一种仿生连续水解反应系统及其进行酶解的方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种仿生连续水解反应系统及其进行酶解的方法。


背景技术：

2.随着节能环保的概念的普及，针对天然可再生能源进行深入开发已成为行业趋势，尤其是天然可再生木材经过化学处理、机械法加工得到的木质纤维素，木质纤维素是一种无毒、无味、无污染和无放射性的有机絮状纤维物质，具有优良的柔韧性及分散性；木质纤维素不溶于水、弱酸和碱性溶液，ph值中性；木质纤维素比重小。木质纤维素主要由木质素、纤维素和半纤维素三组分构成，半纤维素连接着外侧的木质素和内侧的纤维素。纤维素和半纤维素等多糖可以被转化制备单糖，并用于生产燃料或化工原料，从而降低对不可再生资源的依赖和减少二氧化碳排放，对利用可再生资源和改善生态环境等具有十分重要的意义。
3.在现有的自然界中，白蚁是能够高效降解木质纤维素的昆虫之一，其主要借助于白蚁自身的结构，通过口器和砂囊将木质纤维素物理破碎成细小颗粒，并在唾腺分泌的漆酶的作用下对木质素进行初步降解，之后在中肠酶解消化非结晶纤维素及半纤维素，再进入后肠进行结晶纤维素的转化，同时，白蚁肠道表面存在绒毛、褶皱等微结构，能够增大肠道比表面积，并在一定程度上强化物质混合。但其中的分解酶是呈游离状态分布在白蚁体内，在消化过程中上一阶段的分解酶是会随着分解消化的进程不断流通至下一分解阶段，存在大量分解酶的消耗。
4.以及现有技术公开号为cn213681497u公开了一种木质纤维素连续化处理装置，包括依次连接的配料罐、调浆罐、加热盘管、闪蒸罐、反应管道、冷却罐、ph调节罐和固液分离罐。该装置一方面采用氨化、碱相结合的手段，其可实现温和条件下的木质纤维素连续化处理，且能耗低，预处理效果好。但其中采用的酶均为游离体系，在单次反应后无法实现酶的重复利用，生产成本较高，并且通过对原料的应用前需要通过酸、碱等化学方法进行预处理，对预处理设备要求高，并且酸碱试剂可能造成腐蚀，且预处理后会产生抑制物，不利于后续的酶解及发酵。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提出一种仿生连续水解反应系统及其进行酶解的方法，旨在解决现有技术中无法实现酶的重复利用的问题。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案是，一种仿生连续水解反应系统，其特征在于，该系统包括依次连接的进料装置、动力装置、仿生反应器和出料装置；
7.所述仿生反应器包括多个串联连接的酶反应段，每个酶反应段的腔体内壁间隔设置有若干凸起单元，以增加腔体单位反应面积、加速腔体内反应物的混合和提高酶解反应效率，并且在每个酶反应段的腔体内壁负载有多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层，在涂层的
外表面负载有酶催化层；每个酶反应段的外表面设置有保温层；
8.每个酶反应段均设置为能拆解结构，能拆解结构用以实现对酶反应段进行拆解，以便对酶反应段内部的酶催化层进行查看。
9.本发明采用聚乙烯亚胺辅助多巴胺共沉积构建功能化涂层，多巴胺可以在碱性条件下通过自聚合形成具有活性醌基的聚多巴胺涂层，可以与酶的氨基通过席夫碱反应共价结合。聚乙烯亚胺是具有丰富氨基的柔性间隔臂，可以与酶的羧基进行酰胺键结合。将含酶溶液通入具有共沉积涂层的微反应器，在室温条件下孵育，使酶固定到载体表面。
10.本发明反应底物连续流入仿生反应器，扩散至壁面与酶催化层吸附并发生催化反应，反应后的产物从酶催化层表面脱附，扩散回主体溶液并流入下一个酶反应段进行反应，以此类推，最终在出料装置进行产物收集。
11.根据本发明所述的仿生连续水解反应系统的优选方案，每个酶反应段均连接有采集装置，所述采集装置用于对酶反应段腔体内反应物进行采集，并将采集物输送给分析处理装置，所述分析处理装置与动力装置连接，所述分析处理装置对采集物的成分进行分析，以监控各酶反应段内部的催化反应情况，进而调控所述动力装置的输出功率。
12.根据本发明所述的仿生连续水解反应系统的优选方案，所述仿生反应器包括三个串联连接的酶反应段；与动力装置连接的酶反应段是漆酶反应段，与出料装置连接的酶反应段是纤维素酶反应段，连接在漆酶反应段与纤维素酶反应段之间的酶反应段为半纤维素酶反应段；所述漆酶反应段负载的酶催化层为漆酶催化层，所述半纤维素酶反应段负载的酶催化层为半纤维素酶催化层，所述纤维素酶反应段负载的酶催化层为纤维素酶催化层。
