可提升2-KLG产量的L-山梨糖脱氢酶突变体

可提升2-klg产量的l-山梨糖脱氢酶突变体
技术领域
1.本发明涉及可提升2-klg产量的l-山梨糖脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。


背景技术：

2.维生素c，又称抗坏血酸，是人体必须的一种维生素。广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料领域。2-酮基-l-古龙酸(2-klg)是生产维生素c的直接前体物质。目前工业生产2-klg利用三菌两步发酵法。和一步发酵相比，三菌两步发酵法具有高能耗、高物耗、混菌发酵难以精确调控和育种困难等劣势。探索一步发酵生产2-klg成为了研究者的共同目标。由于从山梨醇生产2-klg只涉及3个酶的催化过程，分别为d-山梨醇脱氢酶、l-山梨糖脱氢酶和l-山梨酮脱氢酶。因此，目前研究者大多通过代谢工程进行一步菌的研究。主要方法是将2-klg合成途径中关键酶基因进行异源表达进行2-klg的生产，但效果并不能和工业化生产媲美。目前研究表明，l-山梨糖脱氢酶可能是2-klg生产过程中的关键限速酶。ncbi比对显示，l-山梨糖脱氢酶属于葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族。这类酶包含两个结构域，n末端结构域属于辅因子结合域，c末端结构域属于底物结合域。目前针对l-山梨糖脱氢酶改造的研究较少，对l-山梨糖脱氢酶进行有效的改造，有可能提升2-klg的生产强度。


技术实现要素：

3.发明人前期通过筛选获得了一株可以直接将d-山梨醇转化为2-酮基-l-古龙酸(2-klg)的氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)wsh-004，并鉴定了其中的l-山梨糖脱氢酶与l-山梨酮脱氢酶。本发明通过基因工程和酶工程的手段，制备出了可以提升2-klg产量的l-山梨糖脱氢酶突变体。
4.本发明提供了可以提升2-klg产量的l-山梨糖脱氢酶突变体，以来源于氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)wsh-004的l-山梨糖脱氢酶为出发序列，将第368位缬氨酸突变为半胱氨酸、亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
5.在一种实施方式中，所述出发序列的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(val)变成半胱氨酸(cys)，突变体命名为v368c，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(val)变成亮氨酸(leu)，突变体命名为v368l，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(val)变成丝氨酸(ser)，突变体命名为v368s，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
9.在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(val)变成苏氨酸(thr)，突变体命名为v368t，其氨基酸序列如seq id no.5所示。
10.本发明还提供了编码所述突变体的基因。
11.在一种实施方式中，编码突变体v368c的核苷酸序列是在seq id no.6的基础上将
第368位密码子由gug替换为ugc。
12.在一种实施方式中，编码突变体v368l的核苷酸序列是在seq id no.6的基础上将第368位密码子由gug替换为cuu。
13.在一种实施方式中，编码突变体v368s的核苷酸序列是在seq id no.6的基础上将第368位密码子由gug替换为ucg。
14.在一种实施方式中，编码突变体v368t的核苷酸序列是在seq id no.6的基础上将第368位密码子由gug替换为acc。
15.本发明还提供携带所述基因的重组质粒。
16.在一种实施方式中，所述重组质粒以pmd19为出发质粒。
17.本发明还提供表达所述l-山梨糖脱氢酶突变体或携带所述基因的微生物细胞。
18.在一种实施方式中，所述微生物细胞的宿主细胞为细菌或真菌细胞。
19.在一种实施方式中，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
20.在一种实施方式中，所述质粒为pmd19-t。
21.在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为宿主，以pmd19-t为表达载体，表达所述l-山梨糖脱氢酶、l-山梨糖脱氢酶突变体及2-klg合成途径中关键酶基因。
