一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA及其应用

一种特异性抑制鸡ctgf基因表达的sirna及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性抑制鸡ctgf基因表达的sirna及其应用。


背景技术：

2.rna干扰(rna interference,rnai)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-stranded rna,dsrna)诱发的、同源高效特异性降解的现象。21～25nt大小的短序列双链rna分子通过与目的基因单链mrna互补结合，启动靶基因降解程序，诱导靶序列的mrna降解，阻断靶基因表达，细胞表现特定基因的缺陷表型。该技术简单易行，具备高效性、特异性、位置效应、高稳定性、可传播性、浓度时间依赖性等优势，是基因功能研究中最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和家禽遗传育种领域。
3.结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,ctgf)基因是ccn家族成员之一，是一种广泛存在于各组织器官、兼备细胞自分泌与外分泌传播途径的细胞因子。研究表明人和小鼠等哺乳动物的ctgf在细胞外基质的形成、细胞的黏附和迁移、血管形成、细胞的增殖与纤维化等过程中具有重要作用，拥有广泛而重要的临床意义。中国公开号：cn113943737a，公开了鸡ctgf基因在抑制鸡前脂肪细胞分化的应用；然而，由于现有技术中尚无关于特异性抑制鸡ctgf基因表达的sirna，阻碍了科研工作者对禽类ctgf基因的功能和调控机制研究，导致人类对禽类ctgf基因的功能和调控机制不清楚。


