氯硝柳胺对细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法

1.本发明属于医疗技术领域，尤其涉及一种pi3k-akt信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法。


背景技术：

2.氯硝柳胺长期被作为一种驱虫剂，用于治疗绦虫感染约已有50余年历史。人们发现，氯硝柳胺具有更为广泛的药理活性，可以调节糖尿病和糖尿病肾病，改善树突状细胞功能，抑制寨卡病毒复制，改善关节炎症，预防系统性硬化症等多种药理作用。氯硝柳胺也是一种有效的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor) 抑制剂，可作为潜在的抗糖尿病药物。近年来，一系列研究表明氯硝柳胺显示出抗癌活性，如胶质母细胞瘤、卵巢癌、急性髓细胞白血病、肺癌、乳腺癌，但氯硝柳胺对结肠癌的抗癌活性未见相关文献报道。多项研究表明，氯硝柳胺可通过多种信号通路发挥抗肿瘤作用，如wnt/β-连环蛋白、stat3和notch[13] 等信号通路。以上研究表明，氯硝柳胺是一种潜在的抗癌药物。氯硝柳胺作为一种传统老药，可能具有多种新用途，它作为一种抗肿瘤药可能具有良好的开发前景。pi3k-akt信号通路作为mtor的上游通路之一在结肠癌的发病机制中起到了重要的作用，本研究探索了pi3k-akt信号通路在氯硝柳胺抗结肠癌效应中国的作用。
[0003]
综上所述，现有技术存在的问题是：氯硝柳胺对结肠癌的抗癌活性未见相关文献报道；同时，目前已经建立的人结肠癌细胞分离培养方法多以组织块培养法为主，分离得到的细胞纯度不高，数量少，并且培养时间较长。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种pi3k-akt信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法。
[0005]
本发明是这样实现的，一种pi3k-akt信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法包括以下步骤：
[0006]
步骤一，对结肠癌细胞进行分离及培养；
[0007]
步骤二，用mtt实验法检测氯硝柳胺对结肠癌细胞的增殖抑制作用；
[0008]
步骤三，通过流式细胞术检测氯硝柳胺对结肠癌细胞周期的抑制作用；
[0009]
步骤四，通过dapi荧光染色法观察氯硝柳胺对结肠癌细胞凋亡的诱导作用；
[0010]
步骤五，通过用实时定量pcr技术检测氯硝柳胺对结肠癌细胞pi3k/akt 通路相关基因mrna的表达变化；
[0011]
步骤六，通过用western blot技术分析氯硝柳胺对结肠癌细胞pi3k/akt 通路相关蛋白的表达变化情况。
[0012]
进一步，所述对结肠癌细胞进行分离及培养方法如下：
[0013]
(1)按重量份数据将二甲基亚砜1份、乙酰胺2份、葡萄糖5份、磷酸二氢钠3份、枸橼酸钠2份、枸橼酸钾3份、硫酸镁4份、腺嘌呤核苷1份、左旋精氨酸2份进行搅拌混合，获得保
存液，无菌条件下切取新鲜结肠癌组织放入保存液进行保存，5℃密封运回实验室；将组织处理器械浸泡于浓度76％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；
[0014]
(2)将组织放入预冷无菌含双抗pbs液中，培养皿置于冰上洗涤除去表面的系膜、血管、脂肪、坏死组织，无菌条件下在预冷的pbs中用眼科剪将结肠癌组织剪成1mm
×
1mm
×
1mm的碎块；
[0015]
(3)用38℃预热的胰蛋白酶-edta消化液和胶原酶分别消化；用含胎牛血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液356g离心6min，去掉上清液，保留沉淀，重复两次；取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；
[0016]
(4)加入完全培养基重悬，细胞计数板计数；细胞计数后接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，置于38℃、6％co2环境中继续培养，每4d换一次液；
[0017]
(5)细胞纯化，酶消化法；细胞传代培养；细胞形态及生长情况观察。
