一种诱导蛋白质降解的多肽及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种诱导蛋白质降解的多肽及其应用，该多肽可以与靶标蛋白结合并诱导靶标蛋白降解。


背景技术：

2.蛋白质降解是细胞的一种保护机制，当外界环境刺激或者细胞内蛋白质折叠错误，降解错误折叠蛋白质用来维持细胞内环境的稳态的一种策略，目前已经发现并研究得比较透彻的蛋白质的降解方式包括蛋白质泛素化降解，溶酶体降解等(komander d,rape m,annu rev biochem 81:203
‑
229.(2012)；salami j,crews cm.science 355,1163
‑
1167.(2017))。很多疾病的发生是由于蛋白质的突变或者执行错误的功能造成的，但是很多错误的蛋白质功能区域无法没有结合度较强而且具有功能的小分子。除了小分子药物，细胞内蛋白质降解药物是另外一种抑制细胞内蛋白功能的方式，这种系统利用细胞内的蛋白质降解系统，特异性的降解致病蛋白或者细胞中无用或者有害的蛋白，有望恢复细胞内的蛋白质稳态，阻止疾病的发生。
3.已有的实验表明，部分分子是通过蛋白降解的途径发挥药效。例如，canertinib是酪氨酸激酶erbb
‑
2的抑制剂，erbb
‑
2在多种癌症内有表达，而canertinib可以增加erbb
‑
2的降解。(a.citri et al.,embo j.21,2407
–
2417(2002))erα的抑制剂fulvestrant也可以促进erα的降解。在携带erα的乳腺癌患者中，fulvestrant比另一个没有促进蛋白降解作用的erα抑制剂tamoxifen的疗效更好。(a.howell,endocr.relat.cancer 13,689
–
706(2006).)急性早幼粒细胞白血病的有效药三氧化二砷，同样可以促进致病融合蛋白pml
‑
rarα的降解。(t.
‑
d.zhang et al.,oncogene 20,7146
–
7153(2001).)多发性骨髓瘤的免疫疗法药物lenalidomide，可以诱导激酶ck1α和转录因子ikaros和aiolos的降解。(j.et al.,nature 523,183
–
188(2015))这些药物的成功证实了蛋白质降解在药物研发领域的重要性和有效性。
4.新型的可诱导蛋白质降解的分子可与靶标蛋白结合，降低细胞内靶标蛋白质含量。目前分子生物学中主要利用基因沉默的技术来降低体内蛋白质的含量(如基因编辑等)，但是这些技术导致靶标蛋白质含量降低所需时间相对较长，存在转录和翻译两个阶段，所需时间较长，而靶向蛋白质降解可以直接针对目标蛋白进行降解，速度更快。在灵活性方面，靶向泛素化降解技术可以通过调节融合蛋白的表达水平来精确控制蛋白质降解系统活性，如对细胞转染不同的质粒剂量或者用不同的启动子控制融合蛋白表达的强弱，可以进行细致深入研究靶标蛋白质的功能。但本领域缺乏可用于靶向降解技术的多肽或其母核。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中缺乏有效的可诱导任意蛋白质降解的多肽的缺陷的技术问题，本发明提供了一种诱导蛋白质降解的多肽及其应用。本发明的多肽与目标蛋白结合后，能
id no:4～16的多肽片段中的一种或多种。
21.更优选地，所述融合蛋白的序列如seq id no:19所示。
22.所述融合蛋白在所述多肽片段的诱导下发生蛋白降解，例如泛素化
‑
蛋白酶体降解或溶酶体降解。本领域技术人员皆知，当其它目标蛋白与融合蛋白结合例如共价结合时，也会被融合蛋白带到例如溶酶体中共同发生蛋白质降解(图11)。
23.为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种非治疗目的的降解目标蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
