一种在线粒体内生产乙醇的重组丝状真菌及其构建和应用

pj,gusakov av,olson pt,joosten r,bartels j,visser j.development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a myceliophthora thermophila isolate,previously known as chrysosporium lucknowense c1.ind biotechnol.2011；7:214-23)。如果能够通过遗传改造提高丝状真菌的乙醇产量，将有希望实现纤维素到乙醇的一步生产，能够大大简化生产过程，节约成本，把秸秆变废为宝。但是野生型丝状真菌(包括嗜热毁丝霉)的乙醇产量均较低，尚不能直接应用于乙醇的发酵生产，因此对纤维素降解真菌进行遗传改造，实现生物质原料到乙醇的一步高效生产，是目前第二代燃料乙醇生产中一个重要的方向，同时也具有巨大的应用潜力。
4.要实现纤维素乙醇的一步发酵，就必须提高丝状真菌的乙醇合成能力，但不同于酿酒酵母能够厌氧发酵乙醇，绝大多数的丝状真菌都是好氧菌，大量的碳源会进入线粒体，通过三羧酸循环和呼吸作用，最终转化为co2，导致乙醇的产量难以大幅提高。因此，想要利用丝状真菌以纤维素为原料一步高效合成乙醇，就必须克服上述瓶颈。


技术实现要素：

5.为了克服丝状真菌由于呼吸作用，使得大量碳源进入线粒体，然后通过三羧酸循环和呼吸作用，最后转化为co2，导致乙醇转化率难以提高这一瓶颈。本发明希望利用线粒体中丰富的丙酮酸、乙酰辅酶a和nadh，直接在线粒体中合成乙醇。然而，催化丙酮酸合成乙醇的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶均定位于细胞质，不能进入线粒体；而催化乙酰辅酶a合成乙醇的乙醛脱氢酶来源于原核生物，同样不能定位到真核生物的线粒体中。是否可以通过外加线粒体定位信号，将目标蛋白导入线粒体，而人工融合线粒体定位信号的蛋白是否可以真正进入线粒体，并在线粒体内稳定存在并具有功能，都是未知的，具有非常大的不确定性。经过深入思考分析和选择测试，本发明选取了来源于嗜热毁丝霉线粒体蛋白质的定位信号序列，然后与催化乙醇合成的蛋白质融和表达，引导上述蛋白质到达线粒体基质，这些人工融合的蛋白质最后实现了正确定位线粒体，并能在线粒体内稳定存在和发挥功能，在线粒体中催化乙醇的合成。
6.因此，本发明提供一种丝状真菌的基因工程菌的构建方法，其在丝状真菌细胞中过表达含有线粒体定位信号序列的乙醇合成基因用于合成乙醇。优选地，在丝状真菌细胞中同时过表达含有线粒体定位信号序列的乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶，线粒体定位信号序列会把上述这两个蛋白质转运到线粒体基质中，乙酰辅酶a首先在乙醛脱氢酶的催化下生成乙醛，乙醛再在乙醇脱氢酶的作用下转化为乙醇，nadh为反应提供还原力；或者过表达含有线粒体定位信号序列的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因，线粒体中的丙酮酸首先在丙酮酸脱羧酶的作用下转化为乙醛，乙醛再在乙醇脱氢酶的催化下生成乙醇；或者过表达含有线粒体定位信号序列的乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶以及丙酮酸脱羧酶基因，同时实现上述两个方面的转化。
7.所述丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)/运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)；所述乙醛脱氢酶来源于嗜热厌氧杆菌(thermoanaerobacterium saccharolyticum)。在一些具体的实施方式中，乙醛脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，乙醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.12所示，丙酮酸脱羧
酶的氨基酸序列如seq id no.21所示。
8.优选地，所述丝状真菌是纤维素降解丝状真菌，选自脉孢菌(neurospora)、曲霉(aspergillus)、木霉(trichoderma)、青霉(penicillium)、毁丝霉(myceliophthora)、侧孢霉(sporotrichum)、镰孢菌(fusarium)、根霉(rhizopus)、毛霉(mucor)和拟青霉(paecilomyces)，更优选地，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(myceliophthora heterothallica)。
9.在具体实施方式中，所述导入是指将所要转化的dna转入宿主细胞中，优选启动子为tef、gpda、trpc、cbh1、glaa启动子。