13.漆酶反应段可以对木质纤维素外侧的木质素进行降解与结构修饰，增加酶对木质纤维素中多糖部分的可及性。半纤维素酶反应段、纤维素酶反应段可以依次催化木质纤维素中的半纤维素及纤维素转化为可供后续发酵的木糖、葡萄糖等单糖。进而实现特定的酶对特定组分进行修饰或降解。
14.根据本发明所述的仿生连续水解反应系统的优选方案，所述仿生反应器还包括预热反应段，所述预热反应段位于所述漆酶反应段与半纤维素酶反应段之间。预热反应段用于将待处理物预热到一定的温度，以便后续的催化酶进行催化反应。
15.根据本发明所述的仿生连续水解反应系统的优选方案，所述多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积层是将一定浓度的多巴胺与聚乙烯亚胺的混合溶液以预设流速充满酶反应段内腔，然后在持续流通预设时间后，冲洗酶反应段，再对酶反应段干燥处理后制得。
16.根据本发明所述的仿生连续水解反应系统的优选方案，所述酶催化层是将含酶溶液通入具有多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积层的酶反应段内腔，在室温条件下孵育，之后用缓冲溶液冲洗反应段以去除未结合的酶，获得酶催化层。
17.此外，为实现上述目的，本发明还提出一种采用上述任一项所述的一种仿生连续水解反应系统进行酶解的方法，所述方法包括以下步骤：
18.将一定浓度的木质纤维素浆液加入至进料装置，所述木质纤维素浆液为木质纤维素颗粒与缓冲溶液的混合溶液；
19.启动动力装置，将所述进料装置中的木质纤维素浆液输送至仿生反应器的每个酶反应段，每个酶反应段负载的酶催化层对混合溶液进行相应的酶解反应；
20.根据木质纤维素浆液浓度、各个酶反应段的长度来确定在各个酶反应段的持续反
应时间，反应完成后通过出料装置对固液相产物进行收集。
21.优选地，所述木质纤维素浆液的浓度为5-50g/l，所述缓冲溶液的ph值为3～7的柠檬酸-柠檬酸钠混合溶液。
22.本发明所述的一种仿生连续水解反应系统及其进行酶解的方法的有益效果是：
23.通过负载在每个酶反应段内部的多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积层吸附不同的催化酶，进而实现对催化酶的固定，并且将负载有不同酶催化层的酶反应段依次串联，进而实现对木质纤维素的依次降解处理，以及避免催化酶的流动损失，使得负载的催化酶层可以重复使用，以及不需要增加分离装置对催化酶与产物进行分离处理，进而简化酶催化的工艺也降低了酶的成本投入，以及有效提升酶解反应效率；通过将每个酶反应段均设置为能拆解结构，用以实现对酶反应段进行拆解，以便对酶反应段内部的酶催化层进行查看。本发明可广泛应用于环保、化工以及能源等领域。
附图说明
24.图1为本发明一种仿生连续水解反应系统的结构示意图。
25.图2为具体实施例中酶反应段40分别采用漆酶反应段3、预热段4、半纤维素酶反应段5和纤维素酶反应段6的连接示意图。
26.图3a为酶反应段40内的结构示意简图。
27.图3b为在酶反应段40负载共沉积涂层50和酶催化层30的流程示意简图。
28.图4为纤维酶反应段6在不同温度下的酶催化层的活性保留程度的对比图。
29.图5为纤维酶反应段6在不同贮存时间下的酶催化层的活性保留程度的对比图。
30.图6为纤维酶反应段6在不同底物原料流速下的催化效果的对比图。
31.图7为固定化纤维素酶与游离纤维素酶催化反应的对比示意图。
32.图8为不同内腔结构的仿生反应器进行酶催化反应的降解效果的对比图。
33.附图标号说明：
34.标号名称标号名称1进料装置2动力装置3漆酶反应段4预热反应段5半纤维素酶反应段6纤维素酶反应段7两通接头8出料装置9仿生反应器10底物20产物30酶催化层40酶反应段50多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积层
具体实施方式
35.应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例1，参见图1至图2，一种仿生连续水解反应系统，该系统包括依次连接的进料装置1、动力装置2、仿生反应器9和出料装置8；
38.所述仿生反应器9包括多个串联连接的酶反应段40，每个酶反应段的腔体内壁间隔设置有若干凸起单元，所述凸起单元以增加腔体单位反应面积、加速腔体内反应物的混合和提高酶解反应效率，凸起单元可以是不同形状的环状结构相组合，所述环状结构包括矩形、半圆形、三角形等形状结构，采用多种形状的内腔结构设置加速了内腔中反应物的混合。