[0018]
进一步，所述用预冷的pbs浓度为0.02m，ph为7.5。
[0019]
进一步，所述消化环境为38℃，6％co2培养箱，用0.4％的胰蛋白酶消化16min，再用0.3％的iv型胶原酶消化5h。
[0020]
进一步，所述0.26％的胰蛋白酶消化液消化11min，再用含0.2％的iv型胶原酶消化3.6min。
[0021]
进一步，所述mtt实验法检测方法如下：
[0022]
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)还原为不溶性甲瓒，而死细胞无此功能；
[0023]
二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，570nm)测定其光吸收值，其吸光度值与活细胞数成正比，据此可测出药物处理后的细胞存活率；
[0024]
将处于对数生长期不同结肠癌细胞(5
×
103个)接种于96孔板中，分别用不同浓度氯硝柳胺(用0、2、4、6、8μmol/l处理hct116,sw480,sw620细胞；用0、5、10、15、20μmol/l处理ht29细胞)进行处理，每组设5个复孔；
[0025]
培养72h后，每孔加入150μlmtt(5μg/μl)，孵育4h；溶于200μldmso后，用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度；
[0026]
进行三次生物学重复，求吸光度的平均值，计算出细胞存活率，计算氯硝柳胺对不同结肠癌细胞的半数有效抑制浓度(ic50值)。
[0027]
进一步，所述流式细胞术检测方法为：
[0028]
选取ic50值较低的hct116细胞进行后续实验；取1
×
105/ml细胞悬液2ml接种于六孔板中，用不同浓度的氯硝柳胺(0、0.5、1、2μmol/l)处理48小时后，收集细胞，并在4℃下用75％冰冷乙醇孵育过夜；
[0029]
pbs清洗，去除乙醇，用细胞周期检测试剂盒(含1mg/mlpi和10mg/mlrnasea)室温下在暗室中孵育30min；用流式细胞仪测定细胞周期分布和细胞凋亡率，用modfit软件分析实验结果。
[0030]
进一步，所述dapi荧光染色法如下：
[0031]
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)能与dna强力结合，在紫外光激发下发出荧光，根据细胞核的染色情况，可观察细胞凋亡情况；实验中将结肠癌hct116细胞接种于放置有盖
玻片的6孔板中，培养24小时待细胞贴壁后；加不同浓度(0、0.5、1、2μmol/l)的氯硝柳胺继续培养48小时，取出用4％的多聚甲醛固定10分钟，pbs清洗，加dapi染色工作液染色，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。
[0032]
进一步，所述定量pcr技术检测方法如下：
[0033]
用trizol试剂法提取不同浓度(0、0.5、1.0、2.0μmol/l)氯硝柳胺处理的结肠癌细胞总mrna，逆转录试剂盒法合成cdna(杭州沃森生物科技公司)；根据试剂盒操作说明书提供的方法，使用sybrmix对cdna模板进行实时荧光定量pcr,按以下体系进行rt-pcr反应；以合成的cdna为模板，进行pcr扩增；
[0034]
pcr扩增体系为：cdna模板1μl，dntp混合物(10mmol/l)1μl，上游引物(20μmol/l)1μl，下游引物(20μmol/l)1μl，2
×
μltra-sybrmixture(withrox)8μl，双蒸水8μl，总体积20μl；
[0035]
扩增反应程序为：95℃预变性10min，然后以94℃30s，60℃45s，72℃1min的程序循环35次，72℃延伸10min；实时荧光定量pcr扩增cdna的特异性引物采用premierpremier5.0引物设计软件设计，扩增反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，扩增结果采用2
‑△△
ct
方法表示，与内参基因gapdh进行比对，计算各基因的表达变化情况。
[0036]
进一步，所述westernblot技术分析方法为：
[0037]
用不同浓度(0、0.5、1.0、2.0μmol/l)的氯硝柳胺处理结肠癌hct116细胞48小时细胞，收集细胞，pbs洗涤两次，4℃裂解30分钟，14000g离心15分钟去除不溶性沉淀，提取细胞总蛋白；
