抗水痘-带状疱疹病毒的抗体及其用途的制作方法

1.本技术大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及抗水痘-带状疱疹病毒抗体领域及其用途。本技术开发了新的抗水痘-带状疱疹病毒抗体，并提供了该抗体在预防或治疗水痘和带状疱疹中的用途。


背景技术：

2.水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，vzv)属疱疹病毒属α亚科，是有被膜的dna病毒。vzv是最小的人疱疹病毒，基因组全长约125,000bp，包括70多种开放读码框，编码多种蛋白质(davison,a.j.,and j.e.scott.1986)。vzv至少有6种表面糖蛋白，如gb(gp ii)、gc(gp iv)、ge(gp i)、gh(gp iii)、gi和gl，在受感染的细胞膜上，糖蛋白ge、gb和gh极为丰富，它们诱生的抗体均能中和病毒(davison,a.j.,c.m.edson.1986)。糖蛋白ge在vzv感染细胞中表达丰度最高，与gi蛋白非共价连接，结合免疫球蛋白igg的fc段。gb蛋白是中和抗体的靶点，在病毒侵入宿主细胞的过程中发挥作用，gb的氨基酸序列在vzv和单纯疱疹病毒-1(hsv-1)中高度保守(kapsenberk,j.g.1964)。gh蛋白介导病毒被膜与细胞膜以及细胞膜之间的融合，利于病毒在细胞间的扩散，gh与gl共表达才能糖基化并转运到细胞表面(forghani,b.,l.ni,and c.grose.1994)。
3.vzv感染人二倍体细胞和黑色素瘤细胞，也能在vero细胞和原代非洲绿猴肾细胞中复制。vzv通过吸附细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖，进而与低亲和力的第二受体结合进入细胞，在感染细胞内表达病毒蛋白，形成多核巨细胞(zhu,z.,m.d.gershon.1995)。多数病毒颗粒保留在细胞质液泡中，很少向胞外释放游离的病毒。
4.vzv只有一个血清型，遗传多样性有限，且这种遗传多样性不影响其感染性和毒力。vzv感染具有高度的种属特异性，没有动物储存宿主，虽然能感染一些非人灵长类动物以及豚鼠(chen,j.2003)和大鼠(sadzot-delvaux.1990)等小动物，但不会引起这些动物发病。人是唯一已知自然宿主，皮肤是病毒的主要靶器官。vzv可经飞沫和(或)接触传播，儿童初次感染主要引起水痘。水痘在温带地区流行，一般在冬春季发病。感染水痘后产生终身免疫，二次感染的病例很罕见(gershon,a.a.1984)。感染者体内残余的vzv可沿感觉神经轴突逆行，或经感染的t细胞与神经元细胞的融合，转移到脊髓后根神经节或颅神经节内并潜伏，当机体免疫力降低时，vzv特异性细胞免疫下降，潜伏的病毒被激活并大量复制，通过感觉神经轴突转移到皮肤，引起带状疱疹。带状疱疹源于潜伏病毒的重新激活，因此只有发生过原发感染的患者才会患带状疱疹，而且发病没有季节性。带状疱疹主要在45岁以上人群中发病，发病率随着年龄的增高而增加，普通人群带状疱疹的发病率为(3-5)人/1000人/年，并逐年递增2.5％-5.0％，75岁以上人群可以达到10人/1000人/年，儿童带状疱疹发病率极低(guess,h.a.1985)。带状疱疹在接受免疫抑制剂治疗的患者以及感染hiv的患者中较常见。带状疱疹除皮损外伴随剧烈疼痛，常见并发症为带状疱疹后神经痛(post herpetic neuralgia，phn)，可持续数月至数年。
5.vzv感染产生igg、igm和iga抗体，这些抗体结合包括糖蛋白、调节蛋白、结构蛋白
和酶在内的病毒蛋白(bogger-goren.1984)，中和抗体介导感染细胞的裂解。结合ge和gi蛋白的中和抗体发挥中和作用需要补体，而结合gb、gh/gl蛋白的抗体则不需要补体。初次感染水痘后体内igg抗体长期存在，保护机体免受二次感染，尤其是糖蛋白抗体。新生儿、未免疫妊娠者或者免疫功能低下者暴露vzv后72小时内注射vzv免疫球蛋白可以抑制感染和体内病毒复制(zaia,j.a.,1983)，减轻水痘的严重程度，降低水痘性肺炎的风险，但是急性水痘患儿注射免疫球蛋白在临床上不能改善疾病病程。抗病毒药物能有效降低水痘和带状疱疹的严重程度，缩短病程，降低带状疱疹后神经痛的发病率。带状疱疹的治疗目前主要是非特异性抗病毒治疗，无特异性抗病毒药物。
6.因此，基于临床需求，探索和研发抗水痘-带状疱疹的抗体具有重要的生物学和医学意义。
7.发明概述
8.第一方面，本技术提供了针对水痘-带状疱疹病毒的抗体，其包含含hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列的重链可变区以及含lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列的轻链可变区，其中
9.所述hcdr1氨基酸序列为sgnywn，所述hcdr2氨基酸序列为yisydgstyynpslkn，所述hcdr3氨基酸序列为gyygywfay，所述lcdr1氨基酸序列为rasssvsymh，所述lcdr2氨基酸序列为atsnlas，所述lcdr3氨基酸序列为qqwssnpft；或者
10.所述hcdr1氨基酸序列为sgyywn，所述hcdr2氨基酸序列为yisydgsnnyntslkn，所述hcdr3氨基酸序列为edvnyppyaldy，所述lcdr1氨基酸序列为rssqslvhsngntylh，所述lcdr2氨基酸序列为kvsnrfs，所述lcdr3氨基酸序列为sqsthvpwt；或者
11.所述hcdr1氨基酸序列为sytms，所述hcdr2氨基酸序列为fisnggdnnyyadtvkg，所述hcdr3氨基酸序列为hngnwgfay，所述lcdr1氨基酸序列为sasssissnylh，所述lcdr2氨基酸序列为rtsnlas，所述lcdr3氨基酸序列为qqgssiplt；或者
12.所述hcdr1氨基酸序列为tyamh，所述hcdr2氨基酸序列为visygggnryyaasvkg，所述hcdr3氨基酸序列为ardnhyffgmdv，所述lcdr1氨基酸序列为rasqgisswla，所述lcdr2氨基酸序列为aasslqs，所述lcdr3氨基酸序列为qqansfplt、qegfyfpin、qqatyfpin或qqssyfpia；
