一种抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.白色念珠菌(candida albicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人、艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔、女性阴道等，引起鹅口疮、阴道炎等，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏、脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡。
3.近年来白色念珠菌感染有明显增高的趋势，念珠菌引起的感染在血源性感染中位居第4位，在导管相关性感染中居第3位，即便使用了抗真菌药物，其死亡率仍高达40％。系统性的念珠菌感染并没有典型的临床症状，而目前念珠菌感染缺乏特异的早期诊断手段。
4.目前念珠菌感染检测的金标准是血培养，然而该病的病情发展很快，传统培养的方法阳性检出低、培养周期长，往往造成漏诊、误诊，导致贻误病情。因此开发一种特异性强的可用于念珠菌检测的抗体具有重要意义。
5.单克隆抗体是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏b细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为b细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
6.cn105866409a公开了一种念珠菌甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒，包括mn包被的酶标板和抗mn多克隆酶标抗体。所述试剂盒通过将mn包被在酶标板上，将待检样本或标准抗原与包被抗原竞争结合有限的抗体结合位点，再经辣根过氧化物酶与底物发生显色反应，根据mn标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算待检抗原的浓度值。所述测试剂盒具有较好的敏感性和特异性，操作简便易行，检测快速灵敏。但是由于多克隆抗体可检测蛋白上的一系列表位，因此与单克隆抗体相比，它们批间变异的风险更高。
7.目前，使用最广泛的单克隆抗体是鼠源单克隆抗体，但鼠源单克隆抗体存在亲和力弱、特异性差的问题。兔单克隆抗体技术近些年发展迅速，与鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有识别更多位点、更强的亲和性和特异性。
8.免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分析技术(enzyme-linked immunosorbant assay，elisa)、免疫荧光检测技术、化学发光免疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中化学发光免疫分析技术具有操作简单、灵敏度高、检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。
9.性能优良的抗体是免疫检测技术的基础，只有具有好的抗体，才能研发出性能优良的免疫检测试剂盒。因此，提供一种识别更多位点、更强的亲和性和特异性的抗念珠菌甘
露聚糖单克隆抗体在念珠菌检测中具有重要意义。


技术实现要素：

10.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体及其应用。所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体为兔源单克隆抗体，具有抗原识别位点多、特异性好、亲和力高的特点，解决了鼠源单克隆抗体在实际应用方面的问题，为念珠菌检测、诊断、预防和治疗提供了新的方案。
11.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
12.第一方面，本发明提供一种抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体，所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
13.所述重链可变区包括seq id no.3所示的重链cdr3；
14.所述轻链可变区包括seq id no.6所示的轻链cdr3。
15.优选地，所述重链可变区还包括seq id no.1所示的重链cdr1和seq id no.2所示的重链cdr2。
16.优选地，所述轻链可变区还包括seq id no.4所示的轻链cdr1和seq id no.5所示的轻链cdr2。
17.seq id no.1：sgydmc。
18.seq id no.2：csgnsgntyyaswakg。
19.seq id no.3：gildtgwtrldl。
20.seq id no.4：qasksvantdla。
21.seq id no.5：gasnlas。
22.seq id no.6：lggysggsdna。
23.本发明中所述单克隆抗体抗的原识别位点多、特异性好、亲和力高；所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，抗原识别位点多；所述单克隆抗体不与其他糖(包括荚膜多糖、半乳甘露聚糖、脂多糖、肽聚糖、1,3-β-d-葡聚糖和bsa)产生交叉反应，特异性强；筛选的单克隆抗体对mn抗原具有较强的结合能力，亲和力高，对mn抗原的效价达到1:1280000(od值＞0.5)。
24.优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括seq id no.7所示的序列。