[0038]
用bca法测定总蛋白质浓度，然后进行10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每加样孔上样量为30μg总蛋白；
[0039]
电泳完成之后将蛋白自凝胶转移至pvdf膜，用5％脱脂奶粉封闭，ttbs清洗后，分别加入一抗，(按1:1000比例稀释)孵育2小时或4℃过夜；
[0040]
然后加辣根过氧化物酶标记的二抗igg工作液(鼠抗兔二抗，按1:5000比例稀释)，室温孵育2小时或4℃过夜；凝胶成像仪上显影，用imagelab软件分析，各相关蛋白的表达变化与内参gapdh进行比较，其比值表示相关蛋白的表达变化。
[0041]
本发明的优点及积极效果为：本发明通过mtt实验结果表明氯硝柳胺对不同的结肠癌细胞有明显的增殖抑制作用，且抑制作用在一定程度上呈现出时间和剂量效应，不同结肠癌细胞的ic50值略有不同。流式细胞术结果显示氯硝柳胺能阻滞结肠癌hct116细胞于g2/m期，dapi荧光染色显示氯硝柳胺诱导结肠癌hct116细胞凋亡。进一步对pi3k/akt通路进行研究，westernblot实验显示氯硝柳胺能下调hct116细胞pi3k，p-akt、p-nf-κb、p-erk、survivin等蛋白表达，上调tnf-α蛋白的表达，实时定量pcr结果与westernblot结果相一致；氯硝柳胺可能通过pi3k-akt信号通路阻滞细胞增殖和诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖发挥抗肿瘤作用；同时，本发明提供的对结肠癌细胞进行分离及培养方法，所得结肠癌细胞：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。
附图说明
[0042]
图1是本发明实施提供的pi3k-akt信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法流程图。
[0043]
图2是本发明实施提供的氯硝柳胺对结肠癌细胞的增殖抑制作用图。
[0044]
图3是本发明实施提供的氯硝柳胺处理48h对结肠癌细胞hct116细胞周期的影响图。
[0045]
(a)对照组：g1期：61.27％；g2期:12.31％；s期:26.12％；凋亡率:0.58％。(b) 0.5μmol/l处理组:g1期:59.58％；g2期:9.95％；s期:28.63％；凋亡率:0.23％。 (c)1.0μmol/l处理组:g1组:51.52％；g2期:5.83％；s期:42.61％；凋亡率: 0.56％。(d)2.0μmol/l处理组:g1期:53.78％；g2期:4.90％；s期:41.31％；凋亡率:27.05％。
[0046]
图4是本发明实施提供的氯硝柳胺处理72h对结肠癌细胞hct116细胞周期的影响图。
[0047]
(a)对照组:g1期:63.16％；g2期:1.28％；s期:35.65％；凋亡率:0.02％.(b)0.5 μmol/l处理组:g1期:60.11％；g2期:6.38％；s期:33.56％；凋亡率:0.05％； (c)1.0μmol/l处理组:g1期:41.12％；g2期:10.86％；s期:48.09％；凋亡率: 0.8％；(d)2.0μmol/l处理组:g1期:14.13％；g2期:29.85％；s期:56.13％；凋亡率:21.61％。
[0048]
图5是本发明实施提供的氯硝柳胺对结肠癌细胞hct116凋亡的影响(dapi 染色，20
×
)图。
[0049]
图6是本发明实施提供的氯硝柳胺对结肠癌细胞hct116细胞信号通路的影响图。
[0050]
(a)pi3k-akt信号通路关键分子的表达变化情况；(b)pi3k-akt信号通路下游分子的表达变化；(c)凋亡相关蛋白分子的表达变化。
具体实施方式
[0051]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0052]
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。
[0053]
如图1所示，本发明提供一种pi3k-akt信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法包括以下步骤：