13.其中hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。
14.在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1、3、5或者7所示。
15.在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2、4、6、8、9、10或者28所示。
16.在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示；或者
17.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:4所示；或者
18.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示；
19.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变
区的氨基酸序列如seq id no:8所示；或者
20.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示；或者
21.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示；或者
22.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:28所示。
23.第二方面，本技术提供了针对水痘-带状疱疹病毒的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no:1、3、5和7中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项具有至少90％的一致性。
24.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、fab片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
25.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
26.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自igg1亚型、igg2亚型或igg4亚型的重链恒定区。
27.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
28.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体结合水痘-带状疱疹病毒gh/gl蛋白；和/或所述抗体介导抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(adcc)。
29.第三方面，本技术提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体。
30.第四方面，本技术提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
31.第五方面，本技术提供了第一方面或第二方面所述的抗体、第三方面所述的核酸分子、或第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗水痘和带状疱疹的药物中的用途。
32.第六方面，本技术提供了预防或治疗水痘和带状疱疹的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体、或者第四方面所述的药物组合物。
附图说明
33.图1显示elisa分析抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体阻断抗重组蛋白gh/gl纯化噬菌体与重组蛋白gh/gl结合的能力。其中，图a-图c分别为抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体s8e1、s8b8和s7a10的阻断结果。
34.图2显示elisa分析抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体h4h8-l1b7阻断抗重组蛋白gh/gl纯化噬菌体与重组蛋白gh/gl结合的能力。
35.图3显示基于jurkat-dual-cd16a报告基因细胞评估抗水痘-带状疱疹病毒单克隆抗体的adcc活性。
36.序列说明
37.seq id no:1显示单克隆抗体s7a10的重链可变区的氨基酸序列。
38.seq id no:2显示单克隆抗体s7a10的轻链可变区的氨基酸序列。
39.seq id no:3显示单克隆抗体s8e1的重链可变区的氨基酸序列。
40.seq id no:4显示单克隆抗体s8e1的轻链可变区的氨基酸序列。
41.seq id no:5显示单克隆抗体s8b8的重链可变区的氨基酸序列。
42.seq id no:6显示单克隆抗体s8b8的轻链可变区的氨基酸序列。
43.seq id no:7显示单克隆抗体h4h8-l1b7、h4h8-l14h8、h4h8-l13c1和h4h8-l13c7的重链可变区的氨基酸序列。
44.seq id no:8显示单克隆抗体h4h8-l13c1的轻链可变区的氨基酸序列。
45.seq id no:9显示单克隆抗体h4h8-l13c7的轻链可变区的氨基酸序列。
46.seq id no:10显示单克隆抗体h4h8-l14h8的轻链可变区的氨基酸序列。
47.seq id no:11显示水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus)的gh糖蛋白的氨基酸序列。
48.seq id no:12显示水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus)的gl糖蛋白的氨基酸序列。
49.seq id no:13显示his标签的氨基酸序列。
50.seq id no:14显示人(homo sapiens)igg1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
51.seq id no:15显示人(homo sapiens)igg2亚型重链恒定区的氨基酸序列。