25.优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列。
26.seq id no.7：
27.metglrwlllvavlkgvqcqsleesggglvkpgasltltckasgfsfssgydmcwvrqapgkglewiacsgnsgntyyaswakgqftisktsttvtlqmtsltaadtatyfcargildtgwtrldlwgqgtlvtvss。
28.seq id no.8：
29.mdtraptqllgllllwlpgatfaavltqtpspvsaavggtvsincqasksvantdlawyqqkpgqrpklliygasnlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdvqcadaatyyclggysggsdnafgggtevvvk。
30.优选地，所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体还包括兔源igg1、igg2、igg3或igg4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为兔源igg1恒定区。
31.本发明以新西兰大耳兔为实验动物，制备单克隆抗体，克服了小鼠源抗体亲和力弱的缺陷；以念珠菌甘露聚糖作为抗原进行免疫，得到的脾脏细胞通过与骨髓瘤细胞进行
细胞融合得到兔源单克隆抗体，稳定性好，对念珠菌甘露聚糖具有很强的亲和性。本发明所述单克隆抗体特异性好，与甘露聚糖具有强亲和性，但是不与半乳甘露聚糖、荚膜多糖、脂多糖等其他糖类产生交叉反应，可潜在地应用于念珠菌的抗原检测、念珠菌感染临床样本的检测与鉴定等。
32.第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体。
33.优选地，编码所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列包括seq id no.9所示的序列，编码所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括seq id no.10所示的序列。
34.seq id no.9：
35.atggagactgggctgcgctggcttctcctggtcgctgtgctcaaaggtgtccagtgtcagtcattagaggagtccgggggaggcctggtcaagcctggggcatccctgacactcacctgcaaagcctctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgctgggtccgccaggctccagggaagggactagagtggatcgcatgttctggtaatagtggtaacacttactacgcgagctgggcgaaaggccaattcaccatctccaaaacctcgaccacggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatttctgtgcgagaggtattcttgatactggttggactcggttggatctctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctca。
36.seq id no.10：
37.atggacacgagggcccccactcagctgctggggctcctgctgctctggctcccaggtgccacatttgccgccgtgctgacccagactccatctcccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcagcatcaattgccaggccagtaagagtgttgctaataccgacttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcgtcccaagctcctgatctatggtgcatccaatctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgccgatgctgccacttactactgtctaggcggttatagtggtggtagtgataatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa。
38.第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
39.第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的第三方面所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
40.优选地，所述宿主细胞包括293f细胞或cho细胞。
41.第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体。
42.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中任意一种或至少两种的组合。
43.第六方面，本发明提供一种检测念珠菌的试剂盒，所述检测念珠菌的试剂盒包括第一方面所述的抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体。
44.优选地，所述检测念珠菌的试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、抗体稀释液、显色液、终止液、封闭液或洗涤液中任意一种或至少两种的组合。