39.并且在每个酶反应段的腔体内壁负载有多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层，在涂层的外表面负载有酶催化层；每个酶反应段的外表面设置有保温层；保温层的设置使得每个酶反应段内保持适当的温度，
40.每个酶反应段均设置为能拆解结构，能拆解结构用以实现对酶反应段进行拆解，以便对酶反应段内部的酶催化层进行查看。同时，也可以适当的对腔体内壁存在缺失的酶催化层进行补充，进而方便及时的针对反应过程中存在的异常情况进行及时的处理。比如，每个酶反应段由带腔体的上、下两个半圆柱体构成，两个半圆柱体之间设置密封垫，并通过增加卡箍加强之间的固定效果，以增强每个酶反应段的密封效果。
41.每个酶反应段均连接有采集装置，所述采集装置用于对酶反应段腔体内反应物进行采集，并将采集物输送给分析处理装置，所述分析处理装置与动力装置2连接，所述分析处理装置对采集物的成分进行分析，以监控各酶反应段内部的催化反应情况，进而调控所述动力装置2的输出功率。
42.具体地，如图3a、3b所示，所述多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积层50是将一定浓度的多巴胺与聚乙烯亚胺的混合溶液以预设流速充满每个酶反应段，并在持续流通预设时间后，用去离子水冲洗每个酶反应段并在预设温度烘干后制得；然后在已负载有多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积层的酶反应段中持续通入目标酶溶液，在室温条件下孵育，进而使得酶催化层30负载在酶反应段对应的多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层50表面。之后用缓冲溶液冲洗反应段以去除未结合的酶。在具体实施例中，酶催化层30均匀负载在多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层50表面，比如采用酶催化层30呈预设厚度完全负载在多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层50表面；此外，酶催化层30还可以采用呈预设厚度，并间隔预设间距负载在多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层50表面，这种负载方式需要在进行负载制备的过程中，预先将预设间隔缝隙的薄膜贴附在腔体内壁上，并在负载完成后进行相应的拆除。
43.上述实现酶催化层30负载的原理是基于多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层具有的官能团可以和酶发生席夫碱反应或酰胺键结合，使酶共价结合到每个酶反应段的腔体内壁上，使得吸附在多巴胺与聚乙烯亚胺共沉积涂层50表面的酶催化层30具有更高的活性和酶负载量。
44.在具体实施例中，所述仿生反应器9包括三个串联连接的酶反应段40和预热反应段；与动力装置2连接的酶反应段是漆酶反应段3，与出料装置8连接的酶反应段是纤维素酶反应段6，连接在漆酶反应段3与纤维素酶反应段6之间的酶反应段为半纤维素酶反应段；所述预热反应段位于所述漆酶反应段与半纤维素酶反应段之间。相邻的反应段之间通过相应的两通接头7连接。所述漆酶反应段负载的酶催化层为漆酶催化层，所述半纤维素酶反应段负载的酶催化层为半纤维素酶催化层，所述纤维素酶反应段负载的酶催化层为纤维素酶催
化层。其中，漆酶反应段3长度范围为3～10m，半纤维素酶反应段5长度范围为6～20m，纤维素酶反应段6长度范围为6～20m。
45.在具体实施例中，针对木质纤维素进行分级降解，木质纤维素在应用前需要对木质纤维素预处理，一般地通过漆酶进行预处理，且漆酶催化并不需要设置预热处理，进而直接在室温下将木质纤维素进行漆酶催化处理，其中漆酶的催化处理是对木质素进行修饰与降解，减少木质素对后续酶的非生产性吸附，以及对木质纤维素的三维结构进行破坏，使内部的半纤维素与纤维素暴露出来，进而更有利于后续半纤维素酶及纤维素酶的催化处理。半纤维素酶反应段5用于继续催化经过漆酶反应段3催化后的产物；纤维素酶反应段6用于继续催化经过半纤维素酶反应段5催化后的产物，进而实现特定的酶对特定组分进行修饰或降解；因此，本实施例中最后在出料装置8中收集的液相产物以单糖为主。其中，所述动力装置2用于为整个仿生反应器9内部运行提供动力源，且可调节。