22.在一种实施方式中，以cspa启动子调控l-山梨糖脱氢酶基因和l-山梨酮脱氢酶基因的表达。
23.在一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌bl21(de3)为宿主。
24.本发明还提供了所述l-山梨糖脱氢酶突变体在生产2-酮基-l-古龙酸中的应用。
25.在一种实施方式中，所述应用是将表达所述l-山梨糖脱氢酶突变体的重组大肠杆菌在lb培养基中，于30～37℃，150～250rpm培养至od
600
＝3制备种子液，转接至山梨糖培养基中于30～37℃发酵。
26.本发明还提供了可生产2-klg的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表seq id no.2～5任一所示的l-山梨糖脱氢酶及l-山梨酮脱氢酶。
27.在一种实施方式中，所述l-山梨酮脱氢酶的基因如seq id no.7所示。
28.在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以bl21(de3)为宿主。
29.本发明还提供了所述微生物细胞或所述重组大肠杆菌在生产维生素c或其前体物方面的应用。
30.有益效果：
31.本发明以氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)wsh-004中l-山梨糖脱氢酶为目标，通过定点突变生物技术改造l-山梨糖脱氢酶氨基酸序列，最终获得4株酶活提升的l-山梨糖脱氢酶突变体v368c、v368l、v368s和v368t，通过对表达有l-山梨糖脱氢酶突变体的菌株进行发酵，使2-klg产量达到2.5g/l、3.1g/l、2.5g/l和3.0g/l，分别为表达野生型l-山梨糖脱氢酶菌株的1.1、1.4、1.1和1.3倍。
附图说明
32.图1为定点突变改造的l-山梨糖脱氢酶表达载体(pmd19-cspa-sndh-sdh)构建图。
33.图2为本发明一种实施方式中质粒pmd19-cspa-sndh-v368l的示意图。
34.图3为高效液相色谱检测不同菌株发酵产2-klg图。
35.图4为不同菌株产2-klg的比较图。
具体实施方式
36.1、培养基及试剂：
37.lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。配制固体培养基还需加入18g/l琼脂粉。
38.山梨醇培养基：酵母粉10g/l，山梨醇50g/l。加入18g/l琼脂粉，以配制山梨醇固体培养基。
39.山梨糖培养基：山梨糖10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。
40.2、l-山梨糖脱氢酶的基因克隆：
41.将gluconobacter oxydans wsh-004(cctcc m 2019481，菌株公开于论文《high-throughput screening of a 2-keto-l-gulonic acid-producing gluconobacter oxydans strain based on related dehydrogenases》)接种于山梨醇培养基培养。收集菌体，利用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组，利用pcr扩增l-山梨糖脱氢酶，扩增引物包含连接质粒时所需要的同源臂序列。pcr均使用2
×
phanta max master mix(购自南京诺唯赞公司)。pcr产物回收使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
42.3、l-山梨糖脱氢酶质粒构建与基因的表达：
43.1)利用pcr扩增载体，使载体线性化，并使之带有可以与扩增后的l-山梨糖脱氢酶基因互补的同源臂序列。
44.2)利用infusion-cloning试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将线性化载体和l-山梨糖脱氢酶进行无缝连接，构建完整的质粒。
45.3)将构建好的质粒转入目标感受态，并涂布至含有相应抗生素的平板上，挑选阳性克隆子进行测序。
46.4、对表达有l-山梨糖脱氢酶及其突变体质粒的菌株及进行发酵：
47.1)将正确单菌落接种于lb培养基中，过夜培养，制备种子液。
48.2)将种子液接种以5％接种量接种与山梨糖培养基中，发酵培养72小时后，对发酵液进行收集。
49.3)将收集的发酵液12000
×
g离心3分钟，收集上清用于检测2-klg产量。
50.5、利用高效液相色谱检测发酵液中2-klg的产量：使用高效液相色谱进行测定。高效液相色谱检测条件：色谱柱：aminex hpx-87h柱(300mm
×