[0054]
s101，对结肠癌细胞进行分离及培养；
[0055]
s102，用mtt实验法检测氯硝柳胺对结肠癌细胞的增殖抑制作用；
[0056]
s103，通过流式细胞术检测氯硝柳胺对结肠癌细胞周期的抑制作用；
[0057]
s104，通过dapi荧光染色法观察氯硝柳胺对结肠癌细胞凋亡的诱导作用；
[0058]
s105，通过用实时定量pcr技术检测氯硝柳胺对结肠癌细胞pi3k/akt通路相关基因mrna的表达变化；
[0059]
s106，通过用western blot技术分析氯硝柳胺对结肠癌细胞pi3k/akt通路相关蛋白的表达变化情况。
[0060]
本发明提供的对结肠癌细胞进行分离及培养方法如下：
[0061]
(1)按重量份数据将二甲基亚砜1份、乙酰胺2份、葡萄糖5份、磷酸二氢钠3份、枸橼酸钠2份、枸橼酸钾3份、硫酸镁4份、腺嘌呤核苷1份、左旋精氨酸2份进行搅拌混合，获得保存液，无菌条件下切取新鲜结肠癌组织放入保存液进行保存，5℃密封运回实验室；将组织处理器械浸泡于浓度76％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在
无菌操作台里晾干；
[0062]
(2)将组织放入预冷无菌含双抗pbs液中，培养皿置于冰上洗涤除去表面的系膜、血管、脂肪、坏死组织，无菌条件下在预冷的pbs中用眼科剪将结肠癌组织剪成1mm
×
1mm
×
1mm的碎块；
[0063]
(3)用38℃预热的胰蛋白酶-edta消化液和胶原酶分别消化；用含胎牛血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液356g离心6min，去掉上清液，保留沉淀，重复两次；取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；
[0064]
(4)加入完全培养基重悬，细胞计数板计数；细胞计数后接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，置于38℃、6％co2环境中继续培养，每4d换一次液；
[0065]
(5)细胞纯化，酶消化法；细胞传代培养；细胞形态及生长情况观察。
[0066]
本发明提供的用预冷的pbs浓度为0.02m，ph为7.5。
[0067]
本发明提供的消化环境为38℃，6％co2培养箱，用0.4％的胰蛋白酶消化16min，再用0.3％的iv型胶原酶消化5h。
[0068]
本发明提供的0.26％的胰蛋白酶消化液消化11min，再用含0.2％的iv型胶原酶消化3.6min。
[0069]
本发明提供的mtt实验法检测方法如下：
[0070]
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)还原为不溶性甲瓒，而死细胞无此功能；
[0071]
二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，570nm)测定其光吸收值，其吸光度值与活细胞数成正比，据此可测出药物处理后的细胞存活率；
[0072]
将处于对数生长期不同结肠癌细胞(5
×
103个)接种于96孔板中，分别用不同浓度氯硝柳胺(用0、2、4、6、8μmol/l处理hct116,sw480,sw620细胞；用0、5、10、15、20μmol/l处理ht29细胞)进行处理，每组设5个复孔；
[0073]
培养72h后，每孔加入150μlmtt(5μg/μl)，孵育4h；溶于200μldmso后，用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度；
[0074]
进行三次生物学重复，求吸光度的平均值，计算出细胞存活率，计算氯硝柳胺对不同结肠癌细胞的半数有效抑制浓度(ic50值)。
[0075]
本发明提供的流式细胞术检测方法为：
[0076]
选取ic50值较低的hct116细胞进行后续实验；取1
×
105/ml细胞悬液2ml接种于六孔板中，用不同浓度的氯硝柳胺(0、0.5、1、2μmol/l)处理48小时后，收集细胞，并在4℃下用75％冰冷乙醇孵育过夜；
[0077]
pbs清洗，去除乙醇，用细胞周期检测试剂盒(含1mg/mlpi和10mg/mlrnasea)室温下在暗室中孵育30min；用流式细胞仪测定细胞周期分布和细胞凋亡率，用modfit软件分析实验结果。
