)2.17-2.06(m,6h),1.55(d,j＝0.75hz,3h)。
[0708]
1b：乙酸[(2s,3s,4r,5r)-4-乙酰氧基-3-苄氧基-2-(苄氧基甲基)-5-(2,4-二氧
代嘧啶-1-基)-四氢呋喃-2-基]甲酯
[0709]
将10,0g(20,55mmol)g3和3,49g(30,8mmol)尿嘧啶溶解在200ml干acn中。添加20,09g(30,15ml，123,3mmol)bsa后，将溶液在81℃下搅拌1h。将溶液冷却至0℃后，添加7,48g(6,10ml，33,3mmol)tmsotf并且将混合物加热至65℃。在此温度下继续搅拌1h，这时达到完全转化。在室温下，添加500ml饱和nahco
3-溶液并且将混合物用500ml etoac萃取。将有机层分离并且用h2o和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将粗制产物在硅胶上纯化(在正庚烷中的20％至100％etoac)，得到呈无色泡沫的受保护的核苷类似物1b，产率为82,3％(9,11g)。
[0710]
lcms-方法a：
[0711]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,82
[0712]
电离方法：es
：[m h]
＝539,1
[0713]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:8.97(s,1h),7.66(d,j＝8.0hz,1h),7.38-7.35(m,10h),6.19(d,j＝4.0hz,1h),5.38-5.30(m,2h),4.63(d,j＝12.0hz,1h),4.46-4.41(m,5h),4.19(d,j＝12.0hz,1h),3.79(d,j＝12.0hz,1h),3.51(d,j＝12.0hz,1h),2.12(s,3h),2.07(s,3h)。
[0714]
1c：乙酸[(2s,3s,4r,5r)-4-乙酰氧基-3-苄氧基-2-(苄氧基甲基)-5-[2-(2-甲基丙酰基-氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]四氢呋喃-2-基]甲酯
[0715]
在15℃下在n
2-气氛下向化合物g3(148.5g，0.30mol)在6,68l dce中的溶液中添加n-异丁酰基-鸟嘌呤(135g，0.61mol)和bsa(311.85ml，1.2mol)。将混合物在85℃下搅拌3h。然后在85℃下添加tmsotf(183.4g，0.90mol)并且继续搅拌3h，这时tlc显示完全转化。将混合物冷却至室温并且倒入6,5l饱和nahco
3-溶液中。将有机层分离并且将水相用5l dcm萃取两次。将有机层合并，并且经无水na2so4干燥，过滤并且浓缩。将获得的粗制产物通过制备型hplc纯化(0.1％tfa/acn)，产生呈白色固体的化合物1c(128g，64％)。
[0716]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.09(s,1h),11.62(s,1h),8.14(s,1h),7.41-7.30(m,10h),6.12(d,j＝6.4hz,1h),5.90(t,j1＝j2＝5.6hz,1h),4.71(d,j＝5.2hz,1h),4.63-4.55(m,4h),4.34(d,j＝5.6hz,1h),4.23(d,j＝5.6hz,1h),3.71-3.66(m,2h),3.18(d,j＝4.8hz,1h),2.76-2.51(m,1h),2.05(s,3h),1.99(s,3h),1.20-1.12(s,6h)。
[0717]
1d：乙酸[(2s,3s,4r,5r)-4-乙酰氧基-3-苄氧基-2-(苄氧基甲基)-5-(6-氧代-1h-嘌呤-9-基)-四氢呋喃-2-基]甲基酯
[0718]
从10,0g(20,55mmol)g3和3,32g(23,66mmol)次黄嘌呤作为核碱基开始，按照针对1c所述的方案合成标题化合物。硅胶纯化(在正庚烷中的10％至100％etoac/meoh(9:1))后，分离出呈无色泡沫的标题化合物1d(9,53g，81,1％)。
[0719]
lcms-方法a：
[0720]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,73
[0721]
电离方法：es
：[m h]
＝563,3
[0722]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.42(s,1h),8.22(s,1h),8.01(s,1h),7.25-7.39(m,10h),6.21(d,j＝4.89hz,1h),5.90-5.97(m,1h),4.78(d,j＝5.75hz,1h),4.45-4.61(m,4h),4.32-4.41(m,1h),4.17-4.25(m,1h),3.59-3.74(m,2h),2.04(m,3h),1.98(m,3h)。
[0723]
1e：乙酸[(2s,3s,4r,5r)-4-乙酰氧基-5-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-3-苄氧基-2-(苄氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]甲酯
[0724]
在室温下向化合物g3(164g，0,337mol)和n-苯甲酰基腺嘌呤(121g，0,506mol)在6,56l dce中的混合物中逐滴添加bsa(274g，1,348mol)并且将混合物在90℃下搅拌1.5h。在40℃-50℃下逐滴添加tmsotf(225g，1,011mol)后，将混合物在90℃下搅拌1h。将混合物用15l饱和nahco
3-溶液淬灭并且分离各层。将水层用3l etoac萃取2次并且将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗制产物通过快速色谱法纯化(pe/etoac 1:2)以得到呈黄色油状物的作为异头物混合物的化合物1e(224,4g)。将混合物通过两次反向快速色谱法(中性)纯化以得到呈无色泡沫的纯化合物1e(75,5g，33,7％)。
[0725]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.25(s,1h),8.72(s,1h),8.62(s,1h),8.05(d,j＝7.40hz,2h),7.71-7.62(m,1h),7.60-7.50(m,2h),7.43-7.21(m,10h),6.38(d,j＝4.77hz,1h),6.12(t,j＝5.33hz,1h),4.88(d,j＝5.77hz,1h),4.63(s,2h),4.56-4.45(m,2h),4.41(d,j＝11.92hz,1h),4.25(d,j＝11.80hz,1h),3.75-3.59(m,2h),2.06(s,3h),2.00(s,3h)。
[0726]
2a：1-[(2r,3r,4s,5r)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0727]
在0℃下向40,9g(74,0mmol)1a在500ml thf/etoh(4:1)中的溶液中添加221,9ml(443,8mmol)naoh-水溶液(2m)。移除冰浴后，将混合物搅拌2h以达到完全转化。通过添加2n hcl-溶液使溶液在0℃下达到中性ph。将溶剂在真空中浓缩并且将剩余的水相用250ml dcm萃取两次。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发以产生34,8g(定量)受保护的产物2a，其不经进一步纯化而用于以下步骤。
[0728]
lcms-方法a：
[0729]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,64
[0730]
电离方法：es
：[m h]
＝469,2
[0731]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:9.24-8.77(m,1h),7.45(br s,1h),7.41-7.30(m,8h),7.27(br d,j＝7.78hz,2h),6.04(br d,j＝4.02hz,1h),4.86(br d,j＝11.67hz,1h),4.63-4.51(m,3h),4.45-4.31(m,2h),4.31-3.96(m,1h),3.84(br d,j＝11.29hz,1h),3.76-3.64(m,2h),3.58(d,j＝10.42hz,1h),2.96-2.62(m,1h),1.63-1.51(m,3h)。
[0732]
2b：1-[(2r,3r,4s,5r)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[0733]
将9,10g(16,9mmol)1b溶解在240ml thf/etoh(3:1)中。在0℃下，添加8,49ml(84,5mmol)1m naoh溶液并且将溶液搅拌，允许达到室温。1h后，添加柠檬酸直至ph达到7并且蒸发溶剂。将水性残余物用etoac萃取。将有机层分离并且用饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂，产生7,66g(99,7％)呈无色泡沫的粗制产物，其不经进一步纯化使用。
[0734]
lcms-方法a：
[0735]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,63
[0736]
电离方法：es
：[m h]
＝455,1
[0737]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.29(s,1h),7.69(d,j＝8.2hz,1h),7.27-7.41(m,10h),5.88(d,j＝5.7hz,1h),5.57(d,j＝7.2hz,1h),5.37(d,j＝8.1hz,1h),4.98
(t,j＝5.4hz,1h),4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.46-4.58(m,3h),4.27-4.37(m,1h),4.00-4.14(m,1h),3.50-3.69(m,4h)。
[0738]
2c：n-[9-[(2r,3r,4s,5r)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0739]
在0℃下向化合物1c(72g，0.11mol)在1,7l thf/etoh(4:1)中的溶液中逐滴添加1mnaoh-溶液(443ml)。将溶液在0℃下搅拌1h以达到完全转化。通过添加1n hcl将ph调节至7，并且除去溶剂。将残余物溶解在h2o(500ml)中并且用3x500ml dcm萃取。将有机层合并，经无水na2so4干燥并且浓缩以得到呈无色固体的化合物2c(113g，定量)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。
[0740]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.07(s,1h),11.66(s,1h),8.10(s,1h),7.42-7.30(m,10h),5.92(d,j＝6.8hz,1h),4.99(s,1h),4.87-4.84(m,2h),4.63(d,j＝15.6hz,1h),4.56(s,2h),4.24(d,j＝4.8hz,1h),3.69-3.62(m,4h),2.76-2.73(m,1h),1.13-1.04(m,7h)。
[0741]
2d：9-[(2r,3r,4s,5r)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]-1h-嘌呤-6-酮
[0742]
按照针对2b所述的程序，将9,34g(16,65mmol)1d脱保护以产生7,76g(97,4％)作为粗制产物的标题化合物2d，其不经额外纯化而使用。
[0743]
lcms-方法a：
[0744]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,53
[0745]
电离方法：es
：[m h]
＝479,3
[0746]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.16(s,1h),7.97-8.04(m,1h),7.27-7.41(m,10h),5.97(d,j＝5.75hz,1h),5.75(s,1h),5.03(br s,1h),4.79-4.92(m,2h),4.47-4.62(m,3h),4.24-4.34(m,1h),3.55-3.70(m,4h)。
[0747]
2e：n-[9-[(2r,3r,4s,5r)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0748]
按照针对2b所述的程序，将144g(216mmol)1e脱保护以产生126g(定量，粗品)呈无色泡沫的标题化合物2e，其不经额外纯化而使用。
[0749]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.23(s,1h),8.73(s,1h),8.59(s,1h),8.05(br d,j＝7.46hz,2h),7.71-7.63(m,1h),7.61-7.52(m,2h),7.49-7.23(m,10h),6.16(d,j＝5.75hz,1h),5.85(d,j＝7.46hz,1h),5.14-4.99(m,2h),4.86(d,j＝11.86hz,1h),4.63(d,j＝11.74hz,1h),4.53(s,2h),4.38(d,j＝5.14hz,1h),3.79-3.57(m,4h)。
[0750]
3a：1-[(2r,3r,4s,5s)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0751]
将34,7g(74,2mmol)起始化合物2a和16,8g(244,7mmol)咪唑溶解在300ml干dcm中。在室温下，添加16,2g(18,0ml，81,6mmol)tips-氯化物在200ml dcm中的溶液并且将反应搅拌19h。用etoh淬灭后，蒸发溶剂并且将残余物溶解在etoac中。将有机溶液用h2o、1m hcl、h2o和饱和nahco
3-溶液洗涤，然后用饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物(47,1g)通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的10％至100％etoac)，得到呈无色泡沫的所希望的tips-保护的产物3a(37,5g，80,9％)。
[0752]
lcms-方法a：
[0753]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,22
[0754]
电离方法：es
：[m h]
＝625,3
[0755]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:8.52(s,1h),7.35-7.13(m,11h),5.88(d,j＝3.89hz,1h),4.72-4.63(m,1h),4.60-4.51(m,1h),4.46(s,2h),4.34-4.26(m,1h),4.22(d,j＝6.27hz,1h),3.90(d,j＝10.92hz,1h),3.77(d,j＝1.00hz,2h),3.63-3.51(m,2h),1.52(d,j＝0.88hz,3h),1.12-0.90(m,21h)。
[0756]
3b：1-[(2r,3r,4s,5s)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[0757]
从7,66g(16,8mmol)2b开始，如针对3a的方案中所述制备标题化合物，在硅胶色谱法(在正庚烷中的20％至80％etoac)后产生8,69g(84,5％)所希望的甲硅烷基化产物3b。
[0758]
lcms-方法a：
[0759]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,23
[0760]
电离方法：es
：[m h]
＝611,2
[0761]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:9.04(s,1h),7.63(d,j＝8.0hz,1h),7.37-7.34(m,8h),7.26-7.24(m,2h),5.96(d,j＝4.0hz,1h),5.37(d,j＝8.0hz,1h),4.77(d,j＝12.0hz,1h),4.62(d,j＝12.0hz,1h),4.49(s,2h),4.26(d,j＝8.0hz,1h),3.83(dd,j＝8.0,10.0hz,2h),3.63(dd,j＝8.0,10.0hz,2h),1.15-1.04(m,21h)。
[0762]
3c：n-[9-[(2r,3r,4s,5s)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0763]
在0℃下在n
2-气氛下向化合物2c(75g，133mmol)在无水dcm(1568ml)中的溶液中添加咪唑(38g，559mmol)和tipscl(35.9g，186mmol)。在10℃至15℃下搅拌12h后，将溶液倒入冰水(2l)中并且用dcm(3x1.5l)萃取。将有机层合并，并且用盐水(1l)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(pe/etoac 2:1至etoac)，产生65g(68％)呈白色泡沫的标题化合物3c。
[0764]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.07(s,1h),11.61(s,1h),8.14(s,1h),7.37-7.22(m,10h),5.89(d,j＝6.8hz,1h),5.72(d,j＝5.6hz,1h),4.94-4.93(m,2h),4.90-4.53(m,3h),4.19(d,j＝4.4hz,1h),3.92-3.88(m,2h),3.85-3.71(m,2h),2.78-2.71(m,1h),1.13-1.05(m,6h),1.00-0.94(m,21h)。
[0765]
3d：9-[(2r,3r,4s,5s)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]-1h-嘌呤-6-酮
[0766]
从7,75g(16,2mmol)2d开始，如针对3a的方案中所述制备标题化合物，在硅胶色谱法(在正庚烷中的0至100％etoac/meoh(9:1))后产生8,60g(83,6％)所希望的甲硅烷基化产物3d。
[0767]
lcms-方法a：
[0768]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,19
[0769]
电离方法：es
：[m h]
＝635,5
[0770]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.38(br s,1h),8,22(s,1h),8,03(s,1h),7.26-7.39(m,10h),5.94(d,j＝6.85hz,1h),5.67(d,j＝6.48hz,1h),4.98-4.74(m,2h),
4.61-4.48(m,3h),4.24(d,j＝4.89hz,1h),3.97-3.82(m,2h),3.69(s,2h),0.80-1.18(m,21h)。
[0771]
3e：n-[9-[(2r,3r,4s,5s)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0772]
在室温下向化合物2e(135g，0.232mol)和咪唑(47.4g，0.696mol)在1,35l dcm中的混合物中添加tipscl(80.6g，0.418mol)在1,35l dcm中的溶液。将混合物搅拌24h。用400ml etoh淬灭后，将混合物用1,5l水洗涤。将水层用1l etoac萃取两次并且将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗制产物通过快速色谱法纯化(pe/etoac 2:1)以产生呈白色泡沫的甲硅烷基醚3e(145g，84.8％)。
[0773]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.23(s,1h),8.74(s,1h),8.63(s,1h),8.06(d,j＝7.28hz,2h),7.71-7.62(m,1h),7.60-7.51(m,2h),7.44-7.23(m,10h),6.13(d,j＝6.78hz,1h),5.77(d,j＝6.40hz,1h),5.21-5.10(m,1h),4.94(d,j＝11.92hz,1h),4.66-4.50(m,3h),4.30(d,j＝4.77hz,1h),4.00-3.86(m,2h),3.74(s,2h),1.11-0.89(m,21h)。
[0774]
4a：1-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0775]
在高压釜中，将13,4g(21,4mmol)双-苄基醚3a在100ml etoh中的溶液脱气并且用氩气吹扫。在添加催化量的pd(oh)2(在碳上20％)后，将溶液在4巴的h
2-气氛下放置1h。将pd催化剂滤出并且将滤液蒸发，得到9,74g(定量)所希望的呈无色泡沫的脱苄基化产物。
[0776]
lcms-方法a：
[0777]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,84
[0778]
电离方法：es
：[m h]
＝445,3
[0779]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:8.85(s,1h),7.25(d,j＝1.00hz,1h),5.58(d,j＝6.15hz,1h),4.71-4.61(m,1h),4.51-4.44(m,1h),4.02-3.95(m,1h),3.94-3.89(m,1h),3.88-3.77(m,3h),3.76-3.67(m,1h),3.22(br dd,j＝6.71,3.83hz,1h),1.93(d,j＝1.00hz,3h),1.00-1.24(m,21h)。
[0780]
4b：1-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[0781]
从8,69g(14,2mmol)3b开始，如针对4a的方案中所述制备标题化合物，产生6,21g(定量，粗品)所希望的产物4b，其不经纯化而使用。
[0782]
lcms-方法a：
[0783]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,78
[0784]
电离方法：es
：[m h]
＝431,1
[0785]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.29(s,1h),7.91(d,j＝8.0hz,1h),5.87(d,j＝8.0hz,1h),5.69(d,j＝8.0hz,1h),5.28(d,j＝8.0hz,1h),5.12(t,j＝4.0hz,1h),5.00(d,j＝4.0hz,1h),4.19(dd,j＝8.0,12.0hz,1h),4.05(t,j＝4.0hz,2h),3.81(dd,j＝8.0,12.0hz,2h),3.62(d,j＝4.0hz,2h),1.05-1.00(m,21h)。
[0786]
4c：n-[9-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0787]
在-70℃下在n
2-气氛下向化合物3c(95g，0.132mol)在无水dcm(300ml)中的溶液
中添加bcl3(921ml)。将反应溶液在-75℃与-60℃之间搅拌2h，这时通过tlc检测到完全转化。向混合物中添加大约200ml nh3在meoh中的饱和溶液。将ph调节至10-11并且在减压下除去溶剂。将粗制产物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(pe/etoac 20:1至4:1)，产生呈黄色固体的脱苄基化产物4c(51g，产率71.6％)。
[0788]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.86(s,2h),8.27(s,1h),5.83(d,j＝7.2hz,1h),5.42(s,1h),5.06(s,2h),4.64(s,1h),4.17(d,j＝4.0hz,1h),3.89(d,j＝10.8hz,1h),3.79(d,j＝10.4hz,1h),3.67(s,2h),2.80-2.73(m,1h),1.17-1.08(m,6h),1.02-0.92(m,21h)。
[0789]
4d：9-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]-1h-嘌呤-6-酮
[0790]
将8,59g(13,53mmol)起始化合物3d溶解在200ml dcm中。冷却至-70℃至-50℃后，经15min的时间段添加74,4ml(74,4mmol)bcl3在甲苯中的1m溶液。在-70℃下搅拌另外15min后，移除冷却浴并且在室温下继续搅拌另外30min。然后将反应溶液逐滴添加到180ml nh3在meoh中的7m溶液中。搅拌20min后，将混合物蒸发并且将残余物溶解在100ml dcm/iproh(4:1)中。用饱和nahco
3-溶液洗涤后，分离各层并且将水层用dcm/iproh(4:1)萃取3次。将合并的有机层用mgso4干燥，过滤并且蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至10％meoh)，产生4,14g(67,3％)呈无色泡沫的标题化合物4d。
[0791]
lcms-方法a：
[0792]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,74
[0793]
电离方法：es-：[m-h]-＝453,4
[0794]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.38(m,1h),8.33(s,1h),8.07(s,1h),5.87(d,j＝7.34hz,1h),5.37(d,j＝6.97hz,1h),5.01-5.14(m,2h),4.64-4.76(m,1h),4.15-4.20(m,1h),3.81-3.93(m,2h),3.65(d,j＝5.14hz,2h),0.94-1.14(m,21h)。
[0795]
4e：n-[9-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0796]
在-70℃下向化合物3e(31g，42,0mmol)在620ml dcm中的溶液中逐滴添加bcl3(252ml，0,252mol)。将混合物在-70℃下在n2下搅拌30min并且温热至15℃。在此温度下再搅拌30min后，将反应混合物小心倒入600ml在meoh中的7m nh3中，同时保持温度低于-20℃。蒸发后，将残余物溶解在3l dcm/iproh(4:1)中并且用1l水和饱和nahco
3-溶液洗涤。将合并的水层用2x1 l dcm/iproh(4:1)萃取并且将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(pe/etoac 1:4)以得到呈白色固体的化合物4e(16,9g，产率72.2％)。
[0797]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.23(s,1h),8.77(s,1h),8.72(s,1h),8.06(d,j＝7.28hz,2h),7.70-7.61(m,1h),7.60-7.51(m,2h),6.06(d,j＝7.53hz,1h),5.48(d,j＝6.90hz,1h),5.22-5.11(m,2h),4.93-4.83(m,1h),4.24(t,j＝4.77hz,1h),3.92(q,j＝10.67hz,2h),3.78-3.62(m,2h),1.14-1.01(m,21h)。
[0798]
5a：1-[(2r,6s)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0799]
将2,93g(6,6mmol)起始材料4a溶解在120ml丙酮/h2o(4:1)中。添加1,69g(7,
9mmol)naio4在50ml h2o中的溶液并且将混合物在室温下搅拌1h。将沉淀物滤出并且将滤液在真空中浓缩。将剩余的水溶液用200ml etoac萃取。将有机层用h2o和饱和nacl-溶液洗涤后，将其用mgso4干燥并且在减压下除去溶剂，得到2,86g(94,1％)呈无色固体的所希望的产物，其不经进一步纯化使用。
[0800]
lcms-方法b-1：
[0801]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,04
[0802]
电离方法：es
：[m h-h2o]
＝443,2
[0803]
5b：1-[(2r,6s)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[0804]
从6,21g(14,4mmol)4b开始，按照4a中所述的方案制造标题化合物，这得到6,38g(99％)呈粗制产物的所希望的产物5b，其不经额外纯化而使用。
[0805]
lcms-方法b-1：
[0806]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,00
[0807]
电离方法：es
：[m h-h2o]
＝429,5
[0808]
5c：n-[9-[(2r,6s)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0809]
在25℃下向化合物4c(25g，46mmol)在丙酮(485ml)和水(145ml)的混合溶剂中的溶液中添加naio4(13.9g，65mmol)在水(150ml)中的溶液，并且将混合物搅拌12h。在真空中蒸发溶剂后，将残余物溶解在etoac(500ml)中并且用饱和nahco
3-溶液(500ml)和盐水(500ml)洗涤。将有机层用na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到呈白色固体的粗品5c(25.7g，定量)，其不经进一步纯化使用。
[0810]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.05(br s,1h),11.79(s,1h),8.17(s,1h),7.52(d,j＝5.62hz,1h),6.23(s,1h),5.34(d,j＝5.62hz,1h),5.23(s,1h),4.46(d,j＝9.54hz,1h),4.15-4.04(m,1h),3.93(d,j＝9.78hz,1h),3.85(d,j＝10.03hz,1h),3.71(d,j＝10.03hz,1h),2.85-2.66(m,1h),1.12(d,j＝6.85hz,6h),1.07-0.95(m,21h)。
[0811]
5d：9-[(2r,6s)-3,5-二羟基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-1h-嘌呤-6-酮
[0812]
将4,14g(9,1mmol)起始材料4d溶解在120ml丙酮/h2o(4:1)中。添加2,63g(12,3mmol)naio4在50ml h2o中的溶液并且将混合物在室温下搅拌18h。将沉淀物滤出并且将滤液在真空中浓缩。向剩余的水溶液中添加100ml饱和nahco3-溶液并且将水层用100ml dcm/iproh(4:1)萃取两次。将有机层用mgso4干燥并且在减压下除去溶剂，得到4,27g(99,7％)呈无色泡沫的所希望的产物5d，其不经进一步纯化使用。
[0813]
lcms-方法a：
[0814]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,82
[0815]
电离方法：es
：[m h-h2o]
＝453,3
[0816]
6a：1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0817]
在室温下在n
2-气氛下向化合物5a(31g，67mmol)在无水meoh(527ml)中的溶液中添加(nh4)2b2o
7 4h2o(19.5g，74mmol)。将混合物搅拌2h，然后添加acoh(8.08g，134mmol)、
分子筛(62g)和nabh3cn(8.44g，134mmol)。将混合物在室温下在n
2-气氛下搅拌12h直到tlc显示起始材料完全消耗。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在水(200ml)中并且用dcm(3x200ml)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(dcm/meoh 50:1至10:1)，产生呈无色固体的化合物6a(19.5g，67％)。
[0818]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.27(br s,1h),7.71-7.52(m,1h),5.90-5.68(m,1h),4.68-4.46(m,1h),4.05-3.83(m,2h),3.40(br d,j＝5.38hz,2h),2.83(br d,j＝9.78hz,1h),2.79-2.72(m,1h),2.66(br d,j＝12.96hz,2h),1.79(s,3h),1.22-0.83(m,23h)。
[0819]
6c：n-[9-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0820]
从25,7g(46,4mmol)化合物5c开始，按照针对6a所述的方案合成标题化合物，产生呈无色固体的所希望的吗啉6c(7,5g，30,6％)。
[0821]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.56(br s,1h),8.13-8.25(m,1h),5.67-5.81(m,2h),4.56(br s,1h),4.08(br d,j＝9.54hz,1h),3.83(br d,j＝9.29hz,1h),3.39-3.48(m,2h),3.10(br d,j＝9.54hz,1h),2.65-2.93(m,4h),1.12(br d,j＝6.60hz,7h),0.96-1.07(m,21h)。
[0822]
7a：1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(从6a)
[0823]
在室温下在n
2-气氛下向化合物6a(19,5g，45,7mmol)在无水meoh(390ml)中的溶液中添加分子筛(39g)、丙酮(13,25g，228mmol)和nabh3cn(14,4g，228mmol)。搅拌2h后，用acoh(约2.0ml)将混合物调节至ph＝5至6，并且继续搅拌12h，这时通过tlc检测到起始材料完全消耗。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在水(500ml)中。用dcm(3x500ml)萃取后，将有机层合并，经na2so4干燥并且在真空中浓缩。通过硅胶色谱法纯化(dcm/meoh 50:1至10:1)后，获得呈无色固体的标题化合物7a(17g，81％)。
[0824]
7a：1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(从5a)
[0825]
将2,85g(6,2mmol)起始化合物5a、1,26g(1,74ml，12,4mmol)net3、3,73g(3,56ml，61,9mmol)acoh和924mg(1,34ml，15,5mmol)异丙胺溶解在60ml干meoh中。在室温下，添加1,64g(24,8mmol)氰基硼氢化钠并且将溶液在60℃下搅拌2h。冷却到室温后，将反应混合物倒入100ml饱和nahco
3-溶液中并且将溶剂在减压下浓缩。将剩余的水相用etoac萃取，将其用饱和nahco
3-溶液和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，蒸发溶剂并且将粗制产物(3,0g)通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的10％至80％乙酸乙酯)，产生1,76g(60,7％)呈无色固体的所希望的吗啉7a。
[0826]
lcms-方法a：
[0827]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,80
[0828]
电离方法：es
：[m h]
＝470,2
[0829]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.30(s,1h),7.63(s,1h),5.77(dd,j＝10.42,2.89hz,1h),4.61(t,j＝5.90hz,1h),4.00(d,j＝9.29hz,1h),3.74(d,j＝9.03hz,1h),3.53-3.41(m,2h),2.83-2.63(m,3h),2.26(br d,j＝11.29hz,1h),2.21-2.07(m,1h),1.80
(s,3h),1.14-1.00(m,21h),0.97(d,j＝6.53hz,6h)。
[0830]
7b：1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-嘧啶-2,4-二酮(从5b)
[0831]
在室温下向5b(6,38g，14,3mmol)在150ml meoh中的溶液中添加8,62g(8,23ml，142,8mmol)acoh、2,90g(3,98ml，28,6mmol)net3和2,13g(3,09ml，35,7mmol)异丙胺。1h后，添加3,78g(57,1mmol)氰基硼氢化钠并且继续在室温下搅拌1h，然后在65℃下搅拌另外一小时。将混合物冷却至室温并且添加150ml饱和nahco
3-溶液并且在真空中蒸发meoh。将水溶液用350ml etoac萃取并且将有机层用饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后,除去溶剂并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至5％meoh)，这得到3,18g(48,9％)呈无色固体的标题化合物7b。
[0832]
lcms-方法a：
[0833]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,76
[0834]
电离方法：es
：[m h]
＝456,4
[0835]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.32(b s,1h),7.77(d,j＝8.07hz,1h),5.75(dd,j＝9.90,2.81hz,1h),5.61(d,j＝8.07hz,1h),4.62(t,j＝5.93hz,1h),3.99(d,j＝9.29hz,1h),3.74(d,j＝9.17hz,1h),3.45(dd,j＝10.33,6.05hz,2h),2.82(br d,j＝10.27hz,1h),2.64-2.77(m,2h),2.24(d,j＝11.37hz,1h),2.03-2.13(m,1h),1.00-1.10(m,21h),0.96(m,6h)。
[0836]
7c：n-[9-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺(从6c)
[0837]
从7,5g(14,0mmol)6c开始，按照针对7a所述的方案合成标题化合物(从6a)。在硅胶上最终纯化(pe/etoac 4:1至1:1)后，分离出呈无色固体的7c(5,13g，63％)。
[0838]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.09(s,1h),11.56(s,1h),8.22(s,1h),5.80(dd,j＝9.79,2.76hz,1h),4.60(t,j＝6.27hz,1h),4.09(d,j＝8.78hz,1h),3.71(d,j＝8.78hz,1h),3.48(d,j＝6.27hz,2h),2.98(br d,j＝10.04hz,1h),2.89-2.65(m,3h),2.43(t,j＝10.42hz,1h),2.34(d,j＝11.29hz,1h),1.13(d,j＝6.78hz,6h),1.08-1.01(m,21h),0.99(d,j＝6.27hz,6h)。
[0839]
7d：9-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-1h-嘌呤-6-酮(从5d)
[0840]
将4,27g(9,1mmol)起始化合物5d溶解在100ml meoh中。添加1,84g(2,53ml，18,1mmol)net3、5,44g(5,19ml，90,6mmol)acoh和808mg(1,17ml，13,6mmol)异丙胺后，将溶液在室温下搅拌1h。添加1,80g(27,2mmol)氰基硼氢化钠并且将反应在室温下搅拌30min并且在60℃下搅拌另外30min，这时检测到完全转化。向反应混合物中添加100ml饱和nahco
3-溶液并且蒸发meoh。将剩余的水相用250ml etoac萃取。将有机层用饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至5％meoh)，产生呈无色固体的标题化合物7d(2,68g，61,7％)。
[0841]
lcms-方法a：
[0842]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,80
[0843]
电离方法：es
：[m h]
＝480,4
[0844]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.35(br s,1h),8.31(s,1h),8.06(s,1h),5.91(dd,j＝9.90,2.81hz,1h),4.57(t,j＝6.05hz,1h),4.11(d,j＝9.05hz,1h),3.77(d,j＝9.05hz,1h),3.40-3.50(m,2h),2.94-3.02(m,1h),2.67-2.87(m,2h),2.54-2.63(m,1h),2.33(d,j＝11.37hz,1h),0.97-1.11(m,27h)。
[0845]
合成方案2：
[0846][0847]
1g：乙酸[(2s,3s,4r,5r)-4-乙酰氧基-3-苄氧基-2-(苄氧基甲基)-5-(6-氯嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基]甲酯
[0848]
将12,60g(25,9mmol)碳水化合物构建块g3和6,19g(38,9mmol)6-氯-嘌呤溶解在175ml干acn中。在ar气氛下，在0℃下添加12,07g(11,84ml，77,7mmol)dbu和23,26g(18,99ml，103,6mmol)tmsotf。移除冰浴并且将反应在室温下搅拌1h并且在80℃下搅拌另外h，这时检测到完全转化。将溶液冷却至室温并且倒入500ml饱和nahco
3-溶液中。剧烈搅拌1h后，将水溶液用300ml etoac萃取。将有机层分离并且用饱和nahco
3-溶液/h2o(1:1)和饱和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物(15,78g)在硅胶上纯化(在正庚烷中的10％至100％etoac)以产生12,31g(81,8％)呈浅黄色泡沫的标题化合物1g。
[0849]
lcms-方法c：
[0850]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,57
[0851]
电离方法：es-：[m-h fa]-＝625,1
[0852]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.80(s,1h),8.75(s,1h),7.16-7.39(m,10h),6.38(d,j＝4.2hz,1h),6.10(dd,j＝5.6,4.3hz,1h),4.86(d,j＝5.7hz,1h),4.54-4.68(m,2h),4.37-4.47(m,3h),4.24(d,j＝12.0hz,1h),3.69(d,j＝10.1hz,1h),3.60(d,j＝10.1hz,1h),2.05(s,3h),1.99(s,3h)。
[0853]
2h：(2r,3r,4s,5r)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-5-(羟基-甲基)四氢呋喃-3-醇
[0854]
将12,30g(21,2mmol)氯嘌呤核糖苷1g溶解在40ml acn中。添加68,0g(77,2ml，1,40mol)氨水(35％)后，将反应溶液转移到高压釜中并且在70℃下加热18h。将反应混合物蒸发并且将水性残余物用150ml dcm/异丙醇(4:1)萃取3次。将有机层合并，用mgso4干燥并且蒸发，以产生9,37g粗制产物，将其从400ml acn中重结晶，这得到6,92g(68,5％)呈无色固
体的腺苷类似物2h。
[0855]
lcms-方法c：
[0856]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,69
[0857]
电离方法：es
：[m h]
＝477,9
[0858]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.22(s,1h),8.12(s,1h),7.24-7.42(m,12h),6.01(d,j＝5.7hz,1h),5.72(d,j＝7.3hz,1h),5.01(br t,j＝5.1hz,1h),4.91-4.98(m,1h),4.84(d,j＝11.9hz,1h),4.60(d,j＝11.7hz,1h),4.51(s,2h),4.34(d,j＝5.3hz,1h),3.57-3.72(m,4h)。
[0859]
2e：n-[9-[(2r,3r,4s,5r)-4-苄氧基-5-(苄氧基甲基)-3-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0860]
在ar气氛下将6,91g(14,5mmol)2h溶解在100ml吡啶中。在室温下，添加10,17g(8,41ml，72,4mmol)苯甲酰氯并且将反应搅拌1h。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在h2o中并且用etoac萃取。将有机层分离并且用1n hcl(2x250ml)、h2o(1x200ml)、饱和nahco
3-溶液(2x200ml)和饱和nacl-溶液(1x200ml)洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物(14,66g，黄色泡沫)溶解在140ml吡啶/etoh(1:1)中。在室温下，添加108,5ml(217,1mmol)2n naoh并且将反应混合物30min搅拌。添加11ml acoh后，将反应溶液在真空中浓缩。将残余物用200ml h2o处理并且用200ml etoac萃取。将有机层用1n hcl(2x200ml)、h2o(1x200ml)和饱和nahco
3-溶液(1x200ml)洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物(9,0g)在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的20％至100％meoh/etoac(9:1))得到7,25g(86,1％)呈无色泡沫的标题化合物2e。
[0861]
lcms-方法c：
[0862]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,12
[0863]
电离方法：es
：[m h]
＝582,4
[0864]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.19(s,1h),8.72(s,1h),8.58(s,1h),8.05(br d,j＝7.3hz,2h),7.64(br t,j＝7.3hz,1h),7.52-7.60(br t,2h),7.25-7.44(m,10h),6.15(d,j＝5.6hz,1h),5.82(d,j＝7.5hz,1h),4.99-5.08(m,2h),4.86(d,j＝11.9hz,1h),4.62(d,j＝11.9hz,1h),4.52(s,2h),4.38(d,j＝5.1hz,1h),3.59-3.74(m,4h)。
[0865]
合成方案3
[0866][0867]
8：苯甲酸[(2s,6r)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-吗啉-2-基]甲酯
[0868]
将6,00g(13,2mmol)起始材料7b溶解在80ml干吡啶中。在室温下添加2,80g(2,32ml，19,75mmol)苯甲酰氯并且将反应搅拌20h以实现完全转化。蒸发溶剂后，将残余物溶解在etoac中，用2x100ml 10％柠檬酸-溶液、h2o、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。将有机层用mgso4干燥并且蒸发，产生7,99g(定量)呈无色泡沫的标题化合物，其不经进一步纯化使用。
[0869]
lcms-方法a：
[0870]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,23
[0871]
电离方法：es
：[m h]
＝560,5
[0872]
9：苯甲酸[(2s,6r)-6-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-吗啉-2-基]甲酯
[0873]
将起始化合物8(7,99g粗品，13,2mmol)溶解在200ml干acn中。添加22,88g(31,
4ml，223,8mmol)net3和11,13g(158,0mmol)1h-1,2,4-三唑后，将溶液冷却至0℃并且在剧烈搅拌下添加6,06g(3,68ml 39,5mmol)pocl3在50ml干acn中的溶液。移除冰浴并且将溶液搅拌2h。在减压下蒸发约200ml溶剂并且将剩余的溶液倒入500ml饱和nacho
3-溶液/h2o(1:1)中。将水性混合物用150ml dcm萃取3次并且将合并的有机萃取物用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制中间体(9,1g，黄色泡沫)溶解在200ml acn中并且添加100ml氨水-溶液(32％)。将反应溶液在室温下搅拌18h，这时实现完全转化。在减压下除去溶剂并且将100ml h2o添加到残余物中。用2x200ml dcm萃取，将有机相用mgso4干燥并且蒸发溶剂得到7,65g(定量)粗制化合物9，其不经额外纯化而使用。
[0874]
lcms-方法a：
[0875]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,02
[0876]
电离方法：es-：[m-h]-＝557,4
[0877]
10：苯甲酸[(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]甲酯
[0878]
将7,64g(13,2mmol)起始化合物9溶解在130ml干吡啶中。在室温下，添加2,90g(2,40ml，20,5mmol)苯甲酰氯并且将溶液搅拌20h，这时实现完全转化。蒸发溶剂后，将残余物溶解在etoac中，用2x100ml 10％柠檬酸-溶液、h2o、饱和nahoc
3-和nacl-溶液洗涤。将有机层用mgso4干燥并且蒸发，产生8,88g粗制产物，将其通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生6,69g(76,7％)呈浅黄色泡沫的标题化合物10。
[0879]
lcms-方法a：
[0880]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,29
[0881]
电离方法：es-：[m-h]-＝661,5
[0882]
7f：n-[1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[0883]
将3,63g(5,48mmol)化合物10溶解在45ml吡啶/etoh(2:1)中。在0℃下添加27,4ml(27,4mmol)1m naoh-溶液。将溶液在0℃下搅拌30min并且在室温下搅拌另外3h以实现完全转化。通过添加柠檬酸一水合物(大约2,0g)将ph调节至约6。在35℃下除去有机溶剂并且将水溶液用etoac萃取。将有机相用150ml 10％柠檬酸溶液、h2o、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤3次。用mgso4干燥后，蒸发溶剂。将获得的粗制产物(2,73g，黄色泡沫)通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的10％至70％etoac)，这得到2,25g(73,4％)呈浅黄色泡沫的标题化合物7f。