10.本发明还提供由上述的构建方法所获得的基因重组菌，优选地所述基因重组菌选自脉孢菌(neurospora)、曲霉(aspergillus)、木霉(trichoderma)、青霉(penicillium)、毁丝霉(myceliophthora)、侧孢霉(sporotrichum)、镰孢菌(fusarium)、根霉(rhizopus)、毛霉(mucor)和拟青霉(paecilomyces)，更优选地，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(myceliophthora heterothallica)。
11.本发明还提供上述基因重组菌在生产乙醇中的用途。
12.在具体实施方式中，采用单糖或/和聚糖，或者含有单糖或/和聚糖的物质为底物，优选地，所述单糖为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；所述聚糖包括纤维二糖、木二糖、蔗糖、麦芽糖、木寡糖、纤维寡糖、纤维素、结晶纤维素、半纤维素、淀粉、植物木质生物质或其组合更优选地，所述的植物木质生物质选自农作物秸秆、林业废弃物、能源植物或其部分或全部分解产物；进一步优选地，所述农作物秸秆选自玉米秸秆，小麦秸秆，水稻秸秆，高粱秸秆，大豆秸秆，棉花秸秆，甘蔗渣，玉米芯；所述林业废弃物选自枝叶，锯末；所述能源植物选自甜高粱，柳枝稷，芒草，芦苇或其组合。
13.在一个优选实施方式中，所述重组菌为嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)。
14.本发明还提供一种生产乙醇的方法，其是在含有单糖或/和聚糖的培养基质中，培养本发明上述构建方法所获得的基因工程菌，从培养物中收集乙醇。
15.在优先实施方式中，所述丝状真菌为毁丝霉菌或木霉；优选地，所述毁丝霉菌选自嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、异梭毁丝霉(myceliophthora heterothallica)；最优选为嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)，进而优选地所述发酵温度为40-60℃，较佳地，为45-52℃，更佳地，为48-50℃。
16.本发明针对丝状真菌由于有氧呼吸，使得大量碳源进入线粒体通过三羧酸循环后最终转化为二氧化碳，导致乙醇产量难以提高这一瓶颈进行了攻克，实现了乙醇产量的有效提升，具有突出的应用潜力和广泛的现实应用前景。
附图说明
17.图1为a1菌株pcr鉴定结果。
18.图2为a2菌株pcr鉴定结果。
19.图3为a1菌株在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量。
20.图4为a2菌株在葡萄糖和纤维素条件下乙醇产量。
21.无特殊说明，本技术中glucose代表葡萄糖，avicel代表纤维素，wt代表嗜热毁丝
霉野生型菌株atcc42464。
具体实施方式
22.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
23.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如sambrook等人所著的《分子克隆：实验室手册》(new york:cold springharbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
24.本发明实施例中所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。
25.实施例1表达载体构建
26.1.adhe表达载体(pan52-adhe)的构建
27.以厌氧嗜热杆菌thermoanaerobacterium saccharolyticum的乙醛脱氢酶adhe(氨基酸序列如seq id no.1所示)为模板，通过密码子优化，利用基因合成的方法合成该基因，dna序列如seq id no.2所示。以合成的adhe基因为模板，用引物adhe-f和adhe-r扩增出adhe基因；以嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila，atcc42464)基因组为模板，用引物9261mts-f和9261mts-r扩增出顺乌头酸酶(mycth_2309261)的线粒体定位信号序列(核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示)，然后同时以上述两个dna片段为模板，用引物9261mts-f和adhe-r扩增出两个dna的融合片段。然后利用neb的gibson assembly将上述融合片段重组入经bcui和bamhi酶切后的线性化载体pan52-tb-intron(liu q,li j,ying s,wang j,sun w,tian c,feng m.2014.unveiling equal importance of two 14-3-3proteins for morphogenesis,conidiation,stress tolerance and virulence of an insect pathogen.environ microbiol.doi:10.1111/1462-2920.12634)，得到adhe基因的重组表达质粒pan52-adhe。