45.第七方面，本发明提供第一方面所述的抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备念珠菌感染疾病治疗药物和/或检测产品
中的应用。
46.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
47.本发明中所述单克隆抗体抗的原识别位点多、特异性好、亲和力高；所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，抗原识别位点多；单克隆抗体不与其他糖(包括荚膜多糖、半乳甘露聚糖、脂多糖、肽聚糖、1,3-β-d-葡聚糖和bsa)产生交叉反应，特异性强；筛选的单克隆抗体对mn抗原具有较强的结合能力，亲和力高，对mn抗原的效价达到1:1280000(od值＞0.5)。
附图说明
48.图1为实施例6中单克隆抗体的sds-page电泳结果图。
49.图2为实施例7中单克隆抗体的亲和活性的检测结果。
50.图3为实施例8中交叉反应的结果。
具体实施方式
51.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
52.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
53.实施例1抗原制备
54.念珠菌甘露聚糖抗原(mn)的制备方法如下所示：
55.(1)念珠菌的菌体培养及念珠菌甘露聚糖粗提
56.将念珠菌接种于沙氏液体培养基(每升培养基含1％蛋白胨、4％d-葡萄糖)中，在30℃摇床于200rpm培养42h左右，当培养液的ph值降至4.2-4.5时停止培养；将所得培养液经80℃鼓风干燥箱灭活2h，离心收集菌体，使用生理盐水清洗收集的菌体；使用柠檬酸钠溶液重悬菌体，在121℃高压灭菌90min，重复两次。
57.4℃、16000g离心15min收集上清液，并进行醇沉，收集沉淀；用去离子水复溶沉淀，并进行ctab处理；4℃、16000g离心15min收集上清，并调整上清液ph至8.8，有沉淀析出；4℃、16000g离心15min收集沉淀，并使用冰乙酸复溶，复溶液进行醇沉，收集沉淀，沉淀即为粗提的念珠菌甘露聚糖(mn)，去离子水复溶，透析，透析产物经0.22μm滤膜过滤，所得产物即为粗提念珠菌甘露聚糖产物。
58.(2)对所得念珠菌甘露聚糖粗提物进一步纯化，纯化的步骤如下所示：
59.念珠菌甘露聚糖粗提物
→
ge高通量分离
→
凝胶排阻装置优化
→
梯度洗脱
→
组分阶段搜集
→
截留液
→
透析脱盐
→
糖浓度测定
→
浓缩
→
糖浓度测定
→
纯度测定
→
得到念珠菌甘露聚糖抗原纯品。
60.实施例2动物免疫
61.将mn抗原与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔的免疫剂量控制在0.1-0.8mg。免疫前3天取新西兰大耳兔的耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。共免疫6次。
62.挑选适龄，重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房中饲养3天，如无
异常情况则开始进行免疫。取上述制备的mn抗原30μg，加入到0.5ml高压灭菌后的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀。然后将其与0.5ml弗氏完全佐剂用注射器相互推拉，充分乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫。
63.两周后取mn抗原30μg，加入到0.5ml灭菌后的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，然后与0.5ml弗氏不完全佐剂用注射器相互推拉，充分乳化，进行加强免疫。此后每隔一周进行一次加强免疫，共免疫六次。并且从第三次免疫开始，免疫一周后取新西兰大耳白兔耳缘静脉血200-500μl，测定其效价及亲和性。在最后一次免疫之后取脾。
64.具体免疫步骤如下：
65.(1)第一周：初次免疫，将mn抗原使用生理盐水稀释为1mg/ml，与弗氏完全佐剂1:l充分乳化，将两种溶液分别装入两个注射器中，不要产生气泡，将两个注射器对接，由慢到快逐渐混合抗原稀释液与佐剂，最终将混合液制成乳白色油包水乳浊液，然后进行背部皮下多点免疫，剂量为每只l ml。
66.(2)第三周：加强免疫，将mn抗原使用生理盐水稀释为0.5mg/ml与弗氏不完全佐剂1:1充分乳化，免疫剂量为每只1ml。
67.(3)第五周：加强免疫，免疫方式与第三周相同，免疫剂量为每只1ml。
68.(4)第六周：第一次血清效价检测。取免疫后的新西兰大耳兔的耳缘静脉血200-500μl，静置30min后离心分离血清，测定抗血清效价。
69.(5)第七周：加强免疫，免疫方式同步骤(3)。
70.(6)第八周：第二次血清效价检测，同步骤(4)。
71.(7)第九周：加强免疫，免疫方式同步骤(3)。
72.(8)第十周：第三次血清效价检测，同步骤(4)。
73.(9)第十一周：加强免疫，免疫方式同步骤(3)。
74.抗血清效价测定方法：
75.以mn抗原作为包被抗原，包被浓度为100ng/well，37℃包被2h，然后加入3％bsa配制的封闭液，在37℃温育1h，甩掉液体，烘干备用。然后把制备的抗体血清进行梯度稀释，加入到酶标板中，每孔加入100μl，37℃温育1h，然后用pbst洗涤三次，每次静置3min，然后以hrp标记的羊抗兔igg作为酶标抗体，1:5000稀释，每孔加入100μl，37℃温育1h，然后用pbst洗涤三次，每次静置40s。每孔加入100μl tmb，37℃温育显色15min，然后每孔加入50μl终止液结束反应，于酶标仪检测od
450
值。
76.实施例3兔单抗制备