技术实现要素：

4.基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制鸡ctgf基因表达的sirna，用于研究禽类ctgf基因的功能和调控机制。该sirna分子的正、反义链可特异性地与抑制鸡ctgf基因的mrna结合，降解mrna，从而干扰转录后翻译过程，促进鸡前脂肪细胞分化。
5.本发明所采用的技术方案如下：一种特异性抑制鸡ctgf基因表达的sirna，其正义链和反义链序列分别为：
6.正义链5
‘‑
ccagggucaccaacgauaaugcuuu-3’(seq id no.1)，
7.反义链5
‘‑
aaagcauuaucguuggugacccugg-3’(seq id no.2)，
8.所述的sirna作用于ctgf基因的mrna靶序列为：5
‘‑
gggtcaccaacgataatgc-3’(seq id no.3)。
9.本发明的另一目的是提供一种如上所述sirna在制备促进鸡前脂肪细胞分化药物或饲料添加剂的应用。
10.本发明的有益效果及优点为：利用本发明提供的sirna干扰鸡ctgf基因，转录水平上的干扰效率高、特异性好，与基因敲除技术相比灵敏度高、操作简便、实验周期短、价格低廉，为研究禽类ctgf基因的功能和调控机制提供直接有效的实验工具。
附图说明
11.图1为fam-sictgf(荧光标记的sirna)暗场观察到的转染效率视野图。
12.图2为fam-sictgf(荧光标记的sirna)明场观察到的转染效率视野图。
13.图3为real-timepcr方法确定sirna干扰效果图。
14.图4为real-timepcr技术(转录水平)检测干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化过程中正向调控因子mrna的影响图。
15.图5为real-timepcr技术(转录水平)检测干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化过程中负向调控因子mrna的影响图。
16.图6为western blot技术(翻译水平)检测干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化过程中正向调控因子蛋白的影响图。
17.图7为western blot技术(翻译水平)检测干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化过程中正向调控因子蛋白的定量结果图。
18.图8为油红o染色技术检测干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化过程中细胞脂滴沉积的影响图。
19.图9为油红o染色技术检测干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化过程中细胞脂滴沉积的定量结果图。
具体实施方式
20.下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到。
21.实施例1：细胞培养
22.永生化的鸡前脂肪细胞系(icp2)保存在我们的实验室中。将细胞在补充有10％胎牛血清(gibco)的dmem/f12培养基(gibco，grand island，ny，美国)中培养，并保持在37℃，5％湿润的co2气氛中。
23.实施例2：总rna提取及real-time pcr
24.(1)总rna提取
25.1)取出12孔板，弃掉培养基，用pbs洗3遍。
26.2)在六孔板的每孔加1ml的trizol，摇匀，置于冰上静置5min，在震荡板上震15min。
27.3)吹打细胞，将培养板中的trizol移入depc处理过的1.5ml ep管中，震荡15s。
28.4)每1ml的trizol中加入0.2ml的氯仿，用力震荡15s，室温静置5min。
29.5)4℃，12000rpm，离心15min。
30.6)将上层水相转移到新的depc处理过的1.5ml ep管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。
31.7)4℃，12000rpm，离心10min。
32.8)弃上清，加入1ml现配的75％乙醇，震荡洗涤rna一次。
33.9)4℃，7500rpm，离心5min。
34.10)弃上清，将装有rna沉淀的1.5ml离心管置于超净台中风机干燥10min。
35.11)向rna沉淀中加入20μl depc水进行溶解。
36.12)紫外分光光度计测定rna的浓度，然后立即用于反转录或-80℃保存。
37.(2)反转录
38.按照primescript
tm
rt reagent kitwith gdna eraser(takara)试剂盒说明书进行两步法操作。去除基因组dna反应条件见表1。
39.表1去除基因组dna反应体系
[0040][0041]
去除基因组dna反应条件：42℃ 2min；置于冰上。rna反转录反应体系见表2。
[0042]
表2反转录pcr反应体系
[0043][0044]
rna反转录反应条件：37℃，5min；85℃，5min；4℃保存。
[0045]
(3)real-time pcr
[0046]
按照faststart universal sybr green master(rox)试剂盒说明书操作，real-time pcr反应体系见表3。
[0047]
表3real-time pcr反应体系
[0048][0049]
将上述试剂充分混合，分装到96孔板中(10μl/孔)。反应条件为95℃，10min；40cycles95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
[0050]
以tbp为内参，采用2
–△
ct方法计算目的基因的相对表达量，其中δct＝ct(目的基因)
–
ct(tbp)。各基因real-time pcr引物序列如表4：
[0051]
表4real-time pcr引物
[0052][0053][0054]
实施例3：总蛋白的提取及western blot
[0055]
(1)总蛋白的提取
[0056]
1)以12孔板为例，融解western及ip细胞裂解液，混匀。取1ml裂解液，在使用前数分钟内加入10μl 100nm的pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。
[0057]
2)收细胞，加pbs洗3遍，每孔加入75μl的western及ip细胞裂解液，用100ul移液枪吹打数下，使裂解液与细胞充分接触，置于4
°
冰箱，裂解30min。
[0058]
3)充分裂解后，4℃ 12000rpm离心5min，取上清移入新的ep管中，即为细胞的总蛋白。
[0059]
(2)western blot