[0884]
lcms-方法a：
[0885]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,89
[0886]
电离方法：es
：[m h]
＝559,5
[0887]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.23(s,1h),8.31(d,j＝7.5hz,1h),8.01(d,j＝7.3hz,2h),7.63(t,j＝7.5hz,1h),7.52(m,2h),7.37(d,j＝7.5hz,1h),5.86(dd,j＝9.5,2.6hz,1h),4.67(t,j＝5.9hz,1h),4.06(d,j＝9.4hz,1h),3.76(d,j＝9.3hz,1h),3.51(m,2h),2.98(br d,j＝10.5hz,1h),2.64-2.83(m,2h),2.31(m,1h),2.00(m,1h),0.93-1.14(m,27h)。
[0888]
合成方案4
[0889][0890]
11：苯甲酸[(2s,6r)-4-异丙基-6-(6-氧代-1h-嘌呤-9-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]甲酯
[0891]
将2,68g(5,59mmol)起始材料7d、2,53g(3,42ml，19,55mmol)dipea和0,34g(2,79mmol)dmap溶解在50ml干dcm中。在室温下添加1,18g(0,97ml，8,38mmol)苯甲酰氯并且将反应搅拌18h以实现完全转化。添加20ml meoh后，蒸发溶剂并且将残余物溶解在etoac中，用2x100ml 10％柠檬酸-溶液、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。将有机层相用mgso4干燥并且蒸发，产生3,47g(定量，粗品)呈无色泡沫的标题化合物11，其不经进一步纯化使用。
[0892]
lcms-方法a：
[0893]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,18
[0894]
电离方法：es
：[m h]
＝584,4
[0895]
12：苯甲酸[(2s,6r)-6-(6-氯嘌呤-9-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]甲酯
[0896]
将起始化合物11(2,86g粗品，4,90mmol)、n,n-二甲基苯胺(1,28g，1,34ml，10,53mmol)和四乙基氯化铵(1,24g，7,35mmol)溶解在30ml干acn中。在搅拌下，在室温下添加1,70g(1,03ml，11,07mmol)pocl3并且将溶液回流3h。冷却至室温后，将混合物倒入150ml饱和nahco
3-溶液中并且另外添加3,0g固体nahco3。将反应搅拌30min并且用100ml dcm萃取。分离各层并且将水相用50ml dcm萃取2次。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发。在硅胶上纯化粗制产物(在正庚烷中的0至50％etoac)后，可以分离出1,52g(51,4％)呈浅黄色泡沫的标题化合物12。
[0897]
lcms-方法a：
[0898]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,33
[0899]
电离方法：es
：[m h]
＝602,4
[0900]
13：苯甲酸[(2s,6r)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]甲酯
[0901]
将氯嘌呤12(1,54g，2,56mmol)、苯甲酰胺(646mg，3,84mmol)和cs2co3(1,25g，3,84mmol)溶解在30ml二噁烷中。添加pd(oac)2(43mg，191,8μmol)和呫吨(xantphos)(111mg，191,8μmol)后，将反应溶液在氩气下在100℃下搅拌1h以实现完全转化。将反应冷却至室温并且用50ml etoac稀释。将溶液过滤并且将滤液在真空中蒸发。将粗制产物(2,48g)在硅胶上纯化(在正庚烷中的10％至100％etoac)，这得到1,29g(73,4％)呈无色泡沫的所希望的化合物13。
[0902]
lcms-方法a：
[0903]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,26
[0904]
电离方法：es
：[m h]
＝687,6
[0905]
7e：n-[9-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0906]
按照针对7f所述的方案将1,00g(1,46mmol)苯甲酸酯13皂化。在不色谱纯化的情况下，可以分离出731mg(86,2％，粗品)呈浅黄色泡沫的标题化合物7e。
[0907]
lcms-方法a：
[0908]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,97
[0909]
电离方法：es
：[m h]
＝583,5
[0910]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.17(s,1h),8.75(s,1h),8.71(s,1h),8.04(d,j＝7.2hz,2h),7.65(t,j＝7.3hz,1h),7.55(m,2h),6.11(dd,j＝9.9,2.7hz,1h),4.61(t,j＝5.9hz,1h),4.15(d,j＝9.1hz,1h),3.85(d,j＝9.2hz,1h),3.46(br d,j＝6.7hz,2h),3.08(br d,j＝10.4hz,1h),2.71-2.89(m,3h),2.37(d,j＝11.5hz,1h),0.95-1.19(m,27h)。
[0911]
合成方案5
[0912][0913]
14a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0914]
将810mg(1,7mmol)伯醇7a和873mg(1,20ml，8,6mmol)net3溶解在30ml dcm中。在室温下，添加716mg(2,1mmol)dmt-cl并且将反应在室温下搅拌2h。添加另外0,6当量dmt-cl并且搅拌过夜后，反应显示完全转化。将粗制产物溶液直接转移到二氧化硅柱并且用在正庚烷中的0至65％etoac纯化，产生1,19g(89,0％)呈浅黄色泡沫的所希望的产物14a。
[0915]
lcms-方法a：
[0916]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,38
[0917]
电离方法：es
：[m h]
＝772,5
[0918]
14b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[0919]
将1,00g(2,2mmol)7b和1,42g(1,92ml，11,0mmol)dipea溶解在30ml dcm中。添加948mg(2,7mmol)dmt-氯化物并且将反应在室温下搅拌过夜以实现完全转化。添加isolute-吸附剂后，除去溶剂并且将固体材料在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至75％etoac预调理)，产生1,61g(96,8％)呈浅黄色泡沫的dmt保护的产物14b。
[0920]
lcms-方法a：
[0921]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,34
[0922]
电离方法：es
：[m h]
＝758,3
[0923]
14c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0924]
按照针对14a所述的方案保护1,00g(1,77mmol)起始化合物7c。在硅胶上纯化(在dcm中的0至5％meoh)后，分离出呈黄色泡沫的所希望的产物14c(1,46g，94,8％)。
[0925]
lcms-方法c：
[0926]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,66
[0927]
电离方法：es
：[m h]
＝867,6
[0928]
14e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0929]
将950mg(1,63mmol)起始材料7e溶解在10ml dcm/吡啶(1:1)中。添加733mg(2,12mmol)dmt-cl在20ml dcm中的溶液后，允许将反应搅拌1,5h以实现完全转化。蒸发溶剂后，将残余物吸收在etoac中并且用h2o洗涤，用10％柠檬酸溶液和饱和nahco
3-溶液洗涤2次。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3；在正庚烷中的0至50％etoac预处理)，产生1,20g(83,2％)呈无色泡沫的dmt-醚14e。
[0930]
lcms-方法a：
[0931]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,38
[0932]
电离方法：es-：[m-h]-＝883,5
[0933]
14f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[0934]
按照针对14e的方案在干吡啶中保护2,25g(4,02mmol)起始材料7f。在二氧化硅上的最终色谱法(用正庚烷 0,5％net3；在正庚烷中的0至80％etoac预处理)后，分离出3,35g(96,9％)呈黄色泡沫的标题化合物14f。
[0935]
lcms-方法a：
[0936]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,40
[0937]
电离方法：es
：[m h]
＝861,6
[0938]
15a：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[0939]
将1,18g(1,5mmol)tips保护的吗啉14a和6,74g(9,26ml，66,0mmol)三乙胺溶解在30ml thf中。在室温下添加12,23g(12,4ml，73,6mmol)net3·
3hf并且将反应在65℃下搅拌1h。在室温下静置过夜后，添加10ml nmp并且将反应在65℃下搅拌另外14h以实现完全转化。将溶剂在真空中浓缩并且将剩余的nmp-溶液添加到h2o/饱和nahco
3-溶液混合物(1:2)中。将水溶液用etoac萃取并且将有机层用h2o和饱和nacl-溶液洗涤三次。用mgso4干燥后，将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(用在正庚烷中的1％net3、在正庚烷中的10％至100％乙酸乙酯预调理)，这得到645mg(68,8％)呈无色泡沫的脱甲硅烷基化产物15a。
[0940]
lcms-方法a：
[0941]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,67
[0942]
电离方法：es
：[m h]
＝616,4
[0943]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.53-7.58(m,1h),7.41(d,j＝7.34hz,2h),7.20-7.31(m,7h),6.87(d,j＝8.80hz,4h),5.82(dd,j＝9.66,2.93hz,1h),
4.61(br s,1h),3.67-3.79(m,8h),3.07(s,1h),2.97-3.10(m,1h),2.80(br d,j＝9.78hz,1h),2.63-2.76(m,2h),2.17-2.31(m,2h),1.69(s,3h),0.95(d,j＝6.60hz,6h)。
[0944]
15b：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[0945]
将1,60g(2,1mmol)14b溶解在20ml nmp中。添加4,73g(6,50ml，46,3mmol)net3和8,41g(8,50ml，50,6mmol)net3·
3hf后，将混合物在室温下搅拌15h，然后在65℃下搅拌5h。将混合物冷却至室温，然后添加250ml饱和nahco
3-溶液和250ml h2o。用250ml etoac萃取后，将有机层用h2o(2x)和饱和nacl-溶液洗涤。将有机相用mgso4干燥并且在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，这得到呈无色泡沫的所希望的醇15b(1,16g，91,1％)。
[0946]
lcms-方法a：
[0947]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,63
[0948]
电离方法：es
：[m h]
＝602,3
[0949]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(br s,1h),7.63(d,j＝8.07hz,1h),7.40(br d,j＝7.82hz,2h),7.20-7.33(m,7h),6.88(d,j＝8.56hz,4h),5.81(br d,j＝7.34hz,1h),5.62(d,j＝8.07hz,1h),4.62(br s,1h),3.78-3.95(m,1h),3.68-3.76(m,7h),3.11(d,j＝9.05hz,1h),2.96(br d,j＝9.05hz,1h),2.82(br d,j＝10.27hz,1h),2.60-2.76(m,2h),2.10-2.22(m,2h),0.94(d,j＝6.36hz,6h)。
[0950]
15c：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0951]
将1,44g(1,66mmol)tips保护的醇14c溶解在17ml thf中。添加1,27g(1,15ml，8,30mmol)65％pyr.
·
hf-溶液后，将反应混合物在室温下搅拌1h。在剧烈搅拌下，添加0,9gnahco3和10ml h2o并且继续搅拌2h。除去thf并且将水溶液用dcm/iproh(4:1)萃取10次。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发，产生0,83g(70,1％，粗品)15c，其不经进一步纯化而用于下一步骤。
[0952]
lcms-方法c：
[0953]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,11
[0954]
电离方法：es-：[m-h]-＝709,5
[0955]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.09(s,1h),11.67(s,1h),8.05(s,1h),7.38(d,j＝7.34hz,2h),7.18-7.30(m,7h),6.85(d,j＝8.80hz,4h),5.92(dd,j＝8.99,3.00hz,1h),4.64(t,j＝5.14hz,1h),3.71-3.84(m,8h),2.90-3.08(m,3h),2.55-2.83(m,4h),2.31-2.47(m,1h),1.12(dd,j＝6.79,3.36hz,6h),0.96(d,j＝6.48hz,6h)。
[0956]
15e：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0957]
将1,20g(1,35mmol)起始化合物14e和1,91g(2,63ml，18,90mmol)net3溶解在20ml thf中。添加3,59g(3,63ml，21,60mmol)net3·
3hf后，将溶液在65℃下加热，然后添加另外0,95g(1,32ml，9,45mmol)net3和1,80g(1,82ml，10,8mmol)net3·
3hf。将反应混合物在65℃下搅拌直到实现完全转化(大约10h)。冷却至室温后，将混合物倒入150ml h2o/饱和nahco
3-溶液(1:1)中并且搅拌30min。将水溶液用50dcm萃取3次，用mgso4干燥并且蒸发。硅胶色谱
2.84(m,5h),2.15-2.37(m,2h),1.76,1.73(2 x s,3h),0.93-1.14(m,18h)。
[0974]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,1,147,6。
[0975]
16b：3-[[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[0976]
按照针对16a所述的方案制备标题化合物。从1,95g(3,2mmol)伯醇15b开始，在硅胶上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至80％etoac预调理)后分离出1,70g(65,7％)呈无色泡沫的所希望的亚磷酰胺16b。
[0977]
lcms-方法a：
[0978]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,85
[0979]
电离方法：es
：[m]
＝719,2(m-i
pr2n oh h
)
[0980]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(br s,1h),7.67,7.63(2 x d,j＝8.19hz,1h),7.35-7.44(m,2h),7.20-7.32(m,7h),6.84-6.89(m,4h),5.81-5.89(m,1h),5.67,5.63(2 x d,j＝8.13hz,1h),3.89-4.08(m,2h),3.73(s,6h),3.54-3.72(m,2h),3.41-3.54(m,2h),3.16(d,j＝9.05hz,1h),2.96(t,j＝9.05hz,1h),2.84(br d,j＝10.15hz,1h),2.55-2.76(m,4h),2.10-2.33(m,2h),0.89-1.12(m,18h)。
[0981]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,3,147,6。
[0982]
16c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[0983]
将100mg(141μmol)醇15c、0,2g分子筛和12,7mg(70μmol)二异丙基铵四氮唑溶解在2,5ml干dcm中。在ar气氛下，添加42,8mg(45μl，138μmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌2h以实现完全转化。添加饱和nahco
3-溶液后，分离有机相并且将水相用dcm萃取。将合并的有机层用饱和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(用dcm 0,5％net3、在dcm中的0至10％meoh预调理)，产生87mg(67,9％)呈无色泡沫的标题化合物16c。
[0984]
lcms-方法c：
[0985]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,50,2,52
[0986]
电离方法：es
：[m-i
pr2n oh h]
＝828,3
[0987]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.08(br s,1h),11.62(br s,1h),8.09,8.04(2 x s,1h),7.33-7.40(m,2h),7.18-7.29(m,7h),6.81-6.87(m,4h),5.91(m,1h),3.93-4.07(m,2h),3.73(s,6h),3.54-3.72(m,2h),3.39-3.50(m,2h),3.11(m,1h),2.92-3.07(m,2h),2.54-2.81(m,6h),2.26-2.38(m,1h),0.94-1.16(m,18h),0.83-0.91(m,6h)。
[0988]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,5,146,7。
[0989]
16e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[0990]
将820mg(1,13mmol)15e和584mg(3,38mmol)二异丙基铵四氮唑溶解在20ml干dcm中。在ar气氛下，添加524mg(1,69mmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌。搅拌过夜后，添加50ml h2o并且分离各层。将水层用30ml dcm萃取1次并且将合并的有机相用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(用正
庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％mtb-醚/dcm(1:1)预调理)，产生913mg(87,3％)呈无色固体的标题化合物16e。
[0991]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.19(s,1h),8.76,8.74(2 x s,1h),8.61,8.59(2x s,1h),8.04(d,j＝8.09hz,2h),7.64(t,j＝7.37hz,1h),7.51-7.60(m,2h),7.37(m,2h),7.16-7.28(m,7h),6.77-6.84(m,4h),6.19(m,1h),3.98-4.15(m,2h),3.71(2 x s,6h),3.56-3.69(m,2h),3.41-3.56(m,2h),3.03-3.17(m,2h),2.89-3.01(m,2h),2.74-2.88(m,2h),2.70(t,j＝6.15hz,1h),2.59(m,1h),2.36(m,1h),0.92-1.18(m,18h)。
[0992]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,0,146,7.
[0993]
16f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[0994]
按照针对16e的方案将550mg(0,78mmol)伯醇15f亚磷酸化。在硅胶上色谱纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％mtb-醚/dcm(1:1)预调理)后，分离出560mg(79,3％)呈无色泡沫的16f。
[0995]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.29(br s,1h),8.12(2 x d,j＝7.50hz,1h),7.98-8.04(m,2h),7.63(t,j＝7.40hz,1h),7.48-7.55(m,2h),7.36-7.45(m,3h),7.21-7.35(m,7h),6.88(2 x d,j＝8.89,4h),5.95,6.01(2 x m,1h),3.89-4.14(m,2h),3.74,3.75(2 x s,6h),3.55-3.72(m,2h),3.39-3.55(m,2h),3.24(d,j＝8.85hz,1h),2.93-3.05(m,2h),2.68-2.87(m,3h),2.55-2.64(m,1h),2.10-2.23(m,2h),0.90-1.22(m,18h)。
[0996]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,4,146,7。
[0997]
合成方案6
[0998][0999]
17a：苯甲酸[(2s,6r)-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1000]
将810mg(1,7mmol)游离醇7a溶解在20ml dcm中。添加1,14g(1,45ml，8,6mmol)dipea和294mg(243μl，2,1mmol)苯甲酰氯后，将溶液在室温下搅拌2h。为了实现完全转化，添加另外0,2当量苯甲酰氯并且继续搅拌18小时。将反应溶液直接转移到硅胶柱，用在正庚烷中的0至65％etoac洗脱。获得726mg(73,3％)呈无色泡沫的苯甲酰基化产物17a。
[1001]
lcms-方法a：
[1002]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,29
[1003]
电离方法：es
：[m h]
＝574,3
[1004]
17b：苯甲酸[(2s,6r)-6-(3-苯甲酰基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-4-异丙基-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1005]
如17a中所述将1,45g(3,18mmol)伯醇7b用苯甲酰氯处理，导致单和二苄基化产物的混合物。因此，将反应混合物蒸发并且将粗制产物溶解在30ml吡啶中。添加565mg(3,98mmol)苯甲酰氯和催化量的dmap后，将反应溶液在室温下搅拌4h。蒸发溶剂后，将残余物溶解在etoac中并且用10％柠檬酸-和饱和nacl-溶液洗涤。将有机层用mgso4干燥并且除去溶剂。在二氧化硅上的最终色谱法(在正庚烷中的0至35％etoac)得到1,64g(77,8％)二苯甲酰基化产物17b。
[1006]
lcms-方法c：
[1007]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,67
[1008]
电离方法：es
：[m h]
＝664,4
[1009]
17c：苯甲酸[(2s,6r)-4-异丙基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1010]
将0,89g(1,58mmol)起始化合物7c溶解在30ml吡啶中。添加246mg(203μl，1,73mmol)苯甲酰氯后，将反应溶液在室温下搅拌过夜，这时检测到完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用h2o洗涤后，分离有机相，用mgso4干燥并且蒸发。在二氧化硅上的最终纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到呈无色泡沫的标题化合物17c(1,01g，95,4％)。
[1011]
lcms-方法c：
[1012]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,28
[1013]
电离方法：es
：[m h]
＝669,2
[1014]
18a：苯甲酸[(2r,6r)-2-(羟甲基)-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲酯
[1015]
将720mg(1,25mmol)17a在15ml thf中的溶液用1,34g(1,22ml，8,8mmol)吡啶-氟化氢处理。在室温下搅拌1h后，将反应混合物用饱和nahco
3-溶液处理以达到ph 7.5。将溶剂在减压下浓缩并且将水溶液用dcm萃取两次。将有机层用mgso4干燥并且除去溶剂。将粗制产物用50ml甲苯共蒸馏两次并且将剩余的残余物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，这得到502mg(95,8％)呈无色泡沫的所希望的产物18a。
[1016]
lcms-方法a：
[1017]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,30
[1018]
电离方法：es
：[m h]
＝418,2
[1019]
18b：苯甲酸[(2r,6r)-6-(3-苯甲酰基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲酯
[1020]
按照针对18a所述的方案将1,64g(2,47mmol)甲硅烷基醚17b脱甲硅烷基化，这得到1,33g呈粗制产物的所希望的产物18b，将其不经色谱纯化而用于下一步骤。
[1021]
lcms-方法c：
[1022]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,81
[1023]
电离方法：es
：[m h]
＝508,2
[1024]
18c：苯甲酸[(2r,6r)-2-(羟甲基)-4-异丙基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]吗啉-2-基]甲酯
[1025]
将1,0g(1,49mmol)17c溶解在10ml dmf中。添加1,53g(2,10ml，15,0mmol)net3和
1,48g(1,49ml，9,0mmol)net3·
3hf后，将反应溶液在90℃下搅拌2h。将混合物冷却至室温后，添加2,5g nahco3和10ml h2o并且将反应混合物搅拌2h。在真空中蒸发溶剂并且将残余物溶解在25ml dcm/iproh中并且用h2o洗涤。分离有机相，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至10％meoh)，这得到245mg(32,0％)呈无色泡沫的脱甲硅烷基化产物18c。
[1026]
lcms-方法c：
[1027]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,45
[1028]
电离方法：es
：[m h]
＝513,1
[1029]
18e：苯甲酸[(2r,6r)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-2-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-甲酯按照针对18a所述的方案，将1,23g(1,79mmol)甲硅烷基醚13脱保护，在硅胶色谱法(在正庚烷中的0至100％etoac)后得到939mg(98,8％)标题化合物18e。
[1030]
lcms-方法c：
[1031]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,60
[1032]
电离方法：es-：[m-h]-＝529,3
[1033]
18f：苯甲酸[(2r,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲酯
[1034]
按照针对18a所述的方案，将3,63g(5,48mmol)甲硅烷基醚10脱保护，在硅胶色谱法(在dcm中的5％meoh)后得到2,45(88,4％)标题化合物18f。
[1035]
lcms-方法a：
[1036]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,53
[1037]
电离方法：es
：[m h]
＝507,3
[1038]
19a：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲酯
[1039]
将497mg(1,2mmol)起始化合物18a溶解在15ml dcm中。添加502mg(643μl，3,8mmol)dipea和659mg(1,90mmol)dmt-cl后，将反应溶液在室温下搅拌2h。将反应混合物在真空中蒸发并且将粗制产物在硅胶上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)。分离出呈无色泡沫的dmt保护的产物19a(779mg，90,9％)。
[1040]
lcms-方法a：
[1041]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,14
[1042]
电离方法：es
：[m h]
＝720,4
[1043]
19b：苯甲酸[(2r,6r)-6-(3-苯甲酰基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]甲酯
[1044]
将1,30g(2,41mmol)伯醇18b和492mg(676μl，4,82mmol)net3溶解在20ml dcm中。添加925mg(2,65mmol)dmt-cl后，将反应在室温下搅拌6h，然后添加另外925mg(2,65mmol)dmt-cl。将反应搅拌72h。添加2,0ml正丙醇后，将溶液搅拌10min。将混合物用h2o洗涤并且将有机层分离。用mgso4干燥后，在真空中除去溶剂。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至25％etoac)，产生1,74g(89,2％)所希望的dmt-醚19b。
[1045]
lcms-方法c：
[1046]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,25
[1047]
电离方法：es
：[m h]
＝810,3
[1048]
19c：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]吗啉-2-基]甲酯
[1049]
将240mg(468μmol)起始醇18c溶解在5,0ml dcm中。添加95,7mg(131,5μl，936μmol)net3和180mg(515μmol)dmt-cl后，将反应在室温下搅拌3d以实现完全转化。添加2,0ml正丙醇后，将溶液搅拌10min。将混合物用h2o洗涤并且将有机层分离。用mgso4干燥后，在真空中除去溶剂。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至25％etoac)，产生303mg(79,4％)所希望的dmt-醚19c。
[1050]
lcms-方法c：
[1051]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,93
[1052]
电离方法：es-：[m-h]-＝813,2
[1053]
19e：苯甲酸[(2r,6r)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]甲酯
[1054]
将934mg(1,76mmol)起始材料18e溶解在20ml dmc/吡啶(1:1)中。添加974mg(2,82mmol)dmt-cl后，将反应溶液在室温下搅拌17h。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中并且用h2o、2x10％柠檬酸-、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。将有机相用mgso4干燥并且蒸发。将获得的粗制产物(1,77g)溶解在20ml etoac/乙醚(1:2)中。添加40ml正戊烷后，将沉淀物离心并且丢弃上清液。将沉淀程序再重复两次，产生呈无色固体的所希望的dmt-醚19e。
[1055]
lcms-方法c：
[1056]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,07
[1057]
电离方法：es-：[m-h]-＝831,5
[1058]
19f：苯甲酸[(2r,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]甲酯
[1059]
将2,45g(4,84mmol)18f溶解在40ml吡啶中。添加2,51g(7,26mmol)dmt-cl后，将反应混合物在室温下搅拌4d。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中并且用h2o、2x10％柠檬酸-、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。将有机相用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在硅胶上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生3,69g(94,3％)呈无色泡沫的标题化合物19f。
[1060]
lcms-方法a：
[1061]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,14
[1062]
电离方法：es-：[m-h]-＝807,4
[1063]
20a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1064]
将苯甲酰基酯19a(775mg，1,1mmol)溶解在20ml thf-甲醇(4:1)中。在室温下，添加4,31ml(8,6mmol)2n naoh-水溶液并且将反应搅拌90分钟。通过添加柠檬酸一水合物，将ph调节在7与8之间，然后在减压下除去溶剂。将残余物吸收在dcm和h2o中。将有机层分离并且将水相用dcm萃取。将合并的有机相用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的5％至100％etoac)，产生663mg(定量)呈无色泡沫的所希望的产物20a。
4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1083]
将起始化合物19e(1,27g，1,52mmol)溶解在14ml etoh/吡啶(1:1)中。在0℃下，添加7,59ml(15,19mmol)1m naoh-溶液并且将反应混合物在室温下搅拌1,5h。通过添加柠檬酸一水合物(958mg)将ph调节至7后，添加70ml h2o和etoac。将有机层分离并且用10％柠檬酸溶液(3x)、h2o、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将有机相蒸发，产生1,08g呈无色泡沫的粗制产物，将其溶解在20ml etoac/乙醚(1:1)中。添加40ml正戊烷后，将沉淀物离心并且丢弃上清液。将沉淀程序再重复两次，产生964mg(87,1％)呈无色泡沫的标题化合物20e。
[1084]
lcms-方法c：
[1085]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,42
[1086]
电离方法：es-：[m-h]-＝727,5
[1087]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.18(s,1h),8.71(s,1h),8.69(s,1h),8.05(d,j＝7.34hz,2h),7.61-7.68(m,1h),7.56(t,j＝7.58hz,2h),7.45(d,j＝7.46hz,2h),7.28-7.36(m,6h),7.20-7.28(m,1h),6.90(dd,j＝8.99,2.26hz,4h),5.89(dd,j＝9.84,2.63hz,1h),4.69(t,j＝5.99hz,1h),3.75(s,6h),3.45-3.61(m,3h),3.24-3.30(m,1h),3.00(br d,j＝10.15hz,1h),2.85(br d,j＝11.62hz,1h),2.60-2.78(m,2h),2.45-2.55(m,1h),0.98(br d,j＝6.48hz,3h),0.95(br d,j＝6.48hz,3h)。
[1088]
20f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1089]
按照针对20e所述的程序，将3,68g(4,55mmol)19f皂化。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的20％至100％etoac)，这得到1,72g(53,5％)呈浅黄色泡沫的20f。
[1090]
lcms-方法a：
[1091]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,81
[1092]
电离方法：es-：[m-h]-＝703,3
[1093]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.24(s,1h),8.29(d,j＝7.46hz,1h),8.01(d,j＝7.46hz,2h),7.62(t,j＝7.40hz,1h),7.51(t,j＝7.70hz,2h),7.20-7.41(m,10h),6.88(dd,j＝8.99,2.38hz,4h),5.68(dd,j＝9.35,2.38hz,1h),4.71(t,j＝6.11hz,1h),3.74(s,6h),3.58-3.69(m,1h),3.48-3.58(m,1h),3.35-3.43(m,1h),3.11(d,j＝8.56hz,1h),2.79-2.95(m,2h),2.66-2.76(m,1h),2.39-2.47(m,1h),1.91-2.00(m,1h),0.96(d,j＝6.54hz,3h),0.94(d,j＝6.54hz,3h)。
[1094]
21a：3-[[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-异丙基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]-氧基丙腈
[1095]
按照针对16a的程序(方案5)，将764mg(1,2mmol)起始材料20a转化为所希望的亚磷酰胺21a。获得842mg(83,2％，非对映异构体混合物)，呈无色泡沫。
[1096]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.34,11.32(2 x s,1h),7.59,7.54(2 x d,j＝1.10hz,1h),7.36-7.43(m,2h),7.20-7.34(m,7h),6.89(m,4h),5.59-5.75(m,1h),3.44-3.95(m,6h),3.74(s,6h),3.36(m,1h),3.22(m,1h),2.60-2.85(m,5h),2.36(m,1h),2.18(m,1h),1.78(2 x d,j＝8.69hz,3h),0.83-1.17(m,18h)。
[1097]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,6,148,3。
[1098]
21b：3-[[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-异丙基-吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[1099]
按照针对16b的程序(方案5)，从1,36g(2,26mmol)相应的醇20b开始合成标题化合物21b。分离出1,09g(60,1％)呈无色泡沫的标题化合物。
[1100]
lcms-方法b-1：
[1101]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,80
[1102]
电离方法：es
：[m-nipr2 oh h]
＝718,3
[1103]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.32(br s,1h),7.71,7.66(2 x s,j＝8.13hz,1h),7.35-7.42(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.83-6.92(m,4h),5.60-5.70(m,2h),3.73(s,6h),3.43-3.95(m,6h),3.29-3.39(m,1h),3.22(m,1h),2.59-2.83(m,5h),2.33(m,1h),2.13(m,1h),0.84-1.21(m,18h)。
[1104]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,5,148,3。
[1105]
21c：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1106]
按照针对16c的合成所述的方案(方案5)，在硅胶色谱法(在正庚烷中的0至100％甲基-叔丁基醚，用正庚烷 1％net3进行柱预调理)后，40mg(56μmol)起始化合物20c得到23mg(44,9％)所希望的亚磷酰胺21c。
[1107]
lcms-方法c：
[1108]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,57
[1109]
电离方法：es
：[m-nipr2 oh h]
＝828,2
[1110]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.70-12.30(b s,1h),11.53(b s,1h),8.05(s,1h),7.35-7.45(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.82-6.91(m,4h),5.54-5.68(m,1h),3.80-3.93(m,0.5h),3.73,3.72(2 x s,6h),3.68-3.76(m,1.5h),3.60-3.67(m,2h),3.35-3.60(m,4h),3.12(m,1h),2.57-2.98(m,7h),0.92-1.13(m,24h)。
[1111]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147.6,147.4。
[1112]
21e：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1113]
从950mg(1,30mmol)20e开始，按照针对16e所述的方案(方案5)制备标题化合物，这得到1,10g(91,0％)呈无色泡沫的21e。
[1114]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.19(br s,1h),8.73,8.71(2 x s,1h),8.63,8.59(2 x s,1h),8.04(d,j＝7.65hz,2h),7.64(t,j＝7.34hz,1h),7.55(t,j＝7.43hz,2h),7.44(d,j＝7.78hz,2h),7.21-7.35(m,7h),6.86-6.93(m,4h),5.89-5.99(m,1h),3.80
–
4.15(m,1h),3.74(s,6h),3.63-3.72(m,2h),3.31-3.60(m,5h),3.01(br d,j＝10.79hz,1h),2.66-2.90(m,4h),2.59-2.64(m,1h),2.42-2.47(m,1h),0.91-1.12(m,18h)。
[1115]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,6,147,5。
[1116]
21f：n-[1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-异丙基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1117]
从620mg(0,88mmol)20f开始，按照针对16e所述的方案(方案5)制备标题化合物，这得到681mg(85,5％)呈无色泡沫的21f。
[1118]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.28(br s,1h),8.12
–
8.23(2 x d,j＝7.47hz,1h),8.01(d,j＝7.65hz,2h),7.58-7.67(m,1h),7.51(t,j＝7.58hz,2h),7.35-7.42(m,3h),7.20-7.35(m,7h),6.83-6.93(m,4h),5.71
–
5.80(2 x dd,j＝9.49,2.54hz,1h),3.44-4.00(m,6h),3.74(s,6h),3.38(m,1h),3.24-3.33(m,1h),2.60-2.94(m,5h),2.33-2.48(m,1h),2.01-2.09(m,1h),1.02-1.23(m,12h),0.83-1.00(m,6h)。
[1119]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,5,147,4。
[1120]
合成方案7
[1121][1122]
22a：1-[(2r,3r,4s,5s)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1123]
在室温下在n
2-气氛下向23,7g(53,4mmol)起始化合物4a在240ml无水吡啶中的溶液中添加23,13g(80mmol)dmt-cl。搅拌12h后，在真空中除去溶剂并且将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(pe/etoac 10:1至1:1)，这得到16,3g(41％)呈无色固体的所希望的dmt保护的产物22a。
[1124]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.34(s,1h),7.50(d,j＝0.75hz,1h),7.42-7.37(m,2h),7.32(t,j＝7.53hz,2h),7.29-7.22(m,6h),6.90(dd,j＝8.91,2.13hz,4h),5.89(d,j＝7.28hz,1h),5.45(d,j＝6.53hz,1h),5.15(d,j＝5.02hz,1h),4.48-4.39(m,1h),4.31(t,j＝5.14hz,1h),3.86-3.80(m,1h),3.74(s,6h),1.28(s,3h),0.98-0.83(m,
22h)。
[1125]
22b：1-[(2r,3r,4s,5s)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1126]
在室温下在n
2-气氛下向化合物4b(75g，174mmol)在750ml无水吡啶中的溶液中添加dmt-cl(70.8g，209mmol)。将混合物搅拌12h以实现完全转化。在真空中除去溶剂，将残余物用500ml水稀释并且用3x500ml etoac萃取。将有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将获得的粗制产物通过在硅胶上的快速色谱法纯化(pe/etoac 1:1至etoac/meoh 20:1)以得到80g(62,6％)呈无色泡沫的22b。
[1127]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.35(s,1h),7.61(d,j＝8.28hz,1h),7.42-7.36(m,2h),7.32(t,j＝7.65hz,2h),7.28-7.19(m,5h),6.90(d,j＝8.03hz,4h),5.83(d,j＝6.53hz,1h),5.48(d,j＝6.02hz,1h),5.27(d,j＝8.03hz,1h),5.21(d,j＝5.27hz,1h),4.33-4.26(m,1h),4.22(q,j＝6.02hz,1h),3.89-3.79(m,2h),3.74(s,6h),3.24(d,j＝10.04hz,1h),1.01-0.84(m,21h)。
[1128]
22c：n-[9-[(2r,3r,4s,5s)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1129]
按照针对22b所述的方案，将55,8g(103mmol)4c用在吡啶中的dmt-cl保护，产生50,0g(57,4％)呈无色固体的22c。
[1130]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.12(br s,1h),11.67(br s,1h),7.99-7.83(m,1h),7.38(br d,j＝7.28hz,2h),7.32-7.13(m,8h),6.84(dd,j＝8.78,2.26hz,4h),5.86(d,j＝7.03hz,1h),5.70-5.45(m,1h),5.18(br s,1h),4.73-4.62(m,1h),4.25(br d,j＝4.77hz,1h),3.97(br d,j＝10.29hz,1h),3.84(br d,j＝10.29hz,1h),3.73(s,6h),3.20(br d,j＝10.04hz,1h),2.76(dt,j＝13.61,6.87hz,1h),1.12(d,j＝6.78hz,6h),1.01-0.87(m,21h)。
[1131]
22e：n-[9-[(2r,3r,4s,5s)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1132]
按照针对22b所述的方案，将57,0g(102mmol)4e用在吡啶中的dmt-cl保护，产生呈无色固体的22e(70,0％)。
[1133]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.22(s,1h),8.68-8.58(m,1h),8.49(s,1h),8.05(d,j＝7.28hz,2h),7.70-7.60(m,1h),7.59-7.50(m,2h),7.43(d,j＝7.28hz,2h),7.33-7.17(m,7h),6.86(dd,j＝8.91,1.38hz,4h),6.00(d,j＝7.28hz,1h),5.53(d,j＝6.78hz,1h),5.32(d,j＝4.89hz,1h),5.00-4.87(m,1h),4.34(t,j＝4.89hz,1h),4.08-4.04(m,1h),3.98(d,j＝10.79hz,1h),3.73(s,6h),3.40(d,j＝9.54hz,1h),3.30(br d,j＝9.54hz,1h),1.12-0.93(m,21h)。