77.对制备的兔抗血清进行效价检测，效价合格的情况下，使用合格的新西兰大耳兔的脾脏分别进行细胞融合，制备单克隆杂交瘤细胞株，具体制备方法如下所示：
78.(1)制备免疫脾细胞
79.将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取脾脏。用细胞培养液洗1次后研碎，过不锈钢筛网，用细胞培养液洗2次，离心得到细胞。
80.(2)细胞融合
81.取对数期的sp2/0骨髓瘤细胞，与得到的脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液后37℃恒温90s左右，用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20％胎牛血清的hat选择培养液重悬，将细胞加到96孔板内，
放入细胞培养箱内培养。培养温度为37℃，co2含量为5.0％。
82.(3)细胞单克隆化与筛选
83.将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1-3个细胞/ml，加入到96孔板内，放入细胞培养箱内培养。培养温度为37℃，co2含量为5.0％。对每个细胞株分别编号，选取培养液上清呈阳性的细胞株扩大培养。最终得到杂交瘤细胞株。
84.(4)筛选杂交瘤细胞
85.对所获得的杂交瘤细胞通过elisa方法使用进行筛选，寻找到最多10孔针对念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗体细胞株，细胞株能产生针对各自抗原高亲和力的特异性单克隆抗体。
86.细胞融合步骤之后，培养基里存在两种亲本细胞和三种随机融合的细胞，要想得到能分泌目的抗体的杂交瘤细胞株，就必须把成功融合的杂交瘤细胞从众多细胞中分离出来。b淋巴细胞不能在体外长期生存，需要除去的只有骨髓瘤细胞和其自身融合细胞，因此需要将融合后的细胞通过hat培养基培养，选择性的保留杂交瘤细胞。
87.融合后第5天可观察细胞的生长情况，第10-14天，即可采用间接elisa法检测细胞培养上清并筛选阳性杂交瘤细胞株，进行克隆化培养。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。将检测结果效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大化至细胞阳性率达100％时定株。用elisa测量定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价，将其扩大化培养的单克隆杂交瘤细胞株冻存于液氮中。
88.对杂交瘤细胞上清液进行特异性和亲和力测试，并从中挑选适合配对的杂交瘤细胞，对挑选出的四孔多克隆杂交瘤细胞株进行重组表达得到单克隆抗体，对使用得到的纯化抗体进行夹心法配对，建立念珠菌甘露聚糖抗原的夹心法检测体系，最终分别得到配对最好的单克隆抗体。
89.实施例4兔单抗序列测定
90.(1)从杂交瘤细胞中分离总rna
91.将杂交瘤细胞匀浆化后，加入trizol，匀浆物可分成透明的上层水相层(含有rna)、相界面和红色的下层有机层(含有dna和蛋白质)。然后用异丙醇从水相层中沉淀出rna。用乙醇从有机层中沉淀出dna。利用异丙醇沉淀从酚-乙醇上清液中沉淀出蛋白质。洗涤沉淀的rna，去除杂质，重悬浮后备用。
92.(2)将总rna逆转录成cdna
93.以dntp为底物，以rna为模板，trna为引物，在trna3
’‑
末端上，按5
’→3’
方向，合成一条与rna模板互补的cdna单链，它与rna模板形成rna-cdna杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉rna链，再以cdna为模板合成第二条dna链。至此，将总rna逆转录成cdna。
94.(3)cdna末端快速扩增(race)
95.根据cdna末端快速扩增(race)的标准操作程序扩增重链和轻链的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落pcr以筛选具有正确大小的插入物的克隆。就得到了抗体序列。
96.编码所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列包括seq id no.9所示的序列；编码所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括seq id no.10所示的序列。
97.seq id no.9：
98.atggagactgggctgcgctggcttctcctggtcgctgtgctcaaaggtgtccagtgtcagtcattagaggagtccgggggaggcctggtcaagcctggggcatccctgacactcacctgcaaagcctctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgctgggtccgccaggctccagggaagggactagagtggatcgcatgttctggtaatagtggtaacacttactacgcgagctgggcgaaaggccaattcaccatctccaaaacctcgaccacggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatttctgtgcgagaggtattcttgatactggttggactcggttggatctctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctca。
99.seq id no.10：
