一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法。


背景技术：

2.目前，公知的核移植技术，尤其是核质置换技术，都需要核植入环节。这种植入包括带核胞体被破胞膜后的核注射(简称核注射法)、带核胞体与卵子接触下的电穿孔融合(简称电融合法)和带核胞体与卵子接触下的灭活仙台病毒融合(简称病毒融合法)。其中最后的病毒融合法简单、快速，且不存在显著的机械干扰和电击干扰，在核质置换技术中应用较普遍。但是，病毒融合法还存在不足：1、灭活病毒残留在受体卵内，可能带来一些生物干扰，而目前的常规技术的灭活病毒残留量还比较大；2、常规病毒融合法(待融合胞体被置于狭窄的透明带下间隙中，被透明带挤压与卵子接触)的效率还比较高，但当技术发展后，为了降低核质置换过程中的胞浆残留而使得待融合的胞体体积较小时，则透明带下间隙相对较大而不足以产生透明带挤压胞体与卵子接触的效果，则融合效率就很低。因此，为了解决这两个问题，我们提出了一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合技术。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中病毒融合法存在的问题，本发明提出了一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法。
4.本发明提供一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法，所述方法包括：体外显微操作中将需融合的胞体在含灭活的仙台病毒的培养液中的浸泡操作和将胞体与卵子胞膜接触的融合操作，其特征是所述浸泡操作，是用吸管吸住胞体，只吐露出胞体的一部分浸泡在灭活仙台病毒的培养液中，减少浸泡的胞膜面积；所述融合操作，是用吸管吸住胞体，只吐露出胞体浸泡过灭活仙台病毒培养液的一部分，并将其压迫在所需融合的卵子胞膜上，且维持一定时间，待胞体膜与卵膜粘合较牢固后，再松开压迫，吐出胞体，撤走吸管。
5.优选的，所述压迫融合点正对于透明带开口。
6.进一步优选的，所述方法还包括在所述透明带开口处吸取掉一部分卵子胞浆，以实现进一步对灭活的仙台病毒及核植入时随带的线粒体的二次降残留。
7.进一步优选的，在常规基础上将所述含灭活仙台病毒的培养液成倍稀释到合适浓度使用。
8.进一步优选的，当在常规基础上将所述含灭活仙台病毒的培养液成倍稀释到合适浓度时，延长压迫维持时间。
9.进一步优选的，所述仙台病毒培养液的浓度因所操作卵子的品种不同而有所不同，操作时可在其常规浓度的基础上再稀释2-50倍,所述仙台病毒培养液的浓度为冻存原液的1：2—1：50。
10.进一步选优的，所述浸泡时间因所操作卵子的品种不同而有所不同，所述浸泡时
间为10-90秒。
11.进一步优选的，所述压迫维持时间因所操作卵子的品种不同而有所不同，所述压迫维持时间为10-300秒。
12.上述技术实现的原理是：
13.核质置换用于阻断线粒体遗传病患者生育不健康小孩的关键是降低随核携带的残留线粒体量。也就是随核携带的胞浆量越小越好。所以，核质置换技术在向将带核胞体进行脱胞浆的技术方向发展。然而，经过脱胞浆后的胞体，如纺锤体胞体，其体积变小，如果按常规方法进行融合操作，胞膜接触面和接触张力都很小，无论用电融合法还是病毒融合法的融合效率都极低。增加压迫促融合操作可以解决这一问题，具体是：将脱胞浆后的纺锤体胞体浸泡灭活仙台病毒液(可以用吸管吸住胞体，只浸泡露出的部分胞体)，然后，用显微管吸入转移到受体卵子旁，如果显微操作下卵子固定在左边(即吸持卵子的9：00位置)，则将卵子透明带开口调至3：00位置，显微管从3：00进入(反之，如果吸持的是右边3：00位置，则透明带开口调至9：00位置用于进管)，将胞体部分吐露出管外并定压在所要融合进入的卵子膜上，压成一定的凹陷，并保持一定的时间。这可以增加胞膜接触面和接触张力，促进胞膜融合。