[1134]
23a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1135]
在室温下向12,6g(16,9mmol)起始材料22a在250ml丙酮/h2o(3:1)中的溶液中逐滴添加5,05g(23,6mmol)naio4在h2o(60ml)中的水溶液。将混合物搅拌12h以实现完全转化并且倒入500ml冰水中。将混合物用500ml dcm萃取3次。将有机层合并，并且用盐水洗涤，经
无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到11,20g(87％)呈白色泡沫的所希望的产物23a，其不经进一步纯化而用于下一步骤。
[1136]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.62-11.33(m,1h),7.80-7.65(m,1h),7.57-7.38(m,3h),7.33-7.13(m,9h),6.88-6.73(m,5h),6.08-5.86(m,1h),5.71-5.51(m,1h),5.24-5.06(m,1h),5.01-4.94(m,1h),4.29-4.16(m,1h),3.75-3.70(m,7h),3.34-3.24(m,1h),3.06-2.81(m,1h),2.02-1.59(m,2h),1.03(m,1h),1.09-0.74(m,21h)。
[1137]
23b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1138]
按照针对23a所述的方案，77,0g(105mmol)二醇22b得到80g(定量，粗制产物)呈黄色固体的标题化合物23b。
[1139]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.67-11.36(m,1h),7.87-7.77(m,1h),7.76-7.67(m,1h),7.55-7.41(m,2h),7.39-7.20(m,8h),6.94-6.81(m,4h),5.94-5.87(m,1h),5.78-5.63(m,1h),5.59-5.51(m,1h),5.25-5.08(m,1h),5.07-4.99(m,1h),4.32-4.20(m,1h),3.82-3.70(m,6h),3.34-3.26(m,1h),3.15-3.04(m,1h),2.95-2.86(m,1h),1.14-0.81(m,22h)。
[1140]
23c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1141]
按照针对23a所述的方案，50,0g(59mmol)二醇22c得到47g(96,1％，粗制产物)呈黄色固体的标题化合物23c。
[1142]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.25-12.06(m,1h),11.78-11.55(m,1h),8.19(d,j＝8.78hz,1h),7.44(br d,j＝7.28hz,1h),7.38(br d,j＝6.53hz,1h),7.34-7.14(m,10h),6.99(d,j＝6.78hz,1h),6.90-6.71(m,5h),6.05-5.98(m,1h),5.74(d,j＝7.78hz,1h),5.61-5.53(m,1h),5.48(q,j＝6.78hz,1h),5.24-5.17(m,1h),5.06(d,j＝6.53hz,1h),4.35-4.22(m,1h),3.83(br d,j＝11.54hz,1h),3.72(d,j＝3.26hz,7h),3.27(br d,j＝9.29hz,1h),3.29-3.23(m,1h),3.12-3.04(m,1h),2.91-2.75(m,1h),1.22-0.76(m,29h)。
[1143]
23e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1144]
按照针对23a所述的方案，78,0g(90,6mmol)二醇22e得到75,2g(94,6％，粗制产物)呈白色固体的标题化合物23e。
[1145]
ms(m/z)＝876,2[m h]
[1146]
24a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1147]
在室温下在n
2-气氛下向2,6g(3,4mmol)起始化合物23a在44ml无水meoh中的溶液中添加0,98g(3,7mmol)(nh4)2b4o7·
4h2o。将混合物搅拌2小时，然后添加0,45g(6,8mmol)acoh、5,0g 分子筛和0,47g(6,8mmol)nabh3cn。在室温下搅拌12h后，tlc显示起始材料被完全消耗。在真空中除去溶剂，并且将残余物通过硅胶色谱法纯化(pe/etoac 4:1至1:1)，产生1,59g(64％)呈白色泡沫的所希望的吗啉24a。
[1148]
ms(m/z)＝752,5[m na]
[1149]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.39(s,1h),7.62(s,1h),7.43(br d,j＝7.28hz,2h),7.33-7.23(m,8h),6.84(d,j＝8.78hz,5h),5.86(br dd,j＝9.91,2.64hz,1h),5.89-5.81(m,1h),4.13(br d,j＝9.54hz,1h),3.96(br d,j＝9.54hz,1h),3.72(d,j＝0.75hz,6h),3.06(br d,j＝9.29hz,1h),2.97(br d,j＝9.03hz,1h),2.93-2.78(m,2h),2.76-2.57(m,3h),1.76(s,3h),0.98-0.87(m,22h)。
[1150]
24b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1151]
在25℃下在n
2-气氛下向化合物23b(5.0g，6.7mmol)在85ml无水meoh中的溶液中添加(nh4)2b4o7·
4h2o(1.93g，7.6mmol)。将混合物搅拌2h，然后添加0,80g(13,4mmol)acoh、10g 分子筛和0,84g(13,4mmol)nabh3cn。搅拌12h后，将混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩。将残余物用冰水稀释并且用50ml etoac萃取3次。将有机层合并，并且用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗制产物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(pe/etoac 10:1至1:1)，产生呈白色泡沫的标题化合物24b(94％)。
[1152]
ms(m/z)＝738,5[m h]
[1153]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.44(br s,1h),7.75(d,j＝8.07hz,1h),7.45(br d,j＝7.34hz,2h),7.37-7.20(m,7h),6.89(d,j＝8.80hz,4h),5.88(br dd,j＝10.03,2.45hz,1h),5.73(d,j＝8.07hz,1h),4.17(br d,j＝9.78hz,1h),4.11-4.02(m,2h),3.77(d,j＝0.73hz,6h),3.12(br d,j＝9.05hz,1h),3.02-2.83(m,3h),2.70-2.58(m,2h),1.06-0.90(m,21h)。
[1154]
24c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1155]
按照针对24b所述的方案，将7,0g(8,2mmol)起始材料23c转化为吗啉化合物24c，将其在硅胶色谱法(pe/etoac 5:1至1:1)后分离，呈无色泡沫(73,2％)。
[1156]
ms(m/z)＝825,2[m h]
[1157]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.12(br s,1h),11.59(s,1h),8.15(s,1h),7.40(br d,j＝7.03hz,2h),7.30-7.12(m,7h),6.81(br d,j＝7.78hz,4h),5.83(dd,j＝9.66,3.14hz,1h),4.23(br d,j＝9.03hz,1h),3.92(br d,j＝9.03hz,1h),3.72(d,j＝2.76hz,6h),2.97-3.18(m,3h),2.96-2.86(m,2h),2.80(dt,j＝13.55,6.78hz,1h),2.67(br d,j＝12.05hz,1h),1.13(t,j＝6.15hz,6h),1.03-0.82(m,22h)。
[1158]
24e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1159]
按照针对24b所述的方案，将5,0g(5,7mmol)起始材料23e转化为吗啉化合物24e，将其硅胶色谱法(pe/etoac 1:4)后分离，呈无色泡沫(73,4％)。
[1160]
ms(m/z)＝843,1[m h]
[1161]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.22(br s,1h),8.75(s,1h),8.66(s,1h),8.05(d,j＝7.34hz,2h),7.70-7.62(m,1h),7.60-7.51(m,2h),7.38(br d,j＝6.97hz,2h),7.26-7.16(m,7h),6.78(d,j＝8.93hz,4h),6.16(dd,j＝10.03,2.81hz,1h),4.26(d,j＝9.66hz,1h),4.10-3.98(m,1h),3.71(d,j＝0.73hz,6h),3.28(br d,j＝10.64hz,1h),3.16
(br d,j＝9.17hz,1h),3.06(br d,j＝9.17hz,1h),2.98-2.90(m,2h),2.79(br d,j＝12.47hz,1h),1.10-0.82(m,21h)。
[1162]
合成方案8
[1163][1164]
25：(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-甲酸叔丁酯
[1165]
在室温下向吗啉24b(50g，69.8mmol)和dipea(18g，139,7mol)在500ml dcm中的混合物中逐滴添加boc2o(22,9g，104,8mol)。搅拌24h后，在真空中除去溶剂并且将残余物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 1:1)以得到呈白色泡沫的化合物25(60g，产率93％)。
[1166]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.58(d,j＝8.0hz,1h),7.45(d,j＝7.2hz,2h),7.33-7.26(m,7h),6.85-6.81(m,4h),6.02-5.98(dd,j＝10.0 3.6hz,1h),5.77(d,j＝8.0hz,1h),4.24-4.11(m,2h),3.99(d,j＝9.6hz,1h),3.80(s,1h),3.75(m,1h),3.28-3.20(m,2h),3.08(d,j＝12.8hz,1h),2.69(t,j＝11.4hz,1h),1.48(m,9h),1.03-0.95(m,21h)。
[1167]
26：(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[2-氧代-4-(1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-1-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-甲酸叔丁酯
[1168]
在30℃下向1h-1,2,4-三唑(65g，0,94mol)在650ml acn中的混合物中逐滴添加pocl3(49,79g，0,31mol)。冷却至0℃后，逐滴添加dipea(198g，1,53mol)并且在0℃下继续搅拌30min。在相同温度下，将起始材料25(32g，39,21mmol)一次性添加到混合物中，移除冰浴并且将反应在30℃下搅拌3h。将混合物倒入3l etoac/水(1:2)混合溶剂中。分离后，将有机层用500ml饱和nahco
3-溶液和盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得
到呈黄色油状物的粗制化合物26(40g)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。
[1169]
ms(m/z)＝867,5[m h]
[1170]
27：(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-甲酸叔丁酯
[1171]
在0℃下向苯甲酰胺(38g，0,31mol)在380ml二噁烷中的混合物中分批添加nah(12,8g，0,31mol)。在30℃下搅拌30min后，一次性添加三唑26(40g，39,21mmol，粗品)并且将混合物在30℃下搅拌1h。将反应用24l饱和nh4cl-溶液淬灭并且用3l etoac萃取。将有机层用2l水和盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到54g呈黄色油状物的粗制化合物。最终硅胶色谱法(pe/etoac 2:1)得到20,4g(56,6％)呈黄色泡沫的27。
[1172]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.31(br s,1h),8.20(br d,j＝7.21hz,1h),8.01(br d,j＝7.46hz,2h),7.70-7.59(m,1h),7.58-7.48(m,2h),7.47-7.36(m,3h),7.34-7.16(m,7h),6.87(br d,j＝7.70hz,4h),5.96(br dd,j＝10.09,2.63hz,1h),4.12(br d,j＝11.25hz,1h),4.00-3.83(m,3h),3.74(s,6h),3.28-3.16(m,2h),3.06(br d,j＝9.17hz,2h),1.55-1.32(m,9h),1.11-0.80(m,21h)。
[1173]
28：n-[1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1174]
在0℃下向27(13,5g，14,70mmol)在93ml dcm中的溶液中逐滴添加31ml tfa。将反应在30℃下搅拌16h。用饱和nahco
3-溶液中和至ph＝7-8后，将有机层分离并且将水相用100ml dcm萃取2次。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(etoac/etoh＝30:1)以得到呈黄色泡沫的28(2,7g，产率35,6％)和作为副产物的相应的三氟乙酸酯(4,78g，53,1％)，将其溶解在186ml thf和62ml etoh的混合溶剂中。在0℃下添加75,8ml 1m naoh-水溶液。搅拌2min后，将溶液用饱和柠檬酸溶液中和，用300ml h2o稀释并且用300ml etoac萃取。将有机层用盐水洗涤，用na2so4干燥并且蒸发。通过硅胶色谱法纯化(etoac/etoh 30:1)得到5,2g(68,5％)呈白色固体的28。
[1175]
ms(m/z)＝517,4[m h
]
[1176]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.26(br s,1h),8.28(d,j＝7.53hz,1h),8.01(d,j＝7.28hz,2h),7.67-7.58(m,1h),7.57-7.47(m,2h),7.34(d,j＝7.40hz,1h),5.86(dd,j＝9.66,2.64hz,1h),4.64(br s,1h),4.01-3.90(m,2h),3.46(br s,2h),3.05(dd,j＝11.98,2.57hz,1h),3.11-3.00(m,1h),2.87-2.75(m,1h),2.74-2.63(m,1h),2.40-2.27(m,1h),1.15-0.99(m,21h)。
[1177]
29：(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟甲基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-甲酸9h-芴-9-基甲酯
[1178]
在0℃下向7,0g(13,55mmol)吗啉28(13,55mmol)在70ml dmf中的溶液中分批添加5,5g(16,26mmol)fmoc-n-羟基-琥珀酰亚胺酯。搅拌16h后，将溶液倒入100ml水中并且用30ml etoac萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。在二氧化硅上的最终纯化(pe/etoac 1:2)产生10,0g(定量)呈黄色固体的化合物29。
[1179]
ms(m/z)＝739,4[m h]
[1180]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.26(br s,1h),8.33(br s,1h),8.02(br d,j＝7.46hz,2h),7.90(d,j＝7.58hz,2h),7.64(br t,j＝7.40hz,3h),7.57-7.49(m,2h),
7.48-7.40(m,3h),7.39-7.30(m,2h),6.11-5.79(m,1h),4.98(t,j＝6.05hz,1h),4.52-4.12(m,4h),3.89-3.69(m,2h),3.54(br s,3h),3.21-3.07(m,1h),3.04-2.77(m,1h),1.11-0.89(m,21h)。
[1181]
30：(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-甲酸9h-芴-9-基甲酯
[1182]
在25℃下向化合物29(13,9g，18,83mmol)在140ml吡啶中的溶液中添加12,75g(37,62mmol)dmt-cl。将混合物在25℃下搅拌16h以实现完全转化。蒸发溶剂后，将残余物溶解在200ml etoac中，用100ml水和盐水洗涤。将有机相用na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 1:1)，产生17,3g(88,1％)呈黄色泡沫的化合物30。
[1183]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.32(br s,1h),8.21(br s,1h),8.02(br d,j＝7.58hz,2h),7.88(br s,2h),7.76-7.60(m,3h),7.59-7.50(m,2h),7.42(br d,j＝7.21hz,5h),7.38-7.19(m,9h),6.89(br d,j＝8.44hz,4h),6.19-5.85(m,1h),4.28(br s,4h),3.91(br d,j＝8.80hz,2h),3.75(s,6h),3.23(br s,1h),3.10(br d,j＝9.05hz,3h),1.06-0.78(m,21h)。
[1184]
24f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1185]
在室温下向8,4g(8,07mmol)30在85ml dcm中的溶液中添加17ml哌啶。完全转化(大约20min)后，将反应溶液用饱和nh4cl-溶液洗涤。将水相用dcm萃取并且将合并的有机层用na2so4干燥，过滤并且在真空中。将粗制产物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 1:4)，产生4,7g(71,2％)呈白色泡沫的标题化合物24f。
[1186]
ms(m/z)＝819,4[m h]
[1187]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.31(br s,1h),8.18(d,j＝7.58hz,1h),8.01(br d,j＝7.34hz,2h),7.67-7.58(m,1h),7.57-7.47(m,2h),7.42(br d,j＝7.46hz,3h),7.34-7.15(m,7h),6.86(br d,j＝8.56hz,4h),6.04-5.89(m,1h),4.18(br d,j＝9.54hz,1h),4.07(br d,j＝9.54hz,1h),3.73(d,j＝1.34hz,6h),3.15(br d,j＝9.17hz,1h),3.05(br d,j＝10.15hz,1h),2.97(br d,j＝9.17hz,1h),2.88(br d,j＝12.47hz,1h),2.62(br d,j＝12.47hz,1h),2.46(br s,1h),1.08-0.83(m,21h)。
[1188]
合成方案9
[1189][1190]
还原胺化反应以制备化合物31a-31f的通用程序a
[1191]
将1,0g(1,4mmol)吗啉24a溶解在25ml meoh中，然后添加2,0g分子筛560mg(769μl，5,5mmol)net3、827mg(789μl，13,7mmol)acoh和1,0至3,0当量相应的醛或酮。搅拌15分钟后，将344mg(5,5mmol)氰基硼氢化钠分四份每30分钟添加，并且将反应在室温下搅拌6h。静置过夜后，将混合物过滤并且将滤液用25ml饱和nahco
3-溶液稀释。蒸发meoh并且将水相用50ml dcm/iproh(5:1)萃取。另外过滤后，分离有机相，用mgso4干燥并且蒸发。获得的粗制产物不经进一步纯化而用于下一步骤。
[1192]
31a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-甲基-6-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1193]
按照通用程序a，使用3,0当量甲醛(37％水溶液)，分离出1,0g呈粗制产物的标题化合物31a并且不经进一步纯化而使用。
[1194]
lcms-方法a：
[1195]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,29
[1196]
电离方法：es
：[m h]
＝744,3
[1197]
31b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-丁基-6-(三异
丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1198]
按照通用程序a，使用2,0当量丁醛，分离出1,19g呈粗制产物的标题化合物31b并且不经进一步纯化而使用。
[1199]
lcms-方法a：
[1200]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,41
[1201]
电离方法：es
：[m h]
＝786,7
[1202]
31c：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-辛基-6-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1203]
按照通用程序a，使用2,0当量辛醛，分离出1,35g呈粗制产物的标题化合物31c并且不经进一步纯化而使用。
[1204]
lcms-方法a：
[1205]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,66
[1206]
电离方法：es
：[m h]
＝842,7
[1207]
31d：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1208]
按照通用程序a，使用1,0当量十六醛，分离出1,58g呈粗制产物的标题化合物31d并且不经进一步纯化而使用。
[1209]
31e：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1210]
按照通用程序a，使用1,25当量环己酮，分离出1,14g呈粗制产物的标题化合物31e并且不经进一步纯化而使用。
[1211]
lcms-方法a：
[1212]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,45
[1213]
电离方法：es
：[m h]
＝812,5
[1214]
31f：1-[(2r,6s)-4-苄基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1215]
按照通用程序a，使用1,25当量苯甲醛，分离出1,12g呈粗制产物的标题化合物31f并且不经进一步纯化而使用。
[1216]
lcms-方法a：
[1217]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,37
[1218]
电离方法：es
：[m h]
＝821,4
[1219]
31g：1-[(2r,6s)-4-乙酰基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1220]
将1,0g(1,4mmol)起始化合物24a溶解在25ml dcm中。添加103mg(99μl，1,7mmol)acoh、779mg(2,1mmol)hbtu和903mg(1,19ml，6,9mmol)二异丙基-乙胺后，将反应混合物在室温下搅拌4h以实现完全转化。将反应溶液用25ml h2o洗涤并且将有机层分离。用mgso4干燥后，蒸发溶剂并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至5％meoh)，产生1,06g(定量)标题化合物31g。
[1221]
lcms-方法a：
[1222]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,20
[1223]
电离方法：es-：[m-h]-＝770,2
[1224]
31h：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷酰基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1225]
按照针对31g的方案，在硅胶色谱法(在dcm中的0至20％meoh)后将1,0g(1,4mmol)起始化合物24a和棕榈酸转化为1,14g(86％)标题化合物31h。
[1226]
脱甲硅烷基化反应制备化合物32a-32h的通用程序b
[1227]
将粗制产物31a-31h溶解在12ml nmp中。添加2,1g(2,9ml，20,6mmol)net3和1,14g(1,15ml，6,9mmol)net3·
3hf后，将反应混合物在90℃下搅拌2小时。冷却到室温后，将溶液倒入饱和nahco
3-溶液中并且用etoac萃取两次。将有机层用mgso4干燥并且蒸发。将残余物溶解在乙腈/h2o中并且冻干。将获得粗制产物通过硅胶色谱法纯化，这得到所希望的化合物32a-32h。
[1228]
32a：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-甲基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1229]
按照通用程序b从粗制产物31a开始，最终硅胶纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到543mg(66,0％，两步)标题化合物32a。
[1230]
lcms-方法a：
[1231]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,59
[1232]
电离方法：es
：[m h]
＝588,3
[1233]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.37(s,1h),7.52(s,1h),7.40(d,j＝7.46hz,2h),7.19-7.32(m,7h),6.87(d,j＝8.80hz,4h),5.85(dd,j＝9.78,2.93hz,1h),4.63(t,j＝5.32hz,1h),3.70-3.78(m,7h),3.65(m,1h),2.96-3.06(m,2h),2.81(br d,j＝9.29hz,1h),2.63-2.74(m,1h),2.21(s,3h),2.06-2.16(m,1h),1.97-2.04(m,1h),1.67(s,3h)。
[1234]
32b：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-丁基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1235]
按照通用程序b从粗制产物31b开始，最终硅胶纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到753mg(85,5％，两步)标题化合物32b。
[1236]
lcms-方法a：
[1237]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,75
[1238]
电离方法：es
：[m h]
＝630,3
[1239]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.54(s,1h),7.40(d,j＝7.46hz,2h),7.20-7.34(m,7h),6.87(d,j＝8.68hz,4h),5.85(dd,j＝9.66,2.93hz,1h),4.62(t,j＝5.14hz,1h),3.70-3.78(m,7h),3.65(m,1h),2.96-3.09(m,2h),2.86(br d,j＝9.05hz,1h),2.71-2.80(m,1h),2.31(br t,j＝7.15hz,2h),1.99-2.22(m,2h),1.67(s,3h),1.20-1.45(m,4h),0.88(m,3h)。
[1240]
32c：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-4-辛基-吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1241]
按照通用程序b从粗制产物31c开始，最终硅胶纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到751mg(78,2％，两步)标题化合物32c。
[1242]
lcms-方法a：
[1243]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,99
[1244]
电离方法：es
：[m h]
＝686,4
[1245]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(b s,1h),7.54(s,1h),7.40(d,j＝7.34hz,2h),7.19-7.34(m,7h),6.87(d,j＝8.68hz,4h),5.84(dd,j＝9.72,2.87hz,1h),4.61(t,j＝5.14hz,1h),3.69-3.82(m,7h),3.64(m,1h),2.97-3.14(m,2h),2.82-2.91(m,1h),2.70-2.76(m,1h),2.30(br t,j＝7.09hz,2h),1.98-2.21(m,2h),1.67(s,3h),1.33-1.46(m,2h),1.26(m,10h),0.81-0.92(m,3h)。
[1246]
32d：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1247]
按照通用程序b从粗制产物31d开始，最终硅胶纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到677mg(60,6％，两步)标题化合物32d。
[1248]
lcms-方法a：
[1249]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,44
[1250]
电离方法：es
：[m h]
＝798,5
[1251]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.54(s,1h),7.40(d,j＝7.46hz,2h),7.18-7.34(m,7h),6.86(m,4h),5.84(m,1h),4.61(m,1h),3.69-3.80(m,7h),3.64(m,1h),2.97-3.07(m,2h),2.85(br d,j＝8.80hz,1h),2.68-2.77(m,1h),2.24-2.35(m,2h),1.99-2.20(m,2h),1.67(s,3h),1.35-1.46(m,2h),1.23(s,26h),0.82-0.88(m,3h)。
[1252]
32e：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1253]
按照通用程序b从粗制产物31e开始，最终硅胶纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到701mg(76,4％，两步)标题化合物32e。
[1254]
lcms-方法a：
[1255]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,75
[1256]
电离方法：es
：[m h]
＝656,4
[1257]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.35(s,1h),7.55(s,1h),7.40(d,j＝7.46hz,2h),7.18-7.33(m,7h),6.87(d,j＝8.93hz,4h),5.81(m,1h),4.59(t,j＝5.20hz,1h),3.72-3.78(m,7h),3.66(m,1h),3.03(m,2h),2.84(br d,j＝9.41hz,1h),2.66-2.73(m,1h),2.23-2.39(m,3h),1.64-1.78(m,4h),1.68(s,3h),0.99-1.27(m,6h)。
[1258]
32f：1-[(2r,6r)-4-苄基-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1259]
按照通用程序b从粗制产物31f开始，最终硅胶纯化(在dcm中的0至5％meoh)得到591mg(63,6％，两步)标题化合物32f。
[1260]
lcms-方法a：
[1261]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,94
[1262]
电离方法：es
：[m h]
＝664,3
[1263]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.33(s,1h),7.52(s,1h),7.18-7.39(m,14h),6.86(d,j＝8.80hz,4h),5.86(dd,j＝9.66,2.93hz,1h),4.62(t,j＝5.20hz,1h),3.83(dd,
s,1h),7.37-7.43(m,2h),7.21-7.31(m,7h),6.86(d,j＝8.85hz,4h),5.86(m,1h),3.87-4.02(m,2h),3.73(s,6h),3.53-3.65(m,2h),3.40-3.52(m,2h),3.12(m,1h),3.00(m,1h),2.79-2.88(m,1h),2.64-2.77(m,2h),2.54-2.63(m,1h),2.23-2.41(m,3h),1.64-1.73(s,7h),0.91-1.25(m,18h)。
[1297]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,2,146,7。
[1298]
33f：3-[[(2s,6r)-4-苄基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-丙腈
[1299]
按照通用程序c，将32f(589mg，0,78mmol)转化为标题化合物33f，其分离为无色泡沫(668mg，99,0％)。
[1300]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.34(s,1h),7.54,7.53(2 x s,1h),7.19-7.39(m,14h),6.80-6.89(m,4h),5.92(m,1h),4.10(dd,j＝9.94,7.56hz,0.5h),4.01(m,0.5h),3.93(m,0.5h),3.85(m,0.5h),3.73(s,6h),3.35-3.64(m,6h),3.03-3.12(m,2h),2.98(d,j＝9.10hz,1h),2.72-2.91(m,2h),2.62-2.69(m,1h),2.12-2.26(m,2h),1.71,1.70(2 x s,3h),0.97-1.10(m,9h),0.91(d,j＝6.71hz,3h)。
[1301]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,2。
[1302]
33g：3-[[(2s,6r)-4-乙酰基-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-丙腈
[1303]
按照通用程序c，将32g(598mg，0,89mmol)转化为标题化合物33g，其分离为无色泡沫(728mg，定量)。通过溶解在10ml叔丁基-甲基醚中并且添加40ml正戊烷来进行粗制产物的纯化。将沉淀物离心并且丢弃上清液。将此洗涤程序再重复两次。
[1304]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.41(br s,1h),7.56-7.71(m,1h),7.35-7.46(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.82-6.91(m,4h),5.79-5.97(m,1h),4.27-4.45(m,1h),3.53
–
3.97(m,4h),3.73(s,6h),3.32-3.50(m,4h),3.02-3.19(m,2h),2.80-3.00(m,1h),2.55
–
2.74(m,2h),1.99-2.09(m,3h),1.69-1.81(m,3h),1.04-1.13(m,9h),0.97-1.03(m,3h)。
[1305]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,9,146,9,146,8,146,5。
[1306]
33h：3-[[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-十六烷酰基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-丙腈
[1307]
按照通用程序c，将32h(872mg，1,03mmol)转化为标题化合物33h，其分离为无色泡沫(915mg，87,7％)。
[1308]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.42,11.40(2 x s,1h),7.55-7.71(m,1h),7.40(m,2h),7.18-7.34(m,7h),6.82-6.91(m,4h),5.73-5.99(m,1h),4.27-4.50(m,1h),3.98(m,0.5h),3.75-3.85(m,1.5h),3.73(s,6h),3.53-3.65(m,2h),3.37-3.52(m,2h),3.02-3.25(m,2h),2.82-3.00(m,1h),2.67(m,1h),2.58(m,1h),2.21-2.48(m,2h),1.69-1.80(m,3h),1.49(br s,2h),1.18-1.31(m,26h),1.04-1.12(m,6h),0.92
–
1.03(m,6h),0.82-0.89(m,3h)。
[1309]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,7,147,3,147,2,146,7。
[1310]
合成方案10：
[1311][1312]
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
[1313]
*：参见合成方案9
[1314]
34b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1315]
在25℃下向24b(25g，33mmol)、环己酮(16.1g，165mmol和分子筛(30g)在meoh(450ml)中的混合物中添加acoh以将ph调节在5与6之间。在40℃下搅拌1h后，在40℃下分批添加nabh3cn(10.3g，165mmol)。继续搅拌12h以实现完全转化。将混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩。将残余物用etoac(1500ml)稀释，用h2o(2x500ml)和饱和nacl-溶液(500ml)洗涤。将有机层用na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 2:1)，产生28g(82％)呈无色泡沫的34b。
[1316]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.42(br s,1h),7.71(d,j＝8.1hz,1h),7.41(br d,j＝7.5hz,2h),7.31-7.19(m,7h),6.85(d,j＝8.8hz,4h),5.82(br dd,j＝2.6,9.8hz,1h),5.73(d,j＝8.1hz,1h),4.14(br d,j＝8.9hz,1h),3.93(br d,j＝8.8hz,1h),3.74(d,j＝2.0hz,6h),3.13(br d,j＝9.4hz,1h),2.99-2.83(m,2h),2.72(br d,j＝10.8hz,1h),2.31-2.17(m,3h),1.78-1.48(m,5h),1.32-1.09(m,6h),1.01-0.83(m,21h)。
[1317]
34c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1318]
按照针对34b的合成所述的方案，硅胶纯化(pe/etoac 1:1)后35g(42,4mmol)起始材料24c得到32g(64,7％)呈无色泡沫的所希望的产物34c。
[1319]
lcms-方法d：
[1320]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,18
[1321]
电离方法：es
：[m h]
＝907,5
[1322]
34e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1323]
按照针对34b的合成所述的方案，硅胶纯化(pe/etoac 2:1)后58g(68,8mmol)起始材料24e得到49g(77％)呈无色泡沫的所希望的产物34e。
[1324]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.21(br s,1h),8.77(s,1h),8.66(s,1h),8.06(br d,j＝7.2hz,2h),7.68-7.61(m,1h),7.60-7.52(m,2h),7.38(dd,j＝1.6,7.8hz,2h),7.26-7.15(m,7h),6.76(dd,j＝3.1,9.0hz,4h),6.16(dd,j＝3.1,9.7hz,1h),4.29(d,j＝9.0hz,1h),3.95(d,j＝8.8hz,1h),3.70(d,j＝1.0hz,6h),3.17-3.02(m,3h),2.94(d,j＝9.3hz,1h),2.83(br d,j＝11.1hz,1h),2.36-2.30(m,1h),1.82-1.70(m,4h),1.55(br d,j＝11.2hz,1h),1.34-1.15(m,8h),1.04-0.91(m,23h)。
[1325]
35b：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1326]
在室温下向化合物34b(28g，35.1mmol)在thf(280ml)中的溶液中添加net3(35g，351mmol)和net3·
3hf(56.3g，351mmol)。在70℃下在n
2-气氛下搅拌16h后，通过tlc可以检测到完全脱保护。将混合物在真空中浓缩并且将残余物用etoac(500ml)稀释。将有机溶液用水(2x200ml)和饱和nacl-溶液(200ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将粗制产物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 1:2)，这得到20g(88,8％)呈无色泡沫的标题化合物35b。
[1327]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.41(br s,1h),7.66(d,j＝8.1hz,1h),7.47-7.40(m,2h),7.36-7.21(m,7h),6.92(br d,j＝8.7hz,4h),5.84(br dd,j＝2.3,9.4hz,1h),5.65(br d,j＝7.9hz,1h),4.67(br s,1h),3.88(br d,j＝10.9hz,1h),3.78(s,6h),3.72(br d,j＝10.5hz,1h),3.15(br d,j＝9.0hz,1h),3.10-2.96(m,2h),2.91(br d,j＝9.8hz,1h),2.73(br d,j＝11.5hz,1h),2.35-2.18(m,3h),1.73(br s,4h),1.32-1.10(m,9h)。
[1328]
35c：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1329]
按照针对35b的合成所述的方案，硅胶色谱法(pe/etoac 1:2)后32g(35,3mmol)起始材料34c得到21g(79％)呈无色泡沫的所希望的产物35c。
[1330]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.10(s,1h),11.68(s,1h),8.04(s,1h),7.38(d,j＝7.3hz,2h),7.31-7.20(m,7h),6.85(d,j＝8.7hz,4h),5.91(dd,j＝3.1,8.8hz,1h),4.63(t,j＝5.2hz,1h),3.87-3.78(m,1h),3.74(s,7h),3.06-2.94(m,3h),2.84-2.65(m,3h),2.43(d,j＝11.6hz,1h),2.37-2.28(m,1h),2.37-2.28(m,1h),1.72(br s,4h),1.56(br d,j＝10.8hz,1h),1.27-1.02(m,13h)。
[1331]
35e：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1332]
按照针对35b的合成所述的方案，12h反应时间和硅胶色谱法(pe/etoac 1:2)后49g(53,0mmol)起始材料34e得到38g(88％)呈无色泡沫的所希望的产物35e。
[1333]
lcms-方法d：
[1334]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,94
[1335]
电离方法：es
：[m h]
＝769,4
[1336]
36b：3-[[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(2,4-二-氧代嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]-氧基丙腈
[1337]
在ar气氛下向35b(14g，22.4mmol)在dcm(150ml)中的溶液中添加dipea(11.5g，89.8mmol)和3-[氯-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈(6.9g，29.2mmol)。将溶液在13℃下搅拌0.5h以实现完全转化。将反应混合物在真空中浓缩至大约50ml的体积并且在二氧化硅上纯化(pe/etoac 2:1)，产生12,0g(65,5％)呈无色泡沫的36b。
[1338]
lcms-方法c：
[1339]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,60
[1340]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝759,5
[1341]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.34(br s,1h),7.59-7.69(2 x d,j＝8.0hz,1h),7.35-7.44(m,2h),7.20-7.32(m,7h),6.87(m,4h),5.84(m,1h),5.59-5.68(2 x d,j＝8.1hz,1h),3.99-4.09(m,1h),3.93(m,1h),3.73(s,6h),3.54-3.68(m,2h),3.40-3.53(m,2h),3.16(br d,j＝8.9hz,1h),2.96(t,j＝9.5hz,1h),2.88(m,1h),2.66-2.80(m,2h),2.60(m,1h),2.15-2.35(m,3h),1.69(m,4h),1.53(m,1h),0.95-1.21(m,17h)。
[1342]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,4,146,7。
[1343]
36c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1344]
按照针对36b的合成所述的方案，在室温下15min反应时间和硅胶色谱法(pe/etoac 1:1)后20g(26,6mmol)起始材料35c得到20g(79％)呈无色泡沫的所希望的产物36c。
[1345]
lcms-方法c：
[1346]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,70,2,73
[1347]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝868,5
[1348]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.08(br s,1h),11.63(br s,1h),8.07,8.03(2 x s,1h),7.37(d,j＝8.2hz,2h),7.18-7.29(m,7h),6.79-6.87(m,4h),5.89(m,1h),3.92-4.11(m,2h),3.72-3.74(m,6h),3.55-3.72(m,2h),3.38-3.51(m,2h),3.10(m,1h),2.96-3.05(m,2h),2.66-2.93(m,4h),2.55-2.62(m,1h),2.27-2.45(m,2h),1.71(m,4h),1.55(m,1h),0.83-1.29(m,23h)。
[1349]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,5,146,7。
[1350]
36e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1351]
按照针对36b的合成所述的方案，在室温下15min反应时间和硅胶色谱法(pe/etoac 1:1)后22g(31,2mmol)起始材料35e得到22,3g(80,5％)呈无色泡沫的所希望的产物36e。
[1352]
lcms-方法c：
[1353]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,78
[1354]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝886,6
[1355]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.18(s,1h),8.75,8.73(2 x s,1h),8.59,8.57(2 x s,1h),8.04(d,j＝7.8hz,2h),7.64(t,j＝7.3hz,1h),7.55(t,j＝7.6hz,2h),7.37(m,2h),7.17-7.27(m,7h),6.77-6.84(m,4h),6.18(m,1h),3.97-4.17(m,2h),3.71(m,6h),3.56-3.71(m,2h),3.43-3.56(m,2h),2.92-3.15(m,4h),2.78-2.91(m,1h),2.70(t,j＝6.0hz,1h),2.55-2.62(m,1h),2.31-2.47(m,2h),1.74(m,4h),1.55(m,1h),0.90-1.29(m,17h)。
