一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法

1.本发明涉及一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.虎奶菇（pleurotus tuber-regium (fr.)singer），属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，是一种营养价值很高的珍稀食用菌，因其含有多种生物活性成分，包括糖蛋白、多糖和植物活性成分而具有广泛的知名度以及重要的经济价值。并且虎奶菇是唯一一种已知的从球形菌核产生子实体的侧耳属物种。虎奶菇富含膳食纤维，含有较多具有生物活性的β-葡聚糖组成的非淀粉多糖，这些多糖提供其药理作用。且其含有多种必需氨基酸、必需脂肪酸和维生素。此外，虎奶菇含有大量微量元素，包括钾、钙、磷、钠、镁、铜和锌。特别是虎奶菇还含有大量生物活性成分，如生物碱、酚类化合物、单宁、皂苷、金丝桃苷和黄酮类化合物最近也受到了广泛关注。目前的研究表明，虎奶菇的营养成分和生物活性成分具有抗肿瘤、抗高胆固醇、抗高血压、抗肥胖、抗肝损伤、抗菌、抗氧化等生理活性功能，是一种很有前途的功能食品和营养食品。
3.除了上述营业成分之外，虎奶菇还含有较多的i类疏水蛋白。疏水蛋白（hydrophobins）是丝状真菌分泌的小蛋白质，其有成为商业食品中的新型稳定剂和乳化剂的潜质，虎奶菇疏水蛋白更是其中的佼佼者。疏水蛋白作为新型功能性成分在食品泡沫和充气乳液形成和稳定性方面具有重要的作用。疏水蛋白可以通过提高食品中泡沫的稳定性可延长这些产品的保质期。此外，还可以使用稳定的泡沫来改善诸如冰淇淋的产品的物理和感官特性。与其他蛋白质相比，疏水蛋白以更好的方式稳定气泡。与增稠剂结合使用时，疏水蛋白在长达2.5年的时间内可以稳定泡沫，使其几乎没有气相损失。相较于常见的食品乳化剂如酪蛋白或吐温，其稳定的泡沫的效果要好得多。目前对虎奶菇中疏水蛋白提取方法的研究较少。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法，解决从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白方法的技术空白。
5.实现本发明上述目的所采用的技术方案为：一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：（1）将虎奶菇菌丝冷冻干燥，然后研磨成100目粉末；（2）将步骤（1）所得粉末转移至经沸水预热的抽提液ⅰ中，保持100 ℃抽提10 min，得到悬浊液ⅰ，将悬浊液10000 r/min离心15 min后收集沉淀；所述抽提液ⅰ成分为2% 十二烷基硫酸钠水溶液及0.05 mol/l 三羟甲基氨基甲烷，调整酸碱度至ph6.8；粉末与抽提液ⅰ质量体积比为1:10；（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的沉淀，经10000 r/min离心10 min后再次收集沉淀，重复6～8次此操作至洗涤液无明显泡沫；
g，cacl2 0.1 g，znso4 0.1 g，mnso4 0.1 g，nacl 0.2 g，补足水分至1l，分装至250ml锥形瓶中，每瓶100ml。然后在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，条件为121℃下灭菌20min。
9.（3）挑取活化好的菌丝，无菌接种至其中1瓶用作种子培养液。于32℃，120 r/min的转速下培养5天。
10.（4）用灭好菌的玻璃匀浆器对于种子液进行匀浆处理，然后进行无菌接种，每瓶培养液接种10ml，之后在32℃，120 r/min的转速下培养8天，得到发酵培养物。