24.(1)在细胞中，使如本发明第一方面所述的多肽片段、如seq id no:1所述的多肽片段或如本发明第二方面所述的多肽组合物与目标蛋白结合，形成融合蛋白；
25.(2)所述融合蛋白在所述多肽片段的诱导下发生蛋白降解。
26.如本发明第四方面所述的方法，优选地，所述多肽片段在所述融合蛋白的n端或c端，和/或，所述蛋白降解为泛素化
‑
蛋白酶体降解或溶酶体降解。
27.在某一较佳实施例中，所述融合蛋白的序列如seq id no:19所示。
28.同样地，所述融合蛋白在所述多肽片段的诱导下发生蛋白降解，例如泛素化
‑
蛋白酶体降解或溶酶体降解。本领域技术人员皆知，当其它目标蛋白与融合蛋白结合例如共价结合时，也会被融合蛋白带到例如溶酶体中共同发生蛋白质降解。
29.非治疗目的的降解目标蛋白的方法可应用于例如科学实验中，研究目标蛋白或多肽片段的功能。另外，本发明的降解目标蛋白的方法也可以用于治疗中，例如，使用本发明的第一方面提供的多肽片段、第二方面提供的多肽组合物或第三方面提供的融合蛋白可用于治疗或预防与蛋白质异常折叠相关的疾病。
30.为解决上述技术问题，本发明的第五方面提供了：一种条件性敲除或表达试剂盒，其中所述条件性敲除或表达试剂盒包括如本发明第一方面所述的多肽片段，或包括如本发明第二方面所述的多肽组合物或如本发明第三方面所述的融合蛋白。
31.所述条件性敲除或表达试剂盒优选地包括氨基酸序列如seq id no:1、2、或4～16所示的多肽片段。
32.更优选地，所述试剂盒还包括mg132、bortezomib、carfilzomib、ixazomib citrate、ixazomib、oprozomib、delanzomib和/或celastrol。
33.为解决上述技术问题，本发明的第六方面提供了：一种套装药盒，其中所述套装药盒包括药盒a和药盒b，所述药盒a包括本发明第一方面所述的多肽片段或如本发明第二方面所述的多肽组合物或如本发明第三方面所述的融合蛋白或如seq id no:1所示的多肽片段，所述药盒b包括促进或抑制蛋白降解的药物。
34.为解决上述技术问题，本发明的第七方面提供了：如本发明第一方面所述的多肽片段、如本发明第二方面所述的多肽组合物、如本发明第三方面所述的融合蛋白或如seq id no:1所示的多肽片段在降解目标蛋白、降解与所述目标蛋白结合的蛋白、或制备降解蛋白质的药物中的应用。
35.本发明的积极进步效果在于：
36.本发明的多肽片段可以与任意目标蛋白结合，诱导目标蛋白被蛋白酶体降解，从而进行目标蛋白的敲除。本发明的技术相对于基因组敲除方法如基因编辑，不影响基因组，没有脱靶效应。因此本发明的多肽可应用于降解目标蛋白、降解与所述目标蛋白结合的蛋
白、或制备降解蛋白质的药物。同时，本发明的试剂盒可以用药物抑制降解作用，挽回敲除的蛋白质，进行条件性敲除，从而应用于蛋白质的功能研究。
附图说明
37.图1为诱导蛋白质降解系统的示意图。
38.图2多肽链接在目标蛋白的n端或c端的降解效果。
39.图3为不同降解多肽序列对降解的影响。
40.图4为不同降解多肽序列对降解的影响。
41.图5为蛋白酶体抑制剂对荧光蛋白
‑
降解多肽的作用。mcherry
‑
p2a
‑
gfp
‑
seq id no:1诱导gfp降解，mg132阻断蛋白酶体的降解活性可以抑制gfp的降解。
42.图6为western blot方法检测多肽和抑制剂对目标蛋白的降解作用。
43.图7显示了本发明涉及的多肽片段的序列比对结果。
44.图8显示了本发明与已知降解功能多肽(小鼠鸟氨酸脱羧酶的pest)的降解功能比较。
45.图9显示了seq id no:1的几种突变对降解功能的影响。
46.图10显示了seq id no:1不同截短对降解功能的影响。
47.图11为诱导蛋白质降解靶标蛋白系统的应用示意图，肽段结合在目标蛋白1，目标蛋白2通过与目标蛋白1结合而被降解。
48.图12显示诱导蛋白质降解靶标蛋白系统的应用。