52.seq id no:16显示人(homo sapiens)igg4亚型重链恒定区的氨基酸序列。
53.seq id no:17显示小鼠(mus musculus)igg1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
54.seq id no:18显示小鼠(mus musculus)igg2a亚型重链恒定区的氨基酸序列。
55.seq id no:19显示人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
56.seq id no:20显示人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
57.seq id no:21显示小鼠(mus musculus)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
58.seq id no:22显示小鼠(mus musculus)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
59.seq id no:23显示引物pmcgr的核苷酸序列。
60.seq id no:24显示引物pmckr的核苷酸序列。
61.seq id no:25显示单链抗体s7a10的氨基酸序列。
62.seq id no:26显示单链抗体s8e1的氨基酸序列。
63.seq id no:27显示单链抗体s8b8的氨基酸序列。
64.seq id no:28显示单克隆抗体h4h8-l1b7的轻链可变区的氨基酸序列。
65.发明详述
66.本技术的发明人通过抗体工程技术得到了新的针对水痘-带状疱疹病毒抗体。在本技术的多个方面，提供了新的针对水痘-带状疱疹病毒抗体，编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化所述抗体的方法及所述抗体的医学和生物学应用。根据本技术提供的抗体的可变区的氨基酸序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于预防或治疗水痘和带状疱疹。
67.除非另外指明，本技术的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
68.除非另外指明，本技术中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
69.定义
70.如本文所用术语“抗体”是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
71.通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(vh)和第一、第二及第三恒定区(ch1、ch2及ch3)。每个轻链含有轻链可变区(vl)和恒定区(cl)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如igd、ige、igg、iga或igm(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：iga、igd、ige、igg及igm，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1及iga2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
72.如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)或上述两者。vh和vl中的每个通常含有三个互补决定区cdr1、cdr2及cdr3。
73.本领域技术人员公知，互补决定区(cdr，通常有cdr1、cdr2及cdr3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。vh或vl的cdr氨基酸序列有两种常见的定义方式，即chothia定义和kabat定义。(参阅例如kabat,“sequences of proteins of immunological interest”，national institutes of health,bethesda，md.(1991)；a1-lazikani等人，j.mol.biol.273:927-948(1997)；以及martin等人，proc.natl.acad.sci.usa86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区氨基酸序列，可以根据chothia定义或者kabat定义来确定vh和vl氨基酸序列中的cdr氨基酸序列。在本技术的实施方案中，利用kabat定义cdr氨基酸序列。
74.对于给定抗体的可变区氨基酸序列，可以通过多种方式分析可变区氨基酸序列的中cdr氨基酸序列，例如可以利用在线软件abysis确定(http://www.abysis.org/)。
75.抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)fab片段，其可以是具有vl-cl链和vh-ch1链的单价片段；(2)f(ab')2片段，其可以是具有两个fab'片段的二价片段，该两个fab'片段由铰链区的二硫桥(即fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的vl和vh域的fv片段；(4)单链fv(scfv)，其可以是由vh域和vl域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scfv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的vh域和两个vl域，该两个vl域是经由二硫桥与该两个vh域组合。
76.如本文所用术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
77.如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克
隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应氨基酸序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应氨基酸序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855(1984))。
78.第一方面，本技术提供了针对水痘-带状疱疹病毒的抗体，其包含含hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列的重链可变区以及含lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列的轻链可变区，其中
79.所述hcdr1氨基酸序列为sgnywn，所述hcdr2氨基酸序列为yisydgstyynpslkn，所述hcdr3氨基酸序列为gyygywfay，所述lcdr1氨基酸序列为rasssvsymh，所述lcdr2氨基酸序列为atsnlas，所述lcdr3氨基酸序列为qqwssnpft；或者
80.所述hcdr1氨基酸序列为sgyywn，所述hcdr2氨基酸序列为yisydgsnnyntslkn，所述hcdr3氨基酸序列为edvnyppyaldy，所述lcdr1氨基酸序列为rssqslvhsngntylh，所述lcdr2氨基酸序列为kvsnrfs，所述lcdr3氨基酸序列为sqsthvpwt；或者
81.所述hcdr1氨基酸序列为sytms，所述hcdr2氨基酸序列为fisnggdnnyyadtvkg，所述hcdr3氨基酸序列为hngnwgfay，所述lcdr1氨基酸序列为sasssissnylh，所述lcdr2氨基酸序列为rtsnlas，所述lcdr3氨基酸序列为qqgssiplt；或者
82.所述hcdr1氨基酸序列为tyamh，所述hcdr2氨基酸序列为visygggnryyaasvkg，所述hcdr3氨基酸序列为ardnhyffgmdv，所述lcdr1氨基酸序列为rasqgisswla，所述lcdr2氨基酸序列为aasslqs，所述lcdr3氨基酸序列为qqansfplt、qegfyfpin、qqatyfpin或qqssyfpia；
83.其中hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。
84.在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1、3、5或者7所示。
85.在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2、4、6、8、9、10或者28所示。
86.在第一方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:2所示；或者
87.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:4所示；或者
88.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:6所示；
89.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示；或者
90.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示；或者
91.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:10所示；或者
92.所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述抗体的轻链可变
区的氨基酸序列如seq id no:28所示。
93.第二方面，本技术提供了针对水痘-带状疱疹病毒的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no:1、3、5和7中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项具有至少90％的一致性。
94.在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no:1、3、5和7中任何一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
95.在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
96.在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no:1、3、5和7中任何一项所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
97.在第二方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
98.在第二方面的一些实施方案中，seq id no:1、3、5和7中任何一项所示的氨基酸序列的c端或n端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
99.在第二方面的一些实施方案中，还可以在seq id no:1、3、5和7中任何一项所示的氨基酸序列的c端或n端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
100.在第二方面的一些实施方案中，还可以在seq id no:1、3、5和7中任何一项所示的氨基酸序列的c端或n端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述抗体的重链可变区的功能。
101.在第二方面的一些实施方案中，seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项所示的氨基酸序列的c端或n端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
102.在第二方面的一些实施方案中，还可以在seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项所示的氨基酸序列的c端或n端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