11.（5）将所述发酵培养物抽滤后清洗，得到虎奶菇菌丝。
12.二、一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法：（1）将虎奶菇菌丝冷冻干燥，然后研磨成100目粉末。
13.（2）称取2g虎奶菇菌丝粉末，转移至经沸水预热的20l抽提液ⅰ中，保持100 ℃抽提10 min，得到悬浊液ⅰ，将悬浊液10000 r/min离心15 min后收集沉淀；所述抽抽提液ⅰ为2% 十二烷基硫酸钠水溶液，按照0.05 mol/l的比例加入三羟甲基氨基甲烷，调整酸碱度至ph6.8；（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的沉淀，经10000 r/min离心10 min后再次收集沉淀，重复6～8次此操作至洗涤液无明显泡沫；（4）将步骤（3）所得沉淀置于抽提液ⅱ中，沉淀与抽提液ⅱ质量体积比为1:20，65 ℃抽提10 min并过滤收集不溶物，重复此操作5次至滤液颜色保持不变，且无分层，然后冷冻干燥或者置于通风橱中风干，得到干燥材料1.5 g；所述抽提液ⅱ为氯仿:甲醇=2:1的混合物；（5）按25 mg/ml向步骤（4）得到的干燥材料中加入100% 三氟乙酸，置于冰浴中解离6 h，期间每隔30 min摇匀三氟乙酸悬浊液一次，保持解离物较好的分散性，得到悬浊液
ⅱꢀ
60 ml；（6）将悬浊液ⅱ12000 r/min离心15 min，收集上清液并用氮气吹干，然后加入100 ml 60%乙醇水溶液于25 ℃ 静置溶解12 h，得到溶液ⅰ100 ml；（7）将步骤（6）所得的溶液ⅰ12000 r/min离心30 min，收集上清液进行冷冻干燥得到疏水蛋白，置于密闭容器中室温保存备用，即得。
14.实施例2一、虎奶菇培养方法：步骤（1）~（5）同实施例1。
15.二、一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法：步骤（1）~（4）同实施例1，（5）按25 mg/ml向步骤（4）得到的干燥材料中加入100% 甲酸，置于冰浴中解离6 h，期间每隔30 min摇匀甲酸悬浊液一次，保持解离物较好的分散性，得到悬浊液
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60 ml；（6）将上述步骤（6）所得的溶液ⅰ置于4 ℃透析，透析6 h，每2 h换一次蒸馏水，除去乙醇。去除乙醇后，得到疏水蛋白单体水溶液120 ml，但无法长时保存；将疏水蛋白单体水溶液在漩涡混合仪上剧烈震荡5 min，得到疏水蛋白组装体悬浊液，将疏水蛋白组装体悬浊液12000 r/min离心30 min，收集沉淀，沉淀为疏水蛋白，得到疏水蛋白8.17 mg，将沉淀经冷冻干燥后置于密闭容器中室温保存备用，即得。所述的冷冻干燥指使用冻干机在真空，-80℃环境下干燥48小时。


技术特征：
1.一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：（1）将虎奶菇菌丝冷冻干燥，然后研磨成100目粉末；（2）将步骤（1）所得粉末转移至经沸水预热的抽提液ⅰ中，保持100 ℃抽提10 min，得到悬浊液ⅰ，将悬浊液10000 r/min离心15 min后收集沉淀；所述抽提液ⅰ成分为2% 十二烷基硫酸钠及0.05 mol/l 三羟甲基氨基甲烷，调整酸碱度至ph6.8；粉末与抽提液ⅰ质量体积比为1:10；（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的沉淀，经10000 r/min离心10 min后再次收集沉淀，重复6～8次此操作至洗涤液无明显泡沫；（4）将步骤（3）所得沉淀置于抽提液ⅱ中，沉淀与抽提液ⅱ质量体积比为1:20，65 ℃抽提10 min并过滤收集不溶物，重复此操作5次至滤液颜色保持不变，且无分层，然后冷冻干燥或者置于通风橱中风干，得到干燥材料；所述抽提液ⅱ为氯仿:甲醇=2:1的混合物；（5）按25 mg/ml向步骤（4）得到的干燥材料中加入100% 三氟乙酸或100%甲酸，置于冰浴中解离6 h，期间每隔30 min摇匀三氟乙酸悬浊液或甲酸悬浊液一次，保持解离物较好的分散性，得到悬浊液ⅱ；（6）将悬浊液ⅱ12000 r/min离心15 min，收集上清液并用氮气吹干，然后加入100 ml 60%乙醇水溶液于25 ℃ 静置溶解12 h，得到溶液ⅰ；（7）将步骤（6）所得的溶液ⅰ12000 r/min离心30 min，收集上清液进行冷冻干燥，置于密闭容器中室温保存备用，即得。2.一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：（1）将虎奶菇菌丝冷冻干燥，然后研磨成100目粉末；（2）将步骤（1）所得粉末转移至经沸水预热的抽提液ⅰ中，保持100 ℃抽提10 min，得到悬浊液ⅰ，将悬浊液10000 r/min离心15 min后收集沉淀；所述抽提液ⅰ成分为2% 十二烷基硫酸钠及0.05 mol/l 三羟甲基氨基甲烷，调整酸碱度至ph6.8；粉末与抽提液ⅰ质量体积比为1:10；（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的沉淀，经10000 r/min离心10 min后再次收集沉淀，重复6～8次此操作至洗涤液无明显泡沫；（4）将步骤（3）所得沉淀置于抽提液ⅱ中，沉淀与抽提液ⅱ质量体积比为1:20，65 ℃抽提10 min并过滤收集不溶物，重复此操作5次至滤液颜色保持不变，且无分层，然后冷冻干燥或者置于通风橱中风干，得到干燥材料；所述抽提液ⅱ为氯仿:甲醇=2:1的混合物；（5）按25 mg/ml向步骤（4）得到的干燥材料中加入100% 三氟乙酸或100%甲酸，置于冰浴中解离6 h，期间每隔30 min摇匀三氟乙酸悬浊液或甲酸悬浊液一次，保持解离物较好的分散性，得到悬浊液ⅱ；（6）将悬浊液ⅱ12000 r/min离心15 min，收集上清液并用氮气吹干，然后加入100 ml 60%乙醇水溶液,得到溶液ⅱ,将溶液ⅱ置于4 ℃透析6 h，每2 h换一次蒸馏水，除去乙醇，去除乙醇后，得到疏水蛋白单体水溶液，将疏水蛋白单体水溶液在漩涡混合仪上剧烈震荡5 min，得到疏水蛋白组装体悬浊液，将疏水蛋白组装体悬浊液12000 r/min离心30 min，收集沉淀，将沉淀经冷冻干燥后置于密闭容器中室温保存备用，即得。

技术总结
本发明公开了一种从虎奶菇菌丝中提取疏水蛋白的方法，包括下列步骤：将虎奶菇菌丝冷冻干燥，研磨成粉末；转移至经沸水预热的抽提液Ⅰ中，抽提得到悬浊液Ⅰ，将悬浊液Ⅰ10000 r/min离心15 min后收集沉淀；用无菌水洗涤沉淀，经10000 r/min离心10 min后再次收集沉淀，重复6～8次此操作至洗涤液无明显泡沫；将沉淀置于抽提液Ⅱ中抽提并过滤收集不溶物，重复此操作5次至滤液颜色保持不变且无分层，冷冻干燥，得到干燥材料；按25 mg/mL向干燥材料中加入100%三氟乙酸或100%甲酸，冰浴中解离6 h，得到悬浊液Ⅱ；将悬浊液Ⅱ12000 r/min离心15 min，收集上清液并用氮气吹干，加入100 mL 60%乙醇水溶液于25℃静置溶解12 h，得到溶液Ⅰ；溶液Ⅰ12000 r/min离心30 min，收集上清液进行冷冻干燥，即得。即得。


技术研发人员：马爱民 胡敏涛 莫翠园 盛丽
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.05.19
技术公布日：2022/8/19