[0078]
本发明提供的dapi荧光染色法如下：
[0079]
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)能与dna强力结合，在紫外光激发下发出荧光，根据细胞核的染色情况，可观察细胞凋亡情况；实验中将结肠癌hct116细胞接种于放置有盖玻片的6孔板中，培养24小时待细胞贴壁后；加不同浓度(0、0.5、1、2μmol/l)的氯硝柳胺继续培养48小时，取出用4％的多聚甲醛固定10分钟，pbs清洗，加dapi染色工作液染色，荧光
显微镜下观察细胞凋亡情况。
[0080]
本发明提供的定量pcr技术检测方法如下：
[0081]
用trizol试剂法提取不同浓度(0、0.5、1.0、2.0μmol/l)氯硝柳胺处理的结肠癌细胞总mrna，逆转录试剂盒法合成cdna(杭州沃森生物科技公司)；根据试剂盒操作说明书提供的方法，使用sybrmix对cdna模板进行实时荧光定量pcr,按以下体系进行rt-pcr反应；以合成的cdna为模板，进行pcr扩增；
[0082]
pcr扩增体系为：cdna模板1μl，dntp混合物(10mmol/l)1μl，上游引物(20μmol/l)1μl，下游引物(20μmol/l)1μl，2
×
μltra-sybrmixture(withrox)8μl，双蒸水8μl，总体积20μl；
[0083]
扩增反应程序为：95℃预变性10min，然后以94℃30s，60℃45s，72℃1min的程序循环35次，72℃延伸10min；实时荧光定量pcr扩增cdna的特异性引物采用premierpremier5.0引物设计软件设计，扩增反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，扩增结果采用2
‑△△
ct
方法表示，与内参基因gapdh进行比对，计算各基因的表达变化情况。
[0084]
本发明提供的westernblot技术分析方法为：
[0085]
用不同浓度(0、0.5、1.0、2.0μmol/l)的氯硝柳胺处理结肠癌hct116细胞48小时细胞，收集细胞，pbs洗涤两次，4℃裂解30分钟，14000g离心15分钟去除不溶性沉淀，提取细胞总蛋白；
[0086]
用bca法测定总蛋白质浓度，然后进行10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每加样孔上样量为30μg总蛋白；
[0087]
电泳完成之后将蛋白自凝胶转移至pvdf膜，用5％脱脂奶粉封闭，ttbs清洗后，分别加入一抗，(按1:1000比例稀释)孵育2小时或4℃过夜；
[0088]
然后加辣根过氧化物酶标记的二抗igg工作液(鼠抗兔二抗，按1:5000比例稀释)，室温孵育2小时或4℃过夜；凝胶成像仪上显影，用imagelab软件分析，各相关蛋白的表达变化与内参gapdh进行比较，其比值表示相关蛋白的表达变化。
[0089]
实施例：
[0090]
1.材料与方法：
[0091]
1.1材料
[0092]
氯硝柳胺(2
′
，5
′‑
二氯-4
′‑
硝基水杨酸酰替苯胺，上海甄准生物科技公司，批号：0560000)溶解在二甲基亚砜中，配制成10mmol/l母液，在-20℃冰箱中储存，备用。pi3k抗体、akt抗体、p-akt抗体(s473)、erk-1/2抗体、p-erk-1/2、nf-κb抗体、p-nf-κb抗体、survivin抗体、gapdh抗体等购自abcam公司(louispark，mn，usa)。细胞周期检测试剂盒(abcam公司)，逆转录试剂、trizol试剂盒(杭州沃森生物科技公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)、bca蛋白浓度测定试剂盒、dmem培养基、胎牛血清(fbs)购自杭州四季青公司。
[0093]
1.2方法
[0094]
1.2.1细胞培养
[0095]
人结肠癌细胞系hct116、sw620、sw480、ht29购自中国典型培养物保存中心(中国，武汉)。结肠癌细胞用含10％胎牛血清的dmem培养基，在37℃温度，5％co2条件下恒温培养箱中进行培养。待细胞长满培养瓶时进行传代，取对数生长期的细胞进行后续实验。
[0096]
1.2.2 mtt实验分析细胞存活率
[0097]