103.在第二方面的一些实施方案中，还可以在seq id no:2、4、6、8、9、10和28中任何一项所示的氨基酸序列的c端或n端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述抗体的轻链可变区的功能。
104.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、fab片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
105.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。
106.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
107.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自igg1亚型、igg2亚型或igg4亚型的重链恒定区。
108.在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述重链恒定区为igg1亚型。
109.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
110.在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述轻链恒定区为κ亚型。
111.在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体结合水痘-带状疱疹病毒gh/gl蛋白；和/或所述抗体介导抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(adcc)。
112.第三方面，本技术提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体。
113.在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控氨基酸序列，调控氨基酸序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
114.第四方面，本技术提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
115.在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗水痘和带状疱疹。
116.在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
117.在一些实施方案中，可将本技术中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
118.在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本技术的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
119.在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
120.第五方面，本技术提供了第一方面或第二方面所述的抗体、第三方面所述的核酸分子、或第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗水痘和带状疱疹的药物中的用途。
121.第六方面，本技术提供了预防或治疗水痘和带状疱疹的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体，或者第四方面所述的药物组合物。
122.在其他方面，本技术还提供编码本发明抗体或其轻链或重链的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞以及产生所述抗体的方法。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控氨基酸序列，调控氨基酸序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。
123.此外，本文所述的特异性针对水痘-带状疱疹病毒的抗体也可用于检测生物样品中水痘-带状疱疹病毒的存在。基于抗体的检测方法在本领域是众所周知的，并且包括例如elisa、免疫印迹、放射免疫试验、免疫荧光、免疫沉淀以及其它相关技术。
124.应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本技术的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
125.以下实施例仅用于说明而非限制本技术范围的目的。
126.实施例1：重组蛋白的制备
127.制备和鉴定水痘-带状疱疹病毒特异性抗体的过程中需要用到gh糖蛋白(seq id no:11)和gl糖蛋白(seq id no:12)。gh和gl只有在细胞内分别合成，一起发生折叠形成gh/gl二聚体后才能有效的分泌表达，且gh/gl二聚体有大量的翻译后修饰(如糖基化或二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，在gh糖蛋白的c端添加his标签(seq id no:13)，更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。根据uniprot数据库中水痘-带状疱疹病毒oka株的gh糖蛋白和gl糖蛋白的氨基酸序列，设计并合成编码gh(包含his标签)和gl重组蛋白的基因。利用常规的分子生物学技术分别将合成的编码gh-his和gl重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcdna3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或其它转染试剂(如pei等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入hek293细胞(如invitrogen公司的hek293f)，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天。然后通过离心等方式收获培养上清。利用金属螯合亲和层析柱(如ge公司的histrap ff等)对上清中的重组蛋白进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如ge公司的hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为pbs(ph7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