14.本发明的有益效果在于：所述浸泡操作中用吸管吸住胞体，只吐露出胞体的一部分浸泡在灭活仙台病毒的培养液(其浓度相对常规浓度还可以成倍稀释)中，减少浸泡的胞膜面积；所述融合操作中用吸管吸住胞体，吐露出胞体浸泡过灭活仙台病毒的一部分压迫在所需融合的卵子胞膜上，压成一定的凹陷，并维持一定时间，待胞体膜与卵膜粘合较牢固后，再松开压迫，吐出胞体，撤走吸管。前一操作降低了仙台病毒在核质置换中的残留，后一操作，既保证了前一操作中浸泡过的胞膜面能精准成为融合面，又促进了胞体融合效率，尤其是当大幅度去残留胞浆后的小体积胞体用于核质置换时的融合效率。同时，该压迫融合点正对于透明带开口，因随带的残留线粒体大部分还滞留在融合处附近，而病毒也还大部分滞留在融合处膜上，这时如果有必要，可以再正对这个透明带开口处吸取掉一部分卵子胞浆，则不但可以对这些残留线粒体进行二次降残留，也对融合点膜上的灭活仙台病毒进行了二次降残留。这时如果植入的是纺锤体，则可以在纺锤体观察下用显微管将其拨动离开融入处，以便于上述吸取胞浆行二次降残留操作；如果是受精后核，待胞体融入卵子一段时间后，则植入的核会离开融入处移动到卵中部，也利于上述吸取胞浆行二次降残留操作。
附图说明：
15.图1是灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法步骤a至f示意图；
16.图2是该发明用于小鼠卵纺锤体核质置换操作观测图；
17.图3是小鼠卵核质置换在不同方法下的仙台病毒残留的免疫荧光分析图。
具体实施方式
18.下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。
19.一种灭活的仙台病毒低残留高效促融合方法，其显微镜下具体过程如图1所示，
20.a.用显微玻璃管(平行黑线)将含核(内部菱形)的胞体(椭圆)从管中吐露出一部分，置于含灭活仙台病毒(灰色散在小点)的液滴中，浸泡暴露数十秒。
21.b.经去核操作获得去核的受体卵子(外层大圈为卵子透明带，内部的大圈为卵子胞膜)，然后将步骤a处理后的胞体转移到受体卵子旁，经受体卵的透明带开口，将浸泡过灭活仙台病毒液滴的纺锤体胞体部分吐露出管外，压迫在卵子膜上，维持数十秒至数分钟。
22.c.待胞膜间粘合较牢固后，轻轻吐露出胞体并后撤出吸管。
23.d.再经数分钟或数十分钟后，卵子与胞体完全融合，纺锤体进入受体卵子内。
24.e.再在纺锤体观察下将纺锤体拨动离开融入处，然后吸取融入处的卵膜与附近卵浆。
25.f.去掉所吸融入处的卵膜与附近卵浆，实现进一步对仙台病毒及核植入时随带的线粒体的二次降残留。
26.实施例小鼠卵纺锤体核质置换
27.实验材料来源
28.将实验用两种品系的雌小鼠(如balb/c小鼠、c57bl/6小鼠)分别促排卵，在hcg注射后约15-18小时，颈椎脱臼处死小鼠，取输卵管壶腹部划破获得卵丘团，经透明质酸酶消化，获得小鼠卵子，选成熟小鼠卵子进行两品系间卵子的核质置换。
29.配制灭活的仙台病毒(hvj-e)液：
30.采用hvj envelope cell fusion kit(ishihara sangyo kaisha ltd,cat.no.genomone-cf ex)。在配制过程中，将溶液置于冰上。将一瓶灭活的仙台病毒包膜冻干粉，加入试剂盒自带的260μl缓冲液混悬。然后，为了避免hvj-e库存溶液多次冻结和解冻而失去活性，常规方法是：分装成5μl/小管，在-80℃下保存3个月，对于核质置换的融合操作，在操作前解冻一小管hvj-e液并直接使用未稀释的。本发明方法是：分装成2μl/小管，在-80℃下保存3个月，对于核质置换的融合操作，在操作前解冻一小管hvj-e液并进一步成倍稀释(比如1：2至1：50等)后使用。