[1356]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,0,146,7。
[1357]
合成方案11：
[1358][1359]
37：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-4-(1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-2-酮
[1360]
在20℃下向1,2,4-三唑(41.5g，0.601mol)在acn(415ml)中的混合物中逐滴添加pocl3(30.58g，0.20mol)。在0℃下，小心地添加dipea(126g，0.977mol)并且在0℃下继续搅拌5h，然后一次性添加起始材料34b(20g，25.0mmol)。将溶液在20℃下搅拌3h以实现完全转化。将反应混合物倒入etoac(500ml)和水(1l)中。将有机层分离并且将水相用etoac(2x200ml)萃取。将合并的有机相用饱和nahco
3-(500ml)和饱和nacl-溶液(500ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩，产生呈黄色泡沫的标题化合物37(29g，粗品)，其不经进一步纯化使用。
[1361]
34f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1362]
在0℃下向苯甲酰胺(30.3g，0.251mol)在二噁烷(310ml)中的溶液中分批添加nah(10g，251mmol)。在20℃下搅拌30min后，添加三唑37(29g，粗制产物25.0mmol)并且继续搅拌2h以实现完全转化。将反应混合物倒入etoac(500ml)和饱和nh4cl-溶液(8l)中。分离水层并且用etoac(2x500ml)萃取。将合并的有机相用水(2x500ml)和饱和nacl-溶液(500ml)洗涤，经无水na2so4干燥并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(pe/ea 5:1)以得
到呈黄色泡沫的34f(16g，70.8％)。
[1363]
lcms-方法e：
[1364]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,16
[1365]
电离方法：es
：[m h]
＝901,6
[1366]
35f：n-[1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1367]
按照针对35b的合成所述的方案，16h反应时间和硅胶色谱法(pe/etoac 1:1)后40g(44,4mmol)起始材料34f得到24g(72,7％)呈无色泡沫的所希望的产物35f。
[1368]
lcms-方法e：
[1369]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,92
[1370]
电离方法：es
：[m h]
＝745,3
[1371]
36f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1372]
按照针对36b的合成所述的方案，在室温下15min反应时间和硅胶色谱法(pe/etoac 1:1)后16g(22,8mmol)起始材料35f得到17g(65,5％)呈无色泡沫的所希望的产物36f。
[1373]
lcms-方法c：
[1374]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,92
[1375]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝862,5
[1376]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.29,11.26(2 x br s,1h),8.14,8.09(2 x br d,j＝7.6hz,1h),8.01(br d,j＝7.8hz,2h),7.63(m,1h),7.51(t,j＝7.3hz,2h),7.35-7.45(m,3h),7.21-7.34(m,7h),6.88(m,4h),5.96(m,1h),3.94-4.15(m,2h),3.74(s,6h),3.55-3.69(m,2h),3.41-3.53(m,2h),3.19-3.28(m,1h),2.95-3.08(m,2h),2.66-2.92(m,2h),2.52-2.64(m,1h),2.32(m,1h),2.13-2.28(m,2h),1.70(m,4h),1.54(m,1h),0.91-1.27(m,17h)。
[1377]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,5,146,7。
[1378]
合成方案12：
基]嘧啶-2,4-二酮
[1387]
将1,96g(2,45mmol)dmt-醚34b溶解在50ml dcm中。添加4,15g(2,66ml，31,9mmol)dcaa并且将溶液在室温下搅拌5min以实现完全转化。添加100ml饱和nahco
3-溶液后，将混合物搅拌1h并且分离各层。将水层用100ml dcm萃取两次并且将合并的有机层用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，这得到1,06g(86,9％)呈无色泡沫的受保护的产物38b。
[1388]
lcms-方法c：
[1389]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,51
[1390]
电离方法：es
：[m h]
＝496,4
[1391]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.31(s,1h),7.76(d,j＝8.2hz,1h),5.74(dd,j＝9.8,2.7hz,1h),5.61(d,j＝8.1hz,1h),4.61(t,j＝5.9hz,1h),3.97(d,j＝9.4hz,1h),3.78(d,j＝9.3hz,1h),3.36-3.51(m,2h),2.86(br d,j＝10.4hz,1h),2.76(br d,j＝11.5hz,1h),2.22-2.36(m,2h),2.15(m,1h),1.71(br d,j＝8.4hz,4h),1.55(m,1h),0.92-1.29(m,26h)。
[1392]
38c：n-[9-[(2r,6s)-4-环己基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1393]
按照针对38b所述的方案，将2,58g(2,84mmol)dmt-醚34c脱保护。在硅胶上色谱纯化(在正庚烷中的0至70％etoac/meoh(9:1))后，分离出1,41g(82,1％)呈浅黄色泡沫的标题化合物38c。
[1394]
lcms-方法c：
[1395]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,92
[1396]
电离方法：es
：[m h]
＝605,5
[1397]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.09(s,1h),11.54(s,1h),8.21(s,1h),5.78(dd,j＝9.7,2.7hz,1h),4.59(t,j＝6.1hz,1h),4.08(d,j＝8.9hz,1h),3.73(d,j＝8.8hz,1h),3.46(br d,j＝6.1hz,2h),3.01(br d,j＝10.1hz,1h),2.72-2.93(m,2h),2.37-2.56(m,2h),2.30(m,1h),1.63-1.83(m,4h),1.56(m,1h),0.94-1.31(m,32h)。
[1398]
38e：n-[9-[(2r,6s)-4-环己基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1399]
按照针对类似物38a的合成所述的方案，将2,18g(2,36mmol)dmt-醚34e用二氯乙酸脱保护。在二氧化硅上色谱纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)后，分离出呈无色泡沫的所希望的产物38e(1,14g，77,5％)。
[1400]
lcms-方法c：
[1401]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,94
[1402]
电离方法：es
：[m h]
＝623,7
[1403]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.17(s,1h),8.74(s,1h),8.70(s,1h),8.04(br d,j＝7.3hz,2h),7.65(m,1h),7.55(t,j＝7.1hz,2h),6.10(m,1h),4.60(m,1h),4.14(m,1h),3.88(m,1h),3.45(br d,j＝6.2hz,2h),3.12(m,1h),2.77-2.93(m,2h),2.45(m,1h),2.35(m,1h),1.76(m,4h),1.56(br d,j＝11.5hz,1h),1.16-1.33(m,4h),0.99-1.15(m,22h)。
[1404]
38f：n-[1-[(2r,6s)-4-环己基-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1405]
按照针对38b所述的方案，将1,94g(2,15mmol)dmt-醚34f脱保护。在硅胶上色谱纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)后，分离出1,18g(91,7％)呈浅黄色泡沫的标题化合物38f。
[1406]
lcms-方法c：
[1407]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,77
[1408]
电离方法：es
：[m h]
＝599,5
[1409]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.23(s,1h),8.29(br d,j＝7.3hz,1h),8.01(br d,j＝7.3hz,2h),7.62(t,j＝7.5hz,1h),7.52(m,2h),7.37(br d,j＝7.3hz,1h),5.85(br dd,j＝9.3,2.2hz,1h),4.65(t,j＝6.2hz,1h),4.03(d,j＝9.3hz,1h),3.79(d,j＝9.3hz,1h),3.50(m,2h),3.03(br d,j＝10.6hz,1h),2.82(br d,j＝11.4hz,1h),2.37(d,j＝11.5hz,1h),2.30(m,1h),2.06(t,j＝10.2hz,1h),1.65-1.81(m,4h),1.55(m,1h),0.91-1.33(m,26h)。
[1410]
39a：苯甲酸[(2s,6r)-4-环己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1411]
将3,05g(6,0mmol)起始材料38a溶解在60ml干吡啶中。在室温下，添加1,06g(877,6μl，7,5mmol)苯甲酰氯和745,9mg(6,0mmol)dmap并且将溶液搅拌4h。添加另外212,0mg(175,5μl，1,5mmol)苯甲酰氯后，将溶液搅拌过夜，这时检测到完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。将溶液用5％柠檬酸-、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)产生3,05g(83,0％)呈无色泡沫的苯甲酸酯39a。
[1412]
lcms-方法c：
[1413]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,57
[1414]
电离方法：es
：[m h]
＝614,5
[1415]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.32(s,1h),7.97-8.02(m,2h),7.68(s,1h),7.52-7.58(m,2h),7.47-7.49(m,1h),5.80(dd,j＝9.9,2.9hz,1h),4.40(d,j＝11.3hz,1h),4.31(d,j＝11.4hz,1h),4.17(d,j＝9.4hz,1h),3.95(d,j＝9.4hz,1h),2.95(br d,j＝11.5hz,1h),2.87(br d,j＝10.0hz,1h),2.44(br d,j＝11.4hz,1h),2.33(m,2h),1.69-1.80(m,4h),1.66(s,3h),1.52-1.60(m,1h),1.13-1.31(m,5h),0.96-1.12(m,21h)。
[1416]
39b：苯甲酸[(2s,6r)-4-环己基-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-吗啉-2-基]甲酯
[1417]
向1,03g(2,08mmol)38b在30ml dcm/吡啶(5:1)中的溶液中添加398,3mg(328,9μl，2,80mmol)苯甲酰氯和25,6mg(208μmol)dmap。在室温下搅拌3h后，将反应混合物通过添加1ml正丙醇淬灭。在真空中除去溶剂并且将残余物用h2o和etoac处理。将有机层分离并且用10％柠檬酸溶液(2x)、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生1,14g(92,0％)呈无色泡沫的苯甲酰基酯39b。
[1418]
lcms-方法c：
[1419]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,56
[1420]
电离方法：es
：[m h]
＝600,5
[1421]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.35(s,1h),7.97(m,2h),7.68(m,2h),7.54(m,2h),5.79(dd,j＝9.8,2.8hz,1h),5.58(d,j＝8.2hz,1h),4.33(s,2h),4.17(d,j＝9.4hz,1h),3.95(d,j＝9.4hz,1h),2.93(m,2h),2.40(br d,j＝11.5hz,1h),2.25-2.36(m,2h),1.67-1.80(m,4h),1.56(m,1h),0.92-1.31(m,26h)。
[1422]
39c：苯甲酸[(2s,6r)-4-环己基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1423]
按照针对39b的合成所述的方案并且在硅胶上纯化(在正庚烷中的0至65％etoac/meoh(9:1))，1,39g(2,30mmol)伯醇38c得到1,56g(95,6％)呈无色泡沫的标题化合物39c。
[1424]
lcms-方法c：
[1425]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,53
[1426]
电离方法：es
：[m h]
＝709,5
[1427]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.84(s,1h),11.60(s,1h),8.09(s,1h),7.80(m,2h),7.59(m,1h),7.44(t,j＝7.8hz,2h),5.84(dd,j＝5.8,3.9hz,1h),4.28(d,j＝11.6hz,1h),4.23(d,j＝11.6hz,1h),3.98(d,j＝9.1hz,1h),3.85(d,j＝9.1hz,1h),2.93-3.11(m,2h),2.74-2.90(m,2h),2.68(d,j＝11.6hz,1h),2.45(m,1h),1.70-1.88(m,4h),1.59(m,1h),0.90-1.35(m,32h)。
[1428]
39e：苯甲酸[(2s,6r)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-4-环己基-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-吗啉-2-基]甲酯
[1429]
将1,13g(1,8mmol)起始材料38e溶解在20ml干吡啶中。在室温下，添加334,9mg(276,5μl，2,4mmol)苯甲酰氯和223,9mg(1,8mmol)dmap并且将溶液搅拌3h。添加另外103,0mg(85,1μl，0,7mmol)苯甲酰氯后，将溶液搅拌直到实现完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。将溶液用h2o、2x10％柠檬酸-、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)产生877mg(66,5％)呈无色泡沫的苯甲酸酯39e。
[1430]
lcms-方法c：
[1431]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,65
[1432]
电离方法：es
：[m h]
＝727,8
[1433]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.15(m,1h),8.71(s,1h),8.61(s,1h),8.02(d,j＝7.3hz,2h),7.92(d,j＝7.4hz,2h),7.59-7.69(m,2h),7.48-7.58(m,4h),6.15(m,1h),4.24-4.40(m,3h),3.99(m,1h),3.17(m,1h),2.98-3.10(m,2h),2.60(m,1h),2.42(m,1h),1.70-1.90(m,4h),1.57(br d,j＝12.1hz,1h),1.16-1.32(m,4h),0.99-1.14(m,22h)。
[1434]
39f：苯甲酸[(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-4-环己基-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1435]
按照针对39b的合成所述的方案并且在硅胶上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，1,16g(1,94mmol)伯醇38f得到1,25g(91,9％)呈淡黄色泡沫的标题化合物39f。
[1436]
lcms-方法c：
[1437]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,74
[1438]
电离方法：es
：[m h]
＝703,5
[1439]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.25(s,1h),8.16(br d,j＝7.5hz,1h),7.96-8.03(m,4h),7.48-7.69(m,6h),7.34(br d,j＝7.3hz,1h),5.92(dd,j＝9.4,2.4hz,1h),4.39(m,2h),4.25(d,j＝9.4hz,1h),3.97(d,j＝9.4hz,1h),3.09(br d,j＝10.5hz,1h),3.01(d,j＝11.6hz,1h),2.44(d,j＝11.5hz,1h),2.36(m,1h),2.20(m,1h),1.68-1.81(m,4h),1.56(m,1h),0.89-1.34(m,26h)。
[1440]
40a：苯甲酸[(2r,6r)-4-环己基-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-吗啉-2-基]甲酯
[1441]
将3,0g(4,89mmol)甲硅烷基醚39a溶解在15ml dmf中。添加7,49g(73,3mmol，10,29ml)net3和6,03g(36,7mmol，6,10ml)net3·
3hf后，将溶液在75℃下搅拌2h以实现完全转化。将反应冷却至室温并且用100ml 5％nahco
3-溶液洗涤。过滤后，将水溶液用dcm萃取。分离有机层，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至10％meoh)，这得到1,23g(55,0％)所希望的脱保护的产物40a，其含有约20％异构体杂质，这是由于苯甲酰基酯迁移至游离oh-基团所致。
[1442]
lcms-方法c：
[1443]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,63
[1444]
电离方法：es
：[m h]
＝458,4
[1445]
40b：苯甲酸[(2r,6r)-4-环己基-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(羟甲基)吗啉-2-基]甲酯
[1446]
将1,12g(1,87mmol)甲硅烷基醚39b溶解在18ml thf中。添加2,85g(2,59ml，18,67mmol)pyr
·
hf后，将溶液在室温下搅拌1h以实现完全转化。添加120ml饱和nahco
3-溶液并且将混合物剧烈搅拌1h，然后添加40ml dcm。将有机层分离并且将水相用dcm萃取两次。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物用acn共蒸发并且通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生709mg(85,6％)呈无色泡沫的标题化合物40b。
[1447]
lcms-方法c：
[1448]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,57
[1449]
电离方法：es
：[m h]
＝444,3
[1450]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.33(s,1h),7.99(m,2h),7.68(t,j＝7.5hz,1h),7.64(d,j＝8.1hz,1h),7.56(t,j＝7.8hz,2h),5.80(dd,j＝9.5,2.9hz,1h),5.55(d,j＝8.1hz,1h),4.92(t,j＝5.6hz,1h),4.29(m,2h),3.82(dd,j＝11,3 5.0hz,1h),3.74(dd,j＝11,3,6.2hz,1h),2.87(m,2h),2.41(d,j＝11.5hz,1h),2.22-2.38(m,2h),1.73(m,4h),1.55(m,1h),1.01-1.29(m,5h)。
[1451]
40c：苯甲酸[(2r,6r)-4-环己基-2-(羟甲基)-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]吗啉-2-基]甲酯
[1452]
按照针对40b的合成所述的方案，将1,54g(2,17mmol)甲硅烷基醚39c脱保护，在硅胶上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac/meoh(9:1))后产生995mg(83,2％)呈淡黄色泡沫的标题化合物40c。
[1453]
lcms-方法c：
[1454]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,79
[1455]
电离方法：es
：[m h]
＝553,3
[1456]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.82(s,1h),11.68(s,1h),8.08(s,1h),7.82(d,j＝7.1hz,2h),7.60(t,j＝7.3hz,1h),7.45(t,j＝7.8hz,2h),5.88(t,j＝4.7hz,1h),4.95(t,j＝5.8hz,1h),4.24(d,j＝11.5hz,1h),4.17(d,j＝11.5hz,1h),3.70(dd,j＝11.0,5.6hz,1h),3.57(dd,j＝10.9,5.9hz,1h),3.01(m,2h),2,65-2.84(m,3h),2.46(m,1h),1.71-1.87(m,4h),1.59(m,1h),1.04-1.34(m,11h)。
[1457]
40e：苯甲酸[(2r,6r)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-4-环己基-2-(羟甲基)吗啉-2-基]-甲酯将870mg(1,2mmol)甲硅烷基醚39e溶解在15ml nmp中。添加1,70g(16,8mmol，2,34ml)net3和3,18g(19,2mmol，3,22ml)net3·
hf后，将溶液在室温下搅拌17h，然后在65℃下搅拌3h，这时检测到完全转化。冷却至室温后，添加150ml饱和nahoc
3-溶液和50ml ee并且将混合物剧烈搅拌30min。将有机层分离并且用饱和nahco
3-溶液和10％nacl-溶液洗涤。经mgso4干燥后，在真空中蒸发溶剂。色谱纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)后，分离出呈无色泡沫的40e(616mg，90,2％)。
[1458]
lcms-方法c：
[1459]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,90
[1460]
电离方法：es
：[m h]
＝571,5
[1461]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.13(s,1h),8.70(s,1h),8.56(s,1h),8.02(br d,j＝7.3hz,2h),7.93(m,2h),7.65(m,2h),7.48-7.59(m,4h),6.16(dd,j＝8.7,3.0hz,1h),4.97(br s,1h),4.21-4.38(m,2h),3.89(br d,j＝10.5hz,1h),3.80(br d,j＝10.2hz,1h),3.15(m,1h),3.05(m,1h),2.93(br d,j＝11.6hz,1h),2.63(m,1h),2.37-2.44(m,1h),1.65-1.82(m,4h),1.57(br d,j＝11.7hz,1h),1.13-1.32(m,4h),1.01-1.13(m,1h)。
[1462]
40f：苯甲酸[(2r,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-4-环己基-2-(羟甲基)-吗啉-2-基]甲酯
[1463]
按照针对40b的合成所述的方案，将1,23g(1,74mmol)甲硅烷基醚39f脱保护，在硅胶上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac/meoh(9:1))后产生888mg(93,2％)呈无色泡沫的标题化合物40f。
[1464]
lcms-方法c：
[1465]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,05
[1466]
电离方法：es
：[m h]
＝547,3
[1467]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.25(s,1h),8.12(br d,j＝7.6hz,1h),8.01(m,4h),7.47-7.73(m,6h),7.33(br d,j＝7.5hz,1h),5.92(dd,j＝9.4,2.6hz,1h),4.95(t,j＝6.0hz,1h),4.31-4.40(2 x d,j＝11.4hz,2h),3.92(dd,j＝11.4,5.0hz,1h),3.75(dd,j＝11.5,6.6hz,1h),3.09(br d,j＝10.3hz,1h),2.93(d,j＝11.5hz,1h),2.45(d,j＝11.6hz,1h),2.36(m,1h),2.16(m,1h),1.74(m,4h),1.56(m,1h),1.00-1.32(m,5h)。
[1468]
41a：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲酯
[1469]
将2,05g(4,48mmol)起始材料40a溶解在40ml干吡啶中。在室温下，逐滴添加1,64g(4,70mmol)dmt-cl在10ml dcm中的溶液并且将反应溶液搅拌过夜。添加5ml iproh后，将反
应溶液蒸发并且将残余物溶解在dcm中。将有机溶液用mgso4干燥并且蒸发。将获得的粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至10％meoh)，然后通过hplc进行第二纯化(柱：chiralcel oz-h/140，250x4,6mm，1,0ml/min，30℃；洗脱剂：meoh/etoh 1:1)，这得到1,05g(30,8％)呈无色泡沫的标题化合物41a。
[1470]
lcms-方法c：
[1471]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,17
[1472]
电离方法：es-：[m-h]-＝758,6
[1473]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.31(s,1h),7.73-7.79(m,2h),7.63-7.71(m,1h),7.46-7.54(m,3h),7.35(d,j＝7.1hz,2h),7.16-7.28(m,7h),6.79(dd,j＝8.9,3.6hz,4h),5.65(dd,j＝9.9,2.9hz,1h),4.50(d,j＝11.3hz,1h),4.40(d,j＝11.1hz,1h),3.69(d,j＝1.59hz,6h),3.55(d,j＝8.6hz,1h),3.01(d,j＝11.4hz,1h),2.81(d,j＝9.9hz,1h),2.66-2.69(m,1h),2.23-2.39(m,2h),1.61-1.78(m,4h),1.68(s,3h),1.51-1.60(m,1h),0.98-1.30(m,5h)。
[1474]
41b：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲酯
[1475]
在室温下向690mg(1,56mmol)40b在30ml dcm/吡啶(4:1)中的溶液中添加699mg(2,02mmol)dmt-cl。搅拌16h后，在真空中除去溶剂并且将残余物用25ml acn共蒸馏三次。添加h2o后，将混合物用etoac萃取。将有机相分离并且用饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥并且蒸发溶剂后，将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac，用正庚烷 1％net3进行柱预调理)，产生1,06g(91,3％)呈无色泡沫的dmt-醚41b。
[1476]
lcms-方法c：
[1477]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,16
[1478]
电离方法：es-：[m-h]-＝744,7
[1479]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.34(s,1h),7.64-7.76(m,4h),7.49(m,2h),7.35(m,2h),7.16-7.26(m,7h),6.74-6.81(m,4h),5.63(dd,j＝9.8,2.8hz,1h),5.58(d,j＝8.2hz,1h),4.44(s,2h),3.69(s,3h),3.68(s,3h),3.57(d,j＝8.6hz,1h),3.02(d,j＝11.6hz,1h),2.85(br d,j＝10.2hz,1h),2.34(m,1h),2.24(t,j＝8.6hz,1h),1.61-1.79(m,4h),1.56(m,1h),0.98-1.31(m,5h)。
[1480]
41c：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]吗啉-2-基]甲酯
[1481]
按照针对41b的合成所述的方案，880mg(1,59mmol)起始材料40c得到1,30g(95,6％)呈无色泡沫的标题化合物41c。
[1482]
lcms-方法c：
[1483]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,16
[1484]
电离方法：es-：[m-h]-＝853,4
[1485]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.86(br s,1h),11.55(br s,1h),8.07(s,1h),7.53-7.61(m,3h),7.30-7.42(m,4h),7.16-7.27(m,7h),6.72-6.85(m,4h),5.66(dd,j＝6.6,3.4hz,1h),4.41(d,j＝11.5hz,1h),4.34(d,j＝11.5hz,1h),3.67(s,3h),3.64(s,3h),3.51(d,j＝8.1hz,1h),3.14(d,j＝8.1hz,1h),2.96-3.05(m,2h),2.81-2.93(m,2h),
2.75(m,1h),1.79(m,4h),1.61(br d,j＝11.7hz,1h),1.03-1.39(m,11h)。
[1486]
41e：苯甲酸[(2r,6r)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]甲酯
[1487]
将610mg(1,1mmol)起始材料40e溶解在30ml干吡啶中并且蒸发。将此程序重复三次。然后将化合物溶解在30ml干吡啶中，然后添加162,7mg(223,6μl，1,6mmol)net3和554,4mg(1,6mmol)dmt-cl。将反应溶液在室温下搅拌过夜，这时实现完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用h2o、10％-柠檬酸-(2x)、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤后，将有机相用mgso4干燥。蒸发溶剂并且通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)得到807mg(86,5％)呈无色泡沫的dmt-醚41e。
[1488]
lcms-方法c：
[1489]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,26
[1490]
电离方法：es
：[m h]
＝873,8
[1491]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.17(br s,1h),8.69(s,1h),8.60(s,1h),8.02(m,2h),7.73(m,2h),7.64(m,2h),7.54(m,2h),7.47(m,2h),7.39(m,2h),7.18-7.28(m,7h),6.75-6.84(m,4h),5.95(dd,j＝9.4,2.9hz,1h),4.44(m,2h),3.65-3.72(m,7h),3.44(m,1h),3.02-3.14(m,2h),2.94(br t,j＝10.3hz,1h),2.67(m,1h),2.41(br d,j＝7.7hz,1h),1.66-1.83(m,4h),1.57(br d,j＝11.62hz,1h),1.13-1.29(m,4h),1.01-1.12(m,1h)。
[1492]
41f：苯甲酸[(2r,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]甲酯
[1493]
按照针对41b的合成所述的方案，870mg(1,59mmol)起始材料40f得到1,21g(89,4％)呈无色泡沫的标题化合物41f。
[1494]
lcms-方法c：
[1495]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,37
[1496]
电离方法：es-：[m-h]-＝847,4
[1497]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.27(br s,1h),8.16(d,j＝7.6hz,1h),7.99(m,2h),7.74(m,2h),7.59-7.70(m,2h),7.44-7.55(m,4h),7.28-7.42(m,3h),7.18-7.28(m,7h),6.74-6.84(m,4h),5.74(dd,j＝9.5,2.6hz,1h),4.51(m,2h),3.70(s,3h),3.69(s,3h),3.65(d,j＝8.4hz,1h),3.10(d,j＝11.4hz,1h),3.00(m,1h),2.54(d,j＝11.9hz,1h),2.37(m,1h),2.15(t,j＝10.5hz,1h),1.62-1.80(m,4h),1.56(m,1h),0.98-1.32(m,5h)。
[1498]
42a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟基-甲基)吗啉-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1499]
将1,0g(1,32mmol)苯甲酰基酯41a溶解在12ml etoh/pyr.(5:1)中。在0℃下添加6,58ml(13,16mmol)2m naoh-溶液。移除冷却浴后，将反应溶液在室温下搅拌1h以实现完全转化。将溶液用50ml h2o稀释并且用etoac萃取。将有机层分离并且用10％柠檬酸-s、5％nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥并且蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至50％etoac)，这产生325mg(37,7％)呈无色泡沫的标题化合物42a。
[1500]
lcms-方法c：
[1501]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,33
[1502]
电离方法：es
：[m h]
＝656,5
[1503]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.28(s,1h),7.58(d,j＝1.0hz,1h),7.39(d,j＝7.5hz,2h),7.19-7.32(m,7h),6.87(d,j＝8.8hz,4h),5.56(dd,j＝9.9,2.7hz,1h),4.65(t,j＝6.0hz,1h),3.73(s,6h),3.58(dd,j＝11.4,6.9hz,1h),3.50(dd,j＝11.3,5.0hz,1h),3.35(d,j＝8.7hz,1h),3.10(d,j＝8.6hz,1h),2.68-2.83(m,2h),2.42(d,j＝11.6hz,1h),2.22(m,1h),2.14(t,j＝10.4hz,1h),1.78(s,3h),1.58-1.71(m,4h),1.53(br d,j＝12.2hz,1h),1.00-1.32(m,5h)。
[1504]
42b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1505]
将1,04g(1,39mmol)起始化合物41b溶解在25ml thf/etoh(4:1)中。将溶液冷却至0℃并且添加6,97ml(13,94mmol)2m naoh-溶液。移除冰浴并且将反应搅拌1h。添加另外6,97ml(13,94mmol)2m naoh-溶液后，在室温下继续搅拌3h并且在45℃下搅拌另外60min以实现完全转化。添加100ml h2o和1,7g柠檬酸一水合物后，将混合物用etoac萃取。分离有机相并且用h2o、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将溶液蒸发并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的20至100etoac)以产生823mg(92,0％)呈无色固体的所希望的产物42b。
[1506]
lcms-方法c：
[1507]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,36
[1508]
电离方法：es
：[m h]
＝642,4
[1509]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.30(s,1h),7.74(d,j＝8.1hz,1h),7.39(m,2h),7.19-7.32(m,7h),6.87(d,j＝8.7hz,4h),5.60(d,j＝8.1hz,1h),5.54(dd,j＝9.7,2.5hz,1h),4.66(t,j＝5.9hz,1h),3.73(s,6h),3.58(dd,j＝11.3,6.7hz,1h),3.48(dd,j＝11.3,5.0hz,1h),3.35(d,j＝8.8hz,1h),3.10(d,j＝8.6hz,1h),2.78(br d,j＝11.4hz,2h),2.41(br d,j＝11.9hz,1h),2.23(m,1h),2.08(m,1h),1.57-1.73(m,4h),1.55(m,1h),0.97-1.27(m,5h)。
[1510]
42c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1511]
将1,28g(1,50mmol)苯甲酰基酯41c溶解在36ml etoh/吡啶(2:1)中。在0℃下添加7,49ml(14,97mmol)2m naoh-溶液并且将溶液在冰冷的冷却下持续20min。移除冰浴并且继续搅拌1,5h。将反应溶液再次冷却至0℃，然后添加30ml h2o和980mg柠檬酸一水合物。将反应溶液用150ml etoac萃取并且分离有机相。用10％柠檬酸-溶液(2x)、h2o、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤后，将有机层用mgso4干燥并且蒸发。将获得的粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac/meoh(9:1))，产生721mg(64,1％)呈无色泡沫的标题化合物42c。
[1512]
lcms-方法c：
[1513]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,68
[1514]
电离方法：es-：[m-h]-＝749,3
[1515]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.08(br s,1h),11.52(br s,1h),8.18(s,1h),7.39(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.86-6.93(m,4h),5.53(dd,j＝9.7,2.7hz,1h),4.62
(t,j＝6.2hz,1h),3.73(s,3h),3.72(s,3h),3.45-3.63(m,3h),2.92-3.04(m,3h),2.75(m,1h),2.59(br d,j＝11.7hz,1h),2.41(t,j＝10.6hz,1h),2.33(m,1h),1.63-1.82(m,4h),1.57(m,1h),0.98-1.31(m,11h)。
[1516]
42e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1517]
将起始化合物41e(800mg，0,92mmol)溶解在32ml etoh/吡啶(3:1)中。在0℃下，添加4,58ml(9,16mmol)2m naoh-溶液并且将反应混合物在室温下搅拌1h。通过添加柠檬酸一水合物(641mg)将ph调节至7后，添加100ml h2o和etoac。将有机层分离并且用10％柠檬酸溶液(2x)、h2o、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将有机相蒸发，产生741mg呈无色泡沫的粗制产物。在二氧化硅上色谱纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)得到634mg(90,0％)呈无色泡沫的所希望的化合物42e。
[1518]
lcms-方法c：
[1519]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,69
[1520]
电离方法：es-：[m-h]-＝767,5
[1521]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.18(br s,1h),8.69(s,1h),8.66(s,1h),8.04(d,j＝7.7hz,2h),7.64(m,1h),7.55(t,j＝7.6hz,2h),7.44(d,j＝7.5hz,2h),7.27-7.34(m,6h),7.22(m,1h),6.89(dd,j＝9.1,2.6hz,4h),5.84(dd,j＝9.9,2.7hz,1h),4.68(br t,j＝5.8hz,1h),3.74,3.73(2 x s,6h),3.47-3.63(m,3h),3.28(m,1h),3.03(br d,j＝9.9hz,1h),2.86(br d,j＝11.6hz,1h),2.72(t,j＝10.5hz,1h),2.53(m,1h),2.24-2.34(m,1h),1.61-1.73(m,4h),1.54(br d,j＝11.4hz,1h),1.00-1.30(m,5h)。
[1522]
42f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(羟甲基)吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1523]
按照针对42c的合成所述的方案，将1,19g(1,40mmol)苯甲酸酯41f皂化，在硅胶色谱法(在正庚烷中的0至100％etoac)后导致产生795mg(76,5％)呈无色固体的标题化合物42f。
[1524]
lcms-方法c：
[1525]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,59
[1526]
电离方法：es-：[m-h]-＝743,3
[1527]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.25(br s,1h),8.27(br d,j＝7.5hz,1h),8.00(m,2h),7.62(t,j＝7.5hz,1h),7.51(m,2h),7.17-7.44(m,10h),6.85-6.92(m,4h),5.64(dd,j＝9.4,2.6hz,1h),4.71(t,j＝6.1hz,1h),3.74(m,6h),3.63(dd,j＝11.6,7.1hz,1h),3.55(dd,j＝11.5,5.3hz,1h),3.41(d,j＝8.7hz,1h),3.13(d,j＝8.6hz,1h),2.95(br d,j＝10.1hz,1h),2.85(d,j＝11.9hz,1h),2.48(m,1h),2.26(m,1h),2.00(t,j＝10.3hz,1h),1.59-1.78(m,4h),1.53(m,1h),0.98-1.30(m,5h)。
[1528]
43a：3-[[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)-磷烷基]-氧基丙腈
[1529]
将320mg(488μmol)起始材料42a溶解在6ml干dcm中。在ar气氛下，添加44mg(244μmol)ipr2nh-四唑和190mg(601μmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌过夜。添加50ml h2o和dcm后，将有机层分离，用mgso4干燥并且蒸发。将粗
制产物通过硅胶色谱法纯化(用正庚烷 1％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生322mg(78,6％)呈无色泡沫的所希望的亚磷酰胺43a。
[1530]
lcms-方法b-2：
[1531]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,83
[1532]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝773,3
[1533]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.32,11.30(2 x br s,1h),7.57,7.52(2 x d,j＝1.0hz,1h),7.38(m,2h),7.19-7.32(m,7h),6.84-6.91(m,4h),5.68,5,59(2 x m,1h),3.89(m,0.5h),3.59-3.78(m,3.5h),3.73(s,6h),3.46-3.57(m,2h),3.35(m,1h),3.22(m,1h),2.66-2.84(m,4h),2.40(m,1h),2.17-2.28(m,2h),1.78,1.76(2 x s,3h),1.56-1.72(m,4h),1.47-1.56(m,1h),1.00-1.31(m,17h)。
[1534]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147.6,147.5。
[1535]
43b：3-[[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-4-环己基-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)吗啉-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[1536]
将797mg(1,24mmol)起始材料42b溶解在27ml干dcm中。在ar气氛下，添加644mg(3,73mmol)ipr2nh-四唑和579mg(610μl，1,86mmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌过夜。添加50ml h2o和dcm后，将有机层分离，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物(1,25g)溶解在10ml etoac/乙醚(1:1)中并且添加40ml正戊烷。通过离心收集沉淀物并且丢弃溶剂。将沉淀程序重复三次，在speedvac上干燥后得到865mg(82,7％)呈无色固体的所希望的产物43b。
[1537]
lcms-方法b-2：
[1538]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,89
[1539]
电离方法：es
：[dmt]
＝303,1
[1540]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.34,11.32(2 x br s,1h),7.69,7,65(2 x d,j＝8.1hz,1h),7.38(m,2h),7.19-7.32(m,7h),6.84-6.91(m,4h),5.56-5.66(m,2h),3.89(m,0.5h),3.44-3.79(m,5.5h),3.74(s,6h),3.35(m,1h),3.23(m,1h),2.70-2.86(m,3h),2.67(m,1h),2.38(m,1h),2.11-2.29(m,2h),1.46-1.74(m,5h),0.98-1.24(m,17h)。
[1541]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147.5。
[1542]
43c：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1543]
按照针对43b的合成所述的方案，695mg(923μmol)起始化合物42c得到687mg(78,0％)呈无色泡沫的标题化合物43c。
[1544]
lcms-方法b-2：
[1545]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,96
[1546]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝868,3
[1547]
lcms-方法b-2：
[1548]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,89
[1549]
电离方法：es
：[dmt]
＝303,1
[1550]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.06(br s,1h),11.53(br s,1h),8.05,8.04
(2x s,1h),7.34-7.42(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.83-6.91(m,4h),5.54-5.61(m,1h),3.87(m,0.5h),3.73,3.72(2 x s,6h),3.35-3.67(m,5.5h),3.21,3.14(2 x d,j＝8.4hz,1h),2.65-3.03(m,5h),2.53-2.64(m,3h),2.28-2.41(m,1h),1.62-1.81(m,4h),1.57(m,1h),0.88-1.33(m,23h)。