46.本实施例中具体酶催化反应机理为，底物10在酶反应单元40内腔流动，通过底物10与酶催化层30的充分接触实现了对底物10的催化处理，进而生成了相应的产物20，并且酶催化层30均是固定负载在各酶反应段40的腔体内壁，进而避免催化酶的流动损失，负载的催化酶是可以重复使用，以及不需要增加分离装置用于将催化酶与反应产物的进一步分离处理，进而简化了酶催化的工艺也降低了酶的成本投入。此外，本实施例中的酶解反应中的产物是持续不断的生成，以及在动力装置2的作用下生成的产物也在不断的流动，且随着反应底物不断的补充进而有利于加快酶解反应的反应速率，进而在一定程度上缩短酶解反应的时间。
47.实施例2，一种采用仿生连续水解反应系统进行酶解的方法，所述方法包括以下步骤：
48.步骤s20，将一定浓度的木质纤维素浆液加入至进料装置1，所述木质纤维素浆液为木质纤维素颗粒与缓冲溶液的混合溶液；
49.具体地，在本实施例中，所述木质纤维素浆液的浓度为5～50g/l，并且所采用的缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠混合溶液，通过柠檬酸和柠檬酸钠的配比来实现调配柠檬酸-柠檬酸钠混合溶液的ph值，一般地设置ph范围为3～7。
50.步骤s21，启动动力装置2，将所述进料装置1中的木质纤维素浆液输送至仿生反应器9，以使酶反应段40的每个酶反应段对应的不同酶催化层30进行相应的酶解反应；
51.步骤s22，根据木质纤维素浆液浓度、每个酶反应段的长度来确定在每个酶反应段的持续反应时间，并通过出料装置8对固液相产物进行收集。
52.具体地，所述动力装置2为压力泵，用于为整个催化反应中各底物10的流动提供动力，并且还可以根据实际的需求进行调控输出的功率，进而实现调控底物10流速的目的，即实现调控各底物10与酶催化层30在单位时间内的接触时间，进而实现调控催化反应；此外，还可以通过设置每个酶反应段为不同长度，进而实现调控每个酶反应段的持续反应时间，本实施例中的持续反应时间为4～16h。所述仿生反应器9包括多段孔径0.5～2mm的ptfe毛细管。
53.本实施例中通过采用一种仿生连续水解反应系统进行木质纤维素的降解，实现了对木质纤维素的依次降解处理，并且基于将催化酶固定设置在各酶反应段的内壁上，进而避免催化酶的流动损失，以及不需要进行催化酶与产物的进行分离处理，进而简化酶催化
的工艺也降低了酶的成本投入，提高了降解木质纤维素的效率以及负载的催化酶的重复使用率。
54.实施例3，以纤维素酶为例详细说明纤维酶反应段6的制备及应用。
55.步骤s31，材料选择；选取ptfe(聚四氟乙烯)毛细管，内径为600μm，长度为2m。
56.步骤s32，共沉积涂层的制备；
57.具体地，通过注射泵推动注射器以0.5ml/min依次通入去离子水和空气分别冲洗10min，将2mg/ml多巴胺与0.5mg/ml聚乙烯亚胺的混合溶液以0.5ml/min的流速充满毛细管，然后将混合溶液继续以0.5ml/h的流速连续通入毛细管6h，得到待处理的共沉积涂层。
58.步骤s33，共沉积涂层的干燥处理；
59.具体地，预先用去离子水以0.5ml/min冲洗毛细管10min，用空气吹干后在60℃下烘干1h。
60.步骤s34，纤维素酶的负载；
61.具体地，将含有1mg/ml纤维素酶的溶液(溶剂为ph＝5.0的柠檬酸缓冲溶液)通入毛细管，在室温条件下反应12h，之后用柠檬酸缓冲溶液以0.1ml/min冲洗毛细管30min以去除未结合的酶，获得纤维酶反应段6并在4℃保存备用，具体的制备方法的示意简图如图3。
62.上述制备方法得到共沉积涂层50上的纤维酶负载量为10.80mg/m2，相较于未添加聚乙烯亚胺的酶负载的情况，上述制备的纤维酶反应段6中酶负载量提升了27.8％。其原理是上述制备方法采用的是多巴胺和聚乙烯亚胺的混合溶液进行共沉积负载，并且采用连续流的方式，进而确保了负载过程中多巴胺和聚乙烯亚胺能够实时的补充，进而相应提升了共沉积涂层50中可结合纤维素酶的官能团的密度，实现了提升酶负载量的效果。此外，其他漆酶反应段3、半纤维素酶反应段5的制备原理基本与上述纤维酶反应段6的方式相同，仅加入的漆酶浓度、半纤维素酶浓度的差异。在具体的酶反应段制备中，在相同的酶流通量下，根据各酶反应段的内径大小，获得不同负载量的酶催化层；其中管径越小，负载在酶反应段的腔体内壁的比表面积越大，进而得到的酶反应段内部负载的酶催化层的酶载量越大。