49.图13为多肽诱导融合多肽发生泛素化的示意图。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
51.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
52.本发明中使用了以下试剂：去内毒质粒小提试剂盒(omega公司，d6950
‑
02)，hek293细胞(atcc)，dmem培养基(life，11966025)，fbs(gibco，10099141)，polybrene(merck,tr
‑
1003
‑
g)，lipo3000(life，l3000015)，ripa buffer(cell signaling,9806s)
53.本发明的总体技术示意如图1所示，包括以下部分：质粒的构建、质粒的转染、蛋白质降解检测三个部分。其中e3为e3链接酶复合物，e2为e2链接酶，pep为诱导降解多肽，ub为泛素。
54.实施例1：目标蛋白与降解蛋白融合质粒的构建
55.将表达特定多肽序列和目标蛋白融合，构建融合表达的质粒，测序鉴定后，质粒转染hek293宿主细胞中；质粒转化后，在荧光显微镜下观察，转染成功的细胞显示红色荧光。
56.具体步骤如下：
57.本实施例中，共有两种多肽与目标蛋白质的链接方式，
58.1.本实施例中的质粒为pcdna3.1，mcherry蛋白质作为报告基因，n端是mcherry串联p2a自剪切分离多肽，后面连接gfp
‑
蛋白质降解诱导多肽(简称为gfp
‑
降解诱导多肽，具体实例为seq id no:1)。
59.2.本实施例中的质粒为pcdna3.1，gfp蛋白质作为报告基因，n端是诱导蛋白质降解多肽串联mcherry，串联p2a自剪切分离多肽，后面连接gfp。
60.诱导蛋白质降解多肽序列经过密码子优化后，序列分别如seq id no:1
‑
16所示，将其克隆到pcdna3.1质粒中(由南京金斯瑞公司完成该步骤)，在大肠杆菌中复制，利用去内毒质粒小提试剂盒提纯后用于慢病毒包装(具体实例包括seq id no:1～16，图7显示了seq id no:1
‑
14对应序列氨基酸的比对结果，其中灰色背景显示了氨基酸相对seq id no:1的替换。
61.铺一块6孔板，每孔加5
×
10e5个293细胞，混匀在1ml dmem(life，11966025) 10％fbs(gibco，10099141)中；24小时后，取1.5μg质粒，6μl p3000和125μl dmem加到a管中；取5μl lipo3000(life，l3000015)和125μl dmem加到b管中，室温放置5min；b管溶液全部加到a管，混匀，室温放置5
‑
15min；将混合溶液加到6孔板的1个孔中；6小时后，吸掉样品孔培养基，加入3ml dmem 10％fbs，连续培养24小时。
62.实验结果：导入工程质粒的细胞在荧光显微镜下表现出报告基因荧光，说明重组质粒成功导入到宿主细胞中。
63.表1本发明的多肽片段
64.[0065][0066]
实施例2：针对目标蛋白质的荧光检测
[0067]
本实施例中，24小时后，收集实施例1中的细胞，置于倒置荧光显微镜下，利用488nm的荧光激发波长观察绿色荧光蛋白，利用520nm的荧光激发波长观察mcherry的荧光信号。对照质粒为不含有蛋白质诱导降解多肽的mcherry
‑
p2a串联gfp。
[0068]
实验结果：导入工程质粒的细胞在荧光显微镜下表现出报告基因荧光，说明重组质粒成功导入到宿主细胞中，与降解蛋白串联的蛋白质发生荧光信号衰减。
[0069]
图2的结果说明，seq id no:1无论链接在n端还是c端，都可以有效降解融合的蛋白质。图3的结果说明，seq id no:1、2、4、5可以有效降解目标蛋白质，seq id no:3无法有效降解目标蛋白；图4的结果说明，seq id no:6、7、8、9、10、11、12、13、14与gfp的融合蛋白，可以不同程度地降解目标蛋白质。
[0070]