[1551]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147.6,147.5。
[1552]
43e：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]嘌呤-6-基]-苯甲酰胺
[1553]
将625mg(813μmol)起始材料42e溶解在15ml干dcm中。在ar气氛下，添加422mg(2,44mmol)ipr2nh-四唑和379mg(1,22mmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌过夜。添加50ml h2o和dcm后，将有机层分离并且将水层用dcm萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发，这得到835mg呈无色泡沫的粗制产物。将粗制产物溶解在10ml mtb-醚中并且添加40ml正戊烷。通过离心收集沉淀物并且丢弃溶剂。将沉淀程序重复三次，在speedvac上干燥后得到710mg(90,1％)呈无色固体的所希望的产物43e。
[1554]
lcms-方法b-3：
[1555]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,63
[1556]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh-a
bzl
]
＝647,3
[1557]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.16(br s,1h),8.72,8.70(2 x s,1h),8.60,8.57(2 x s,1h),8.04(d,j＝8.1hz,2h),7.63(m,1h),7.55(m,2h),7.44(m,2h),7.20-7.36(m,7h),6.85-6.94(m,4h),5.83-5.95(m,1h),3.83-3.95(m,1h),3.74(s,6h),3.34-3.73(m,7h),3.00-3.11(m,2h),2.76-2.92(m,2h),2.71,2.62(2 x m,2h),2.23-2.39(m,1h),1.59-1.77(m,4h),1.47-1.58(m,1h),0.99-1.30(m,14h),0.90-0.97(m,3h)。
[1558]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147.5,147.3。
[1559]
43f：n-[1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-4-环己基-吗啉-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1560]
按照针对43b的合成所述的方案，769mg(1,03mmol)起始化合物42f得到698mg(71,5％)呈无色泡沫的标题化合物43f。在所述沉淀程序中，将粗制产物溶解在10ml乙醚而非etoac/乙醚(1:1)溶剂混合物中
[1561]
lcms-方法b-2：
[1562]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,96
[1563]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh-dmt]
＝560,2
[1564]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.27(br s,1h),8.16(m,1h),8.01(d,j＝7.4hz,2h),7.63(t,j＝7.4hz,1h),7.51(m,2h),7.16-7.45(m,10h),6.85-6.91(m,4h),5.73,5.69(2 x dd,j＝9.7,2.7hz,1h),3.89-4.01(m,0.5h),3.46-3.88(m,5.5h),3.74(s.6h),3.36-3.44(m,1h),3.24-3.34(m,1h),2.92-3.02(m,1h),2.79-2.92(m,1h),2.75(t,j＝5.9hz,1h),2.68(m,1h),2.44(m,1h),2.27(m,1h),2.03-2.15(m,1h),1.57-1.73(m,4h),1.53(m,1h),0.98-1.29(m,17h)。
[1565]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147.6,147.5。
[1566]
b：式(i)的核苷酸类似物的合成，其中x是o
[1567]
合成方案13
[1568][1569]
44a：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1570]
在-30℃下向化合物4a(72,75g，0,164mmol)在728ml dmf中的混合物中添加44,6gbom-cl(0,285mol)和50g dbu(0,327mol)。将混合物在-15℃至-30℃下搅拌3h以实现完全转化。将混合物倒入饱和nahco
3-溶液(2l)中并且用etoac(3x1 l)萃取。将合并的有机层
经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化(dcm/meoh 20:1)以得到62,7g(67,7％)呈黄色油状物的bom保护的产物44a。
[1571]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:8.67-8.55(m,4h),7.70(tt,j＝7.64,1.77hz,2h),7.52-7.20(m,10h),5.69-5.62(m,1h),5.52-5.44(m,1h),4.74-4.54(m,2h),4.51-4.42(m,1h),4.11-3.63(m,6h),2.01-1.84(m,4h),1.30-0.85(m,21h)。
[1572]
44b：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)-5-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1573]
按照针对44a所述的方案，在硅胶色谱法(dcm/meoh 20:1至10:1)后，24g(0,056mol)起始化合物4b得到22,0g(71,7％)呈无色固体的44b。
[1574]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:8.02(d,j＝8.0hz,1h),7.34-7.31(m,5h),5.95(d,j＝8.0hz,1h),5.85(d,j＝8.0hz,1h),5.35-5.32(m,3h),5.08(d,j＝4.0hz,1h),4.59(s,2h),4.50(d,j＝4.0hz,1h),4.24-4.19(m,2h),4.09(t,j＝4.0hz,1h),3.83(s,2h),3.65(t,j＝4.0hz,2h),1.03-1.02(m,21h)。
[1575]
45a：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,3r,4s,5s)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1576]
将7,42g(13,1mmol)起始材料44a用40ml吡啶共蒸馏两次并且溶解在150ml dcm/吡啶(4:1)中。添加4,77g(13,8mmol)dmt-cl后，将溶液在室温下搅拌65h。将溶液用柠檬酸-水溶液(10％)洗涤两次，然后用h2o、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤。分离有机相，用mgso4干燥并且通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)以得到8,50g(74,7％)呈无色泡沫的所希望的产物45a。
[1577]
lcms-方法a：
[1578]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,34
[1579]
电离方法：es
：[m na]
＝889,5
[1580]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.46-7.40(m,1h),7.35-7.12(m,14h),6.75(d,j＝7.91hz,4h),6.04(d,j＝5.52hz,1h),5.53-5.37(m,2h),4.67-4.54(m,2h),4.46-4.37(m,2h),3.89(d,j＝10.29hz,1h),3.76-3.68(m,7h),3.62(d,j＝10.16hz,1h),3.52(br d,j＝8.41hz,1h),3.40-3.33(m,1h),3.17(d,j＝10.16hz,1h),1.44(s,3h),1.05-0.85(m,21h)。
[1581]
45b：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,3r,4s,5s)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-甲基]-3,4-二羟基-5-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)四氢呋喃-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1582]
在室温下向化合物44b(21,0g，38mmol)在230ml干dmf中的溶液中添加dipea(9,8g，76mmol)和dmt-cl(15,4g，45,6mmol)。将反应溶液在n
2-气氛下搅拌4h。添加30ml etoh后，在减压下除去溶剂并且将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(pe/etoac10:1至1:1)，这得到19,0g(58,5％)呈黄色泡沫的45b。
[1583]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.72(d,j＝8.0hz,1h),6.90(d,j＝8.0hz,4h),7.39-7.24(m,14h),5.89(d,j＝8.0hz,1h),3.51(d,j＝8.0hz,1h),5.37-5.24(m,4h),4.58(s,2h),4.34(t,j＝4.0hz,1h),4.24(dd,j＝12.0,8.0hz,1h),3.73(s,6h),3.40(d,j＝12.0hz,1h),3.29(d,j＝12.0hz,1h),1.19-0.86(m,21h)。
[1584]
46a：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1585]
在室温下向45a(20g，23,07mmol)在400ml丙酮/水(3:1)中的溶液中添加naio4(6,9g，32,29mmol)在100ml水中的溶液。搅拌16h后，在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac(300ml)中并且用饱和nahco3(200ml)和盐水(200ml)洗涤。将有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到呈黄色泡沫的46a，其不经进一步纯化而用于下一步骤。
[1586]
lcms-方法a：
[1587]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,30、2,32(两种异构体)
[1588]
电离方法：es
：[m na]
＝905,5
[1589]
46b：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3,5-二羟基-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1590]
按照针对46a所述的方案，将20g(23,5mmol)45b转化为标题化合物46b(18,6g，粗制)。
[1591]
lcms-方法a：
[1592]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,23、2,25(两种异构体)
[1593]
电离方法：es
：[m na]
＝891,4
[1594]
47a：3-(苄氧基甲基)-1-[(1r)-1-[(1s)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1595]
在室温下向化合物46a(粗制产物，23,07mmol)在320ml etoh中的溶液中分批添加nabh4(1,05g，27,68mmol)。将混合物搅拌过夜并且在真空中除去溶剂。将残余物溶解在etoac(500ml)中并且用饱和nahco
3-溶液(500ml)和盐水(500ml)洗涤。将有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。柱色谱法(dcm/meoh 20:1)后，分离出12,0g呈黄色泡沫的47a(48％)。
[1596]
lcms-方法a：
[1597]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,31
[1598]
电离方法：es
：[m na]
＝891,5
[1599]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.52-7.06(m,20h),6.80-6.65(m,5h),6.08(dd,j＝7.03,3.76hz,1h),5.44-5.25(m,1h),4.64-4.46(m,2h),3.85-3.63(m,12h),3.60-3.40(m,2h),3.35.3.22(m,2h),2.95-2.66(m,2h),1.80(s,3h),1.51(s,3h),1.03-0.81(m,23h)。
[1600]
47b：3-(苄氧基甲基)-1-[(1r)-1-[(1s)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]-甲基]-1-(羟甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]嘧啶-2,4-二酮
[1601]
在室温下向15,35g(17,7mmol，粗品)46b在250ml etoh中的溶液中添加818mg(21,2mmol)nabh4。将反应搅拌16h，这时检测到完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。将有机溶液用h2o、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤后，将有机层用mgso4干燥并且蒸发，这得到14,85g(98,3％)呈无色泡沫的47b，其不经进一步纯化使用。
[1602]
lcms-方法a：
[1603]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,23
[1604]
电离方法：es
：[m]
＝303,2(dmt
)
[1605]
47c：n-[9-[(1r)-1-[(1s)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基-甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1606]
在15℃-20℃下向23c(30g，35mmol)在400ml无水etoh中的溶液中添加nabh4(1,6g，42mmol)。搅拌4h后，通过使用10％柠檬酸溶液(约25ml)将ph调节至7。将溶剂在真空中浓缩并且将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(dcm/meoh 20:1至10:1)，这得到22,0g(74,5％)呈黄色固体的47c。
[1607]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.06(s,1h),11.71(s,1h),8.04(s,1h),7.37-7.28(m,3h),7.26-7.19(m,11h),6.87-6.83(m,4h),6.09(d,j1＝5.6hz,j2＝5.6hz,1h),5.22(d,j＝5.6hz,1h),4.75(d,j1＝4.8hz,j2＝4.8hz,1h),3.85-3.84(m,2h),3.74-3.70(m,9h),3.68-3.49(m,2h),3.14(m,1h),2.99-2.81(m,1h),1.15-1.12(m,6h),0.80-0.79(m,21h)。
[1608]
47e：n-[9-[(1r)-1-[(1s)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟基-甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]-2-羟基-乙基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1609]
将3,55g(4,1mmol)起始材料23e溶解在60ml乙醇中。在ar气氛下，添加285,5mg(7,4mmol)硼氢化钠并且将混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物冷却至0℃后，添加50ml柠檬酸，然后添加饱和nahco
3-溶液以达到ph 7。在真空中除去溶剂并且将水性残余物用h2o稀释并且用etoac萃取。将有机层分离并且用饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)，这得到2,15g呈浅黄色泡沫的所希望的二醇47e。
[1610]
lcms-方法c：
[1611]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,21
[1612]
电离方法：es
：[m h]
＝862,7
[1613]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.14(s,1h),8.66(s,1h),8.47(s,1h),8.05(br d,j＝7.3hz,2h),7.61-7.67(m,1h),7.51-7.60(m,2h),7.36(d,j＝7.3hz,2h),7.27(br t,j＝7.6hz,2h),7.17-7.23(m,5h),6.83(dd,j＝9.0,3.0hz,4h),6.43(t,j＝5.7hz,1h),5.17(t,j＝5.7hz,1h),4.63(t,j＝4.7hz,1h),3.76-3.99(m,2h),3.55-3.76(m,10h),3.17-3.26(m,1h),3.05(d,j＝9.7hz,1h),0.78-1.02(m,21)。
[1614]
48a：[(2r)-2-[3-(苄氧基甲基)-5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1s)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(羟甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]乙基]4-甲基苯磺酸酯
[1615]
在15℃下向47a(10,8g，12,43mmol)、net3(3,14g，31,07mmol)和dmap(1,52g，12,43mmol)在108ml dcm中的溶液中添加ts-cl(1,9g，9,94mmol)在54ml dcm中的溶液。将混合物搅拌2h，然后添加溶解在5ml dcm中的另外500mg ts-cl。在15℃下搅拌另外1h，将反应混合物用饱和nahco
3-溶液(200ml)和盐水(200ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 2:1)以得到呈黄色油状物的48a(10g，78.7％)。
[1616]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.74-7.43(m,2h),7.34-7.00(m,18h)6.84-6.64
6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1629]
在15℃下向化合物48a(10,5g，10,26mmol)在343ml无水thf和343ml meoh中的混合物中添加2m naoh溶液(74ml，147,47mmol)。将混合物在65℃下搅拌3h，这时检测到完全转化。将混合物用柠檬酸水溶液(10％)中和并且在真空中浓缩。将残余物溶解在etoac(700ml)中并且用饱和nahco
3-溶液(700ml)洗涤。将有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 5:1)以得到呈黄色油状物的标题化合物49a(4,9g，49,1％)。
[1630]
ms(m/z)＝873,4(m na)
[1631]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.62-7.18(m,19h),6.82(br d,j＝8.66hz,4h),6.10(dd,j＝10.04,3.39hz,1h),5.53(s,1h),4.74(s,1h),4.26-4.15(m,1h),4.04-3.88(m,2h),3.81(d,j＝1.00hz,7h),3.72-3.59(m,1h),3.31-3.12(m,3h),1.94-1.80(m,3h),1.17-0.78(m,23h)。
[1632]
49b：3-(苄氧基甲基)-1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1633]
向化合物48b(1,0g，1,0mmol)在250ml meoh中的溶液中添加naome(2,5g，45,0mmol)。将混合物在50℃下在n
2-气氛下加热3h，这时tlc显示完全转化。在减压下除去溶剂并且将残余物通过在硅胶上的柱色谱法纯化(pe/etoac 10:1至3:1)以得到呈白色泡沫的49b(0,27g，33％)。
[1634]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.54(d,j＝8.0hz,1h),7.39-7.37(m,2h),7.35-7.30(m,6h),7.28-7.26(m,3h),7.24-7.22(m,1h),6.85(d,j＝8.0hz,4h),6.05(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),5.79(d,j＝12.0hz,1h),5.49(s,2h),4.72(s,2h),4.20(d,j＝8.0hz,1h),4.0(dd,j＝12.0,4.0hz,1h),3.94(d,j＝12.0hz,1h),3.86(d,j＝12.0hz,1h),3.79(s,6h),3.56(d,j＝12.0hz,1h),3.22-3.12(m,3h),1.10-0.95(m,21h)。
[1635]
49c：2-氨基-9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-1h-嘌呤-6-酮
[1636]
在15℃至20℃下向化合物48c(28g，28mmol)在616ml meoh中的溶液中逐滴添加151ml(758mmol)5m naoh。将混合物在60℃与70℃之间搅拌30min以实现完全转化。将混合物冷却至0℃并且使用10％柠檬酸溶液(约200ml)将ph调节至7。在30℃下浓缩溶剂并且将剩余的水相用dcm(3x500ml)萃取。将合并的有机层用盐水(500ml)洗涤，经无水na2so4干燥，并且浓缩。将粗制产物通过柱色谱法纯化(dcm/meoh 20:1至10:1)以得到呈黄色固体的49c(18g，79％)。
[1637]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:10.71(m,1h),7.91(m,1h),7.41-7.40(m,2h),7.27-7.20(m,12h),6.82-6.50(m,6h),6.50(s,1h),5.88-5.85(m,1h),4.17-4.14(m,1h),3.96-3.89(m,1h),3.80(m,2h),3.74-3.72(m,10h),3.69-3.61(m,1h),3.10-3.08(m,1h),2.41-2.58(m,1h),0.94-0.91(m,21h)。
[1638]
49e：9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-胺
[1639]
向2,45g(2,4mmol)甲苯磺酸酯48e在50ml二噁烷中的溶液中添加36,16ml(72,3mmol)2m naoh。在80℃下搅拌2h后，将反应混合物冷却至室温并且蒸发有机溶剂。向水性
残余物中添加250ml h2o和150ml dcm，然后添加4,5ml乙酸。将有机层分离并且用饱和nahco
3-溶液洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至50％meoh/etoac(1:1))，这得到1,22g呈浅黄色泡沫的二噁烷49e(68,6％)。
[1640]
lcms-方法c：
[1641]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,41
[1642]
电离方法：es
：[m h]
＝740,6
[1643]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.33(s,1h),8.16(s,1h),7.11-7.45(m,11h),6.72-6.79(m,4h),6.13(m,1h),4.13-4.26(m,2h),4.04(m,1h),3.93(m,1h),3.5(m,1h),3.71(s,3h),3.70(s,3h),3.66(br d,j＝11.6hz,1h),3.06(d,j＝9.5hz,1h),2.92(d,j＝9.5hz,1h),0.88-0.95(m,21h)。
[1644]
50a：1-[(2r,6r)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1645]
向化合物49a(3,7g，4,35mmol)在55,5ml etoac中的溶液中添加pd(oh)2/c(2g，在碳上20％以及在水中50％)和三氯乙酸(1,42g，8,70mmol)。将反应混合物在15℃下在h2(15psi)下搅拌1h以实现完全转化。将混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩以得到呈黄色油状物的粗制脱苄基化且脱三苯甲基化中间体，将其溶解在90ml meoh中。在15℃下添加net3(1,14g，11,28mmol)后，将溶液搅拌过夜，这时检测到完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物通过柱色谱法纯化(dcm/meoh 50:1)，这得到950mg呈白色泡沫的标题化合物50a(51,0％)。
[1646]
ms(m/z)＝451,2(m na)
[1647]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.22(s,1h),7.26-7.17(m,1h),6.06-5.93(m,1h),5.52(d,j＝8.16hz,1h),4.39-4.25(m,1h),4.08(d,j＝11.92hz,1h),4.01-3.90(m,1h),3.85(d,j＝9.29hz,1h),3.74(s,2h),3.56-3.49(m,1h),3.31(dd,j＝11.29,10.29hz,1h),2.32-2.10(m,1h),2.02-1.89(m,3h),1.32-0.96(m,17h)。
[1648]
50b：1-[(2r,6r)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1649]
从9,5g(11,4mmol)49b开始，按照针对50a所述的方案合成标题化合物50b。在硅胶上纯化(pe/etoac 10:1至1:1)后，分离出4,0g(86％)呈白色泡沫的50b。
[1650]
ms(m/z)＝415,0(m h)
[1651]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.74(br.s.,1h),7.47(d,j＝8.03hz,1h),6.02-5.97(m,1h),5.85-5.78(m,1h),5.50(br.s.,1h),4.32-4.26(m,1h),4.08(d,j＝12.05hz,1h),4.03-3.96(m,1h),3.85(d,j＝9.29hz,1h),3.73(s,2h),3.51(d,j＝12.05hz,1h),3.27(t,j＝10.67hz,1h),1.19-1.09(m,21h)。
[1652]
51a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1653]
将起始化合物50a(683mg，1,5mmol)溶解在30ml干dcm中。在室温下，添加753mg(1,03ml，7,4mmol)net3和616mg(1,8mmol)dmt-cl并且将反应搅拌16h，这时起始材料的转化完成。将反应溶液蒸发并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，得到990mg(91,0％)呈浅黄色泡沫的dmt保护的产物51a。
[1654]
lcms-方法a：
[1655]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,31
[1656]
电离方法：es
：[m na]
＝753,4
[1657]
52a：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1658]
将985mg(1,35mmol)起始材料51a溶解在40ml thf中。添加5,95g(8,18ml，58,25mmol)net3和10,80g(10,92ml，65,0mmol)net3·
3hf后，将反应在65℃下搅拌直到检测到完全转化(大约16h)。除去溶剂并且将残余物倒入400ml h2o/饱和nahco
3-溶液(1:2)中。将水性混合物用dcm(2x50ml)萃取两次。将有机层用mgso4干燥并且蒸发以产生956mg粗制产物，将其在二氧化硅上纯化(用在正庚烷中的1％net3、在正庚烷中的10％至100％etoac预调理)。分离出760mg(98,2％)呈无色泡沫的所希望的醇52a。
[1659]
lcms-方法a：
[1660]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,86
[1661]
电离方法：es
：[m]
＝303,1(dmt
)
[1662]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.41(s,1h),7.56-7.61(m,1h),7.40(d,j＝7.34hz,2h),7.20-7.32(m,7h),6.87(d,j＝8.56hz,4h),5.90(dd,j＝10.09,3.36hz,1h),4.79(t,j＝5.20hz,1h),3.70-3.85(m,10h),3.62(d,j＝11.74hz,1h),3.49(t,j＝10.76hz,1h),2.97-3.12(m,2h),1.70(s,3h)。
[1663]
53a：3-[[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[1664]
将669mg(1,2mmol)起始材料52a和415mg(530μl，3,1mmol)dipea溶解在10ml dcm中。在ar-气氛下，在0℃下添加384mg(361μl，1,6mmol)2-氰基乙基-n,n-二异丙基氯亚磷酰胺并且将溶液搅拌1h，允许达到室温。为了实现完全转化，添加另外0,5当量dipea和2-氰基乙基-n,n-二异丙基氯亚磷酰胺并且将反应搅拌另外2h。添加200μl正丁醇后，将反应搅拌10分钟。将溶液用50ml h2o洗涤。分离水层并且用50ml dcm萃取。将有机层用mgso4干燥并且蒸发。将残余物溶解在30ml乙醚中并且在-30℃下逐滴添加到100ml正戊烷中。将沉淀物过滤并且在真空中干燥，以产生723mg(80,1％)呈无色固体的所希望的产物53a。
[1665]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.40(s,1h),7.63,7.60(2 x s,1h),7.36-7.45(m,2h),7.21-7.34(m,7h),6.84-6.90(m,4h),5.93-6.03(m,1h),3.76-4.04(m,4h),3.74(s,6h),3.42-3.71(m,6h),2.98-3.12(m,2h),2.58-2.74(m,2h),1.75,1.72(2 x s,3h),0.95-1.14(m,12h)。
[1666]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,8,148,7。
[1667]
51c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1668]
在0℃下在n
2-气氛下向49c(14,18g，18,8mmol)在150ml无水吡啶中的溶液中添加tmscl(15,22g，141mmol)。在室温下搅拌2h，在0℃下添加2-甲基丙酰基氯(2,18g，20,6mmol)并且在室温下继续搅拌2h，以实现完全转化。添加20ml etoh后，将混合物搅拌另外10min。将溶液倒入冰水(500ml)中并且用dcm(3x500ml)萃取。将合并的有机层用10％柠檬酸水溶液(2x500ml)、饱和nahco
3-溶液(300ml)和盐水(200ml)洗涤，经无水na2so4干燥并且
浓缩。将粗制产物通过制备型hplc纯化(0.1％fa/acn)，这得到9,5g(61,2％)呈白色固体的51c。
[1669]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.08(s,2h),7.39-7.26(m,2h),7.25-7.19(m,8h),6.80(d,j＝8.0hz,4h),5.79(d,j＝1.6hz,1h),4.18-4.12(m,1h),3.99-3.81(m,4h),3.72(s,7h),3.69(d,j＝10hz,1h),3.11(d,j＝11.2hz,1h),2.93(d,j＝10.4hz,1h),2.72(s,1h),1.11-1.08(m,7h),1.01-0.91(m,21h)。
[1670]
51e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1671]
在ar气氛下将1,84g(2,5mmol)二噁烷49e溶解在30ml干吡啶中。在室温下，添加1,05g(867μl，7,5mmol)苯甲酰氯并且将反应搅拌3h。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在h2o中并且用etoac萃取。将有机层分离并且用柠檬酸溶液(10％)(2x100ml)、h2o(1x100ml)和饱和nahco
3-溶液(1x100ml)洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物(2,61g，黄色泡沫)溶解在40ml吡啶/etoh(1:1)中。在0℃下，添加7,46ml(14,9mmol)2n naoh并且将反应混合物搅拌30min。添加864μl acoh后，将反应溶液在真空中浓缩。将残余物用100ml h2o处理并且用100ml etoac萃取。将有机层分离并且用柠檬酸溶液(10％)(2x100ml)、h2o(1x100ml)、饱和nahco
3-溶液(1x100ml)和饱和nacl-溶液(1x100ml)洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物(2,19g)在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至70％etoac)得到1,72g(82,0％)呈无色泡沫的标题化合物51e。
[1672]
lcms-方法c：
[1673]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,56
[1674]
电离方法：es-：[m-h]-＝842,8
[1675]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.26(br s,1h),8.77(s,1h),8.68(s,1h),8.05(m,2h),7.64(br t,j＝7.3hz,1h),7.56(m,2h),7.37(dd,j＝7.8,1.5hz,2h),7.13-7.28(m,7h),6.76(dd,j＝8.9,1.7hz,4h),6.28(dd,j＝10.1,3.4hz,1h),4.20-4.36(m,2h),4.12(m,1h),3.84-3.99(m,2h),3.64
–
3.75(m,7h),3.06(m,1h),2.96(m,1h),0.88-1.06(m,21h)。
[1676]
52c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1677]
将1,33g(1,61mmol)51c溶解在16ml dmf中。添加1,65g(2,26ml，16,1mmol)net3和1,32g(1,34ml，8,05mmol)net3·
3hf后，将溶液在90℃下搅拌2h。将反应混合物冷却至室温，然后添加2,5g nahco3和10ml h2o。搅拌2h后，将混合物蒸发并且将残余物溶解在25ml dcm/iproh(4:1)中并且在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至10％meoh)以产生0,83g(76,5％)标题化合物52c。
[1678]
lcms-方法c：
[1679]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,33
[1680]
电离方法：es
：[m h]
＝670,2
[1681]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.11(br s,1h),11.66(s,1h),8.11(s,1h),7.37(d,j＝7.46hz,2h),7.18-7.29(m,7h),6.84(dd,j＝8.93,2.69hz,4h),5.98(dd,j＝8.31,4.40hz,1h),4.81(t,j＝5.26hz,1h),3.90-4.02(m,2h),3.67-3.86(m,4h),3.72(s,
6h),3.04(d,j＝9.54hz,1h),2.96(m,1h),2.75-2.81(m,1h),1.11(t,j＝6.66hz,6h)。
[1682]
52e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1683]
将1,10g(1,3mmol)甲硅烷基醚51e溶解在20ml nmp中。添加3,47g(3,50ml，20,9mmol)net3.hf和1,85g(2,54ml，18,2mmol)net3后，将反应溶液在65℃下搅拌18h。冷却至室温后，添加250ml饱和nahco
3-溶液和150ml etoac并且将混合物搅拌30min。将有机层分离并且用饱和nahco
3-洗涤并且用饱和nacl-溶液洗涤两次。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(用0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生852mg(95,1％)呈无色泡沫的52e。
[1684]
lcms-方法c：
[1685]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,43
[1686]
电离方法：es
：[m h]
＝688,3
[1687]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.22(br s,1h),8.75(s,1h),8.59(s,1h),8.04(d,j＝7.6hz,2h),7.64(t,j＝7.1hz,1h),7.55(t,j＝7.6hz,2h),7.38(d,j＝7.6hz,2h),7.14-7.32(m,7h),6.80(m,4h),6.26(dd,j＝9.8,3.3hz,1h),4.85(t,j＝5.4hz,1h),4.29(t,j＝10.6hz,1h),4.09(dd,j＝11.1,3.2hz,1h),3.73-3.90(m,4h),3.72(s,3h),3.71(s,3h),3.03(m,1h),2.95(m,1h)。
[1688]
53c：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1689]
将100mg(149μmol)醇52c、0,2g分子筛和13,5mg(75μmol)二异丙基铵四氮唑溶解在2,5ml干dcm中。在ar气氛下，添加45,5mg(48μl，146μmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌2h以实现完全转化。添加饱和nahco
3-溶液后，分离有机相并且将水相用dcm洗涤1次。将合并的有机层用饱和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(用dcm 0,5％net3、在dcm中的0至10％meoh预调理)，产生95mg(73,1％)呈无色泡沫的标题化合物53c。
[1690]
lcms-方法c：
[1691]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,34,2,36
[1692]
电离方法：es
：[m]
＝787,2(m-i
pr2n oh h
)
[1693]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.09(br s,1h),11.61,11.58(2 x s,1h),8.13,8.08(2 x s,1h),7.35(m,2h),7.18-7.28(m,7h),6.80-6.85(m,4h),5.97(m,1h),3.95-4.07(m,4h),3.56-3.94(m,4h),3.72(s,6h),3.36-3.54(m,2h),2.96-3.11(m,2h),2.68-2.82(m,2h),2.59(m,1h),0.96-1.15(m,12h),0.83-0.90(m,6h)。
[1694]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,1,147,9.
[1695]
53e：n-[9-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1696]
将848mg(1,2mmol)起始材料52e和640mg(3,7mmol)二异丙基铵四氮唑溶解在25ml干dcm中。在ar气氛下，在室温下添加574,7mg(1,9mmol)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯。16h后，添加50ml h2o。将有机层分离并且将水相用dcm萃取。将合并的有机
层用mgso4干燥并且在35℃下在真空中除去溶剂。将粗制产物溶解在10ml etoac/乙醚(1:1)中并且添加40ml正戊烷。通过离心收集沉淀物并且丢弃溶剂。将沉淀程序重复三次，在speedvac上干燥后得到991mg(90,5％)呈无色固体的所希望的产物53e。
[1697]
lcms-方法b-3：
[1698]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,61
[1699]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝805,3
[1700]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]11.21(br s,1h),8.76,8.74(2 x s,1h),8.63,8.61(2 x s,1h),8.04(d,j＝7.3hz,2h),7.65(t,j＝7.3hz,1h),7.55(m,2h),7.37(br d,j＝8.3hz,2h),7.14-7.30(m,7h),6.75-6.86(m,4h),6.30(m,1h),4.27(m,1h),3.85-4.17(m,4h),3.61-3.80(m,9h),3.49(m,2h),3.08(m,1h),2.98(dd,j＝9.1,7.1hz,1h),2.72(m,1h),2.62(m,1h),1.04-1.14(m,6h),1.02(m,3h),0.93(d,j＝6.8hz,3h)。
[1701]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,7,147,6。
[1702]
合成方案14
[1703][1704]
54：[(2r)-2-[3-(苄氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1s)-1-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1-(对甲苯基磺酰氧基甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]乙基]4-甲基苯磺酸酯
[1705]
将14,80g(17,31mmol)起始材料47b溶解在120ml干吡啶中。在室温下，添加13,33g(69,23mmol)ts-cl并且将反应在室温下搅拌。23h后，添加1,0g(8,2mmol)dmap并且继续搅拌另外24h。添加另外6,67g(34,62mmol)ts-cl并且将反应混合物搅拌48h以实现完全转化。除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。将有机溶液用h2o、柠檬酸水溶液(10％)、饱和nahco
3-溶液和盐水洗涤。经mgso4干燥并且蒸发溶剂得到粗制产物，将其在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的20％至50％etoac预调理)，产生12,0g(59,6％)呈无色泡沫的54。
[1706]
lcms-方法a：
[1707]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,33
[1708]
电离方法：es
：[m na]
＝1185,5
[1709]
55：[(2r)-2-[3-(苄氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-[(1s)-1-(羟甲基)-1-(对甲苯基磺酰氧基甲基)-2-三异丙基甲硅烷氧基-乙氧基]乙基]4-甲基苯磺酸酯
[1710]
将12,0g(10,31mmol)54在240ml dcm中的溶液用26,87g(17,22ml，206,28mmol)dca处理。将溶液在室温下搅拌30min以实现完全转化。将有机溶液用饱和nahco
3-溶液洗涤并且分离各层。将水相用dcm洗涤2次并且将合并的有机层用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100etoac)，产生7,84g(88,3％)呈橙色油状物的标题化合物55。
[1711]
lcms-方法a：
[1712]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,19
[1713]
电离方法：es
：[m h]
＝861,3
[1714]
56：4-甲基苯磺酸[(2s,6r)-6-[3-(苄氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1715]
将7,83g(9,09mmol)55溶解在250ml干meoh中。添加22,11g(409,18mmol)甲醇钠后，将溶液在50℃下搅拌。2,5h后，除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。将有机溶液用h2o和盐水洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的20％至100％乙基)，产生呈无色泡沫的所希望的二噁烷56(3,84g，61,3％)。
[1716]
lcms-方法a：
[1717]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,20
[1718]
电离方法：es
：[m h]
＝689,3
[1719]
57：苯甲酸[(2r,6r)-6-[3-(苄氧基甲基)-2,4-二氧代-嘧啶-1-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1720]
将3,84g(5,57mmol)起始化合物56溶解在200ml dmf中。添加2,03g(13,94mmol)苯甲酸钠后，将溶液在150℃下搅拌24h以实现完全转化。将反应混合物冷却至室温并且在真空中除去溶剂。将残余物溶解在etoac中并且用h2o和盐水洗涤2次。经mgso4干燥并且蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生2,63g(73,8％)呈无色泡沫的57。
[1721]
lcms-方法a：
[1722]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,24
[1723]
电离方法：es
：[m h]
＝639,3
[1724]
58：苯甲酸[(2r,6r)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1725]
在ar气氛下向2,62g(4,10mmol)57在65ml meoh中的溶液中添加144mg(0,21mmol)pd(oh)2(在碳上20％)。将溶液用h2吹扫后，将反应混合物在室温下在4巴h2气氛下搅拌。1h后，将催化剂过滤并且将滤液在减压下蒸发。将粗制产物(2,11g)溶解在40ml meoh中并且添加3,63g(5,0ml，35,87mmol)net3。将溶液在室温下搅拌30min以实现完全转化。将ph调节至7后，使用柠檬酸水溶液(10％)，除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用柠檬酸水溶液(10％)和饱和nahco
3-溶液洗涤后，将有机相用mgso4干燥并且蒸发，产生1,97g(99,3％，粗品)呈无色泡沫的58。
[1726]
lcms-方法a：
[1727]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,12
[1728]
电离方法：es
：[m h]
＝519,3
[1729]
59：苯甲酸[(2r,6r)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1730]
将980mg(1,89mmol)58溶解在35ml干thf中。在室温下，添加7,20g(6,55ml，47,24mmol)吡啶-hf(65％)并且将溶液搅拌1,5h。添加另外7,20g吡啶-hf(65％)后，继续搅拌5h，这时检测到完全转化。添加固体nahco3(大约24g)后，将反应搅拌1,5h。过滤出无机盐并且将滤液蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)，产生呈无色泡沫的标题化合物59(494mg，72,2％)。
[1731]
lcms-方法a：
[1732]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,22
[1733]
电离方法：es
：[m h]
＝363,1
[1734]
60：苯甲酸[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1735]
在室温下向490mg(1,35mmol)59在20ml dcm中的溶液中添加874mg(1,18ml，6,76mmol)dipea和584mg(1,69mmol)dmt-cl。搅拌16h后，将溶液蒸发并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生894mg(99,5％)呈无色泡沫的所希望的dmt-醚60。
[1736]
lcms-方法a：
[1737]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,96
[1738]
电离方法：es
：[m na]
＝687,2
[1739]
52b：1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1740]
将888mg(1,34mmol)60溶解在20ml thf和5ml meoh中。在0℃下，添加6,68ml(13,36mmol)2m naoh溶液并且将溶液搅拌1h，允许达到室温。冷却至0℃后，添加12ml柠檬酸水溶液(10％)并且将混合物用etoac萃取。将有机层分离并且用饱和nahco