7.8mm；bio-rad，hercules，ca)；柱温：40℃；流动相：5mm h2so4；流速：0.5ml/min，使用视差检测器检测。
51.l-山梨糖脱氢酶及其突变体的酶活测定采用可控温、可实时监测吸光度的分光光度计，用光程1.0cm的比色皿，反应体系如下：底物25mm，吩嗪硫酸甲酯(pms)2.5mm，2,6-二氯靛酚钠(dcip)0.5mm，酶终浓度0.04g/l，缓冲液为ph7.0的50mm的tris-hcl。单位酶活(u)定义为在37℃和ph 7.0条件下，1min内还原1μmol dcip所需的酶量。
52.实施例1：野生型l-山梨糖脱氢酶基因克隆、质粒的构建及表达
53.(1)l-山梨糖脱氢酶表达载体的构建：
54.从保藏的甘油管中，将gluconobacter oxydans wsh-004接种于山梨醇培养基中，
37℃，220rpm培养48h，4000rpm离心，并收集菌体，提取gluconobacter oxydans wsh-004基因组，利用引物对f1/r1进行l-山梨糖脱氢酶基因(基因序列见seq id no.6)的扩增。并回收pcr产物。引物对f1/r1如下：
55.f1：ggatttcgtaatgacgagcggttttgattacatcgttgtcg；
56.r1：atctgcagaattctcaggcgttcccctgaatgaaatccgc。
57.使用引物对f2/r2对生产2-klg关键基因l-山梨酮脱氢酶(基因序列见seq id no.7)进行扩增，并回收pcr产物。引物对f2/r2如下：
58.f2：aaaggtaatacactatgaatgttgtctcaaagactgtatctttaccg；
59.r2：aaaccgctcgtcattacgaaatccagtgcgaacgtttg。
60.使用引物对f3/r3对携带cspa启动子(seq id no.8)的pmd19质粒(pmd19-cspa)进行线性化扩增，(质粒公开于《high throughput screening platform for a fad-dependent l-sorbose dehydrogenase》)中，并回收pcr产物。引物对f3/r3如下：
61.f3：ggggaacgcctgagaattctgcagatatccatcacactgg；
62.r3：caacattcatagtgtattacctttaataattaagtgtgcctttcgg。
63.pcr反应体系均为：25μl 2
×
phanta max master mix，1μl正向引物(10μmol
·
l-1
)，1μl反向引物(10μmol
·
l-1
)，1μl模板dna，加入蒸馏水至50μl。l-山梨糖脱氢酶与l-山梨酮脱氢酶pcr扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入30个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，4℃保温。pmd19-cspa线性化载体pcr扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入25个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
64.将40ng l-山梨糖脱氢酶和40ng l-山梨酮脱氢酶的pcr产物和20ng pmd19-cspa线性化载体混合，利用infusion-cloning试剂盒进行连接，构建质粒pmd19-cspa-sndh-sdh(图1)。将10μl pmd19-cspa-sndh-sdh连接产物转入大肠杆菌bl21(de3)感受态中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入1ml lb培养基，37℃，220rpm培养45min，3000rpm离心3min，去掉上清，将菌体重悬于100μl lb培养基中，涂布在含有100mg/l氨苄青霉素的lb平板中，培养过夜。次日，挑选阳性克隆进行测序，验证质粒的是否正确。将测序正确的菌株命名为wt。
65.(2)l-山梨糖脱氢酶的表达：
66.将测序正确的克隆子转移至含有100mg/l氨苄青霉素的10ml lb中培养，培养过夜至od
600
＝3，制备种子液。将培养好的种子液以5％转接至含有100mg/l氨苄青霉素的25ml山梨糖培养基中(接种后的od
600
＝0.153)，于30℃下培养72小时，收集发酵液进行产物产量检测。
67.实施例2：l-山梨糖脱氢酶突变体的制备
68.(1)单突变的制备
69.根据实施例1构建的pmd19-cspa-sndh-sdh质粒序列，分别设计并合成引入v368c、v368l、v368s和v368t突变的引物，对l-山梨糖脱氢酶的基因序列进行定点突变，并分别测序确认l-山梨糖脱氢酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌bl21(de3)中进行发酵。