28.pcr反应体系为：max buffer 25μl，10mm dntps 1μl，上游/下游引物各1.5μl，模板1μl，max super-fidelity dna polymerase 1μl，水19μl。
29.pcr反应条件为：先95℃3min；然后98℃15s，59℃15s，72℃2min，34个循环；最后72℃5min。
30.本实施例中载体构建所用引物如下：
31.seq id no.引物序列(5
’-3’
)5adhe-fccggcgcatgatggccaccaccaagacc6adhe-rgatttcagtaacgttaagtggatcctcaggcgccgtaggcctt79261mts-fccacatcacagaaatcaaaactagtatgttggcttctcgtcagc89261mts-rtcttggtggtggccatcatgcgccggagaccaag9adhe-yz-fctgtcggcagcgcgagccttggtctccg10adhe-yz-rgaaggcgtgttggtgttgtagatgtcg
32.2.adh1过表达载体(pan52-adh1)的构建
33.以酿酒酵母saccharomyces cerevisiae s288c(taxid:559292)基因组dna为模板，用引物adh1-f和adh1-r扩增出adh1基因(gene id:854068，核苷酸序列如seq id no.11所示，氨基酸序列如seq id no.12所示)。以嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila，atcc42464)基因组为模板，用引物5575mts-f和5575mts-r扩增出线粒体苹果酸脱氢酶(mycth_2305575)的线粒体定位信号序列(核苷酸序列如seq id no.13所示)，然后同时以上述两个dna片段为模板，用引物5575mts-f和adh1-r扩增出两个dna的融合片段。然后利用neb的gibson assembly将上述融合片段重组入经bcui和bamhi酶切后的线性化载体pan52-tb-intron(environ microbiol.015.17(4):1444-62)，得到adh1基因的重组表达质粒pan52-adh1。
34.pcr反应体系为：max buffer 25μl，10mm dntps 1μl，上游/下游引物各1.5μl，模板1μl，max super-fidelity dna polymerase 1μl，水19μl。
35.pcr反应条件为：先95℃3min；然后98℃15s，59℃15s，72℃2min，34个循环；最后72℃5min。
36.本实施例中载体构建所用引物如下：
37.seq id no.引物序列(5
’-3’
)145575mts-fccacatcacagaaatcaaaactagtatgttcctgggcagccgc155575mts-rtttctgggatagacataccgagaacggcgaccttg16adh1-fcgttctcggtatgtctatcccagaaactc17adh1-rtgttaataacccacgcgtgggcggatccttatttagaagtgtcaacaacg18adh1-yz-fcagccgcatccagacccgcgccttctc19adh1-yz-rttatttagaagtgtcaacaacgtatctacca
38.3.pdc1过表达载体(pan52-pdc1)的构建
39.以酿酒酵母saccharomyces cerevisiae s288c(taxid:559292)基因组dna为模板，用引物pdc1-f和pdc1-r扩增出pdc1基因(gene id:850733，核苷酸序列如seq id no.20所示，氨基酸序列如seq id no.21所示)。以嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila，atcc42464)基因组为模板，用引物mts-pdc1-f和mts-pdc1-r扩增出顺乌头酸酶(mycth_2309261)的线粒体定位信号序列(核苷酸序列如seq id no.3所示)，然后以上述扩增出的两个dna片段同时为模板，用引物mts-pdc1-f和pdc1-r扩增出两个dna的融合片段。然后利用neb的gibson assembly将上述融合片段重组入经bcui和bamhi酶切后的线性化载体pan52-tb-intron(environ microbiol.015.17(4):1444-62)，得到pdc1基因的重组表达质粒pan52-pdc1。
40.pcr反应体系为：max buffer 25μl，10mm dntps 1μl，上游/下游引物各1.5μl，模板1μl，max super-fidelity dna polymerase 1μl，水19μl。
41.pcr反应条件为：先95℃3min；然后98℃15s，59℃15s，72℃2min，34个循环；最后72℃5min。
42.本实施例中载体构建所用引物如下：