3-溶液洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂。将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％(etoac 5％meoh)预调理)，这得到730mg(97,5％)呈无色泡沫的52b。
[1741]
lcms-方法a：
[1742]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,78
[1743]
电离方法：es-：[m-h]-＝559,4
[1744]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.42(br s,1h),7.67(d,j＝8.07hz,1h),7.39(d,j＝6.95hz,2h),7.19-7.33(m,7h),6.85-6.90(m,4h),5.89(dd,j＝10.03,3.18hz,1h),5.66(d,j＝8.07hz,1h),4.80(t,j＝5.26hz,1h),3.70-3.83(m,10h),3.55(d,j＝11.62hz,1h),3.44(m,1h),3.08(d,j＝9.41hz,1h),2.97(d,j＝9.41hz,1h)。
[1745]
53b：3-[[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[1746]
将725mg(1,29mmol)起始化合物52b和122mg(0,71mmol)二异丙基铵四氮唑溶解在20ml干dcm中。在ar气氛下，在室温下添加429mg(452μl，1,43mmol)n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸2-氰基乙酯并且将溶液搅拌16h。添加另外122mg(0,71mmol)二异丙基铵四氮唑和429mg(452μl，1,43mmol)n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸2-氰基乙酯后，继续搅拌2h以实现完全转化。除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中并且用h2o和饱和nahco
3-溶液洗涤。用mgso4干燥后，蒸发溶剂并且将粗制产物溶解在25ml乙醚中。在搅拌下，将有机溶液滴入150ml正戊烷中。将沉淀物过滤并且在40℃下在真空中干燥，产生751mg(76,3％)呈无色固体的标题化合物53b。
[1747]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.39(br s,1h),7.65-7.73(m,1h),7.34-7.43(m,2h),7.19-7.34(m,7h),6.84-6.90(m,4h),5.95(m,1h),5.66(m,1h),3.92-4.10(m,2h),3.78-3.91(m,2h),3.73(s,6h),3.41-3.68(m,6h),3.11(m,1h),2.98(m,1h),2.70(m,1h),2.61(m,1h),0.94-1.14(m,12h)。
[1748]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,9,148,7。
[1749]
合成方案15
[1750]
[1751]
61：苯甲酸[(2s,6r)-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-甲酯
[1752]
将2,66g(6,42mmol)50b溶解在35ml干吡啶中。在室温下，逐滴添加1,37g(1,13ml，9,62mmol)苯甲酰氯并且将溶液搅拌16h以实现完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用10％柠檬酸水溶液(2x)、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤后，将有机层用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生2,0g(60,0％)呈无色泡沫的61。
[1753]
lcms-方法c：
[1754]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,02
[1755]
电离方法：es
：[m h]
＝519,4
[1756]
62：苯甲酸[(2s,6r)-6-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1757]
向1,99g(3,61mmol)61在干acn中的溶液中添加6,28g(8,63ml，61,43mmol)net3和3,06g(43,36mmol)1h-1,2,4-三唑。将反应混合物冷却至0℃并且在剧烈搅拌下逐滴添加1,66g(1,01ml，10,84mmol)pocl3在15ml干acn中的溶液。1h后，在真空中除去溶剂并且向残余物中添加150ml饱和nahco3/h2o-混合物(1:1)。将水性混合物用dcm萃取3次并且将合并的有机层用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制产物溶解在50ml干acn中，然后添加50ml nh
3-水溶液(32％)。搅拌过夜(17h)后，将溶液浓缩并且将剩余的水性混合物用dcm(2x100ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥。蒸发溶剂得到1,93g(定量，粗制产物)呈浅黄色泡沫的62，其不经进一步纯化使用。
[1758]
lcms-方法c：
[1759]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,59
[1760]
电离方法：es
：[m h]
＝518,4
[1761]
63f：苯甲酸[(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1762]
将1,93g(3,72mmol)62溶解在30ml干吡啶中。在室温下，逐滴添加0,79g(0,66ml，5,59mmol)苯甲酰氯并且将溶液搅拌18h以实现完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用10％柠檬酸水溶液(2x)、饱和nahco
3-和nacl-溶液洗涤后，将有机层用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生1,91g(82,5％)呈无色泡沫的63f。
[1763]
lcms-方法c：
[1764]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,27
[1765]
电离方法：es
：[m h]
＝622,5
[1766]
50f：n-[1-[(2r,6r)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1767]
将952mg(1,53mmol)63f溶解在20ml etoh/吡啶(1:1)中。在0℃下，添加9,19ml(9,19mmol)1m naoh-溶液并且将溶液在0℃下搅拌3h，这时检测到完全转化。使用柠檬酸-一水合物(大约650mg，溶解在15ml h2o中)使ph达到6。蒸发有机溶剂后，将水层用etoac萃取。将有机相用柠檬酸水溶液(10％)、h2o和饱和nacl-溶液洗涤。经mgso4干燥并且蒸发后，将粗制
产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生678mg(85,5％)呈无色泡沫的标题化合物50f。
[1768]
lcms-方法c：
[1769]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,72
[1770]
电离方法：es
：[m h]
＝518,2
[1771]
51f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基-甲硅烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1772]
将673mg(1,30mmol)50f溶解在20ml dcm/吡啶(1:1)中。在室温下添加719mg(2,08mmol)dmt-cl后，将溶液搅拌2h。蒸发溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用2x柠檬酸水溶液(10％)和饱和nahco
3-溶液洗涤后，将有机层用mgso4干燥并且在真空中浓缩。将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至70％etoac预调理)，产生975mg(91,5％)呈浅黄色泡沫的dmt-醚51f。
[1773]
lcms-方法c：
[1774]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,61
[1775]
电离方法：es-：[m-h]-＝818,4
[1776]
52f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1777]
将970mg(1,18mmol)51f和1,68g(2,31ml，16,56mmol)net3溶解在20ml thf中。添加3,15g(3,18ml，18,93mmol)net3·
3hf后，将反应在65℃下搅拌48h以实现完全转化。冷却至室温后，将混合物倒入200ml饱和nahco
3-溶液中并且搅拌1,5h。用2x100ml dcm萃取后，将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发。在二氧化硅上的最终纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)得到745mg(94,9％)呈无色泡沫的52f。
[1778]
lcms-方法c：
[1779]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,61
[1780]
电离方法：es
：[m h]
＝664,3
[1781]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.31(br s,1h),8.13(br d,j＝7.15hz,1h),8.00(d,j＝7.66hz,2h),7.63(t,j＝7.38hz,1h),7.51(t,j＝7.79hz,2h),7.36-7.42(m,3h),7.22-7.33(m,7h),6.87-6.91(m,4h),6.03(dd,j＝9.72,3.12hz,1h),4.84(t,j＝5.50hz,1h),3.94(dd,j＝11.19,3.12hz,1h),3.84-3.89(m,1h),3.72-3.81(m,8h),3.56(d,j＝11.92hz,1h),3.33-3.38(m,1h),3.16(d,j＝9.35hz,1h),3.02(d,j＝9.17hz,1h)。
[1782]
53f：n-[1-[(2r,6s)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1783]
将715mg(1,08mmol)起始化合物52f和559mg(3,23mmol)二异丙基铵四氮唑溶解在20ml干dcm中。在ar气氛下，在室温下添加502mg(529μl，1,62mmol)n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸2-氰基乙酯并且将溶液16h搅拌以实现完全转化。添加40ml h2o后，将有机层分离并且将水相用dcm萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 1,0％net3、在正庚烷中的0至100％mtb-醚/dcm(1:1)预调理)，产生887mg呈无色泡沫的标题化合物53f。
[1784]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.30(br s,1h),8.15(2 x d,j＝7.53hz,1h),8.00(m,2h),7.63(m,1h),7.51(m,2h),7.20-7.44(m,10h),6.89(br d,j＝8.72hz,4h),6.03-6.13(m,1h),3.78-4.17(m,4h),3.74(s,6h),3.35-3.71(m,6h),3.20(m,1h),3.03(m,1h),2.89(m,1h),2.72(m,1h),0.89-1.22(m,12h)。
[1785]
31p-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:148,2,147,7。
[1786]
合成方案16
[1787][1788]
50c：n-[9-[(2r,6r)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1789]
在0℃下在n
2-气氛下向dmt-醚51c(9.5g，11.5mmol；参见合成方案12)在190ml无水dcm中的溶液中逐滴添加dcaa(29.7g，230mmol)。在室温下搅拌30min后，tlc显示完全转化。将混合物用饱和nahco
3-溶液(100ml)中和并且用dcm(3x200ml)萃取。将有机层合并，并且用饱和nacl-溶液(200ml)洗涤。用无水na2so4干燥后，将有机溶液蒸发并且将粗制产物通过制备型hplc纯化(acn，0.1％fa)，产生9,5g(61,2％)呈白色固体的所希望的产物50c。
[1790]
lcms-方法c：
[1791]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,68
[1792]
电离方法：es
：[m h]
＝524,4
[1793]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.10(br s,1h),11.53(br s,1h),8.21(s,1h),5.88(dd,j＝9.8,3.3hz,1h),4.75(t,j＝6.0hz,1h),4.06(d,j＝9.5hz,1h),3.98(dd,j＝11.4,3.3hz,1h),3.86(d,j＝11.7hz,1h),3.74-3.83(m,2h),3.61(d,j＝11.7hz,1h),
3.46(d,j＝6.1hz,2h),2.79(m,1h),1.00-1.16(m,27h)。
[1794]
50e：n-[9-[(2r,6r)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1795]
将615mg(729μmol)dmt-醚51e溶解在25ml dcm中。添加949mg(608μl，7,3mmol)二氯乙酸后，将反应混合物搅拌1min以实现完全转化。将反应溶液用100ml饱和nahco
3-溶液洗涤。将有机层分离并且将水相用35ml dcm萃取两次。将合并的有机萃取物用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生302mg(76,5％)呈无色泡沫的所希望的产物50e。
[1796]
lcms-方法c：
[1797]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,70
[1798]
电离方法：es
：[m h]
＝542,5
[1799]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.20(s,1h),8.75(s,1h),8.69(s,1h),8.04(d,j＝7.5hz,2h),7.65(m,1h),7.55(m,2h),6.23(m,1h),4.75(t,j＝6.1hz,1h),4.01-4.12(m,3h),3.94(d,j＝9.9hz,1h),3.86(d,j＝11.9hz,1h),3.65(d,j＝11.7hz,1h),3.44(m,2h),1.10-1.17(m,3h),1.04-1.09(m,18h)。
[1800]
63a：苯甲酸[(2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1801]
按照针对化合物61所述的方案(方案15)，在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)后，1,0g(2,33mmol)50a得到1,24g(86,4％)呈无色泡沫的苯甲酰基化产物63a。
[1802]
lcms-方法c：
[1803]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,10
[1804]
电离方法：es-：[m-h]-＝531,6
[1805]
63c：苯甲酸[(2s,6r)-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1806]
将2,80g(5,35mmol)起始材料50c溶解在20ml干吡啶中。添加949mg(784μl，6,68mmol)苯甲酰氯和667mg(5,35mmol)dmap后，将反应溶液在室温下搅拌4h。添加另外189mg(157μl，1,37mmol)苯甲酰氯并且将反应搅拌过夜以实现完全转化。在真空中除去溶剂，将残余物溶解在etoac中并且用5％柠檬酸水溶液、5％nahco
3-和饱和nacl-水溶液洗涤。用mgso4干燥后，将有机层蒸发并且将粗制产物在硅胶上纯化(在dcm中的0至10％meoh)，产生3,33g(99,2％)呈无色泡沫的苯甲酰基酯63c。
[1807]
lcms-方法c：
[1808]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,06
[1809]
电离方法：es
：[m h]
＝628,5
[1810]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.84(s,1h),11.58(s,1h),8.09(s,1h),7.79-7.86(m,2h),7.56-7.64(m,1h),7.41-7.49(m,2h),5.89(dd,j＝5.9hz,3.4hz,1h),4.18-4.32(m,3h),4.07(m,1h),3.77-4.02(m,4h),2.79(m,1h),0.93-1.21(m,27h)。
[1811]
63e：苯甲酸[(2s,6r)-6-[6-(二苯甲酰基氨基)嘌呤-9-基]-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1812]
在室温下向299mg(552μmol)游离醇50e在10ml干吡啶中的溶液中添加94,0mg(77,7μl，662,3μmol)苯甲酰氯。18h后，将溶剂浓缩至5ml的体积并且添加另外94,0mg苯甲酰氯。在室温下另外60min后添加另外282mg苯甲酰氯并且将溶液搅拌过夜。除去溶剂并且将残余物用h2o和etoac处理。将有机层分离并且用柠檬酸-溶液(10％)、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤两次。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，这得到405mg(97,8％)呈无色泡沫的63e。
[1813]
lcms-方法c：
[1814]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,49
[1815]
电离方法：es
：[m h]
＝750,7
[1816]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.74(s,1h),8.62(s,1h),7.92-7.97(m,2h),7.74-7.79(m,4h),7.42-7.67(m,9h),6.28(dd,j＝9.4,3.4hz,1h),4.22-4.35(m,4h),4.16(m,1h),4.01(m,2h),3.78(m,1h),1.06-1.14(m,3h),0.97-1.05(m,18h)。
[1817]
64a：苯甲酸[(2s,6r)-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]-甲酯
[1818]
将1,07g(2,01mmol)63a溶解在20ml thf中。在室温下，添加1,53g(1,39ml，10,03mmol)吡啶.hf(65％)并且将混合物搅拌18h。添加另外3,06g(2,78ml，20,06mmol)吡啶.hf(65％)后，将溶液在65℃下搅拌5h，这时检测到完全转化。将反应混合物倒入250ml饱和nahco
3-溶液中。搅拌1h后，将混合物用dcm(3x50ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)，产生680mg(90,0％)呈无色泡沫的64a。
[1819]
lcms-方法c：
[1820]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,46
[1821]
电离方法：es-：[m-h]-＝375,3
[1822]
64c：苯甲酸[(2s,6r)-2-(羟甲基)-6-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1823]
将3,30g(5,26mmol)甲硅烷基醚63c溶解在33ml dmf中。添加8,06g(78,9mmol，11,1ml)net3和6,49g(39,4mmol，6,56ml)net3·
3hf后，将溶液在75℃下搅拌2h以实现完全转化。将反应冷却至室温并且用100ml 5％nahco
3-溶液洗涤。过滤后，将水溶液用dcm萃取。分离有机层，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物通过hplc纯化(柱：chiralcel od-h/74，250x4,6mm，1,0ml/min，30℃；洗脱剂：庚烷/etoh 5:2)，这得到1,20g(48,4％)呈无色固体的所希望的产物64c。
[1824]
lcms-方法c：
[1825]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,40
[1826]
电离方法：es
：[m h]
＝472,3
[1827]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.89(s,1h),11.67(s,1h),8.08(s,1h),7.87(d,j＝7.7hz,2h),7.62(t,j＝7.2hz,1h),7.47(t,j＝7.6hz,2h),5.92(dd,j＝6.6,3.3hz,1h),5.11(t,j＝5.7hz,1h),4.14-4.26(m,3h),4.03(dd,j＝12.0,3.4hz,1h),3.90(d,j＝12.0hz,1h),3.79(d,j＝12.0hz,1h),3.70(m,2h),2.79(spt,j＝6.8hz,1h),1.15(d,j＝6.9hz,3h),1.11(d,j＝6.7hz,3h)。
[1828]
64e：苯甲酸[(2s,6r)-6-[6-(二苯甲酰基氨基)嘌呤-9-基]-2-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1829]
使用针对52e所述的方案(方案13)将402mg(536μmol)甲硅烷基醚63e脱保护。在二氧化硅上色谱纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)后，分离出194mg(61,0％)呈无色泡沫的所希望的产物64e。
[1830]
lcms-方法c：
[1831]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,22
[1832]
电离方法：es
：[m h]
＝594,5
[1833]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.71(s,1h),8.59(s,1h),7.97(m,2h),7.77(m,4h),7.43-7.67(m,9h),6.27(m,1h),5.14(m,1h),4.20-4.36(m,3h),4.12(m,1h),3.95(m,1h),3.75-3.91(m,3h)。
[1834]
64f：苯甲酸[(2s,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-甲酯
[1835]
按照针对化合物64a所述的方案，使用10,0当量吡啶-hf，952mg(1,53mmol)63f得到471mg(66,1％)呈无色泡沫的64f。
[1836]
lcms-方法c：
[1837]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,89
[1838]
电离方法：es
：[m h]
＝466,1
[1839]
65a：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1840]
将675mg(1,79mmol)64a溶解在10ml dcm/吡啶(1:1)中。添加806mg(2,33mmol)dmt-cl在15ml dcm中的溶液后，将反应溶液在室温下搅拌5,5h，然后添加另外403mg(1,17mmol)dmt-cl。继续搅拌18h，这时检测到完全转化。蒸发溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用柠檬酸水溶液(10％)和饱和nahco
3-溶液洗涤2次后，将有机层用mgso4干燥并且在真空中浓缩。将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生1,15g(94,1％)呈无色泡沫的dmt-醚65a。
[1841]
lcms-方法c：
[1842]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,76
[1843]
电离方法：es-：[m-h]-＝677,3
[1844]
65c：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[2-(2-甲基丙酰基-氨基)-6-氧代-1h-嘌呤-9-基]-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1845]
将1,20g(2,55mmol)伯醇64c溶解在25ml干吡啶中。添加647mg(6,36mmol，891μl)net3和1,78g(5,09mmol)dmt-cl并且将溶液在室温下搅拌1h，然后在80℃下搅拌4h。冷却至室温后，添加1ml meoh并且将溶液用etoac稀释。将有机溶液用10％柠檬酸-和饱和nacl-水溶液洗涤。将有机相用mgso4干燥后，蒸发溶剂并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至5％meoh)，这得到1,97g(定量)呈浅黄色固体的所希望的dmt-醚65c。
[1846]
lcms-方法c：
[1847]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,75
[1848]
电离方法：es
：[m h]
＝774,4
[1849]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.78(s,1h),11.53(s,1h),8.06(s,1h),7.50-7.55(m,2h),7.31-7.41(m,5h),7.14-7.29(m,7h),6.81(br d,j＝8.9hz,2h),6.77(d,j＝8.9hz,2h),5.72(m,1h),4.19-4.35(m,3h),4.01-4.11(m,3h),3.66(s,3h),3.63(s,3h),3.34(d,j＝8.8hz,1h),3.16(d,j＝8.7hz,1h),2.75(m,1h),1.13(d,j＝6.9hz,3h),1.08(d,j＝6.7hz,3h)。
[1850]
65e：苯甲酸[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[6-(二苯甲酰基氨基)-嘌呤-9-基]-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1851]
将190mg(320μmol)起始材料64e溶解在10ml干吡啶中并且蒸发。将此程序重复三次。然后将化合物溶解在10ml干吡啶中，然后添加48,7mg(66,9μl，480μmol)net3和166mg(480μmol)dmt-cl。在室温下搅拌过夜后，添加另外97,4mg net3和332mg dmt-cl并且将溶液搅拌另外18h以实现完全转化。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中。用h2o、柠檬酸溶液(2x)、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤后，将有机相用mgso4干燥。蒸发溶剂并且通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至100％etoac)得到216mg(75,3％)呈浅黄色泡沫的dmt-醚65e。
[1852]
lcms-方法c：
[1853]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,17
[1854]
电离方法：es
：[m h]
＝896,5
[1855]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:8.75(s,1h),8.61(s,1h),7.73-7.80(m,7h),7.65(m,1h),7.58(m,2h),7.42-7.50(m,6h),7.36-7.41(m,2h),7.22-7.29(m,6h),6.78-6.84(m,4h),6.07(m,1h),4.36(m,2h),4.22(m,1h),3.99-4.14(m,2h),3.84(d,j＝11.9hz,1h),3.68(s,6h),3.44-3.57(m,2h)。
[1856]
65f：苯甲酸[(2r,6r)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代-嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-1,4-二噁烷-2-基]甲酯
[1857]
按照针对65a所述的方案，将467mg(1,00mmol)起始化合物64f进行dmt保护，产生677mg(87,9％)呈无色泡沫的65f。
[1858]
lcms-方法c：
[1859]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,95
[1860]
电离方法：es-：[m-h]-＝766,4
[1861]
66a：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮
[1862]
将起始化合物65a(580mg，0,85mmol)溶解在25ml thf/meoh(4:1)中。在室温下，添加4,27ml(8,55mmol)2m naoh-溶液并且将反应搅拌30min。使用固体柠檬酸-一水合物和饱和nahco
3-溶液使ph达到7。在真空中除去有机溶剂并且将水相用dcm(2x30ml)萃取。将合并的有机层用mgso4干燥。蒸发后，获得481mg(98,0％，粗品)呈无色固体的标题化合物66a，其不经进一步纯化使用。
[1863]
lcms-方法a：
[1864]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,82
[1865]
电离方法：es-：[m-h]-＝573,3
[1866]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.35(s,1h),7.63(s,1h),7.39(d,j＝7.34hz,
2h),7.20-7.33(m,7h),6.89(d,j＝8.31hz,4h),5.75(m,1h),4.83(t,j＝5.81hz,1h),3.74(s,6h),3.57-3.72(m,4h),3.51-3.56(m,2h),3.20-3.29(m,2h),1.79(d,j＝0.86hz,3h)。
[1867]
66c：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺
[1868]
将1,97g(2,55mmol)苯甲酰基酯65c溶解在40ml etoh/吡啶(3:1)中。添加12,9ml(25,8mmol)2m naoh-溶液后，将混合物在室温下搅拌30min以实现完全转化。用柠檬酸(固体)中和后，在真空中除去etoh并且将残余物用50ml etoac和25ml h2o稀释。通过过滤除去沉淀物，并且从滤液中分离有机层并且用饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，除去溶剂并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)，产生0,99g(58,0％)呈无色泡沫的标题化合物66c。
[1869]
lcms-方法c：
[1870]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,46
[1871]
电离方法：es
：[m h]
＝670,4
[1872]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.10(s,1h),11.52(s,1h),8.19(s,1h),7.20-7.42(m,9h),6.85-6.93(m,4h),5.62(dd,j＝9.7,3.3hz,1h),4.81(br t,1h),3.91-3.99(m,2h),3.74(s,3h),3.73(s,3h),3.65-3.76(m,1h),3.41-3.59(m,4h),3.15(d,j＝9.1hz,1h),2.77(m,1h),1.13(m,6h)。
[1873]
66e：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1874]
将起始材料65e(213mg，238μmol)溶解在8ml etoh/吡啶(3:1)中。在0℃下添加1,19ml(2,4mmol)2m naoh后，将溶液在0℃下搅拌10min并且在室温下搅拌60min以实现完全转化。添加166mg柠檬酸-一水合物，然后添加50ml h2o和50ml etoac。将有机层分离并且用10％柠檬酸溶液(2x)、h2o、饱和nahco
3-和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至100％丙酮)，产生134mg(82,0％)呈无色泡沫的66e。
[1875]
lcms-方法c：
[1876]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,44
[1877]
电离方法：es
：[m h]
＝688,4
[1878]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.21(br s,1h),8.72(s,1h),8.67(s,1h),8.04(m,2h),7.65(m,1h),7.55(m,2h),7.45(m,2h),7.29-7.37(m,6h),7.23(m,1h),6.91(dd,j＝9.0,2.0hz,4h),6.01(m,1h),4.84(t,j＝5.9hz,1h),3.94-4.02(m,2h),3.83(m,1h),3.74(s,6h),3.68-3.73(m,1h),3.49-3.55(m,2h),3.38(m,2h)。
[1879]
66f：n-[1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1880]
将672mg(0,88mmol)65f溶解在20ml etoh/吡啶(1:1)中。在0℃下，添加5,25ml(5,25mmol)1m naoh-溶液并且将反应搅拌1h。使用柠檬酸水溶液使ph达到7。添加200ml etoac和h2o后，分离有机相并且用柠檬酸水溶液(10％)、h2o和nacl-溶液洗涤2次。用mgso4干燥并且蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生555mg(95,5％)呈无色泡沫的标题化合物66f。
[1881]
lcms-方法c：
[1882]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,49
[1883]
电离方法：es-：[m-h]-＝662,3
[1884]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.28(br s,1h),8.31(br d,j＝6.79hz,1h),8.00(d,j＝7.66hz,2h),7.63(t,j＝7.43hz,1h),7.52(t,j＝7.79hz,2h),7.39(m,3h),7.21-7.33(m,7h),6.87-6.91(m,4h),5.80(dd,j＝9.81,3.21hz,1h),4.89(t,j＝5.96hz,1h),3.85(dd,j＝11.19,3.12hz,1h),3.79(m,1h),3.74(s,6h),3.64(d,j＝11.92hz,1h),3.59(m,2h),3.26-3.30(m,2h),3.20(t,j＝10.55hz,1h)。
[1885]
67a：3-[[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[1886]
按照针对53a所述的方案(方案13)，将380mg(0,66mmol)起始化合物66a转移至亚磷酰胺67a。从乙醚/正戊烷沉淀，分离出342mg(66,7％)呈无色固体的标题化合物67a。
[1887]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.40,11.39(2 x s,1h),7.63,7.61(2 x s,1h),7.40(m,2h),7.21-7.35(m,7h),6.83-6.96(m,4h),5.77-5.87(m,1h),3.36-3.90(m,17h),3.12-3.28(m,1h),2.66-2.77(m,2h),1.81-1.79(2 x s,3h),1.02-1.17(m,12h)。
[1888]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,5,148,1。
[1889]
67c：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-6-氧代-1h-嘌呤-2-基]-2-甲基-丙酰胺将985mg(1,47mmol)起始材料66c溶解在30ml干dcm中。在ar气氛下，添加133mg(735μmol)ipr2nh-四唑和571mg(1,84mmol，602μl)2-氰基乙基-n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸酯并且将溶液在室温下搅拌过夜。添加50ml h2o和dcm后，将有机层分离，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(用正庚烷 1％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生1,07g(83,8％)呈无色泡沫的所希望的亚磷酰胺67c。
[1890]
lcms-方法c：
[1891]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,42
[1892]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝787,4
[1893]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:12.08(br s,1h),11.55(br s,1h),8.06,8.05(2x s,1h),7.18-7.44(m,9h),6.82-6.94(m,4h),5.65(m,1h),3.66-4.01(m,3h),3.73(s,3h),3.72(s,3h),3.35-3.65(m,6h),3.21-3.29(m,1h),2.72-2.83(m,1h),2.59-2.72(m,2h),0.90-1.22(m,20h)。
[1894]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,7,147,3。
[1895]
67e：n-[9-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]嘌呤-6-基]苯甲酰胺
[1896]
按照针对其立体异构体53e所述的方案(方案13)将131mg(190μmol)起始化合物66e亚磷酸化，这得到定量产率的所希望的亚磷酰胺67e。
[1897]
lcms-方法b-3：
[1898]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝0,61
[1899]
电离方法：es
：[m h-i
pr2n oh]
＝805,3
[1900]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]11.20(br s,1h),8.74,8.73(2 x s,1h),8.62,8.60(2 x s,1h),8.05(d,j＝7.4hz,2h),7.65(m,1h),7.55(m,2h),7.45(d,j＝7.3hz,2h),
7.29-7.36(m,6h),7.24(m,1h),6.91(m,4h),6.06(m,1h),3.99-4.14(m,2h),3.62-3.90(m,11h),3.37-3.62(m,5h),2.71(m,1h),2.64(m,1h),1.06-1.13(m,6h),1.03(d,j＝6.7hz,3h),0.97(m,3h)。
[1901]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,7,147,6。
[1902]
67f：n-[1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-1,4-二噁烷-2-基]-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰胺
[1903]
按照针对53f所述的方案(方案15)，将525mg(0,79mmol)起始材料66f转移至亚磷酰胺67f。在二氧化硅上色谱纯化(用正庚烷 1,0％net3、在正庚烷中的0至100％mtb-醚/dcm(1:1)预调理)，分离出620mg(90,7％)呈无色泡沫的标题化合物67f。
[1904]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.31(br s,1h),8.22(m,1h),8.01(d,j＝7.59hz,2h),7.57-7.69(m,1h),7.52(m,2h),7.39(m,3h),7.20-7.34(m,7h),6.86-6.92(m,4h),5.88(m,1h),3.39
–
3.95(m,11h),3.74(s,6h),3.26-3.34(m,0.5h),3.17-3.24(m,0.5h),2.71-2.77(m,1h),2.64-2.69(m,1h),1.03-1.24(m,12h)。
[1905]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,5,147,3。
[1906]
合成方案17
[1907][1908]
68：1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-6-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1909]
将980mg(1,89mmol)起始材料58溶解在40ml thf/meoh(4:1)中。在0℃下添加9,45ml(18,90mmol)2m naoh-溶液并且将反应在0℃下搅拌1h。通过添加固体柠檬酸(大约1,33g)使溶液达到ph 7。在真空中除去有机溶剂并且将水性残余物用100ml etoac萃取。将有机层分离并且用饱和nahco
3-溶液洗涤并且用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)，产生603mg(77,0％)呈无色泡沫的68。
[1910]
lcms-方法a：
[1911]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,90
[1912]
电离方法：es
：[m h]
＝415,3
[1913]
69：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(三异丙基甲硅
烷氧基-甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1914]
将597mg(1,44mmol)68和931mg(1,26ml，7,20mmol)dipea溶解在20ml dcm中。添加622mg(1,80mmol)dmt-cl后，将溶液在室温下搅拌22h以实现完全转化。在真空中除去溶剂并且将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的0至100％etoac预调理)，产生860mg(83,3％)呈无色泡沫的dmt-醚69。
[1915]
lcms-方法a：
[1916]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,25
[1917]
电离方法：es
：[m na]
＝739,4
[1918]
66b：1-[(2r,6r)-6-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(羟甲基)-1,4-二噁烷-2-基]嘧啶-2,4-二酮
[1919]
将854mg(1,19mmol)69添加到5,26g(7,23ml，51,49mmol)net3和9,55g(9,66ml，57,46mmol)net3·
3hf在17ml nmp中的溶液中。在65℃下搅拌2h后，将反应置于在室温下过夜。将反应溶液倒入450ml h2o/饱和nahco
3-溶液(1:1)中并且将溶液用2 x 100ml etoac萃取。将合并的有机层用h2o和饱和nacl-溶液洗涤。用mgso4干燥后，将粗制产物在二氧化硅上纯化(用正庚烷 0,5％net3、在正庚烷中的10至100％etoac预调理)，产生666mg(99,7％)呈无色泡沫的标题化合物66b。
[1920]
lcms-方法a：
[1921]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,76
[1922]
电离方法：es
：[m na]
＝583,3
[1923]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.37(s,1h),7.79(d,j＝8.07hz,1h),7.35-7.45(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.89(2 x d,j＝8.93,4h),5.72(dd,j＝10.09,3.24hz,1h),5.62-5.68(m,1h),4.84(t,j＝5.75hz,1h),3.74(s,6h),3.71(m,2h),3.47-3.63(m,3h),3.14-3.30(m,3h)。
[1924]
67b：3-[[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-1,4-二噁烷-2-基]甲氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基丙腈
[1925]
将650mg(1,16mmol)起始化合物66b和110mg(0,64mmol)二异丙基铵四氮唑溶解在16ml干dcm中。在ar气氛下，在室温下添加396mg(418μl，1,28mmol)n,n,n’,n
’‑
四异丙基二氨基磷酸2-氰基乙酯并且将溶液搅拌16h。除去溶剂并且将残余物溶解在etoac中并且用h2o和饱和nahco
3-溶液洗涤。用mgso4干燥后，蒸发溶剂并且将粗制产物溶解在15ml甲基-叔丁基醚中。在搅拌下，将有机溶液滴入120ml正戊烷中。将沉淀物过滤并且在40℃下在真空中干燥，产生827mg(93,7％)呈无色固体的标题化合物67b。
[1926]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.39(br s,1h),7.74(m,1h),7.35-7.44(m,2h),7.18-7.35(m,7h),6.84-6.92(m,4h),5.73-5.86(m,1h),5.67(m,1h),3.54-3.89(m,7h),3.74(s,6h),3.35-3.53(m,4h),3.12-3.28(m,1h),2.62-2.76(m,2h),1.02-1.16(m,12h)。
[1927]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,5,148,1。
[1928]
c：式i的靶向核苷酸类似物的合成
[1929]
合成方案18
[1930][1931]
71：乙酸[(3ar,5r,6r,7r,7ar)-6,7-二乙酰氧基-2-甲基-5,6,7,7a-四氢-3ah-吡喃并[3,2-d]噁唑-5-基]甲酯
[1932]
在30℃下向20,0g(51,4mmol)d-半乳糖胺五乙酸酯(70)在200ml dce中的溶液中逐滴添加17,1g(77,1mmol)tmsotf。将混合物加热至50℃持续2h。在室温下静置过夜，检测到完全转化。将混合物通过nahco3(8,63g，102,8mmol)在1l水中的溶液淬灭并且用2x500ml dcm萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩，产生19,0g标题化合
物71(粗品)，其不经进一步纯化而使用。
[1933]
lcms-方法a：
[1934]
elsd：r
t
[min]＝0,90
[1935]
电离方法：es
：[m h]
＝330,1
[1936]
72g：12-苄氧基十二烷-1-醇
[1937]
将14,05g(68,76mmol)1,12-十二烷二醇溶解在150ml干dmf中。在0℃下，将2,75g(68,76mmol)nah(60％)经30min的时间段分四份添加。移除冰浴并且将溶液在室温下搅拌3h，然后在0℃下添加10,0g(6,99ml，57,33mmol)苄基溴在50ml干dmf中的溶液。将反应搅拌过夜在室温下。添加另外1,99g(49,8mmol)nah(60％)后，继续搅拌4h。将反应混合物倒入500ml冰水中并且用乙醚和etoac萃取。将有机层用饱和nacl-溶液洗涤，用mgso4干燥并且蒸发。将粗制产物在二氧化硅上纯化(在正庚烷中的0至60％etoac)以产生6,91g(41,2％)呈白色固体的标题化合物72g。
[1938]
lcms-方法a：
[1939]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,09
[1940]
电离方法：es
：[m h]
＝293,3
[1941]
制备化合物73a至73g的通用程序d
[1942]
向噁唑啉71(1,0当量)在干dce(200ml/50,0mmol)中的溶液和醇72a-72g(1,10当量)中添加分子筛(20,0g)。在室温下，逐滴添加tmsotf(0,5当量)并且将溶液搅拌直到实现完全转化.通过添加nahco3(2,0当量)在400ml h2o中的溶液将反应淬灭。分离有机相并且将水层用2x100ml dcm萃取。将合并的有机萃取物用na2so4干燥并且在真空中浓缩。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化以产生糖苷73a至73g。
[1943]
73a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(2-苄氧基乙氧基)四氢吡喃-2-基]甲酯
[1944]
按照通用程序d，在硅胶色谱法(pe/etoac 1:2)后，17,0g(51,37mmol)71和8,6g(56,56mmol)72a得到18,87g(76,4％)呈黄色油状物的标题化合物73a。
[1945]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.83(d,j＝9.29hz,1h),7.41-7.20(m,5h),5.22(d,j＝3.30hz,1h),4.98(dd,j＝11.25,3.42hz,1h),4.58(d,j＝8.44hz,1h),4.52-4.43(m,2h),4.03(s,2h),3.96-3.80(m,2h),3.69-3.49(m,3h),2.12-2.08(m,3h),1.99(s,3h),1.89(s,3h),1.74(s,3h)。
[1946]
73b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(2-苄氧基乙氧基)乙氧基]-四氢吡喃-2-基]甲酯