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5
‑ꢀ
二苯基四氮唑溴盐(mtt)还原为不溶性甲瓒，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 (dmso)能溶解细胞中的甲臜，570nm)测定其光吸收值，其吸光度值与活细胞数成正比，据此可测出药物处理后的细胞存活率。将处于对数生长期不同结肠癌细胞(5
×
103个)接种于96孔板中，分别用不同浓度氯硝柳胺(用0、2、4、 6、8μmol/l处理hct116,sw480,sw620细胞；用0、5、10、15、20μmol/l处理ht29细胞)进行处理，每组设5个复孔。培养72h后，每孔加入150μl mtt (5μg/μl)，孵育4h。溶于200μl dmso后，用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光度。进行三次生物学重复，求吸光度的平均值，计算出细胞存活率，进一步计算氯硝柳胺对不同结肠癌细胞的半数有效抑制浓度(ic50值)。
[0098]
1.2.3流式细胞术分析细胞周期
[0099]
选取ic50值较低的hct116细胞进行后续实验。取1
×
105/ml细胞悬液2ml 接种于六孔板中，用不同浓度的氯硝柳胺(0、0.5、1、2μmol/l)处理48小时后，收集细胞，并在4℃下用75％冰冷乙醇孵育过夜。pbs清洗，去除乙醇，用细胞周期检测试剂盒(含1mg/ml pi和10mg/ml rnase a)室温下在暗室中孵育30min。用流式细胞仪测定细胞周期分布和细胞凋亡率，用modfit软件分析实验结果。
[0100]
1.2.4 dapi染色观察细胞凋亡
[0101]
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)能与dna强力结合，在紫外光激发下发出荧光，根据细胞核的染色情况，可观察细胞凋亡情况。实验中将结肠癌hct116 细胞接种于放置有盖玻片的6孔板中，培养24小时待细胞贴壁后。加不同浓度(0、0.5、1、2μmol/l)的氯硝柳胺继续培养48小时，取出用4％的多聚甲醛固定10 分钟，pbs清洗，加dapi染色工作液染色，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。
[0102]
1.2.5western blot技术检测pi3k-akt信号通路相关蛋白的表达
[0103]
用不同浓度(0、0.5、1.0、2.0μmol/l)的氯硝柳胺处理结肠癌hct116细胞48小时细胞，收集细胞，pbs洗涤两次，4℃裂解30分钟，14000g离心15 分钟去除不溶性沉淀，提取细胞总蛋白。用bca法测定总蛋白质浓度，然后进行10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每加样孔上样量为30μg总蛋白。电泳完成之后将蛋白自凝胶转移至pvdf膜，用5％脱脂奶粉封闭，ttbs清洗后，分别加入一抗，(按1:1000比例稀释)孵育2小时或4℃过夜。然后加辣根过氧化物酶标记的二抗igg工作液(鼠抗兔二抗，按1:5000比例稀释)，室温孵育2 小时或4℃过夜。凝胶成像仪上显影，用image lab软件分析，各相关蛋白的表达变化与内参gapdh进行比较，其比值表示相关蛋白的表达变化。
[0104]
1.2.6实时荧光定量pcr技术检测pi3k-akt信号通路相关基因mrna的表达
[0105]
用trizol试剂法提取不同浓度(0、0.5、1.0、2.0μmol/l)氯硝柳胺处理的结肠癌细胞总mrna，逆转录试剂盒法合成cdna(杭州沃森生物科技公司)。根据试剂盒操作说明书提供的方法，使用sybrmix对cdna模板进行实时荧光定量pcr,按以下体系进行rt-pcr反应。以合成的cdna为模板，进行pcr扩增。pcr 扩增体系为：cdna模板1μl，dntp混合物(10mmol/l)1μl，上游引物 (20μmol/l)1μl，下游引物(20μmol/l)1μl，2
×
μltra-sybr mixture (with rox)8μl，双蒸水8μl，总体积20μl。扩增反应程序为：95℃预变性10min，然后以94℃30s，60℃45s，72℃1min的程序循环35次，72℃延伸 10min。实时荧光定量pcr扩增cdna的特异性引