seq id no:17为小鼠鸟氨酸脱羧酶的pest(脯氨酸(p)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)和苏氨酸(t))序列，是一个已知的降解域，可以促进偶联蛋白的降解，缩短蛋白的半衰期。图8的结果说明，与seq id no:17相比，seq id no:1的降解效果更佳。
[0071]
seq id no:13、15、16分别为seq id no:1突变的序列，从图9的结果可知，与seq id no:1相比，单点突变的seq id no:13不影响降解的效果，截短以后比如seq id no:15和16的序列降解的能力部分减弱。
[0072]
seq id no:3和18分别相对seq id no:1具有c端缺失、n端与c端的缺失的序列。从图10的结果可知，截短以后seq id no:3和18的降解能力减弱了。
[0073]
实施例3：针对目标蛋白质的荧光检测
[0074]
本实施例中，使用实施例1中的细胞，在培养基中加入蛋白酶体抑制剂(mg132)，加
入2.5μm mg132，12小时、24小时和38小时后，置于倒置荧光显微镜下，利用488nm的荧光激发波长观察绿色荧光蛋白，利用520nm的荧光激发波长观察mcherry的荧光信号。对照质粒为不含有蛋白质诱导降解多肽的mcherry
‑
p2a串联gfp。
[0075]
图5的结果说明，抑制剂mg132可以阻断多肽诱导的蛋白质降解，并且随着时间的延长而增加。
[0076]
实施例4：针对目标蛋白质的降解定量分析
[0077]
细胞中分别转入对照质粒gfp，gfp
‑
诱导降解多肽质粒，针对gfp
‑
诱导降解多肽，一个孔不加蛋白酶体抑制剂，另外一个孔在细胞贴壁后加入2.5μm mg132，分析蛋白质凝胶中gfp的条带的量。
[0078]
细胞汇合度长至整个培养皿的70％
‑
80％时，倒掉培养皿中原有的培养基，用枪头吸取磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗2
‑
3次，完全将培养基洗净后，在培养皿中加入适量的细胞裂解液用细胞刮将细胞刮下来。之后将收集到的细胞加入细胞裂解ripa溶液，放置在冰浴中裂解30min，中途要轻轻摇晃细胞使其充分裂解。之后用超声细胞破碎仪超声裂解(超声2s，停5s)，循环5分钟。低温冷冻离心机4℃，20000g条件下离心10min收集上清。对上清使用bca法对总蛋白定量，每个孔加入20μg的总蛋白，用4
‑
12％的梯度聚丙烯酰胺凝胶分离。
[0079]
利用湿法将蛋白质从凝胶转到膜上，按照将胶从胶板中取出泡置在转膜液中平衡，然后将剪好的pvdf膜浸泡在无水甲醇中10秒活化，待膜变成半透明状说明已经活化好，取出泡在转膜液中。然后按照从下到上分别为黑板、海绵、四层滤纸、胶、pvdf膜、滤纸、海绵、透明板的顺序制作三明治转膜板，夹好将板放入转膜槽中，放上冰盒。在冰浴中转膜1h。
[0080]
将pvdf膜取出放在小盒子里，用tbst轻轻冲洗洗一次，然后将其浸泡于5％的奶粉的tbst中(脱脂奶粉溶解于tbst中)，放置在摇床上最小转速摇动，封闭1h，让pvdf膜上没有结合蛋白置的位置也结合上蛋白质，降低一抗非特异性结合。tbst洗膜三次，每次5min；tbst溶解的一抗室温下孵育1小时；洗膜三次，每次5min；tbst溶解的一抗室温下孵育1小时，显影并分析western结果。
[0081]
图6的结果说明，多肽可以诱导结合蛋白的降解，加入蛋白酶体抑制剂mg132可以阻断多肽诱导的蛋白质降解，说明诱导多肽引起的蛋白质降解需要通过蛋白酶体进行，且多肽诱导的降解是通过泛素化
‑
蛋白酶体的机制进行的。
[0082]
实施例5：降解目标蛋白质结合蛋白
[0083]
将seq id no:1和目标蛋白(抗体)融合，构建融合表达蛋白seq id no:19，该抗体在文献中报道(the embo journal(2007)26,3250
–