[1947]
按照通用程序d，硅胶色谱法后，14,0g(42,5mmol)71和7,5g(38,2mmol)72b得到10,6g(48％)呈黄色油状物的标题化合物73b。
[1948]
ms：电离方法：es
：[m h]
＝526,3
[1949]
73c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-(2-苄氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[1950]
按照通用程序d，硅胶色谱法后，16,0g(48,6mmol)71和14,0g(58,3mmol)72c得到15,6g(57％)呈无色油状物的标题化合物73c。
[1951]
ms：电离方法：es
：[m h]
＝570,1
[1952]
73d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-苄氧基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[1953]
按照通用程序d，硅胶色谱法后，19,0g(51,4mmol)71和17,5g(61,7mmol)72d得到10,0g(32％)呈无色油状物的标题化合物73d。
[1954]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.79(d,j＝9.3hz,1h),7.40-7.25(m,5h),5.27-5.20(m,1h),5.22(d,j＝3.3hz,1h),4.98(dd,j＝3.4,11.2hz,1h),4.49(s,2h),4.08-3.99(m,3h),3.94-3.75(m,2h),3.62-3.43(m,16h),2.15-2.07(m,3h),2.00(s,3h),1.90(s,3h),1.78(s,3h)。
[1955]
73e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-(2-苄氧基乙氧基)-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[1956]
按照通用程序d，硅胶色谱法后，35,0g(64,2mmol，60％纯度)71和23,2g(70,6mmol)72e得到13,4g(32％)呈黄色油状物的标题化合物73e。
[1957]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.44-7.29(m,5h),6.63(d,j＝9.29hz,1h),5.33(d,j＝2.76hz,1h),5.01(dd,j＝11.17,3.39hz,1h),4.80(d,j＝8.66hz,1h),4.58(s,2h),4.33-4.01(m,4h),3.98-3.80(m,3h),3.77-3.54(m,20h),2.18-2.16(m,3h)1.99(s,6h)1.87(s,3h)。
[1958]
73f：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-苄氧基戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲酯
[1959]
按照通用程序d，硅胶色谱法(在dcm中的0至10％meoh)后，1,69g(5,13mmol)71和1,10g(1,09ml，5,39mmol)72f得到2,60g(96,7％)呈无色油状物的标题化合物73f。
[1960]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.36-7.28(m,6h),5.24(d,j＝12.0hz,1h),5.37(d,j＝2.4hz,1h),5.34-5.31(m,1h),4.71(d,j＝8.0hz,1h),4.51(s,2h),4.17-4.14(m,2h),3.93-3.90(m,3h),3.50-3.47(m,3h),2.15(s,3h),2.06(s,3h),1.92(s,3h),1.68(s,3h),1.66-1.61(m,4h),1.48-1.44(m,2h)。
[1961]
73g：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(12-苄氧基十二烷氧基)四氢-吡喃-2-基]甲酯
[1962]
按照通用程序d，硅胶色谱法(在etoac中的10％至100％dcm)后，4,16g(12,62mmol)71和4,43g(15,14mmol)72g得到5,69g(72,6％)呈浅黄色油状物的标题化合物73g。
[1963]
lcms-方法a：
[1964]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,07
[1965]
电离方法：es
：[m h]
＝622,4
[1966]
制备化合物74a至74g的通用程序e
[1967]
将苄基醚73a-g溶解在thf(在370ml中的40mmol)中。添加5g pd/c(10％，含有50％h2o)后，将混合物在室温下在h2气氛(15psi)下搅拌直到观察到完全脱苄基化。将混合物过滤并且将滤液在真空中蒸发。在二氧化硅上的最终纯化得到所希望的标题化合物74a-g。
[1968]
74a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(2-羟乙氧基)四氢吡喃-2-基]甲酯
[1969]
按照通用程序e，在二氧化硅上纯化(etoac/meoh 10:1)后，18,87g(39,19mmol)73a得到11,6g(75,8％)呈无色固体的74a。
[1970]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.81(br d,j＝9.03hz,1h),5.22(br d,j＝2.38hz,1h),4.98(br dd,j＝10.98,2.57hz,1h),4.66-4.44(m,2h),4.04(s,3h),3.94-3.79(m,1h),3.68(br d,j＝4.64hz,1h),3.49(br s,3h),2.11(s,3h),2.01(s,3h),1.90(s,3h),1.78(s,3h)。
[1971]
74b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]-四氢吡喃-2-基]甲酯
[1972]
按照通用程序e，10,6g(20,1mmol)73b得到8,0g(92,0％)呈无色油状物的74b，不经另外纯化。
[1973]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.80(d,j＝9.2hz,1h),5.22(d,j＝3.3hz,1h),4.98(dd,j＝3.4,11.3hz,1h),4.64-4.53(m,2h),4.11-4.00(m,3h),3.94-3.83(m,1h),3.82-3.73(m,1h),3.61(dt,j＝3.2,7.1hz,1h),3.56-3.46(m,4h),3.44-3.38(m,2h),2.11(s,3h),2.01(s,3h),1.90(s,3h),1.78(s,3h)。
[1974]
74c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[1975]
按照通用程序e，将15,6g(27,4mmol)73c在200ml etoac/thf(1:1)的混合溶剂中氢化，这得到11,0g(84,6％)呈无色油状物的74c，不经另外纯化。
[1976]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.80(d,j＝9.2hz,1h),5.22(d,j＝3.3hz,1h),4.98(dd,j＝3.4,11.2hz,1h),4.62-4.52(m,2h),4.09-4.00(m,4h),3.89(td,j＝8.9,11.0hz,1h),3.82-3.74(m,1h),3.63-3.56(m,1h),3.55-3.46(m,8h),3.45-3.39(m,2h),2.11(s,3h),2.01(s,3h),1.91-1.88(m,3h),1.78(s,3h),1.18(t,j＝7.1hz,1h)。
[1977]
74d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[1978]
(按照通用程序e，将10,0g(16,3mmol)73d在100etoac中氢化，产生8,7g(93,0％)呈无色油状物的74d，不经另外纯化。
[1979]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.80(d,j＝9.2hz,1h),5.22(d,j＝3.3hz,1h),4.97(dd,j＝3.4,11.2hz,1h),4.62-4.53(m,2h),4.09-3.98(m,4h),3.89(td,j＝9.0,10.9hz,1h),3.82-3.75(m,1h),3.63-3.56(m,1h),3.55-3.46(m,12h),3.42(d,j＝5.0hz,2h),2.11(s,3h),2.00(s,3h),1.92-1.87(m,3h),1.78(s,3h)。
[1980]
74e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[1981]
按照通用程序e，在二氧化硅上的最终纯化(dcm/meoh 15:1)后，12,4g(18,9mmol)73e在250etoac中氢化，产生9,7g(83,9％)呈黄色油状物的74e。
[1982]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:6.96(br d,j＝9.29hz,1h),5.35-5.32(m,1h),5.05(dd,j＝11.17,3.39hz,1h),5.09-5.02(m,1h),4.74(d,j＝8.66hz,1h),4.27(dt,j＝11.04,8.97hz,1h),4.20-4.11(m,2h),4.01-3.91(m,3h),3.84-3.59(m,21h),2.95(br s,2h),2.17-2.15(m,3h),2.05(s,3h),2.01-1.98(m,6h)。
[1983]
74f：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-羟基戊氧基)四氢吡喃-2-基]甲酯
[1984]
将2,50g(4,77mmol)73f在13ml thf中在168mg(239μmol)pd(oh)2/c(20％)的存在
下在室温下在4巴h
2-气氛下氢化直到实现完全转化。将反应混合物过滤并且将滤液蒸发，产生2,08g(定量，粗品)标题化合物74f。
[1985]
lcms-方法a：
[1986]
elsd：r
t
[min]＝1,15
[1987]
电离方法：es-：[m-h 甲酸]-＝478,2
[1988]
74g：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(12-羟基十二烷氧基)四氢-吡喃-2-基]甲酯
[1989]
按照针对74f所述的方案，将5,69g(9,14mmol)苄基醚73g氢化，产生4,79g(98,5％)呈无色油状物的标题化合物74g，将其结晶为白色针状物。
[1990]
lcms-方法a：
[1991]
elsd：r
t
[min]＝1,72
[1992]
电离方法：es
：[m-h
]
＝532,3
[1993]
75a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(2-氧代乙氧基)四氢吡喃-2-基]-甲酯
[1994]
向0,75g(1,92mmol)起始材料74a在10ml dcm中的溶液中添加6,77g(4,97ml，2,40mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯并碘氧杂戊环-3(1h)-酮(戴斯-马丁高碘烷(dess-martin periodinane))。将溶液在室温下搅拌2h，除去溶剂并且将残余物在二氧化硅上纯化(etoac/dcm 1:1至etoac/dcm/meoh 5:5:2)，产生591mg(79,2％)标题化合物75a。
[1995]
lcms-方法c：
[1996]
elsd r
t
[min]＝0,86
[1997]
电离方法：es
：[m h]
＝390,2
[1998]
75b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]四氢-吡喃-2-基]甲酯
[1999]
按照针对75a所述的方案，将1,0g(2,30mmol)74b用8,12g(5,96ml，2,87mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯并碘氧杂戊环-3(1h)-酮(戴斯-马丁高碘烷)氧化。在二氧化硅上的最终纯化(etoac/dcm 1:1至etoac/dcm/meoh 5:5:2)得到1,0g(定量)标题化合物75b。
[2000]
lcms-方法b2：
[2001]
ms tic r
t
[min]＝0,35
[2002]
电离方法：es
：[m h]
＝434,1
[2003]
75c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基]-四氢吡喃-2-基]甲酯
[2004]
将596mg(542μl，7,59mmol)dmso溶解在11ml干dcm中。冷却至-60℃后，添加1,75ml(3,50mmol)草酰氯在干dcm中的2m溶液并且继续搅拌10分钟，然后添加1,40g(2,92mmol)醇74c在11ml干dcm中的溶液。将混合物在-60℃下搅拌另外10分钟并且添加2,97g(4,08ml，29,2mmol)net3。移除冷却浴并且允许反应混合物达到室温。完全转化后，将溶液用25ml dcm稀释并且用饱和nahco
3-溶液洗涤。将有机层分离，用mgso4干燥并且除去溶剂，这得到1,27g(91,1％，粗品)呈无色油状物的所希望的醛75c，其不经进一步纯化使用。
[2005]
lcms-方法b2：
[2006]
elsd r
t
[min]＝1,66
[2007]
电离方法：es
：[m h]
＝478,2
[2008]
75d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2009]
按照针对75c所述的方案，将1,10g(2,10mmol)醇74d氧化，产生0,99g(90,3％，粗品)呈无色油状物的醛75d。
[2010]
lcms-方法c：
[2011]
elsd r
t
[min]＝1,69
[2012]
电离方法：es
：[m h]
＝522,2
[2013]
75e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-(2-氧代乙氧基)乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2014]
按照针对75c所述的方案，将1,10g(1,94mmol)醇74e氧化，产生1,10g(定量，粗品)呈无色油状物的醛75e。
[2015]
lcms-方法a：
[2016]
elsd r
t
[min]＝1,50
[2017]
电离方法：es
：[m h]
＝566,4
[2018]
75f：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(5-氧代戊氧基)四氢吡喃-2-基]-甲酯
[2019]
按照针对75c所述的方案，将2,05g(4,73mmol)醇74f氧化，产生2,05g(定量，粗品)呈无色油状物的醛75f。
[2020]
lcms-方法a：
[2021]
elsd r
t
[min]＝1,19
[2022]
电离方法：es-：[m-h 甲酸]-＝476,2
[2023]
75g：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-(12-氧代十二烷氧基)四氢吡喃-2-基]甲酯
[2024]
按照针对75c所述的方案，将2,20g(4,14mmol)醇74g氧化，产生2,19g(99,9％，粗品)呈无色油状物的醛75g。
[2025]
lcms-方法a：
[2026]
elsd r
t
[min]＝1,79
[2027]
电离方法：es-：[m-h 甲酸]-＝574,3
[2028]
合成化合物76a至76g的通用程序f
[2029]
将1,0当量起始醛75a至75g溶解在meoh(20ml/1,0mmol)中。在室温下，5g分子筛添加4,0当量net3和10,0当量acoh，然后添加1,0当量吗啉24a。将反应溶液搅拌15分钟并且经2h的时间段(4份)添加4,0当量氰基硼氢化钠。将反应在室温下搅拌过夜以实现完全转化。将混合物过滤并且将滤液倒入50ml饱和nahco
3-溶液中。蒸发meoh并且将水性混合物用dcm萃取两次。将有机层用mgso4干燥，在真空中除去溶剂并且将粗制产物通过硅胶色谱法纯化以产生标题化合物76a至76g。
[2030]
76a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异
丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2031]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(在dcm中的0至10％meoh)，580mg(745μmol)起始醛75a得到510mg(62,1％)呈无色泡沫的标题化合物76a。
[2032]
lcms-方法c：
[2033]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,30
[2034]
电离方法：es
：[m h]
＝1104,0
[2035]
76b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基-甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2036]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(etoac/dcm 1:1至etoac/dcm/meoh5:5:1)，500mg(577μmol)起始醛75b得到352mg(53,2％)呈无色泡沫的标题化合物76b。
[2037]
lcms-方法c：
[2038]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,27
[2039]
电离方法：es
：[m h]
＝1148,0
[2040]
76c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2041]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(在dcm中的0至10％meoh)，900mg(1,88mmol)起始醛75c得到1,34g(59,5％)呈无色泡沫的标题化合物76c。
[2042]
lcms-方法c：
[2043]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,29
[2044]
电离方法：es-：[m-h]-＝1189,9
[2045]
76d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2046]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(在dcm中的0至10％meoh)，840mg(1,61mmol)起始醛75d得到835mg(42,0％)呈无色泡沫的标题化合物76d。
[2047]
lcms-方法c：
[2048]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,30
[2049]
电离方法：es
：[m h]
＝1235,8
[2050]
74e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2051]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(在dcm中的0至10％meoh)，1,09g(1,54mmol，纯度80％)起始醛75e得到1,12g(56,8％)呈无色泡沫的标题化合物76e。
[2052]
lcms-方法a：
[2053]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,20
[2054]
电离方法：es
：[m h]
＝1279,9
[2055]
76f：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2056]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(在dcm中的0至10％meoh)，1,0g(2,32mmol)起始醛75f得到2,18g(82,1％)呈无色泡沫的标题化合物76f。
[2057]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.44(s,1h),7.84-7.77(m,1h),7.62(s,1h),7.42(d,j＝7.6hz,2h),7.33-7.18(m,8h),6.84(d,j＝8.8hz,4h),5.88(dd,j＝2.4,10.0hz,1h),5.22(d,j＝3.6hz,1h),4.98(dd,j＝3.2,11.2hz,1h),4.52-4.47(m,1h),4.11(d,j＝9.6hz,1h),4.07
–
3.97(m,4h),3.93-3.83(m,2h),3.80
–
3.65(m,8h),3.47-3.38(m,1h),3.11(d,j＝9.2hz,1h),2.97(d,j＝9.2hz,1h),2.90(d,j＝8.8hz,1h),2.79(d,j＝11.2hz,1h),2.29(t,j＝7.2hz,2h),2.14-2.04(m,5h),2.02-1.95(m,3h),1.90(s,3h),1.82-1.73(m,6h),1.57-1.22(m,6h),1.01-0.83(m,21h)。
[2058]
76g：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2059]
按照通用程序f并且在二氧化硅上的最终纯化(在正庚烷中的0至100％meoh/etoac(9:1))，2,19g(4,13mmol)起始醛75g得到4,84g(94,3％)呈无色泡沫的标题化合物76g。
[2060]
lcms-方法b-2：
[2061]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,14
[2062]
电离方法：es
：[(m 2h)/2]
＝622,5
[2063]
合成化合物77a-g和83a-e的通用程序g
[2064]
将1,0当量tips保护的起始化合物76a-e(82a-e，参见方案20)溶解在nmp(14ml/1,0mmol)中。添加15,0当量三乙胺和6,0当量net3·
3hf后，将反应混合物在90℃下搅拌直到实现完全转化。将溶液冷却至室温后，添加饱和nahco
3-溶液并且将混合物用etoac萃取三次。将合并的有机层用饱和nacl-溶液洗涤并且用mgso4干燥。蒸发溶剂后，将粗制产物在二氧化硅上纯化，产生脱保护的产物77a-g(83a-e，参见方案20)。
[2065]
77a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2066]
按照通用程序g，将850mg(770μmol)tips-醚76a脱保护，在硅胶色谱法(etoac/dcm1:1至etoac/dcm/meoh 5:5:1)后产生401mg(55,0％)标题化合物77a。
[2067]
lcms-方法c：
[2068]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,16
[2069]
电离方法：es
：[m h]
＝947,8
[2070]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.37(s,1h),7.78(d,j＝9.17hz,1h),7.53(s,1h),7.40(d,j＝7.52hz,2h),7.18-7.32(m,7h),6.87(d,j＝8.99hz,4h),5.85(dd,j＝9.90,3.12hz,1h),5.20(d,j＝3.48hz,1h),4.96(dd,j＝11.19,3.48hz,1h),4.57(t,j＝
5.32hz,1h),4.52(d,j＝8.44hz,1h),3.99-4.06(m,3h),3.79-3.91(m,2h),3.72-3.76(m,7h),3.66(dd,j＝11.10,5.78hz,1h),3.59(dt,j＝11.51,5.52hz,1h),3.00(s,2h),2.90(br d,j＝9.35hz,1h),2.76(br d,j＝11.55hz,1h),2.51-2.60(m,2h),2.25(d,j＝11.37hz,1h),2.17(t,j＝10.64hz,1h),2.04(m,3h),1.97(m,3h),1.88(s,3h),1.70(s,3h),1.69(s,3h)。
[2071]
77b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2072]
按照通用程序g，将720mg(635μmol)tips-醚76b脱保护，在硅胶色谱法(etoac/dcm1:1至etoac/dcm/meoh 5:5:1)后产生527mg(83,7％)标题化合物77b。
[2073]
lcms-方法c：
[2074]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,12
[2075]
电离方法：es
：[m h]
＝991,9
[2076]
1h-nmr dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.79(d,j＝9.17hz,1h),7.55(s,1h),7.40(d,j＝7.70hz,2h),7.21-7.31(m,7h),6.87(d,j＝8.80hz,4h),5.85(br d,j＝7.34hz,1h),5.21(d,j＝3.30hz,1h),4.98(dd,j＝11.19,3.30hz,1h),4.61(br s,1h),4.54(d,j＝8.62hz,1h),3.99-4.04(m,3h),3.83-3.90(m,1h),3.72-3.79(m,8h),3.55-3.67(m,2h),3.48-3.55(m,4h),3.01(s,2h),2.90(br d,j＝10.09hz,1h),2.80(br d,j＝12.10hz,1h),2.51-2.55(m,2h),2.27(br d,j＝11.74hz,1h),2.15-2.21(m,1h),2.09(s,3h),1.98(s,3h),1.89(s,3h),1.76(s,3h),1.67(s,3h)。
[2077]
77c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2078]
按照通用程序g，将1,25g(1,05mmol)tips-醚76c脱保护，在硅胶色谱法(etoac/dcm1:1至etoac/dcm/meoh 5:5:1)后产生630mg(58,0％)标题化合物77c。
[2079]
lcms-方法c：
[2080]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,11
[2081]
电离方法：es
：[m h]
＝1035,6
[2082]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.77(d,j＝9.17hz,1h),7.55(s,1h),7.40(d,j＝7.34hz,2h),7.20-7.31(m,7h),6.87(d,j＝8.62hz,4h),5.85(dd,j＝9.72,3.12hz,1h),5.21(d,j＝3.48hz,1h),4.97(dd,j＝11.19,3.30hz,1h),4.60(t,j＝5.41hz,1h),4.54(d,j＝8.62hz,1h),4.00-4.06(m,3h),3.84-3.91(m,1h),3.71-3.77(m,8h),3.59-3.67(m,1h),3.42-3.57(m,9h),3.01(s,2h),2.92(br d,j＝9.54hz,1h),2.80(br d,j＝11.55hz,1h),2.51-2.56(m,2h),2.27(d,j＝11.55hz,1h),2.17(t,j＝10.45hz,1h),2.10(s,3h),1.99(s,3h),1.89(s,3h),1.76(m,3h),1.67(m,3h)。
[2083]
77d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[(2r,6r)-2-(羟基-甲基)-2-[[(4-羟苯基)-(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2084]
按照通用程序g，将780mg(631μmol)tips-醚76d脱保护，在硅胶色谱法(etoac/dcm1:1至etoac/dcm/meoh 5:5:1)后产生450mg(66,1％)标题化合物77d。
[2085]
lcms-方法c：
[2086]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,12
[2087]
电离方法：es
：[m h]
＝1079,7
[2088]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.77(d,j＝9.17hz,1h),7.55(s,1h),7.40(d,j＝7.34hz,2h),7.20-7.31(m,7h),6.87(d,j＝8.80hz,4h),5.84(dd,j＝9.72,3.12hz,1h),5.21(d,j＝3.48hz,1h),4.97(dd,j＝11.28,3.39hz,1h),4.60(t,j＝5.32hz,1h),4.55(d,j＝8.44hz,1h),4.00-4.06(m,3h),3.85-3.91(m,1h),3.72-3.78(m,8h),3.61-3.66(m,1h),3.55-3.60(m,1h),3.43-3.54(m,12h),3.00(s,2h),2.92(br d,j＝8.99hz,1h),2.81(br d,j＝11.19hz,1h),2.51-2.56(m,2h),2.28(d,j＝11.74hz,1h),2.15-2.21(m,1h),2.10(s,3h),1.99(s,3h),1.89(m,3h),1.77(s,3h),1.67(s,3h)。
[2089]
77e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[2-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2090]
按照通用程序g，将1,10g(860μmol)tips-醚76e脱保护，在硅胶色谱法(在dcm中的0至5％meoh)后产生437mg(45,3％)标题化合物77e。
[2091]
lcms-方法a：
[2092]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,72
[2093]
电离方法：es-：[m-h]-＝1121,6
[2094]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.77(d,j＝9.17hz,1h),7.53-7.56(m,1h),7.40(d,j＝7.34hz,2h),7.19-7.31(m,7h),6.87(d,j＝8.93hz,4h),5.85(dd,j＝9.66,2.93hz,1h),5.21(d,j＝3.42hz,1h),4.97(dd,j＝11.25,3.42hz,1h),4.53-4.62(m,2h),4.03(s,3h),3.83-3.93(m,1h),3.72-3.82(m,8h),3.44-3.66(m,18h),2.98-3.04(m,2h),2.92(br d,j＝8.80hz,1h),2.77-2.86(m,1h),2.52-2.57(m,2h),2.25-2.32(m,1h),2.18(br t,j＝10.51hz,1h),2.10(m,3h),1.99(m,3h),1.89(s,3h),1.77(s,3h),1.67(s,3h)。
[2095]
77f：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2096]
按照通用程序g，将2,15g(1,88mmol)tips-醚76f脱保护，在硅胶色谱法(在dcm中的0至5％meoh)后产生1,21g(65,0％)标题化合物77f。
[2097]
lcms-方法a：
[2098]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,69
[2099]
电离方法：es
：[m h]
＝989,5
[2100]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(s,1h),7.79(d,j＝9.29hz,1h),7.51-7.58(m,1h),7.40(d,j＝7.34hz,2h),7.19-7.32(m,7h),6.87(d,j＝8.44hz,4h),5.84(dd,j＝9.90,2.93hz,1h),5.21(d,j＝3.42hz,1h),4.96(dd,j＝11.25,3.42hz,1h),4.58-4.65(m,1h),4.48(d,j＝8.44hz,1h),3.98-4.06(m,3h),3.80-3.94(m,1h),3.63-3.78(m,9h),
[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)-磷烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2126]
按照通用程序h，将495mg(441μmol)起始醇77e亚磷酸化，产生589mg(定量)标题化合物78e。
[2127]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.35(br s,1h),7.77(d,j＝9.16hz,1h),7.56,7.53(2 x s,1h),7.35-7.43(m,2h),7.18-7.33(m,7h),6.86(br d,j＝8.78hz,4h),5.84-5.93(m,1h),5.22(dm,1h),4.97(m,1h),4.56(m,1h),3.96-4.10(m,4h),3.72-3.95(m,4h),3.73(s,6h),3.41-3.63(m,21h),2.79-3.08(m,4h),2.64-2.72(m,1h),2.53-2.61(m,2h),2.14-2.33(m,2h),2.10(s,3h),1.99(s,3h),1.89(s,3h),1.77(s,3h),1.72,1.69(2 x s,3h),0.93-1.12(m,12h)。
[2128]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,6,147,4。
[2129]
78f：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2130]
按照通用程序h，将1,17g(1,18mmol)起始醇77f亚磷酸化，产生1,32g(94,1％)标题化合物78f。
[2131]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.36(br s,1h),7.78(2 x d,j＝9.19,1h),7.57,7.54(2 x s,1h),7.36-7.44(m,2h),7.19-7.32(m,7h),6.86(br d,j＝8.78hz,4h),5.89(m,1h),5.21(m,1h),4.96(m,1h),4.48(m,1h),3.94-4.09(m,4h),3.81-3.93(m,2h),3.66-3.75(m,1h),3.73(s,6h),3.53-3.66(m,2h),3.37-3.51(m,3h),3.07-3.13(m,1h),2.95-3.05(m,1h),2.84-2.92(m,1h),2.77(m,1h),2.63-2.71(m,1h),2.52-2.62(m,1h),2.23-2.39(m,2h),2.02-2.16(m,2h),2.10(s,3h),1.99,1.98(2 x s,3h),1.89(s,3h),1.76(s,3h),1.73,1.70(2 x s,3h),1.35-1.56(m,4h),1.22
–
1.33(m,2h),0.93-1.13(m,12h)。
[2132]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,4,147,1。
[2133]
78g：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2134]
按照通用程序h，将1,52g(1,40mmol)起始醇77g亚磷酸化，产生1,55g(86,3％)标题化合物78g。
[2135]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.37(br s,1h),7.80(d,j＝9.22hz,1h),7.57,7.54(2 x s,1h),7.36-7.45(m,2h),7.20-7.32(m,7h),6.86(d,j＝8.85hz,4h),5.86-5.93(m,1h),5.22(m,1h),4.97(m,1h),4.49(m,1h),3.82-4.09(m,6h),3.74(s,6h),3.65-3.72(m,1h),3.54-3.64(m,2h),3.36-3.52(m,3h),3.06-3.14(m,1h),2.96-3.06(m,1h),2.73-2.91(m,2h),2.64-2.71(m,1h),2.53-2.61(m,1h),2.20-2.39(m,2h),2.03-2.16(m,2h),2.11(s,3h),1.99(s,3h),1.90(s,3h),1.77(s,3h),1.73,1.71(2xs,3h),1.35-1.52(m,4h),1.17-1.32(m,16h),0.97-1.14(m,12h)。
[2136]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,3,147,1.
[2137]
合成方案19
[2138]
19a
[2139][2140]
80a：2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙酸苄酯
[2141]
向起始化合物70(16g，41,1mmol)和2-羟基-乙酸苄酯79a(13,6g，82,2mmol)在160ml dce中的混合物中添加sc(otf)3(1,41g，2,88mmol)。将溶液在90℃下搅拌16h以实现完全转化。将反应混合物倒入200ml饱和nahco3中并且用3x100ml dcm萃取。将合并的有机相经无水na2so4干燥，过滤并且将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(pe:etoac 1:1)以及然后反向快速色谱法(中性)来纯化，产生12,0g(60％)呈黄色油状物的标题化合物80a。
[2142]
ms[m h]
(m/z)＝496,0
[2143]
81a：2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸
[2144]
在25℃下向化合物80a(12g，24,2mmol)在150ml etoac中的混合物中添加pd/c(3g，在碳上10％以及50％的水含量)。将混合物在室温下在h
2-气氛(15psi)下搅拌12h直到实现完全转化。将混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩以得到呈无色泡沫的81a(9,2g，93％)。
[2145]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.93(br d,j＝8.7hz,1h),5.22(d,j＝3.4hz,1h),5.01(dd,j＝3.3,11.1hz,1h),4.63(d,j＝8.5hz,1h),4.10(br d,j＝4.9hz,2h),4.05-3.99(m,3h),3.94-3.85(m,2h),2.14-2.10(m,3h),2.02-1.99(m,3h),1.89(s,3h),1.79(s,3h)。
[2146]
80c：2-[2-[2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲
基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙酸苄酯
[2147]
按照针对化合物80a所述的方案，14,6g(37,6mmol)70和19,1g(75,2mmol)2-[2-(2-羟乙氧基)乙氧基]乙酸苄酯79c得到12,0g(54,8％)呈浅黄色油状物的标题化合物80c。
[2148]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.75(d,j＝9.17hz,1h),7.50-7.27(m,5h),5.21(d,j＝3.30hz,1h,)5.15(s,2h),4.97(dd,j＝11.19,3.36hz,1h),4.57(d,j＝8.44hz,1h),4.19(s,2h),4.04-4.00(m,3h),3.88(dt,j＝10.97,8.94hz,1h),3.81-3.71(m,1h),3.63-3.48(m,7h),2.10(s,3h),1.99(s,3h),1.89(s,3h),1.77(s,3h)。
[2149]
81c：2-[2-[2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙酸
[2150]
向苄基酯80c(12,0g，20,6mmol)在400ml etoac中的溶液中添加pd/c(2g，在碳上10％以及50％的水含量)。将混合物在室温下在h
2-气氛(15psi)下搅拌12h。将反应混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩以得到8,5g(83,7％)呈无色油状物的81c。
[2151]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.78(d,j＝9.17hz,1h),5.22(d,j＝3.42hz,1h),4.98(dd,j＝11.13,3.42hz,1h),4.59(d,j＝8.44hz,1h),4.10-3.98(m,5h),3.89(dt,j＝11.00,8.93hz,1h),3.78(dt,j＝11.16,4.63hz,1h),3.65-3.46(m,7h),2.11(s,3h),2.01(s,3h),1.90(s,3h),1.78(s,3h)。
[2152]
80b：2-[2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙酸苄酯
[2153]
在25℃下向化合物79b(7,0g，21,2mmol)和噁唑啉71(6,7g，31,9mmol)在100ml dce中的混合物中添加筛(10g)中。将混合物搅拌1,5h，然后添加tmsotf(2,3g，10,6mmol)。在室温下搅拌12h后，将反应溶液倒入200ml饱和nahco
3-溶液中并且用3x100ml dcm萃取。将合并的有机相经无水na2so4干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过反向快速色谱法纯化以得到呈黄色油状物的化合物80b(4,0g，36％)。
[2154]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.68(d,j＝9.2hz,1h),7.29-7.16(m,5h),5.12-5.05(m,1h),5.02(s,2h),4.89-4.79(m,1h),4.43(d,j＝8.4hz,1h),4.06(d,j＝1.6hz,2h),3.92-3.85(m,3h),3.81-3.64(m,2h),3.55-3.41(m,3h),1.97(s,3h),1.87-1.84(m,3h),1.78-1.74(m,3h),1.65-1.57(m,3h)。
[2155]
81b：2-[2-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙酸
[2156]
在室温下向化合物80b(6,0g，11,1mmol)在100ml etoac中的混合物中添加pd/c(0.6g，在碳上10％以及50％的水含量)。将混合物在h2(15psi)下搅拌12h以实现完全转化。将反应混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩以得到5,0g(96％)呈白色泡沫的标题化合物81b。
[2157]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:7.83(d,j＝9.3hz,1h),5.22(d,j＝3.4hz,1h),4.97(dd,j＝3.4,11.2hz,1h),4.57(d,j＝8.6hz,1h),4.06-4.02(m,3h),4.01(s,2h),3.89(td,j＝8.9,11.1hz,1h),3.83-3.77(m,1h),3.66-3.52(m,3h),2.13-2.07(m,3h),2.02-1.98(m,3h),1.89(s,3h),1.78(s,3h)。
[2158]
80d：5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基戊酸苄酯
[2159]
在15℃下向(d)-2-脱氧-2-氨基-半乳糖基-五乙酸酯70(387g，0,968mol)在4l dce中的溶液中逐滴添加tmsotf(322g，1,452mol)。将混合物在50℃下加热1,5h并且然后在30℃下搅拌过夜。将反应混合物倒入4l饱和nahco
3-溶液中并且用1l dcm萃取两次。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物溶解在4l dce中，在15℃下添加5-羟基戊酸苄酯79d(302g，1,452mol)和300g粉末状分子筛搅拌1h后，在15℃下逐滴添加tmsotf(107,4g，0,484mol)。将悬浮液在15℃下搅拌过夜以实现完全转化。将反应混合物倒入4l饱和nahco
3-溶液中，过滤并且用1l dcm萃取两次。将合并的有机层经na2so4干燥，过滤并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(pe/etoac 3:1)以得到呈无色油状物的所希望的产物(240g，46％)80d。
[2160]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:7.47-7.30(m,5h),5.74(br d,j＝8.5hz,1h),5.36(d,j＝2.8hz,1h),5.30-5.23(m,1h),5.17-5.07(m,2h),4.65(d,j＝8.4hz,1h),4.20-4.08(m,3h),4.02-3.94(m,1h),3.94-3.85(m,2h),3.50(td,j＝6.1,9.9hz,1h),2.49-2.32(m,2h),2.15(s,3h),2.05(s,3h),2.01(s,3h),1.92(s,3h),1.78-1.56(m,4h)。
[2161]
81d：5-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基戊酸
[2162]
向苄基酯80d(240g，0,447mol)在2,5l meoh中的溶液中添加pd/c(24g，在碳上10％，50％的水含量)。将混合物在15℃下在h2(15psi)下搅拌过夜。将反应混合物过滤并且将滤液在真空中浓缩，产生196g(97％)呈白色固体的81d。
[2163]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ[ppm]:6.19(d,j＝8.8hz,1h),5.37(d,j＝3.1hz,1h),5.30(dd,j＝3.4,11.2hz,1h),4.69(d,j＝8.3hz,1h),4.16(m,1h),3.98-3.92(m,2h),3.57-3.48(m,2h),2.40-2.30(m,2h),2.18-2.15(s,3h),2.06(s,3h),2.02(s,3h),1.99-1.94(s,3h),1.76-1.59(m,4h)。
[2164]
79e：12-羟基十二烷酸苄酯
[2165]
将5,0g(22,4mmol)12-羟基十二烷酸溶解在100ml dmf中。添加4,5g(3,15ml，25,8mmol)苄基溴和3,37g(33,6mmol)碳酸氢钾后，将混合物搅拌20h。在真空中除去溶剂并且将残余物溶解在乙醚中。用h2o洗涤后，分离水相并且用乙醚萃取。将合并的有机层用mgso4干燥并且通过硅胶色谱法纯化(在正庚烷中的0至30％etoac)，产生5,70g(82,9％)所希望的苄基酯79e。
[2166]
lcms-方法a：
[2167]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,04
[2168]
电离方法：es
：[m h]
＝307,2
[2169]
80e：12-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-吡喃-2-基]氧基十二烷酸苄酯
[2170]
从2,20g(5,7mmol)70开始，按照针对80d所述的方案合成2,0g(55,9％)标题化合物80e。在70℃下搅拌4h并且在室温下搅拌另外16h后实现用79e的完全糖基化。在硅胶上用在正庚烷中的0至100％etoac/dcm(1:1)洗脱进行最终纯化。
[2171]
lcms-方法a：
[2172]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,99
[2173]
电离方法：es
：[m h]
＝636,5
[2174]
81e：12-[(2r,3r,4r,5r,6r)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基十二烷酸
[2175]
将2,0g(3,2mmol)苄基酯80e溶解在20ml thf中。添加167mg(157μmol)pd(在碳上10％)后，将反应混合物用h2吹扫并且在4巴h2压力下氢化。4h后，将pd-催化剂滤出并且将滤液在真空中蒸发。将粗制产物通过硅胶色谱法纯化(在dcm中的0至20％meoh，10％acoh)，这得到1,67g(97,3％)羧酸81e。
[2176]
lcms-方法a：
[2177]
elsd：r
t
[min]＝1,68
[2178]
电离方法：es
：[m h]
＝546,4
[2179]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.79(br s,1h),7.67(d,j＝9.17hz,1h),5.08(d,j＝3.42hz,1h),4.83(dd,j＝11.25,3.42hz,1h),4.35(d,j＝8.44hz,1h),3.84-3.95(m,3h),3.73(m,1h),3.56(m,1h),3.44-3.51(m,1h),3.28(m,1h),1.97(s,3h),1.87(s,3h),1.76(s,3h),1.63(s,3h),1.28-1.39(m,4h),1.11(s,14h)。
[2180]
合成方案20
[2181][2182]
合成化合物82a至82e的通用程序j
[2183]
将羧酸(81a-e，1,0至1,2当量)和吗啉化合物24a(1,0当量)溶解在dcm(20ml/1,0mmol)中。添加1,5当量hbtu和3,0当量dipea后，将反应在室温下搅拌18h以实现完全转化。将反应溶液用饱和nacho
3-和饱和nacl-溶液洗涤。将有机层用mgso4干燥并且蒸发溶剂。在二氧化硅上纯化粗制产物得到呈无色固体的所希望的酰胺。
[2184]
82a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异
丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2185]
按照通用程序j，在二氧化硅上纯化(在dcm/etoac 1:1中的0至10％dcm/etoac/meoh 10:10:1)后，400mg(986μmol，1,2当量)羧酸81a得到530mg(57,7％)标题化合物82a。
[2186]
lcms-方法c：
[2187]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,15
[2188]
电离方法：es-：[m-h]-＝1115,9
[2189]
82b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基-甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2190]