物采用premier premier 5.0引物设计软件设计(表1。)，扩增反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，扩增结果采用2
‑△△
ct方法表示，与内参基因gapdh进行比对，计算各基因的表达变化情况。
[0106]
表1 rt-pcr引物
[0107][0108]
1.2.7统计分析
[0109]
用spss 17.0进行统计学分析，实验数据以平均值
±
标准差(s
±
d)表示。统计学显著性检验采用student
′
s t检验，以p＜0.05表示具有显著统计学差异。
[0110]
2结果
[0111]
2.1氯硝柳胺对结肠癌细胞的增殖抑制作用
[0112]
用不同浓度的氯硝柳胺处理结肠癌细胞，mtt实验检测细胞存活率。结果表明，氯硝柳胺对各种结肠癌细胞均具有一定的抑制作用。各种结肠癌细胞 (hct116、sw480、sw620、ht29)的存活率曲线如图所示(图2)。测得其半数抑制浓度(ic50)分别是：hct116为0.98
±
0.105μmol/l；sw480：1.13
±
0.103 μmol/l；sw620：1.85
±
0.213μm ol/l和ht29：2.78
±
0.308μmol/l。
[0113]
2.2氯硝柳胺对结肠癌细胞周期的影响
[0114]
课题组选择了抑制作用相对较为明显(ic50较低)的结肠癌hct116细胞进行后续实验。分别用浓度为0、0.5、1.0和2.0μm的氯硝柳胺处理hct116细胞48 h和72h，然后收集、固定和染色，用流式细胞仪分析氯硝柳胺对hct116细胞周期的影响。结果表明，随着氯硝柳胺浓度的增加，g1期细胞比例减少，s期和g2/m期细胞比例增加(表一)。g1期细胞百分率随时间延长而明显下降。氯硝柳胺对hct116细胞s期和g2/m期的阻滞在一定程度上具有时间和剂量依赖性。氯硝柳胺通过阻断hct116细胞周期而抑制细胞增殖并诱导凋亡，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率呈现出明显增加的趋势。(图3和图4)。
[0115]
表2 氯硝柳胺对结肠癌细胞hct116的细胞周期的影响
gene mrna level in hct116 cells
[0132][0133]
*与对照组相比：p《0.05；**与对照组相比：p《0.01
[0134]
3讨论
[0135]
结肠癌是一种好发于结肠部位的消化道恶性肿瘤，在消化系统肿瘤中发病率较高，长期的结肠息肉亦可发展为结肠癌。目前，手术治疗是结肠癌最佳的治疗办法，术后配合化疗对结肠癌有更好的治疗效果。在结肠癌的化疗中，澳利沙铂是最重要的药物，肿瘤病人的长期化疗会产生耐药性，广泛的多药耐药(mdr)严重的影响肿瘤的化疗效果[15-16]。爱必妥(西妥昔单抗)和安维汀(贝伐珠单抗)等分子靶向药物是结肠癌治疗的重要选择，为晚期结肠癌患者带来了新的希望，但这些药物的疗效仍远不能令人满意。寻找新的抗肿瘤药物对结肠癌的治疗仍然具有重要意义。
[0136]
氯硝柳胺作为传统上的驱虫药和兽药，近年来被发现对肿瘤细胞具有良好的抑制作用，本实验以结肠癌细胞为对象，探索了氯硝柳胺对结肠癌细胞的增殖抑制作用及其分子机制。
[0137]
本实验首先采用mtt实验验证了氯硝柳胺对结肠癌细胞具有增殖抑制作用，然后采用流式细胞术和dapi荧光染色观察了氯硝柳胺对结肠癌细胞周期和凋亡的影响，最后通过western技术和实时定量pcr技术研究了氯硝柳胺抑制肿瘤细胞的信号通路。研究显示，氯硝柳胺阻滞结肠癌细胞在s期和g2/m期作用，从抑制hct116细胞的增殖和诱导细胞凋亡。氯硝柳胺处理结肠癌细胞，可使 pi3k表达下调，pi3k是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，其表达下调，使akt磷酸化作用减弱，p-akt进一步使下游分子erk、nf-κb 磷酸化减弱，nf-κb是种转录因子，其磷酸化作用减弱，进而使tnf-α蛋白的表达上调、survivin表达下调，使细胞分裂受阻，启动细胞凋亡。
[0138]
综上，pi3k/akt信号通路在氯硝柳胺抑制结肠癌细胞周期和诱导细胞凋亡过程中可能起到重要的作用。
[0139]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。