128.在制备重组抗体时，抗体重链恒定区可以是人igg1亚型(seq id no:14)、人igg2亚型(seq id no:15)、人igg4亚型(seq id no:16)、或者鼠igg1亚型(seq id no:17)、鼠igg2a(seq id no:18)亚型、轻链恒定区可以是人κ亚型(seq id no:19)、人λ亚型(seq id no:20)、鼠κ亚型(seq id no:21)、鼠λ亚型(seq id no：22)。利用常规的分子生物学手段，将编码抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别克隆至融合有编码重链恒定区和轻链恒定区核苷酸序列的真核表达载体(如invitrogen公司的pcdna3.1等)，组合表达全抗体。利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或其它转染试剂(如pei等)将制备的重组抗体表达质粒转染入hek293细胞(如invitrogen公司的hek293f)，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天。然后通过离心等方式收获培养上清，利用proteina/g亲和层析柱(如ge公司的mabselect sure等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如ge公司的hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为pbs(ph7.0)或者其它合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
129.实施例2：鼠抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的筛选
130.2.1小鼠免疫及免疫抗体库的制备
131.以实施例1中制备的重组蛋白gh-his/gl为抗原，免疫6-8周龄的balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只小鼠，每14天加强免疫1次，初免后8周处死小鼠并收集脾细胞。使用小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术股份有限公司，cat#dkw33-r0100)对小鼠脾脏淋巴细胞进行分离。利用细胞总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，cat#dp430)，将分离的
淋巴细胞进行总rna的提取。以提取的总rna为模板，利用第一链cdna合成试剂盒(thermo scientific，cat#k1621)分别合成抗体重链可变区和轻链可变区的cdna，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，具体序列分别为pmcgr:tgcatttgaactccttgcc(seq id no:23)和pmckr:ccatcaatcttccacttgac(seq id no:24)。将合成的cdna立即存放于-70℃保存备用。然后以反转录得到的cdna为模板，参考文献(krebber a,bornhauser s,burmester j,et al.reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system.j immunol methods.1997；201(1):35-55，通过引用方式将上述文献的全部内容并入本文中)合成引物，并利用pcr分别扩增编码鼠抗体vh和vk的核苷酸序列，然后利用重叠延伸pcr技术，构建单链抗体(scfv)基因。最后将制备的小鼠单链抗体核苷酸序列克隆至载体padscfv-s(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号的实施例1，通过引用方式将上述专利申请的全部内容并入本文中)，构建scfv库。抗体库的库容达到2.13e 08，正确率为50％。
132.2.2抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl小鼠单链抗体的筛选
133.参照文献(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号，通过引用方式将上述专利申请的全部内容并入本文中)，以实施例1制备的重组蛋白gh-his/gl为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(clackson,t.),(美)洛曼(lowman,h.b.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5，通过引用方式将上述文献的全部内容并入本文中)筛选上述构建的展示小鼠单链抗体的噬菌体库，通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行三轮筛选，最终获得多株序列不同，但均能特异性结合重组蛋白gh-his/gl的单链抗体，包括克隆s7a10(氨基酸序列如seq id no:25所示)、s8e1(氨基酸序列如seq id no:26所示)和s8b8(氨基酸序列如seq id no:27所示)。
134.实施例3：鼠抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的亲和力分析
135.利用常规分子生物学方法，将编码特异性结合gh/gl的单链抗体的轻重链的核苷酸序列克隆至真核表达载体，制备重组人igg1-κ形式鼠-人嵌合抗体。