63.为了详细说明本技术中的酶反应段的酶解效果，将实施例3中制备的纤维酶反应段6与对比例1比较在不同温度下的酶解效果，具体可见下述实施例4和对比例1。
64.实施例4
65.采用实施例3制备的纤维酶反应段6对羧甲基纤维素溶液进行酶解，包括：将1％(w/v)羧甲基纤维素溶液通入实施例3得到的纤维酶反应段6，在45～65℃反应3h，测定获得的葡萄糖产量，计算负载纤维素酶的酶活性。结果见图4。
66.对比例1
67.采用游离纤维素酶对羧甲基纤维素溶液进行酶解，包括：在相同底物浓度、酶浓度、反应温度、反应时间下测定游离纤维素酶的酶活性。
68.具体地，将最适温度下的酶活性设定为100％，其他温度下的酶活性除以最适温度下的酶活性定义为酶的活性保留程度，结果见图4。可见，本技术中制备的纤维酶反应段6在45～65℃范围内比游离纤维素酶具有更高的温度稳定性。
69.实施例5：通过活性保留程度来比较本技术中制备的纤维酶反应段6与游离纤维素酶的酶解反应情况。
70.将多个按实施例3的方法制备好的纤维酶反应段6与游离纤维素酶放在4℃环境中
贮存0～20天，期间每隔5天取出并通入1％(w/v)羧甲基纤维素溶液在最适温度下进行壁载纤维素酶和游离纤维素酶的酶活性测定。
71.其中，将贮存天数为0天时的初始酶活性设定为100％，其他贮存时间下的酶活性除以初始酶活性定义为酶的活性保留程度，结果见图5。可以看出，纤维酶反应段6在贮存20天后的活性保留程度是游离纤维素酶的1.7倍。
72.实施例6：通过底物原料的流速来确定纤维素酶酶解的效果。
73.将1％(w/v)羧甲基纤维素溶液通过注射泵以3～7μl/min通入按实施例1方法制备的纤维酶反应段6，在60℃下进行催化反应，测定葡萄糖浓度及葡萄糖生成速率。结果见图6。
74.可见，随着底物原料流速的增加，进而在纤维酶反应段6停留时间减少，造成葡萄糖浓度的下降。但由于流动增强了酶反应段的物质传递，造成葡萄糖生成速率增加。当流速超过4μl/min后，葡萄糖浓度急剧下降，葡萄糖生成速率增加并趋于平缓，因此，在本实施例中选定的1％(w/v)羧甲基纤维素溶液酶解的最佳流速为4μl/min，进而通过调控至最佳流速，可以很好的保留酶的活性，进而调高酶的利用效率，并有效的降低相应酶的投入量。
75.实施例7：将实施例3制备的纤维酶反应段6，从酶解生成的葡萄糖的角度验证本发明的固定化酶反应段的酶解反应与游离纤维素酶的酶解效果。
76.比较了游离酶和固定化酶的催化效果，在相同底物浓度和相同酶使用量下(0.072mg/ml)，针对内径为600μm的ptfe毛细管，进行酶解数据分析，具体如图7所示，在反应时间为4～8h过程中，游离纤维素酶的转化效果是高于固定化体系的转化率，其主要原因是由于固定化过程会损失一定酶活性，造成固定化体系的转化率略低于游离体系。但在反应时间超过8h时，游离酶所在批次反应体系随着产物浓度的增加而产生产物抑制，造成催化速率下降，转化率较低，同时固定化酶所在的连续流体系可以不断地排出产物以缓解产物抑制，造成其转化率上升。说明固定化纤维素酶具有良好的催化效果，并且可以实现重复利用。
77.实施例8：针对每个酶反应段的内腔结构的不同，进行不同结构的酶反应段的反应情况进行分析。
78.在相同的反应物酶解设置下，将反应物原料分别通入不同内腔结构的仿生反应器中，例如粘度范围在20.9～186.8mpa
·
s的羧甲基纤维素的酶解反应，其中仿生反应器9分别为内径600μm的圆形内腔和高度50μm、宽度20μm的矩形内腔结构，最终得到的反应效果如图8所示。可见，相较于表面平滑的微反应器，矩形表面结构的出口葡萄糖浓度的提升率均高于7.0％。其中所述矩形内腔的反应器的间距为2.5m。
79.需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个......”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者系统中还存在另外的相同要素。上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
80.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技
术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。