100.atggacacgagggcccccactcagctgctggggctcctgctgctctggctcccaggtgccacatttgccgccgtgctgacccagactccatctcccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcagcatcaattgccaggccagtaagagtgttgctaataccgacttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcgtcccaagctcctgatctatggtgcatccaatctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacgtgcagtgtgccgatgctgccacttactactgtctaggcggttatagtggtggtagtgataatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa。
101.实施例5构建单克隆抗体表达载体并进行纯化表达
102.(1)构建单克隆抗体的表达载体
103.根据兔单抗序列测定结果，设定合适的酶切位点，分别对重链和轻链进行基因合成；将基因合成产物分别连接到pcdna3.4表达载体。
104.(2)单克隆抗体的表达与纯化
105.单克隆抗体的表达：
106.(a)转染前的准备：细胞计数及传代处理，保证细胞具备转染条件；
107.(b)细胞转染：摇匀细胞液后，用移液管无菌吸取50μl细胞悬液，加950μl培养基稀释20倍，用细胞计数板进行细胞计数，活细胞密度约为(4.5-5.5)
×
106cells/ml，细胞活率应为95-99％；
108.(c)配制转染试剂和质粒混合物，室温孵育20min；
109.(d)将转染试剂缓慢加入待转染细胞培养液中，摇瓶置37.0
±
0.2℃，120rpm和8％co2的细胞培养摇床中培养；
110.(e)转染后的第2天(转染后第18至22小时，第1天)，将补料添加到摇瓶中，并在添加过程中轻轻摇动摇瓶；将摇瓶置37.0
±
0.2℃，120rpm和8％co2的细胞培养摇床中培养，继续培养3-5天。
111.(3)单克隆抗体的纯化
112.(a)细胞培养液收获：离心收集细胞培养液上清，使用protein a beads进行抗体纯化；
113.(b)纯化完成后进行抗体浓度测定。
114.实施例6单克隆抗体分子量测定
115.用sds-page电泳鉴定单克隆抗体的分子量，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量标准系列作为参照(marker)，首先在90v电压下电泳20min，再在140v电压下电泳直到指示剂全部跑出，取下凝胶，用考马斯亮蓝染色，染色后凝胶分析单克隆抗体的分子量。图1为单克隆抗体的sds-page电泳结果图，从图1可知，单克隆抗体的蛋白重链和轻链主要
分布在55kda和25kda左右，图1中泳道m1为marker，泳道1为单克隆抗体。
116.实施例7采用elisa方法检测单克隆抗体对念珠菌甘露聚糖(mn)的亲和活性(效价)
117.亲和活性检测，亲和活性的检测步骤如下所示：
118.将mn抗原用pbs稀释成1ng/μl，以每孔100μl加入到96孔酶标板中，37℃包被2h；弃上清，用0.01m的pbst洗板3次，用pbst配制含3％bsa的封闭液，每孔加入100μl，37℃封闭2h；弃上清，用pbst清洗5次，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从1:1000倍比稀释至1:2560000，加入各孔，每孔加入100μl，37℃温育1h；弃抗体稀释液，用pbst清洗6遍，用1:5000封闭液稀释hrp标记的羊抗兔igg(二抗)，每孔加入100μl二抗，37℃温育1h；弃二抗稀释液，用pbst清洗6遍，每孔加入100μl tmb，避光37℃放置15min；每孔加入50μl 1m稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度。
119.单克隆抗体的亲和活性的检测结果如表1和图2所示，在od值保持不变的情况下，单克隆抗体的稀释倍数越大，说明抗原抗体的结合能力越强，筛选的单克隆抗体对mn抗原具有较强的结合能力，对mn抗原的效价达到1:1280000(od值＞0.5)。
120.表1
121.稀释倍数od值1:100004.2151:200004.1391:400004.0631:800003.9751:1600003.5791:3200002.6541:6400001.9281:12800000.962
122.实施例8采用elisa方法检测单克隆抗体的特异性
123.通过交叉反应检测单克隆抗体的特异性，交叉反应的步骤如下所示：
124.分别用甘露聚糖、半乳甘露聚糖、荚膜多糖、脂多糖、肽聚糖、1,3-β-d-葡聚糖和bsa包被酶标板，每孔包被量为50ng/孔；将单克隆抗体稀释至10ng/ml，加入到各酶标板中，每孔加入100μl，37℃孵育1h；洗涤后每孔加入100μl二抗(hrp标记的羊抗兔igg)，37℃孵育0.5h；洗涤后加入tmb，37℃孵育15min，终止读数。交叉反应的结果如图3所示，结果表明所得单克隆抗体不与其他糖产生交叉反应，特异性强。
125.综上，本发明提供一种了抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体，所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，抗原识别位点多、特异性好、亲和力高，解决了鼠源单克隆抗体在实际应用方面的问题，所述抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体在制备念珠菌检测的产品中具有重要应用价值。
126.申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。