[0060]
1)采用bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定所收集的蛋白浓度，并将测定的蛋白调整至同等浓度，加入适量的5x sds-page蛋白上样缓冲液，100℃加热煮沸5min，以充分变性蛋白。
[0061]
2)待蛋白样品冷却到室温后，每个样品上样20μl，按照75v，40min；120v，45min进行常规电泳。
[0062]
3)电泳结束后，将海绵、转膜滤纸、胶和nc膜按顺序放入转膜槽中，接通电源，按照
0.2a的恒定电流进行转膜1h。
[0063]
4)将nc膜置于含有5％脱脂奶粉的pbst(封闭液)中，室温在摇床上摇2h。
[0064]
5)用pbst洗去nc膜上的封闭液，并将nc膜孵育在含有一抗的稀释液中，放置4℃冰箱过夜。
[0065]
6)用pbst洗膜3次，每次10min；然后将膜孵育在含二抗的封闭液中，室温在摇床上摇1h。
[0066]
7)用pbst洗膜3次，每次10min，然后用beyoecl star(特超敏ecl化学发光试剂盒)进行化学发光成像仪检测。
[0067]
实施例4：油红o染色、提取比色及蛋白校正
[0068]
(1)油红o染色、提取比色
[0069]
1)除去细胞中的培养基，用pbs清洗3次。每孔加入1ml 4％多聚甲醛固定液(6孔板)，4℃固定30min；此时配制油红o工作液，即油红o原液和去离子水按照3:2的比例混合均匀后，用滤纸过滤(现用现配)。
[0070]
2)弃去固定液，pbs温和洗涤3次，放入65℃烘箱中烘干。
[0071]
3)油红o染色工作液避光染色15min。
[0072]
4)弃去油红o染色液，pbs温和洗涤3次，每孔加入1ml 60％异丙醇，立即弃掉，pbs洗涤3次。
[0073]
5)每孔加入2ml pbs，倒置显微镜下拍照、存图。
[0074]
6)弃去pbs，每孔加入1ml 100％异丙醇，用于溶解被染细胞里的油红o，置于水平摇床上晃动15min。
[0075]
7)用酶标仪在510nm处测定od值。
[0076]
(2)蛋白校正
[0077]
1)取出细胞培养板，弃培养基。
[0078]
2)用pbs洗细胞2次。
[0079]
3)12孔板每孔加300μl胰酶消化液，37℃1min，至细胞状态呈流沙状。
[0080]
4)加入1ml完全培养液中和消化液，反应体系全部移至depc处理后的1.5ml离心管中。
[0081]
5)2000rpm，离心7min，弃去上清。
[0082]
6)加入1ml pbs，轻轻吹打，重悬细胞。
[0083]
7)4000rpm，离心10min，弃去上清，-80℃保存。
[0084]
8)取出冻存的细胞，冰浴助融，加入适量的含有1mm pmsf的细胞裂解液充分震荡直至没有细胞团块，冰上静置30min。
[0085]
9)12000rpm离心5min，取上清。
[0086]
10)取少量上清，用bca方法测定蛋白浓度。
[0087]
11)用油红o提取比色所得od值/对应蛋白量，即得到油红o提取比色的校正结果。
[0088]
实施例5：si-ctgf转染鸡前脂肪细胞系
[0089]
鸡ctgf基因的干扰片段(si-ctgf)及阴性对照序列(si-nc)均由百奥迈科生物技术有限公司合成。将icp2细胞接种在12孔板中，待细胞生长至40％的汇合度时，采用2000(美国invitrogen公司)进行sictgf及si-nc的转染，具体操作参照
2000试剂盒说明书进行。
[0090][0091]
实施例6：si-ctgf转染效率的检测
[0092]
为了检测干扰片段的转染效率，将icp2细胞接种在12孔板中，待细胞生长至40％的汇合度时进行油酸诱导细胞分化，向细胞里转染fam-sictgf(荧光标记的sirna)，同时设置si-nc(阴性对照组)和mock(空白对照组)，具体操作参照2000试剂盒说明书进行。转染6h后用荧光显微镜观察sirna转染效率，图1-2为fam-sictgf(荧光标记的sirna)转染效率示意图，图1是暗场观察到的视野，图2是明场观察到的视野。
[0093]
实施例7：si-ctgf干扰效率的检测
[0094]
为了检测干扰片段的干扰效果，待icp2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导细胞分化，同时将sictgf(实验组)转染到细胞中，设立si-nc(阴性对照组)和mock(空白对照组)，转染48h后，提取细胞中的rna，利用real-time pcr的方法检测si-ctgf的干扰效果。如图3结果显示，si-ctgf具有很好的干扰效果，可作为研究禽类ctgf基因的功能和调控机制直接有效的实验工具。
[0095]
实施例8：干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化标志基因mrna的检测
[0096]
待icp2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导细胞分化，同时将sictgf(实验组)转染到细胞中，设立si-nc(阴性对照组)和mock(空白对照组)，转染48h后，利用real-time pcr的方法检测鸡前脂肪细胞分化过程中分化标志基因的表达水平。结果显示，干扰组pparr、ap2、c/ebp/β的表达量显著高于阴性对照组和空白对照组(p《0.05或p《0.01，图4)，干扰组cata2的表达量显著低于阴性对照组和空白对照组(《0.05或p《0.01，图6)；plin、klf的表达量无显著变化(图4-5)。
[0097]
实施例9：干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞分化标志基因蛋白的检测
[0098]
待icp2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导细胞分化，同时将sictgf(实验组)转染到细胞中，设立si-nc(阴性对照组)和mock(空白对照组)，转染48h后利用western blot的方法检测鸡前脂肪细胞分化过程中分化标志基因(pparr、c/ebpβ)的蛋白表达水平。结果显示，干扰组pparr、c/ebp/β的表达量显著高于对照组(p《0.05)(图6-7)。
[0099]
实施例10：干扰ctgf基因对鸡前脂肪细胞脂滴沉积的检测
[0100]
待icp2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导，同时将sictgf(实验组)转染到细胞中，设立si-nc(阴性对照组)和mock(空白对照组)，转染48h后，进行油红o染色和油红o染色的提取比色(对细胞数目进行了校正)，计算鸡前脂肪细胞脂滴沉积含量。结果显示，干扰组中细胞的脂滴沉积极显著高于阴性对照组和空白对照组(p《0.01)(图8-9)。