136.利用biacore x100通过表面等离子共振技术测定抗gh/gl抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(br-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(br-1008-39)、cm5芯片(br100012)和ph7.4的10
×
hbs-ep(br100669)等相关试剂和耗材均购自ge healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide，nhs)对羧基化cm5芯片表面进行活化，将抗人igg(fc)抗体(捕获抗体)用10mm ph5.0的乙酸钠稀释至25μg/ml，之后以流速10μl/min注射以实现大约多至10000个响应单位(ru)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1m的乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗gh/gl抗体至0.5-1μg/ml，10μl/min注射，保证50ru左右的抗体被抗人fc的抗体捕获。然后将重组蛋白gh/gl设置一系列的浓度梯度(例如1.23nm、3.7nm、11.1nm、33.3nm和100nm)，于25℃下30μl/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为3600s，以10μl/min注射3m的mgcl
2 30s对芯片表面进行再生。使用biacore x100评估软件第2.0.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(ka)和解离速率(kd)。以比率kd/ka计算解离平衡常数(kd)。拟合结果如表1所示。
137.表1.重组抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体结合水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl的亲和力常数
[0138] kakdkds8b8-igg14.488e 52.068e-44.609e-10s7a10-igg11.721e 59.531e-45.539e-9s8e1-igg16.695e 42.995e-44.473e-9
[0139]
实施例4：鼠抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的表位分析
[0140]
使用水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl包被96孔elisa板(3μg/ml，100μl/孔)，4℃冰箱包被过夜。利用封闭液pbs-0.1％吐温20-3％牛奶在37℃封闭1小时。用固定浓度(5
×
10
10-1
×
10
11
cfu/ml)的各个抗重组蛋白gh/gl纯化噬菌体(s7a10、s8b8和s8e1)分别对抗重组蛋白gh/gl的抗体(s7a10、s8b8和s8e1)进行梯度稀释，起始浓度为10μg/ml，3倍梯度稀释，8-10个浓度梯度，100μl/孔加入封闭好的96孔elisa板中，37℃孵育1小时。使用pbs-0.1％吐温20洗涤elisa板，然后加入hrp抗m13二抗(北京义翘神州科技股份有限公司，11973-mm05t-h)，37℃孵育1小时。使用pbs-0.1％吐温20洗涤elisa板，加入opd底物显色液，5-10分钟后用1m的h2so4终止显色，使用酶标仪测定492nm/630nm双波长光密度值。elisa分析结果如图1所示，s8e1-igg1单克隆抗体不能阻断s8b8噬菌体、s7a10噬菌体与重组蛋白gh/gl的结合(图1a)；s8b8-igg1单克隆抗体可以部分阻断s8e1噬菌体与重组蛋白gh/gl的结合信号，但是对s7a10噬菌体与重组蛋白gh/gl的结合没有影响(图1b)；s7a10-igg1单克隆抗体不能阻断s8b8噬菌体、s7a10噬菌体与重组蛋白gh/gl的结合(图1c)。
[0141]
实施例5：鼠抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的中和活性
[0142]
通过抗体与vzv病毒混合后感染mrc5细胞形成空斑减少确定抗体(s7a10、s8b8和s8e1)中和活性。mrc-5细胞以1.5
×
105个/孔接种6孔细胞培养板，培养72小时成单层细胞，90％铺满时，去除培养液上清，加入病毒维持液(含2％血清的mem培养基)，每孔400μl。用病毒维持液将vzv(oka)稀释至2000pfu/ml，即与抗体等体积混合后每100μl含100pfu的vzv；用病毒稀释液将抗体进行2倍梯度稀释，起始浓度是20μg/ml，8个浓度梯度，即与vzv等体积混合后抗体浓度为10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.62μg/ml、0.31μg/ml、0.16μg/ml和0.08μg/ml。vzv与抗体等体积混合，25℃放置1小时，感染6孔板的mrc5细胞，每孔100μl。37℃吸附1小时，吸弃上清，pbs洗2次，每孔加入3ml的维持液，37℃维持培养8天，将上清去掉，pbs清洗一次，每孔加入1ml的考马斯亮蓝染色液，作用10分钟后，pbs清洗1次，置于明亮处计数空斑，用reed和muench法计算空斑减少50％的抗体浓度(prnt50)。实验结果如表2所示。
[0143]
表2.鼠抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的中和活性
[0144]
抗体s7a10s8b8s8e1prnt50(μg/ml)0.340.380.38
[0145]
实施例6：抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体抑制病毒在细胞间传播的活性
[0146]
vzv病毒感染mrc5细胞后24小时加入抗体(s7a10、s8b8和s8e1)，通过形成空斑减少确定抗体抑制病毒在细胞间传播的活性。mrc-5细胞以1.5
×