43.seq id no.引物序列(5
’-3’
)22pdc1-fccggcgcatgatgtctgaaattactttggg
23pdc1-rgatttcagtaacgttaagtggatccttattgcttagcgttggtag24mts-pdc1-fccacatcacagaaatcaaaactagtatgttggcttctcgtcagc25mts-pdc1-rtttcagacatcatgcgccggagaccaag26pdc1-yz-fatgtctgaaattactttgggtaaa27pdc1-yz-rgcatcgtttggcttcaaagacatgtcaa
44.实施例2将转化dna导入嗜热毁丝霉
45.将野生型嗜热毁丝霉atcc 42464接种于mm固体斜面培养基中，45℃培养10天后待用。mm培养基配方为：[50
×
vogel’s盐20ml，蔗糖20g，琼脂15g，组氨酸(50mg/ml)20ml，定容体积到1l，高压蒸汽灭菌]。50
×
vogel’s盐(1l)配方为：柠檬酸三钠(1/2h2o)150g，无水kh2po
4 250g，无水nh4no
3 100g，mgso4·
7h2o 10g，cacl2·
2h2o 5g，微量元素液5ml，生物素(0.1mg/ml)2.5ml，定容体积到1l。微量元素液配方(100ml)：5g c6h8o
·
7h2o，5g znso4·
7h2o，1g fe(nh4)2(so4)
·
6h2o，0.25g cuso4·
5h2o，0.05g mnso4·
h2o，0.05g h3bo3，0.05g namoo4·
2h2o，溶于水中，定容至100ml，
[0046]
1、嗜热毁丝霉原生质体转化
[0047]
1)菌丝体准备
[0048]
将成熟的野生型嗜热毁丝霉孢子，用0.05％吐温80灭菌水收集，经擦镜纸过滤除去菌丝后，涂布于铺有玻璃纸的mm平板，37℃培养16h-24h。
[0049]
2)原生质体制备
[0050]
将带有菌丝的玻璃纸放置于30ml裂解液(配方：0.15g裂解酶，无菌操作加入30ml溶液a，过滤除菌；溶液a配方为:1.036g磷酸二氢钾，21.864g山梨醇，溶于90ml去离子水，氢氧化钾调ph到5.6，定量至100ml，高温灭菌)中，28℃裂解2h，每隔15min轻轻摇动。
[0051]
而后经过擦镜纸过滤后，2000rpm 4℃离心10min，弃上清，加入4ml溶液b(0.735g氯化钙，18.22g山梨醇，1ml tris
·
hcl(1m，ph7.5)，溶于90ml去离子水，盐酸调ph到7.6，定量至100ml，高温灭菌)，2000rpm 4℃离心10min；弃上清，按200μl/5ug质粒加入一定体积溶液b。
[0052]
3)原生质体转化
[0053]
在预冷的15ml离心管中，依次加入50μl预冷peg(12.5g peg6000，0.368g氯化钙，500μl tris
·
hcl(1m ph 7.5))，10μl载体dna(pan52-adhe和pan52-adh1载体dna，或者pan52-adhe和pan52-pdc1载体dna)，200μl原生质体。放置冰上20min后加入2ml预冷peg，室温5min，加入4ml溶液b，轻轻混匀。取3ml上述溶液加入12ml融化的含有相应抗生素的mm培养基中，置于平板中，45℃培养，2d-4d后于体式显微镜下挑取单个菌丝体于相应抗性平板中生长。
[0054]
2、嗜热毁丝霉转化子验证
[0055]
1)基因组提取
[0056]
采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组dna，具体包括以下操作：
[0057]
1)2.0ml的无菌的dna提取管中加入200mg的锆珠及1ml的裂解液(lysis buffer，配方：0.2m tris
·
hcl(ph 7.5)，0.5m nacl，10mm edta，1％sds(w/v))，挑取平板中生长的嗜热毁丝霉菌丝于dna提取管中。
[0058]
2)将所有dna提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。
[0059]
3)65℃水浴30分钟，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。
[0060]
4)水浴结束后取出，每管加入80μl ph 7.5的1m tris
·
hcl中和。
[0061]
5)加入400μl的酚：氯仿(1:1)，13000rpm离心5分钟。
[0062]
6)取300μl上清液于新的1.5mlep管中，加入600μl 95％的乙醇(dna)。
[0063]
7)冰上孵育一小时，随后4℃、13000rpm离心，可看到白色的dna沉淀到ep管底部。
[0064]
8)用75％的酒精(dna级)400μl清洗，4℃、13000rpm离心，轻轻取出上清液。
[0065]
9)将ep管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。
[0066]
10)加入50μl ddh2o溶解dna，用nanodrop测定dna浓度，测完浓度后将提取的dna置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行pcr验证。