31.小鼠卵脱胞浆纺锤体胞体制备的具体步骤：
32.进行纺锤体核质置换操作时，借助显微镜上的纺锤体观测仪观察纺锤体的位置与形态；取出纺锤体胞体的操作按常规进行，其所用培养基为下述常规的培养基(其水溶液中基础成分和浓度)如下：
33.氯化钠(97.6mm)、氯化钾(4.7mm)、碳酸镁(或硫酸镁)(0.2mm)、氯化钙(2.04mm)；丙酮酸钠(0.33mm)、乳酸钠(21.4mm)；庆大霉素(50μg/ml)、酚红0.001％wt/vol)；碳酸氢钠(25.0mm)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(25mm)。
34.再常规添加了：蛋白成分为10％，且细胞松弛素b为5微克/毫升。
35.但为了降低核质置换残留线粒体，本发明还使用了新的培养基(胞浆机械脱离用培养液)用于对上述取出的纺锤体胞体进行进一步脱胞浆，该培养基除上述的基础成分与浓度外，所添加的成分及其浓度与常规不同，而是：聚乙烯吡咯烷酮(pvp)为5％，且蛋白成分为30％和/或细胞松弛素b为1.25微克/毫升。
36.采用该培养液，用显微玻璃管吸入纺锤体胞体一侧，露出另一侧，并使得纺锤体至少大部分处于管口以内(无或仅一小部分也露出管外)，将玻璃管相对皿底晃动(只晃动玻璃管或者只移动皿底均可)。由于胞浆机械脱离用培养液使得胞体的胞膜变得柔软且粘滞，易被机械力作用下逐渐拉伸变细，并在断开后重新自行闭合，不会造成胞体膜破裂崩解。当一侧胞浆脱离后，吐出管外。从胞体另一侧吸入，露出尚未脱胞浆的另一侧，并使得纺锤体
至少大部分处于管口以内(无或仅一小部分也露出管外)。重复上述晃动的操作，脱掉胞浆，从而获得两侧都脱胞浆的纺锤体胞体。
37.采用以上操作，获得小鼠脱胞浆纺锤体胞体后，继续对小鼠卵纺锤体进行置换的融合操作：
38.具体过程示意图如图1所示(见上述实施方式描述)，过程实图如图2所示，左部图为纺锤体胞体脱胞浆后状态，左上部分是明场图，左下部分为纺锤体观测图(纺锤体呈现纺锤形的白光)，可见该胞体几乎被纺锤体占据；中部上图为脱胞浆纺锤体胞体被吸管吸住，露出约一半浸泡在灭活仙台病毒液滴内(浓度为冻存原液的1：10)；中部下图为病毒浸泡后转到卵子一侧，将显微吸管从透明带开口进入，将胞体吐露约一半压迫卵子一侧的胞膜(使其形成凹陷即可)，维持约10秒-120秒，待胞膜间粘合较牢固后，轻轻吐露出胞体并后撤出吸管；右侧图为胞体压迫融合后状态，右上部分为明场图，右下部分为纺锤体观测图(纺锤体呈现纺锤体形的白光)，可见纺锤体已经进入受体卵内。此例略去了在融合处吸取胞浆行二次降残留(降低灭活仙台病毒的残留及核植入时随带的线粒体残留)步骤及其展示。
39.对比例分析：
40.传统的灭活仙台病毒融合法，即泡灭活仙台病毒的浓度一般为1：1(指直接使用冻存的原液，当然这对不同商品试剂可能有不同)，为全胞体置于灭活仙台病毒溶液内，然后全胞体塞入卵周隙内(即透明带下)受透明带挤压而接触卵膜。这种方法处理常规操作的病毒融合，病毒残留量高(如图3所示设为100％)，且如果是对脱胞浆后的纺锤体胞体作融合，因其体积小而不能形成挤压接触效果，融合效率低(如图3所示《5％)。
41.而采用上述新技术方法，对病毒残留量相对常规法降低超过60％，且融合效率超过90％(如图3所示)。
42.进一步的，上述新技术还可以进行二次降残留，即因为正对透明带开口进行压迫融合，所以在融合后还能找到融合位点，对该位点下吸取掉部分胞浆，不但能降低残留线粒体，也能降低融合点膜上的残留病毒，对病毒残留量相对常规法降低超过80％(如图3所示)。
43.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。