按照通用程序j，在二氧化硅上纯化(在dcm/etoac 1:1中的0至10％dcm/etoac/meoh 10:10:1)后，406mg(904μmol，1,1当量)羧酸81b得到590mg(61,8％)标题化合物82b。
[2191]
lcms-方法c：
[2192]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,16
[2193]
电离方法：es-：[m-h]-＝1160,0
[2194]
82c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基甲基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2195]
按照通用程序j，在二氧化硅上纯化(在dcm/etoac 1:1中的0至10％dcm/etoac/meoh 10:10:1)后，406mg(822μmol，1,2当量)羧酸81c得到413mg(50,0％)标题化合物82c。
[2196]
lcms-方法c：
[2197]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝3,17
[2198]
电离方法：es-：[m-h]-＝1204,0
[2199]
82d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]-5-氧代-戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2200]
按照通用程序j，在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)后，750mg(1,68mmol，1,0当量)羧酸81d得到1,76g(90,6％)标题化合物82d。
[2201]
lcms-方法a：
[2202]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,16
[2203]
电离方法：es-：[m-h]-＝1157,5
[2204]
82e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-2-(三异丙基甲硅烷氧基-甲基)吗啉-4-基]-12-氧代-十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2205]
按照通用程序j，在二氧化硅上纯化(在dcm中的0至5％meoh)后，897mg(1,64mmol，1,2当量)羧酸81e得到1,46g(84,5％)标题化合物82e。
[2206]
lcms-方法a：
[2207]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,25
[2208]
电离方法：es-：[m-h]-＝1255,6
[2209]
83a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2210]
按照通用程序g(参见方案18)，将530mg(474μmol)tips-醚82a脱保护，在硅胶色谱法(在dcm/etoac 1:1中的0至10％dcm/etoac/meoh 5:5:1)后产生380mg(83,4％)标题化合物83a。
[2211]
lcms-方法c：
[2212]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,29
[2213]
电离方法：es-：[m-h]-＝959,9
[2214]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.44(br s,1h),7.83-7.88(m,0.4h),7.78(br d,j＝9.17hz,0.6h),7.64(s,1h),7.39-7.44(m,2h),7.21-7.32(m,7h),6.85-6.90(m,4h),5.88-5.93(m,0.4h),5.83(m,0.6h),5.19-5.23(m,1h),4.90-5.02(m,1.6h),4.53-4.62(m,1.4h),21 4.42(br d,j＝14.12hz,0.6h),4.32-4.39(m,1h),4.20-4.31(m,1.4h),3.81-4.07(m,6h),3.72
–
3.79(m,7h),3.47-3.65(m,2h),2.99-3.11(m,2h),2.88-2.97(m,1h),2.10,2.04(2 x s,3h),1.99,1.97(2 x s,3h),1.88(s,3h),1.73,1.72(m,6h)。
[2215]
83b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2216]
按照通用程序g(参见方案18)，将670mg(577μmol)tips-醚82b脱保护，在硅胶色谱法(在dcm/etoac 1:1中的0至10％dcm/etoac/meoh 5:5:1)后产生504mg(86,9％)标题化合物83b。
[2217]
lcms-方法c：
[2218]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,30
[2219]
电离方法：es-：[m-h]-＝1003,9
[2220]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.42(br s,1h),7.80(d,j＝9.35hz,1h),7.64,7.60(2 x s,1h),7.39-7.44(m,2h),7.19-7.35(m,7h),6.85-6.90(m,4h),5.87-5.93(m,0.4h),5.82(br d,j＝8.07hz,0.6h),5.21(br s,1h),4.94
–
5.00(m,1.6h),4.64-4.70(m,0.4h),4.54-4.58(m,1h),4.33-4.39(m,0.6h),4.11-4.26(m,2.4h),4.00-4.05(m,3.4h),3.78-3.94(m,2.6h),3.74(m,6h),3.42-3.70(m,6h),3.07-3.11(m,1h),2.89-3.05(m,2h),2.04-2.12(m,3h),1.97-2.01(m,3h),1.89(s,3h),1.71-1.78(m,6h)。
[2221]
83c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2222]
按照通用程序g(参见方案18)，将410mg(340μmol)tips-醚82c脱保护，在硅胶色谱法(在dcm/etoac 1:1中的0至10％dcm/etoac/meoh 5:5:1)后产生285mg(79,9％)标题化合物83c。
[2223]
lcms-方法c：
[2224]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝2,31
[2225]
电离方法：es-：[m-h]-＝1047,9
[2226]
1h-nmr(dmso-d6,600mhz)δ[ppm]:11.43(br s,1h),7.76(m,1h),7.57-7.65(m,1h),7.42(m,2h),7.21-7.32(m,7h),6.85-6.90(m,4h),5.88-5.94(m,0.4h),5.82(m,0.6h),5.21(m,1h),4.94
–
4.99(m,1.6h),4.63-4.69(m,0.4h),4.57(m,1h),4.36(m,0.6h),4.16-4.26(m,2h),4.09-4.15(m,0.4h),3.99-4.05(m,3h),3.85-3.92(m,2h),3.69-3.79(m,8h),3.45-3.62(m,9h),3.06-3.10(m,1h),2.88-3.06(m,2h),2.10(s,3h),1.99(s,3h),1.88(s,3h),1.76(br s,3h),1.73(s,3h)。
[2227]
83d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-5-氧代-戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2228]
按照通用程序g(参见方案18)，将1,75g(1,51mmol)tips-醚82d脱保护，在硅胶色谱法(在dcm中的0至10％meoh)后产生1,17g(77,3％)标题化合物83d。
[2229]
lcms-方法a：
[2230]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,80
[2231]
电离方法：es-：[m-h]-＝1001,4
[2232]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.43(s,1h),7.78(m,1h),7.64,7.58(2 x b s,1h),7.41(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.88(m,4h),5.85(m,0.4h),5.77(m,0.6h),5.21(m,1h),4.92-5.01(m,1.6h),4.61-4.67(m,0.4h),4.45-4.52(m,1h),4.37-4.45(m,0.6h),4.21-4.29(m,0.4h),3.67-4.07(m,12h),3.32-3.64(m,4h),2.81-3.14(m,3h),2.27-2.38(m,2h),2.06-2.12(m,3h),1.96-2.01(m,3h),1.89(m,3h),1.76(m,3h),1.72(m,3h),1.49(br s,4h)。
[2233]
83e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2r,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-(羟甲基)-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)-吗啉-4-基]-12-氧代-十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2234]
按照通用程序g(参见方案18)，将1,45g(1,15mmol)tips-醚82e脱保护，在硅胶色谱法(在dcm中的0至5％meoh)后产生1,10g(86,6％)标题化合物83e。
[2235]
lcms-方法a：
[2236]
uv-波长[nm]＝220：r
t
[min]＝1,96
[2237]
电离方法：es-：[m-h]-＝1099,6
[2238]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.42(br s,1h),7.79(d,j＝9.29hz,1h),7.63,7.57(2 x s,1h),7.41(m,2h),7.20-7.34(m,7h),6.87(m,4h),5.84(m,0.4h),5.77(m,0.6h),5.21(m,1h),4.91-5.01(m,1.6h),4.61-4.68(m,0.4h),4.48(m,1h),4.39(m,0.6h),4.24(m,0.4h),3.98-4.06(m,3h),3.66-3.90(m,3h),3.74(s,6h),3.56(m,1h),3.36-3.50(m,2h),2.77-3.16(m,2h),2.22-2.39(m,2h),2.10(m,3h),1.99(m,3h),1.89(m,3h),1.76(m,3h),1.72(m,3h),1.39
–
1.56(m,4h),1.18
–
1.32(br s,16h)。
[2239]
84a：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2240]
按照通用程序h(参见方案18)，380mg(395μmol)起始醇83a得到434mg(94,4％)标
题化合物84a。
[2241]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.41(b s,1h),7.72-7.90(m,1h),7.60-7.71(m,1h),7.35-7.48(m,2h),7.17-7.33(m,7h),6.82-6.95(m,4h),5.78-6.05(m,1h),5.16-5.26(m,1h),4.91-5.03(m,1h),4.55-4.64(m,1h),4.10-4.54(m,3h),3.52-4.08(m,16h),3.36-3.50(m,2h),2.85-3.18(m,3h),2.57-2.72(m,2h),2.07(m,3h),1.98(m,3h),1.88(m,3h),1.68-1.78(m,6h),0.89-1.22(m,12h)。
[2242]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,2,147,1,146,8,146,3。
[2243]
84b：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2244]
按照通用程序h(参见方案18)，500mg(497μmol)起始醇83b得到575mg(95,9％)标题化合物84b。
[2245]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.40(br s,1h),7.79(br d,j＝9.22hz,1h),7.63(m,1h),7.40(br s,2h),7.20-7.34(m,7h),6.83-6.91(m,4h),5.80-6.03(m,1h),5.22(m,1h),4.96(m,1h),4.56(m,1h),4.08-4.43(m,4h),4.03(s,3h),3.52-3.91(m,16h),3.38-3.50(m,2h),2.86-3.18(m,3h),2.52-2.75(m,2h),2.07(m,3h),1.99(m,3h),1.90(m,3h),1.68-1.81(m,6h),0.89-1.22(m,12h)。
[2246]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,2,147,2,147,13,147,06。
[2247]
84c：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[2-[2-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]-乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2248]
按照通用程序h(参见方案18)，285mg(272μmol)起始醇83c得到317mg(93,5％)标题化合物84c。
[2249]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.40(br s,1h),7.77(m,1h),7.60-7.71(m,1h),7.40(m,2h),7.21-7.33(m,7h),6.87(m,4h),5.82-5.99(m,1h),5.21(m,1h),4.97(m,1h),4.57(m,1h),4.09-4.39(m,3h),3.97-4.08(m,3h),3.34-3.95(m,20h),2.90-3.18(m,3h),2.56-2.73(m,2h),2.10(m,3h),2.07(m,3h),1.99(m,3h),1.89(m,3h),1.71
–
1.80(m,6h),0.89-1.22(m,12h)。
[2250]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:148,1,147,3,147,2,147,0。
[2251]
84d：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[5-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-5-氧代-戊氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2252]
按照通用程序h(参见方案18)，1,0g(997μmol)起始醇83d得到1,19g(99,2％)标题化合物84d。
[2253]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.41(br s,1h),7.74-7.81(m,1h),7.58-7.70(m,1h),7.40(m,2h),7.20-7.33(m,7h),6.87(m,4h),5.79-5.93(m,1h),5.21(br s,1h),
4.96(m,1h),4.31-4.52(m,2h),3.96-4.08(m,4h),3.53-3.94(m,6h),3.73(s,6h),3.34-3.50(m,4h),3.02-3.19(m,1h),2.83-3.01(m,1h),2.56-2.74(m,2h),2.52-2.54(m,1h),2.26-2.43(m,2h),2.10,2.08(2 x s,3h),1.99(s,3h),1.89(m,3h),1.71-1.79(m,6h),1.41-1.69(m,4h),0.89-1.12(m,12h)。
[2254]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,9,147,1,147,0,146,7。
[2255]
84e：乙酸[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[12-[(2s,6r)-2-[[双(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-2-[[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)磷烷基]氧基-甲基]-6-(5-甲基-2,4-二氧代-嘧啶-1-基)吗啉-4-基]-12-氧代-十二烷氧基]四氢吡喃-2-基]甲酯
[2256]
按照通用程序h(参见方案18)，557mg(506μmol)起始醇83e得到396mg(60,2％)标题化合物84e。
[2257]
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ[ppm]:11.35-11.48(m,1h),7.76-7.84(m,1h),7.56-7.70(m,1h),7.33-7.45(m,2h),7.21-7.33(m,7h),6.87(m,4h),5.77-5.96(m,1h),5.21(m,1h),4.93-5.01(m,1h),4.31-4.51(m,2h),3.94-4.11(m,4h),3.53-3.92(m,4h),3.73(m,6h),3.33-3.49(m,3h),3.03-3.21(m,2h),2.83-2.99(m,1h),2.62-2.72(m,1h),2.21-2.48(m,2h),2.10(m,3h),1.99(m,3h),1.89(m,3h),1.71-1.82(m,6h),1.45(br s,4h),1.14-1.30(m,18h),0.83-1.13(m,12h)。
[2258]
31p-nmr(dmso-d6,162mhz)δ[ppm]:147,7,147,3,147,2,146,7。
[2259]
根据本说明书的化合物的一些实施例的化学结构在下表中说明；指示了与说明书和方案的对应，以及立体化学。表a和表b示出了用于寡核苷酸合成的吗啉代和二噁烷系列的非靶向亚磷酰胺核苷酸类似物的一些实施例；表c示出了一些用于寡核苷酸合成的靶向核苷酸类似物的一些实施例。
[2260]
作为核苷酸前体的亚磷酰胺缩写为“pre-l”，核苷酸类似物缩写为“l”，然后是核碱基和数字，其指定式(i)和(ii)中的基团y(参见表a和b)。为了区分两种立体化学，(2s,6r)-非对映异构体用另外的“a”指示，类似物(2r,6r)-非对映异构体用另外的“b”表示。靶向核苷酸前体和靶向核苷酸类似物(表c)的缩写如上所述，但用“lg”代替“l”。对于靶向类似物，立体异构体之间没有另外的区别。
[2261]
化合物表
[2262]
表a：吗啉系列中的式(i)的非靶向核苷酸类似物
[2263]
[2264]
[2265]
[2266]
[2267][2268]
表b：二噁烷系列中的式(i)的非靶向核苷酸类似物
[2269]
[2270]
[2271][2272]
表c：式(i)的靶向核苷酸类似物
[2273]
[2274][2275]
包含核苷酸类似物和靶核苷酸和类似物的sirna的合成
[2276]
寡核苷酸合成和sirna制备
[2277]
在abi 394合成仪上合成所有寡核苷酸。具有标准保护基团的可商购(sigma aldrich)dna-、rna-、2
’‑
ome-rna和2
’‑
脱氧-f-rna-亚磷酰胺如5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿嘧啶-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-叔丁基二甲基甲硅烷基-n4-胞苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-叔丁基二甲基甲硅烷基-n6-苯甲酰基-腺苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-叔丁基二甲基甲硅烷基-n2-异丁酰基-鸟苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基-三苯甲基-2
’‑
o-甲基-尿嘧啶-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-甲基-n4-胞苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-甲基-n6-苯甲酰基-腺苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
o-甲基-n2-异丁酰基-鸟苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
脱氧-氟-尿嘧啶-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
脱氧-氟-n4-胞苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺、5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
脱氧-氟-n6-苯甲酰基-腺苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺和5
’‑
o-二甲氧基三苯甲基-2
’‑
脱氧-氟-n2-异丁酰基-鸟苷-3
’‑
o-(n,n-二异丙基-2-氰基乙基)-亚磷酰胺以及相应的固体支持材料(cpg-负载量40μmol/g，chemgenes)用于自动化寡核苷酸合成。对于3’末端胆固醇缀合物，使用固体支持物3
’‑
胆固醇synbase
tm cpg1000(link technologies)32μmol/g。
[2278]
使用作为在乙腈中的0.1m溶液的亚磷酰胺构建块并且用5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1h-四唑(活化剂42，在乙腈中0.25m，sigma aldrich)活化。对于标准亚磷酰胺偶联使用200s的反应时间。在表a、b和c中列出的本文所述亚磷酰胺的情况下，应用300s的偶联时间。作为封端试剂，使用在thf中的乙酸酐(用于abi的capa，sigma aldrich)和在thf中的n-甲基咪唑(用于abi的capb，sigma aldrich)。作为氧化试剂，使用在thf/吡啶/水中的碘(0.02m；用于abi的氧化剂，sigma aldrich)。可替代地，用3-((n,n-二甲基-氨基亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ddtt)在吡啶/乙腈(1:1)中的0.05m溶液实现ps-氧化。使用在dcm中的二氯乙酸(dca deblock，sigma aldrich)进行dmt-保护基团的脱保护。用nh3(32％水溶液/乙醇，v/v 3:1)实现从固体支持物上的最终切割和脱保护(酰基-和氰基乙基-保护基团)。用nmp/net3/net3.3 hf(3:1.5:2)的处理应用于tbdms-脱保护。
[2279]
在通用接头-固体支持物(cpg-负载量39μmol/g，am chemicals llc)上合成本文所述吗啉代或二噁烷构建块在3’末端的寡核苷酸，并且相应的亚磷酰胺示出在表a、b和c中。
[2280]
通过hplc分析粗制产物并且通过离子交换或制备型hplc方法对单链进行纯化。
[2281]
离子交换：纯化器(thermo fisher scientific dnapac pa200半制备型离子交换柱，8μm颗粒，宽22mm x长250mm)。
[2282]
缓冲液a：1.50l h2o、2.107g naclo4、438mg edta、1,818g tris、540.54g脲，ph7.4。
[2283]
缓冲液b：1.50l h2o、105.34g naclo4、438mg edta、1.818g tris、540.54g脲，ph7.4。
[2284]
通过沉淀实现寡核苷酸的分离，通过添加4体积乙醇诱导并且储存在-20℃。
[2285]
制备型hplc：agilent 1100系列制备型hplc(watersbeh c18obd
tm
制备柱5μm，10mm x 100mm)。洗脱剂：在乙腈/水中的三乙基乙酸铵(0,1m)。冻干后，将产物溶解在1,0ml 2,5m nacl-溶液和4,0ml h2o中。沉淀后通过添加20ml乙醇并且在-20℃下储存18h，分离出相应的na
-盐。
[2286]
通过lc/ms-tof方法对单链进行最终分析。结果示出在表d1和d2中。
[2287]
对于双链形成，将等摩尔量的有义链和反义链在1 x pbs缓冲液中混合，并且加热至85℃持续10min，并且缓慢冷却至室温。通过lc/ms-tof方法对sirna-双链进行最终分析。结果示出在表e1和e2中。
[2288]
单链和双链寡核苷酸的分析数据
[2289]
来自单链寡核苷酸的分析数据可以在下表d1和d2中找到。
[2290]
表d1：有义链
[2291][2292]
[2293]
表d2：反义链
[2294]
[2295]
[2296][2297]
来自双链寡核苷酸的分析数据可以在下表e1和e2中找到。
[2298]
表e1：sirna
[2299]
[2300]
[2301]
[2302]
[2303]
[2304]
[2305][2306]
*)两个单链(有义链和反义链)实测值(参见表e2)。
[2307]
表e2
[2308][2309]
体外生物测定的材料和方法
[2310]
t
m-确定
[2311]
在分光光度计(jasco v-650)中将sirnas在pbs-缓冲液(1 x pbs)中的1.0μm溶液以1℃/min的加热速率从20℃加热到90℃。在260nm处测量吸收并且与相应的温度作图。达到90℃后，以1℃/min的相同速率将溶液冷却至20℃，并且重复加热冷却循环。解链温度计算为两个加热曲线拐点的平均值。
[2312]
细胞和组织培养
[2313]
基于改编自seglen,p.o.(1976):preparation of isolated rat liver cells；methods in cell biology,13:29-83的方案，在实验前新鲜分离来自雌性c57bl/6小鼠的原代肝细胞。在37℃、5％co2和95％rh下在补充有2mm谷氨酰胺(thermofisher，目录号25030)、100u/ml青霉素-链霉素(thermofisher，目录号15140)、1μg/ml地塞米松(sigma，目录号d1756)、1x its溶液(thermofisher，目录号41400)和5％fbs的williams的e培养基(thermofisher，目录号22551)中进行分离的肝细胞的铺板，持续3-5小时。铺板后，将培养基更换为除了补充1％fbs外与铺板培养基相同的培养基。在48或72小时的孵育时间段内不进行进一步的培养基更换。
[2314]
根据制造商的说明，从收集在包被有肝素钠的vacutainer管(bd,heidelberg germany)中的来自三名健康供体的大约16ml血液中分离出人外周血单核细胞(pbmc)。
[2315]
在37℃、5％co2和95％rh下生长人hep3b细胞，并且在补充有10％fbs的emem培养基(atcc，目录号30-2003)中培养。
[2316]
sirna转染
[2317]
对于人pbmc的转染，用在总体积150μl无血清rpmi培养基(thermofisher，目录号11875)中的每个96-孔(n＝2)0.3μl脂质体2000，在24小时内将100nm sirna反向转染到1x10
5 pbmc中。
[2318]
对于用原代小鼠肝细胞的敲低实验，在不进一步培养基更换的情况下在自由摄取条件下用10、1和0.1nm浓度的ttr sirna将在胶原-i包被的96孔板中的40,000个细胞/孔孵育72小时。如下所述进行ttr mrna表达分析(参见“mrna表达分析”)。
[2319]
ic
50
测量
[2320]
对于原代新鲜小鼠肝细胞的ic
50
测量，用使用10倍稀释阶梯的范围为从1μm至1pm浓度的sirna将在胶原-i包被的96孔板中的30,000个细胞在自由摄取条件下孵育48小时。通过应用biostat-speed统计计算工具计算每种sirna的半数最大抑制浓度(ic
50
)。根据
ratkovsky和reedy(1986,biometrics,第42卷:575-582)使用4参数逻辑模型获得结果。使用sas v9.1.3软件中的levenberg-marquardt算法通过非线性回归获得调整。
[2321]
mrna表达分析
[2322]
在sirna转染或自由sirna摄取后48小时，根据制造商的方案(包括程序中的脱氧核糖核酸酶步骤)通过使用promega的sv96总rna分离系统(目录号z3500)收获细胞rna。
[2323]
对于cdna合成，使用来自thermofisher的逆转录酶试剂盒(目录号n8080234)。使用1.2μl 10xrt缓冲液、2.64μl mgcl2(25mm)、2.4μl dntp(10mm)、0.6μl随机六聚物(50μm)、0.6μl寡聚(dt)16(50μm)、0.24μl核糖核酸酶抑制剂(20u/μl)和0.3μl multiscribe(50u/μl)(总体积为12μl)从30ng rna进行cdna合成。将样品在25℃下孵育10分钟并且在42℃下孵育60分钟。通过加热至95℃持续5分钟，使反应停止。
[2324]
通过qpcr使用thermofisher taqman universal pcr master mix(目录号4305719)和taqman基因表达测定mm00443267_m1对小鼠ttr mrna水平进行定量。在以下pcr条件下用abi prism 7900以技术复制进行pcr：在50℃下2分钟、在95℃下10分钟、40个95℃ 15秒和60℃1分钟的循环。将pcr设置为单一pcr，在一个反应中检测靶基因并且在第二个反应中检测用于归一化的管家基因(小鼠rpl37a)。pcr反应的最终体积为在1xpcr master mix中12.5μl，使用rpl37a引物，最终浓度为50nm并且探针为200nm。应用δδct方法计算靶转录物的相对表达水平。基于lv2非沉默sirna对照序列的水平通过归一化计算靶基因表达的百分比。
[2325]
ifnα确定
[2326]
人pbmc上清液中的ifnα蛋白浓度定量如下：应用基于mesoscale discovery的技术的自行建立的电化学发光测定并且使用泛ifnα单克隆捕获抗体(mt1/3/5，mabtech)，使用25μl细胞培养上清液测量ifnα浓度。可替代地，基于mesoscale的u-plex平台并且根据供应商的方案应用人ifnα2a同种型特异性测定(目录号k151vhk)。
[2327]
细胞毒性
[2328]
在用30,000个原代新鲜小鼠肝细胞在自由摄取条件下孵育后72小时，通过确定每个样品中细胞活力/毒性的比率来测量小鼠ttr sirna的细胞毒性。通过使用celltiter-glo测定(promega，目录号g7570)根据制造商的方案确定细胞内atp含量来测量细胞活力。使用ldh测定(sigma，目录号11644793001)根据制造商的方案，测量上清液中的细胞毒性。
[2329]
pmirglo双萤光素酶报告基因测定
[2330]
为了定量sirna种子区介导的脱靶，将经修饰的部分3’utr小鼠ttr序列(nm_013697)亚克隆到可商购的基于双萤光素酶报告基因的pmirglo筛选质粒(promega，目录号e1330)的多克隆位点中。四个接续的小鼠ttr sirna种子序列元件侧翼是天然小鼠ttr 3’utr序列的大约60个相应上游和下游核苷酸：
[2331]
tgagagactcagcccaggaggaccaggatcttgccaaagcagtagcatcccatttgtaccttttctcactagaacctctataaacttttctcactagaacctctataaacttttctcactagaacctctataaacttttctcactagaacctctataaaccgtgttagcagctcaggaagatgccgtgaagcattcttattaaaccacctgctatttcattcaaa[seq id no.2]
[2332]
tga＝nm_013697的终止密码子，ctctataa＝小鼠ttr sirna种子区
[2333]
将10μg pmirglo-ttr质粒在快速正向设置中瞬时转染18小时至400万个。在两个
t25烧瓶(greiner，目录号690175)中的hep3b细胞，使用fugene hd转染试剂(promega，目录号e2311)。第二天，在反向设置下，使用lipofectamine rnaimax进行在384孔板(greiner，目录号781098)中5000个质粒预转染的hep3b细胞/孔的100、10、1和0.1nm sirna转，并且将细胞培养72小时。使用dual-glo萤光素酶测定(promega，目录号e2940)通过同样由pmirglo质粒编码的测量归一化为组成型表达的海肾萤光素酶的水平的萤火虫萤光素酶水平来确定相对发光信号。基于lv2非沉默sirna对照序列的相对发光信号，通过归一化计算ttr基因敲低的百分比。
[2334]
实施例1：用根据本公开文本的经修饰sirna对靶基因表达的体内抑制
[2335]
表1a：具有lgt-和lt-突出端的有义链(5
’→3’
)
[2336][2337][2338]
表1b：反义链(5
’→3’
)
[2339][2340]
表1c：具有lgt-和lt-突出端的sirna
[2341]
sirna-#ss-#as-#标注sirna1-0ss1-0as1-0阴性对照sirna1-1ss1-1as1-1 sirna1-2ss1-2as1-1 sirna1-3ss1-3as1-1 sirna1-4ss1-4as1-1 [2342]
体外结果
[2343]
在原代小鼠肝细胞中化合物sirna1-1至sirna1-4的体外敲低结果总结在表1d中。
[2344]
表1d：在原代小鼠肝细胞中sirna的ic
50
数据
[2345]
sirna-#ic
50
(pm)imax(％)sirna1-14899.4sirna1-215100.3sirna1-310100.2
sirna1-46099.9
[2346]
所有测试的具有lgt构建块的sirna在自由摄取后都显示出在皮摩尔范围内的高体外效力。含有lgt3的靶向核苷酸类似物与含有lgt7的靶向核苷酸类似物之间的比较显示对于lgt7-类似物有益的ic
50
值(sirna1-1对比sirna1-2和sirna1-3)，而3’末端取代或5’末端取代之间无显著差异(sirna1-2对比sirna1-3)。sirna1-1与sirna1-4之间的比较显示，当额外lt4a-突出端附接在有义链的3’末端而没有任何额外硫代磷酸酯基团从而产生完全没有任何硫代磷酸酯稳定化的有义链时，体外效力没有显著差异。
[2347]
在ifnα和细胞毒性测定中测试所有具有lgt-或lgt-和lt-突出端的sirna(sirna1-0至sirna1-4)，并且未显示对免疫刺激或细胞活力的任何影响。
[2348]
体内实施例1.1：
[2349]
galnac-sirna缀合物的体内活性的证明，以及有和没有额外lt4a-突出端的不同galnac构建块对rna干扰活性的影响的比较。
[2350]
方法
[2351]
将c57bl/6n小鼠(雌性20-22g；charles river，德国)在n＝6的组中用单剂量5mg/kg的peg-galnac-sirna或pbs(模拟对照)进行皮下处理。施用的化合物的序列和化学组成列出在表1a至表1c中。在给药前和给药后抽取血液样品，如图1所指示。通过可商购的elisa测定(alpco diagnostics，目录号：41-palms-e01)从血清中定量靶向ttr的sirna。
[2352]
结果(参见图1)
[2353]
如图1中可见，与具有lgt3构建块的类似化合物相比(sirna1-3对比sirna1-1)，在有义链的5’末端附接三个lgt7构建块导致显著提高的作用持续时间。使用相同的靶向核苷酸(lgt7)，在5’末端附接三个构建块相对于在有义链的3’末端具有相同靶向部分的类似物sirna(sirna1-3对比sirna1-2)显示出明显益处。出人意料地，在有义链的5’末端的靶向核苷酸(lgt7)与在3’末端的非靶向核苷酸类似物(lt4a)的组合显示，与没有额外lt4a构建块的类似物硫代磷酸酯稳定的sirna相比(sirna1-4对比sirna1-1)，体内作用持续时间明显改善。
[2354]
这些结果清楚地显示，当用作galnac取代的核苷酸类似物(lgt)用于肝脏sirna靶向时，基于吗啉的核苷酸类似物在体内显示出有益的特性。
[2355]
体内实施例1.2：
[2356]
选自体内实施例1.1的化合物的剂量依赖性体内活性和急性毒性评估。
[2357]
方法
[2358]
动物研究
[2359]
将c57bl/6n小鼠(雌性20-22g；charles river，德国)在n＝6(对于0.5和2.5mg/kg)或n＝5(对于25mg/kg)的组中用单剂量0.5、2.5或25mg/kg的sirna或pbs(模拟对照)进行皮下处理。施用的化合物的序列和化学组成参考表1a至表1c。处理后48h取走动物，抽取血液用于血液学分析、临床化学，并且收获器官并且称重。在scil vet动物血液计数器上进行血液学血细胞计数，并且在roche cobas系统上进行临床化学分析。
[2360]
通过可商购的elisa测定(alpco diagnostics，目录号：41-palms-e01)从血清中定量靶向ttr的sirna。
[2361]
通过包括脱氧核糖核酸酶消化的总rna提取(rnaeasy mini kit，qiagen)处理肝
组织以进行rt-qpcr分析。在寡聚-dt和随机六聚物引发的cdna合成后通过在abi prism 7900系统上qpcr定量ttr(taqman测定id mm00443267_m1)和参考mrna(actb(taqman测定id 4352341e)、gapdh(taqman测定id 4308313))。应用δδct方法计算靶转录物的相对表达水平。
[2362]
对25mg/kg处理组( pbs)的右上肝叶、脾脏和肾脏进行福尔马林固定，并且在标准h&e染色后对异常物进行病理学评价。
[2363]
结果(参见图2和图3)
[2364]
在给药后48h，所有测试的活性sirna均以剂量依赖性方式降低了蛋白质水平和mrna水平两者。mrna和蛋白质的减少以平行的方式发生。在测试的活性物质中，在任何剂量下均未观察到蛋白质或mrna水平的显著差异。
[2365]
在标准血液学和肝脏/肾脏临床化学测定中未观察到处理剂量依赖性效应。此外，在结束时没有观察到显著的处理依赖性血清细胞因子改变和对器官或体重的影响。所有偏差均在正常生理范围或正常的动物间变异性内。肝脏和脾脏的组织病理学评价没有发现结果。
[2366]
实施例2：用根据本公开文本的经修饰sirna对靶基因表达的体内抑制
[2367]
表2a：具有lgt-和lt-末端的有义链(5
’→3’
)
[2368][2369]
表2b：具有内部lt构建块的反义链(5
’→3’
)
[2370][2371]
表2c：具有lgt-和lt-突出端的sirna
[2372]
[2373][2374]
在原代小鼠肝细胞中化合物sirna2-1至sirna2-17的体外敲低结果总结在表2d中：
[2375]
表2d：在0.1、1和10nm的sirna浓度下，小鼠原代肝细胞中ttr-mrna[％]的残留表达
[2376]
sirna-#0.1nm1nm10nmsirna2-198.961.31.7sirna2-2117.0113.257.1sirna2-3124.1113.260.9sirna2-4119.462.26.0sirna2-5119.795.111.1sirna2-6133.065.89.6sirna2-7125.186.120.2sirna2-8104.649.43.7sirna2-9113.292.914.6sirna2-1091.854.62.1sirna2-1198.843.41.5sirna2-12103.150.41.4sirna2-13113.536.11.6sirna2-14106.280.87.5sirna2-15100.140.81.6sirna2-16120.365.97.7sirna2-17112.169.28.9
[2377]
在10nm的浓度下，几乎所有化合物都显示出非常高的体外效力，几乎定量减少mrna。仅在反义链的位置2具有吗啉代类似物la4a的sirna2-2和sirna2-3显示出非常低的体外效力，剩余mrna为57,1％和60,9％。与10nm浓度相比，所有sirna在最低浓度0.1nm下均未降低mrna。最具差异性的浓度是1nm，其中sirna 2-2和sirna 2-3再次显示出最弱的抑制值。在位置4掺入lt4a构建块导致体外效力降低(sirna2-5)。在位置5、6和7掺入具有恰当核碱基的式i的构建块(sirna2-6、sirna2-8、sirna2-10、sirna2-11、sirna2-12和sirna2-13)导致高的体外效力，而在位置7具有错配核碱基的相应双链(sirna2-14)再次显示出减少的体外敲低。出人意料地，最有效力的化合物包括在吗啉代或二噁烷构建块(分别为la4b和la1b)处具有(2r,6r)-立体化学的sirna2-11和sirna2-13。在位置8，两种sirna(sirna2-16
和sirna2-17)均显示出与阳性对照sirna2-1相似的效力。
[2378]
对于所描述的具有序列内部的式i构建块的sirna，已经确定了相应的tm值，其总结在表2e中。
[2379]
表2e：sirna2-1至sirna2-17的tm值
[2380][2381][2382]
与对照sirna2-1(tm＝86.8℃)相比，经修饰的sirna显示出其解链温度降低，取决于反义链中掺入的经修饰核苷酸类似物的位置。如所预期，在位置2、3和4(sirna2-2至sirna2-5)的修饰仅显示tm的小幅降低，而在较高位置的修饰导致更明显的tm降低，在位置8的情况下降低极其高(sirna2-16和sirna2-17)，匹配的sirna2-16的tm降低13.3℃并且错配的类似物sirna2-17的tm降低15.6℃。
[2383]
出人意料地，对于在位置7具有吗啉代或二噁烷构建块的sirna，tm值存在显著差异，取决于掺入支架的手性。在吗啉代化合物的情况下，la4a-核苷酸的掺入导致tm值为77.5℃，降低了9.3℃(sirna2-10)，而在c-2处具有相反立体化学的类似物吗啉代化合物la4b的掺入导致84.7的tm值，这与对照sirna2-1相比仅小幅降低2.1℃(sirna2-11)。在类似物二噁烷对中进行相同观察。在位置7掺入la1a-核苷酸类似物导致tm显著降低至79.4℃(sirna2-12)，比对照sirna2-1低7.4℃。具有相反立体化学(la1b)的类似物修饰导致85.3℃的tm值，这再次仅略微降低1.5℃(sirna2-13)。在位置7含有式i的化合物的寡核苷酸双链的双链体稳定性似乎受到掺入的核苷酸类似物的c-2处立体化学的显著影响。含有具有(2s,6r)-立体化学的式i的核苷酸类似物的sirna显示出与其(2r,6r)-类似物相比更高的双链体去稳定化并且因此更低的tm值。
[2384]
表2f：转染到人hep3b细胞中并且用0.1、1、10和100nm sirna浓度处理的经ttr sirna种子序列修饰的pmirglo报告基因质粒的残留相对萤光素酶信号[％]。
[2385][2386][2387]
在双萤光素酶报告基因测定的给定设置下，亲本阳性对照sirna2-1在10和100nm sirna浓度下显示出与ttr-sirna序列最明显的结合。出人意料地，在反义链的位置2至7具有吗啉代和二噁烷构建块的化合物sirna2-2至sirna2-15(参见表2a和表2c)消除了这种潜在的脱靶结合。仅sirna2-16和sirna2-17的在位置8的修饰在10和100nm浓度下再次显示出一些影响，表明潜在的脱靶效应，但仍不如阳性对照sirna2-1明显。
[2388]
这些数据支持了在反义链中至少位置2至7使用式i的吗啉代或二噁烷构建块有潜力进一步改善sirna分子的特异性概况，视情况而定。
[2389]
体内结果
[2390]
描述：
[2391]
体内实施例2.1：
[2392]
表2c中列出的sirna-缀合物的体内活性的证明以及其rnai活性的比较
[2393]
方法
[2394]
将c57bl/6n小鼠(雌性20-22g；charles river，德国)在n＝6的组中用单剂量1mg/kg的sirna或pbs(模拟对照)进行皮下处理。施用的化合物的序列和化学组成列出在表2a至表2c中。在给药前和给药后抽取血液样品，如图4和图5所指示。通过可商购的elisa测定(alpco diagnostics，目录号：41-palms-e01)从血清中定量靶向ttr的sirna。
[2395]
结果(参见图4和图5)
[2396]
如从图4和图5可以推断，当与阳性对照sirna2-1相比时，在位置3、4、5、6和8具有式i化合物的(2s,6r)-吗啉代类似物的sirna显示出显著降低的体内效力。在反义链的位置7具有(2s,6r)-吗啉代-和(2s,6r)-二噁烷-支架的sirna2-10和sirna2-12以及它们的错配类似物sirna2-14和sirna2-15获得了类似结果。出人意料地，sirna2-11和sirna2-13显示出与阳性对照化合物sirna2-1可比的体内效力。与在位置7具有(2s,6r)-构型的构建块(分
别为la4a和la1a)的效力显著更低的对应物(sirna2-10和sirna2-12)相比，这两种sirna(sirna2-11和sirna2-13)的不同之处仅在于吗啉代或二噁烷构建块(分别为la4b和la1b)的c-2原子处的立体化学。将手性更改为(2r,6r)-系列导致吗啉代和二噁烷系列两者的体内效力均显著增加。
[2397]
体内实施例2.2：
[2398]
从体内实施例2.1选择的化合物的剂量依赖性体内活性和急性毒性评估
[2399]
方法
[2400]
动物研究
[2401]
将c57bl/6n小鼠(雌性20-22g；charles river，德国)在n＝6(对于0.5和2.5mg/kg)或n＝5(对于25mg/kg)的组中用单剂量0.5、2.5或25mg/kg的sirna或pbs(模拟对照)进行皮下处理。施用的化合物的序列和化学组成参考表2a至表2c。处理后48h取走动物，抽取血液用于血液学分析、临床化学，并且收获器官并且称重。在scil vet动物血液计数器上进行血液学血细胞计数，并且在roche cobas系统上进行临床化学分析。
[2402]
通过可商购的elisa测定(alpco diagnostics，目录号：41-palms-e01)从血清中定量靶向ttr的sirna。
[2403]
通过包括脱氧核糖核酸酶消化的总rna提取(rnaeasy mini kit，qiagen)处理肝组织以进行rt-qpcr分析。在寡聚-dt和随机六聚物引发的cdna合成后通过在abi prism 7900系统上qpcr定量ttr(taqman测定id mm00443267_m1)和参考mrna(actb(taqman测定id 4352341e)、gapdh(taqman测定id 4308313))。应用δδct方法计算靶转录物的相对表达水平。
[2404]
对25mpk处理组( pbs)的右上肝叶、脾脏和肾脏进行福尔马林固定，并且在标准h&e染色后对异常物进行病理学评价。
[2405]
结果(参见图6和图7)
[2406]
在给药后48h，所有测试的活性sirna均以剂量依赖性方式降低了蛋白质水平和mrna水平两者。mrna和蛋白质的减少以平行的方式发生。在测试的活性物质中，在任何剂量下均未观察到蛋白质或mrna水平的显著差异。
[2407]
在标准血液学和肝脏/肾脏临床化学测定中未观察到处理剂量依赖性效应。此外，在结束时没有观察到显著的处理依赖性血清细胞因子改变和对器官或体重的影响。所有偏差均在正常生理范围或正常的动物间变异性内。肝脏和脾脏的组织病理学评价没有发现结果。
[2408]
实施例3：用根据本公开文本的经修饰sirna对靶基因表达的体外抑制
[2409]
在已经在实施例1和2中使用的靶向ttr-mrna的sirna序列中，在有义链和反义链中，两条链均被基于吗啉代和二噁烷的核苷酸修饰。然后，在体外对均在反义链中显示出至少一个吗啉代或二噁烷构建块的所获得序列测试其在原代小鼠肝细胞中的mrna敲低，如以上指示的材料和方法的“sirna转染”和“mrna表达分析”部分中所述。有义链和反义链以及相应的sirna-寡核苷酸的序列列出在表3a、3b和3c中。
[2410]
在原代小鼠肝细胞中化合物sirna3-1至sirna3-120的体外敲低结果总结在表3d中。
[2411]
表3a：具有基于吗啉的lb4b-和基于二噁烷的lb1b-支架的有义链(5
’→3’
)
[2412]
[2413][2414]
表3b：具有基于吗啉的lb4b-和基于二噁烷的lb1b-支架的反义链(5
’→3’
)
[2415]
[2416]
[2417]
[2418][2419]
表3c：具有基于吗啉的lb4b-和基于二噁烷的lb1b-支架的sirna双链
[2420]
[2421]
[2422][2423]
[2424]
表3d：在0.1、1.0和10.0nm的sirna浓度下，小鼠原代肝细胞中ttr-mrna[％]的残留表达
[2425]
[2426]
[2427][2428]
*)来自6个敲低研究的平均值。
[2429]
**)设定为100％。
[2430]
***)来自3个敲低研究的平均值。
[2431]
n.a.＝不可用
[2432]
体外结果
[2433]
在0.1、1.0和10.0nm的应用浓度下，阳性对照化合物sirna2-1显示出分别为91.95％、52.40％和3.20％的残留表达，而具有ps稳定的有义链3
’‑
末端的第二个阳性对照sirna3-1(＝sirna1-3，实施例1)显示更高的体外效力，剩余ttr mrna为60.47％、20.78％和0.88％。sirna2-1和sirna3-1这两种化合物都显示出高的体内效力(参见实施例1和2)。因此，在两种阳性对照化合物范围内的体外敲低可以被认为对于有希望的体内结果而言是足够有效的。
[2434]
此处描述的sirna(sirna3-2至sirna3-120)显示出令人满意的敲低结果，其中很
多结果在阳性对照序列的范围内。
[2435]
当本文所述的新型核苷酸置于反义链的5’末端时，反义链中具有一个吗啉或二噁烷构建块的化合物系列sirna3-2至sirna3-22和sirna3-60至sirna3-80显示出良好至中等的效力。吗啉修饰的系列(sirna3-2、3-3、3-4和3-5)中在位置1、2、3和4的修饰以及在二噁烷类似物(sirna3-60和3-61)内位置1和2的修饰导致中等效力。有利地，这两个系列中的所有其他序列都显示出良好的体外敲低，以及还有在阳性对照范围内的一些(例如，sirna3-8、sirna3-9、sirna3-17、sirna3-70、sirna3-71或sirna3-77)也如此。
[2436]
除了位置7之外，反义链中还具有第二修饰核苷酸类似物的sirna(具有吗啉衍生的核苷酸的sirna3-23至sirna3-41以及具有相应二噁烷的sirna3-81和sirna3-100)在体外也显示出良好至中等的体外敲低。此系列中表现最好的化合物是sirna3-29、sirna3-30、sirna3-32、sirna3-36、sirna3-38、sirna3-39、sirna3-40和sirna3-41，它们显示出与阳性对照化合物相当的高效力。似乎除了修饰位置7之外，在反义链的3’末端的修饰优于相反的5’末端修饰。非常有趣的是，在类似物二噁烷系列(sirna3-81和sirna3-100)中，反义链中具有两个二噁烷构建块的几乎所有序列都显示出高效力。与吗啉系列类似，除了位置7之外仅5’末端修饰(sirna3-81、sirna3-82和sirna3-84)导致中等但令人满意的敲低效力。
[2437]
在有义链中和反义链的位置7具有修饰的第三修饰系列中实现了最佳效力。所有具有吗啉衍生的核苷酸(sirna3-42至sirna3-59)以及还有具有相应二噁烷构建块(sirna3-101至sirna3-120)的sirna均显示出在两种阳性对照序列范围内的高体外效力。
[2438]
总之，表3d中列出的结果表明，在sirna序列的杂交部分中掺入吗啉和二噁烷系列的(2r,6r)-构型新型核苷酸构建块在寡核苷酸双链的许多位置被良好耐受，并且导致高的体外敲低效力。
再多了解一些
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