[0067]
2)pcr验证嗜热毁丝霉转化子
[0068]
同时转化pan52-adhe和pan52-adh1载体获得的转化子，以提取的转化子基因组dna为模版，以adhe-yz-f，adhe-yz-r为引物，通过pcr扩增验证adhe基因是否整合到基因组中；以adh1-yz-f，adh1-yz-r为引物验证adh1基因是否整合到基因组中。成功转入pan52-adhe载体的转化子用引物adhe-yz-f，adhe-yz-r能够扩增出1291bp的目的条带，成功转入pan52-adh1载体的转化子用引物adh1-yz-f，adh1-yz-r能够扩增出1114bp的目的条带。pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(110v电压，30分钟)，结果如图1所示，在凝胶成像系统下观察基因扩增条带，发现转化子成功扩增出了对应大小的dna条带，而野生型菌株未扩增出任何条带，表明pan52-adhe和pan52-adh1载体已经成功转入嗜热毁丝霉基因组中，将所获得的同时转入pan52-adhe和pan52-adh1两个表达载体的菌株命名为a1菌株。
[0069]
同理，对同时转化pan52-pdc1和pan52-adh1载体获得的转化子，以提取的基因组dna为模版，以pdc1-yz-f，pdc1-yz-r为引物，通过pcr验证pdc1基因是否整合到基因组中；以adh1-yz-f，adh1-yz-r为引物验证adh1基因是否整合到基因组中。成功转入pan52-pdc1载体的转化子，用引物pdc1-yz-f，pdc1-yz-r能够扩增出581bp的目的条带；成功转入pan52-adh1载体的转化子用引物adh1-yz-f，adh1-yz-r能够扩增出1114bp的目的条带。pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(110v电压，30分钟)，结果如图2所示，在凝胶成像系统下看基因扩增条带，观察到转化子成功扩增出了对应大小的dna条带，而野生型未扩增出任何条带，表明pan52-pdc1和pan52-adh1载体已经成功转入嗜热毁丝霉基因组中，将所获得的同时转入pan52-pdc1和pan52-adh1载体的菌株命名为a2菌株。
[0070]
实施例3嗜热毁丝霉转化子生产乙醇能力测定
[0071]
将上述pcr验证正确的a1，a2菌株以及野生型嗜热毁丝霉atcc42464菌株，分别以相同的接种量接种至250ml三角瓶中，培养基体积为100ml，葡萄糖为碳源的培养基配方为：glucose 75g，yeast extract 10g,0.15g kh2po4,0.15g k2hpo4,0.15g mgso4·
7h2o,0.1g cacl2·
2h2o，1ml tace element,1ml 0.1mg/ml生物素溶液,定容体积到1l，高压蒸汽灭菌。纤维素(avicel)为碳源培养基配方为：avicel 75g，yeast extract 10g,0.15g kh2po4,0.15g k2hpo4,0.15g mgso4·
7h2o，0.1g cacl2·
2h2o，1ml tace element，1ml 0.1mg/ml生物素溶液，定容体积到1l，高压蒸汽灭菌。采用无菌水收集获得的转化子孢子，经2层无菌擦镜纸过滤后，计算孢子的数量，接种量均为2.5*105个/ml，培养基体积为100ml/瓶，45℃条件下培养7天，摇床转速150rpm，第7天取样测定乙醇含量。
[0072]
1)样品处理：
[0073]
取1ml发酵液于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，取上清液测定乙醇含量。
[0074]
2)乙醇含量测定
[0075]
处理后的样品用高效液相色谱测定乙醇含量，其中检测器为示差检测器，5mm h2so4为流动相，流速为0.5ml/min。转入pan52-adhe和pan52-adh1载体的a1转化子，乙醇产量测定结果如图3所示，以葡萄糖为碳源发酵7天时，a1菌株的乙醇产量为4.42g/l，相比野生型菌株(嗜热毁丝霉atcc42464，3.17g/l)提高39.4％。在以纤维素(avivel)为碳源发酵7天时，a1菌株的乙醇产量为145mg/l，相较野生型菌株(嗜热毁丝霉atcc42464，30.5mg/l)提高3.75倍。表明在线粒体中表达adhe和adh1基因，可以提高嗜热毁丝霉在以葡萄糖和纤维素(avicel)为碳源时的乙醇产量。
[0076]
转入pan52-pdc1和pan52-adh1载体的a2转化子，乙醇产量测定结果如图4所示，以葡萄糖为碳源发酵7天时，a2菌株的乙醇产量为4.03g/l，相比野生型菌株(嗜热毁丝霉atcc42464，3.17g/l)提高27％。在以纤维素(avivel)为碳源发酵7天时，a2菌株的乙醇产量为118mg/l，相较野生型菌株(嗜热毁丝霉atcc42464，30.5mg/l)提高2.87倍。表明在线粒体中表达pdc1和adh1基因，可以提高嗜热毁丝霉在以葡萄糖和纤维素(avicel)为碳源时的乙醇产量。