3259,doi:10.1038/sj.emboj.7601744)可以结合ras蛋白。利用mcherry作为报告基因，构建“mcherry
‑
p2a
‑
抗体
‑
多肽”的质粒，测序鉴定后，质粒转染hek293宿主细胞中；质粒转化后，在荧光显微镜下观察，转染成功的细胞显示红色荧光。用不含有seq id no:1作为对照质粒。
[0084]
同时构建抗体结合目标蛋白(ras)与绿色荧光蛋白(gfp)的融合蛋白，构建gfp
‑
ras蛋白融合表达质粒。
[0085]
铺一块6孔板，每孔加5
×
10e5个293细胞，混匀在1ml dmem(life，11966025) 10％fbs(gibco，10099141)中；24小时后，取上述两种质粒共1.5μg，6μl p3000和125μl dmem加到a管中；取5μl lipo3000(life，l3000015)和125μl dmem加到b管中，室温放置5min；b管溶液全部加到a管，混匀，室温放置5
‑
15min；将混合溶液加到6孔板的1个孔中；6小时后，吸掉
样品孔培养基，加入3ml dmem 10％fbs，连续培养24小时。荧光显微镜观察。
[0086]
结果如图12所示，结果说明将seq id no:1多肽与抗体融合表达，多肽可以诱导融合多肽的抗体从而降解抗体的结合蛋白，该结果也是图11原理的应用。
[0087]
虽然本实施例只提供了一个融合蛋白的实验结果，但本领域技术人员皆知，本发明的多肽片段具有将目标蛋白携带至溶酶体并使之降解的功能，因此，由seq id no:1以外的多肽片段制备的融合蛋白也具有被诱导降解的效果。此外，当其他蛋白与多肽片段结合，或与融合蛋白结合时，也能最终实现被降解的效果。
[0088]
实施例6：诱导目标蛋白质泛素化
[0089]
hek293细胞种在6孔板中，每个孔1
×
106个细胞。hek293细胞中转染ha
‑
ubiquitin质粒(南京金斯瑞公司合成，ha为蛋白质标签，ubiquitin的序列参考kamitani et al j biol chem.1997 nov 7.272(45):28557
‑
62完成)和gfp
‑
seq id no:1或者gfp质粒。48小时后，293细胞用pbs(ph 7.4)润洗一次，然后用ripa裂解液(beyotime,p0013b)裂解，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂(thermo fisher,78440)，在冰上裂解30分钟。细胞裂解液离心10分钟(12000
×
g，4℃)。上清中蛋白质的浓度用bca试剂盒(thermo fisher,23227)定量。25μl抗gfp磁珠(kt health，#ktsm1333)用稀释液(10mm tris/cl ph 7.5,150mm nacl,0.5mm edta)预平衡，接着加入细胞的裂解液在4℃孵育2小时。磁珠洗三次。结合在磁珠上的蛋白用蛋白上样缓冲液煮沸洗脱。上清和输入对照用sds
‑
page胶分离，然后转到pvdf膜上(millipore，#ipvh00010)。pvdf膜在室温封闭1小时，封闭液为tris缓冲溶液，加入0.1％tween20，加入5％的脱脂奶粉。一抗使用抗ubiquitin的抗体(santa cruz biotechnology,sc
‑
8017)，抗gfp(abclonal，ae012)的抗体和抗beta
‑
actin的抗体(genscript，a00702
‑
100)，二抗使用带有hrp标记的羊抗小鼠抗体(abclonal,as003)，然后用显色液(millipore#wbkls0100)显色。
[0090]
结果如图13所示，其中input组代表全部裂解液，其说明两个样品的上样量是一致的。裂解液与抗gfp磁珠孵育进行免疫共沉淀(ip)，其与磁珠结合的蛋白标记为gfp ip，该组结果说明将seq id no:1多肽与抗体融合表达，多肽可以诱导融合多肽发生泛素化。