70.定点突变体编码基因的pcr扩增：利用pcr技术，以携带编码野生型l-山梨糖脱氢
酶基因的表达载体pmd19-cspa-sndh-sdh质粒为模板，扩增携带突变体基因的重组质粒。
71.引入v368c突变的定点突变引物对f4/r4为：
72.f4：gaggctgggtgcacgtccgttcccaagggagcg(下划线标注突变碱基)
73.r4：tgggaacggacgtgcacccagcctcagccccagc(下划线标注突变碱基)
74.引入v368l突变的定点突变引物对f5/r5为：
75.f5：gaggctgggcttacgtccgttcccaagggagcg(下划线标注突变碱基)
76.r5：tgggaacggacgtaagcccagcctcagccccagc(下划线标注突变碱基)
77.引入v368s突变的定点突变引物对f6/r6为：
78.f6：gaggctgggtcgacgtccgttcccaagggagcg(下划线标注突变碱基)
79.r6：tgggaacggacgtcgacccagcctcagccccagc(下划线标注突变碱基)
80.引入v368t突变的定点突变引物对为f7/r7：
81.f7：gaggctgggaccacgtccgttcccaagggagcg(下划线标注突变碱基)
82.r7：tgggaacggacgtggtcccagcctcagccccagc(下划线标注突变碱基)
83.pcr体系同实施例1。突变体质粒pcr扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入25个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸5min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
84.(2)突变体的表达与验证
85.按照实施例1步骤(1)的方法进行l-山梨糖脱氢酶突变体的验证。将表达含有v368c突变体的菌株命名为m1，将表达含有v368l突变体(质粒图谱见图2)的菌株命名为m2，将表达含有v368s突变体的菌株命名为m3，将表达含有v368t突变体的菌株命名为m4。将重组菌株在tb培养基中，于37℃条件下培养至od
600
＝0.8，降温至20℃，并添加终浓度为0.5mm/l的iptg(异丙基硫代半乳糖苷)继续培养20小时，离心收集菌体，破碎细胞后在37℃和ph 7.0条件下对酶进行纯化，在体外对纯化后的野生型酶和突变体进行酶活测试，结果显示，wt的比酶活为5400
±
400u/mg，v368c、v368l、v368s和v368t的比酶活分别是wt的1.43、1.83、1.39、1.74倍。
86.实施例3：l-山梨糖脱氢酶及其突变体发酵用于生产2-klg
87.将实施例1和实施例2中构建的菌株(wt、m1、m2、m3和m4)分别接种至添加有100mg/l氨苄青霉素的lb中，于37℃，220rpm条件下培养过夜，至od
600
＝3，制备种子液。次日，将种子液以5％接种于山梨糖培养基中于30℃发酵72小时，收集发酵液，于12000
×
g离心3分钟，弃掉沉淀，收集上清，用于检测2-klg产量。
88.使用高效液相色谱的视差检测器进行发酵液中2-klg产量测定。使用5mm h2so4作为流动相，流速为0.5ml/min，aminex hpx-87h色谱柱(300mm
×
7.8mm；bio-rad，hercules，ca)，柱温为40℃进行检测，检测结果见图3。结果显示，m1、m2、m3和m4发酵72小时后2-klg的产量达2.5g/l、3.1g/l、2.5g/l和3.0g/l(od
600
达3.733、3.796、3.859和3.805)，2-klg产量分别为wt(2-klg产量为2.2g/l，od
600
达3.799)的1.1、1.4、1.1和1.3倍(图4)。
89.对比例1：
90.按照实施例2相同策略设计引物，分别构建突变体v368d、v368e、v368f、v368g、v368k、v368m、v368p、v368q、v368r、v368w、和v368y。按照实施例2的方法制备和表达突变体，并按照实施例3的方法进行发酵、检测。结果如表1所示。
91.表1不同单突变体的2-klg产量
92.突变体2-klg(g/l)v368d2.06297v368e0.85952v368f2.067019v368g0.677537v368k2.006918v368m2.175933v368p1.803614v368q0.700799v368r1.535407v368w2.18846v368y1.811543
93.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。