105个/孔接种6孔细胞培养板，培养72小时成单层细胞，90％铺满，去培养上清，加入病毒维持液(含2％血清的mem培养
基)，每孔400μl。用病毒维持液将vzv稀释至1000pfu/ml，感染6孔板的mrc5细胞，每孔100μl，即每孔感染100pfu的vzv。37℃吸附1小时，吸弃上清，pbs洗2次，每孔加入3ml的维持液，37℃维持培养24小时。用病毒稀释液将抗体进行2倍梯度稀释，起始浓度是400μg/ml，8个浓度梯度，加入6孔板感染了vzv的mrc5细胞，每孔30μl，即培养液中抗体浓度为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml和0.125μg/ml。37℃维持培养7天，将上清去掉，pbs清洗一次，每孔加入1ml的考马斯亮蓝染色液，作用10分钟后，pbs清洗1次，置于明亮处计数空斑，计算空斑减少50％的抗体浓度。实验结果如表3所示。
[0147]
表3.鼠抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体抑制病毒在细胞间传播的活性
[0148]
抗体s7a10s8b8s8e1prnt50(μg/ml)0.933.212.82
[0149]
实施例7：全人源抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的筛选
[0150]
以实施例1制备的重组蛋白gh-his/gl为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(clackson,t.),(美)洛曼(lowman,h.b.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5，通过引用方式将上述文献的全部内容并入本文中)筛选天然人噬菌体抗体库(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例1，通过引用方式将上述专利申请的全部内容并入本文中)，最终获得1株特异性结合重组蛋白gh-his/gl的全人源单链抗体h4h8-l1b7。
[0151]
实施例8：全人源抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的表位分析
[0152]
利用常规分子生物学方法，将编码h4h8-l1b7的轻重链克隆至真核表达载体，制备重组人igg1-κ形式全人源单克隆抗体。
[0153]
参照实施例4，用固定浓度(5
×
10
10-1
×
10
11
cfu/ml)的各个抗重组蛋白gh/gl纯化噬菌体(s7a10、s8e1、s8b8和h4h8-l1b7)分别对抗重组蛋白gh/gl的抗体(h4h8-l1b7-igg1)进行梯度稀释，测定人抗重组蛋白gh/gl单克隆抗体h4h8-l1b7-igg1对抗重组蛋白gh/gl噬菌体结合重组蛋白gh/gl的阻断。elisa分析结果见图2，h4h8-l1b7-igg1单克隆抗体可以完全阻断h4h8-l1b7噬菌体和s8e1噬菌体与重组蛋白gh/gl的结合信号，对其它2种噬菌体(s7a10和s8b8)与重组蛋白gh/gl的结合信号没有任何影响。
[0154]
实施例9：全人源抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体h4h8-l1b7轻链突变库的构建和筛选
[0155]
9.1h4h8-l1b7轻链突变库的构建及筛选
[0156]
基于双载体噬菌体展示系统，利用轻链cdr突变的策略(具体操作可参照申请人之前提交的中国专利第201510097117.0号中的实施例5，通过引用方式将上述专利申请的全部内容并入本文中)对h4h8-l1b7单克隆抗体进行体外亲和力成熟。利用经典重叠延伸pcr方法构建了库容量超过5.5e 07的lcdr3突变库，突变库设计方案见表4。
[0157]
表4.lcdr3突变库设计方案
[0158][0159][0160]
以重组蛋白gh-his/gl为抗原，以h4h8-l1b7重链为基础，利用固相筛选策略对l1b7(seq id no:28)的lcdr3突变库进行了2轮筛选，最终获得3个轻链突变体l13c1(seq id no:8)、l13c7(seq id no:9)和l14h8(seq id no:10)。
[0161]
9.2h4h8-l1b7轻链突变体亲和力分析
[0162]
利用常规分子生物学方法，将编码h4h8-l14h8、h4h8-l13c1和h4h8-l13c7的轻重链克隆至真核表达载体，制备重组人igg1-κ形式全人源单克隆抗体。
[0163]
参照实施例3，利用biacore x100评估软件第2.0.1版对h4h8-l1b7轻链突变体亲和力进行了分析，结果见表5。
[0164]
表5.h4h8-l1b7轻链突变体结合重组蛋白gh/gl的亲和力常数
[0165] kakdkdh4h8-l13c1-igg12.601e 51.281e-44.925e-10h4h8-l13c7-igg12.494e 51.211e-44.855e-10h4h8-l14h8-igg13.666e 51.062e-42.896e-10
[0166]
实施例10：抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的中和活性
[0167]
参照实施例5，测定单克隆抗体h4h8-l14h8、h4h8-l13c1和h4h8-l13c7的中和活性。实验结果如表6所示。
[0168]
表6.抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体的中和活性
[0169] h4h8-l14h8h4h8-l13c1h4h8-l13c7prnt50(μg/ml)0.0160.016》0.4
[0170]
实施例11：抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体抑制病毒在细胞间传播的活性
[0171]
参照实施例6，测定单克隆抗体h4h8-l14h8、h4h8-l13c1和h4h8-l13c7的抑制病毒在细胞间传播的活性。实验结果如表7所示。
[0172]
表7.抗水痘-带状疱疹病毒重组蛋白gh/gl单克隆抗体抑制病毒在细胞间传播的
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