自然杀伤细胞及其用途的制作方法

自然杀伤细胞及其用途
1.相关申请
2.本技术为2013年8月13日提交的、发明名称为“自然杀伤细胞及其用途”、申请号为201380053349.5的中国发明专利申请的分案申请。
3.1.领域
4.本文提供的是由造血祖细胞群体产生自然杀伤(nk)细胞群体和nk祖细胞群体的方法，例如，由胎盘的细胞，例如由胎盘灌洗液(例如，人胎盘灌洗液)，例如胎盘来源的中间体nk细胞或其它组织(例如，脐带血或外周血)产生nk细胞和nk祖细胞的方法。本文还提供的是通过本文所提供的方法产生的扩增的nk细胞群体，以及分离的nk细胞群体和nk祖细胞。本文进一步提供的是使用本文描述的胎盘灌洗液、nk细胞和/或nk祖细胞抑制肿瘤细胞增殖的方法。在某些实施方式中，将通过本文描述的方法产生的nk细胞和/或nk祖细胞与一种或多种免疫调节化合物(例如，本文中称为的免疫调节化合物)组合使用和/或用所述一种或多种免疫调节化合物处理。
5.2.背景
6.自然杀伤(nk)细胞是构成先天性免疫系统的主要组分的细胞毒性淋巴细胞。nk细胞不表达t-细胞抗原受体(tcr)、cd3或表面免疫球蛋白(ig)b细胞受体。nk细胞一般在人类中表达表面标志物cd16(fcγriii)和cd56，但是人nk细胞的亚类为cd16
–
。nk细胞是细胞毒性的；它们的细胞质中的小颗粒含有特殊的蛋白质，例如穿孔素(perforin)和被称为颗粒酶的蛋白酶。一旦在要杀伤的靶向细胞附近释放，则穿孔素在所述靶细胞的细胞膜中形成孔，颗粒酶及所缔合的分子通过该孔可以进入，从而诱导细胞凋亡。一种颗粒酶，颗粒酶b(也称为颗粒酶2和细胞毒性t-淋巴细胞相关丝氨酸酯酶1)，是对于在细胞介导的免疫应答中快速诱导靶细胞凋亡来说至关重要的丝氨酸蛋白酶。
7.nk细胞对干扰素或者巨噬细胞源性细胞因子响应而被激活。激活的nk细胞有时被称为淋巴因子活化的杀伤(lak)细胞，虽然lak细胞通常为nk细胞、cd56 cd3 nk样t细胞且可能为其它细胞毒性细胞的异质性群体。nk细胞的细胞毒性活性在很大程度上受两种表面受体类型调节，所述受体可被视为“激活受体”或“抑制受体”，尽管有些受体，例如，cd94和2b4，可以视配体相互作用的方式不同而作用不同。
8.在其它活性中，nk细胞在宿主肿瘤排斥中起作用并且已显示能够杀死被病毒感染的细胞。改变或降低自身i类mhc表达水平的癌细胞导致诱导nk细胞敏感性。积累的临床数据表明分离自外周血单核细胞(pbmc)或骨髓的人nk细胞的单倍同一性移植介导了强效的抗白血病效应而不会引起可检测的移植物抗宿主病(gvhd)。参见ruggeri等人,science 295:2097-2100(2002))。自然杀伤细胞可以通过细胞缺少或显示出降低水平的主要组织相容性复合体(mhc)蛋白而被激活。另外，已知nk细胞上表达的激活受体介导了具有激活受体表达配体的“应激”或转化细胞的检测，并因此触发了nk细胞活化。举例来说，ncr1(nkp46)结合病毒血凝素。nkg2d配体包括cmv ul16-结合蛋白1(ulb1)、ulb2、ulb3和mhc-i类多肽相关序列a(mica)和micb蛋白。nk蛋白2b4结合cd48，并且dnam-1结合脊髓灰质炎病毒受体(pvr)和粘连蛋白-2(nectin-2)，两者均在急性髓样白血病(aml)中持续检测到。参见penda
等人,blood 105:2066-2073(2004)。此外，已描述aml的溶胞主要是天然细胞毒性受体(ncr)依赖性的。参见fauriat等人,blood 109:323-330(2007)。激活并扩增的来源于外周血的nk细胞且在有些情况下是lak细胞已在晚期癌症患者的离体疗法(ex vivo therapy)和体内治疗(in vivo treatment)中使用，其中对骨髓相关疾病，如白血病、乳癌和某些类型的淋巴瘤，取得了一定的成功。nk细胞治疗或在有些情形下是lak细胞治疗需要患者首先接受il-2，随后进行白细胞去除术和过继转移(adoptive transfer)。在有些情形下，在过继转移之前还将所收获的自体血细胞在存在il-2的情况下离体孵育和培养几天。必须将nk细胞或在有些情形下是lak细胞与相对高剂量的il-2一起再输注以完成所述疗法。这种净化治疗(purging treatment)是昂贵的并且可引起严重的副作用。这些包括体液潴留、肺水肿、血压降低和高烧。
9.虽然nk细胞在杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞中具有有利性能，但是它们仍难以与免疫疗法一起使用和在免疫疗法中应用，这主要是由于在培养和扩增期间难以维持它们的肿瘤靶向和杀肿瘤能力。因此，本领域需要开发产生并且扩增保留杀肿瘤功能的自然杀伤细胞的有效方法。
10.3.概述
11.本文提供的是扩增并且分化细胞(例如，造血细胞，例如造血干细胞，例如cd34

造血干细胞)以产生自然杀伤(nk)细胞和nk祖细胞的方法。
12.在一个方面，本文提供的是产生nk细胞的方法，包括在第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞(例如，cd34

干细胞或祖细胞)以产生扩增并且分化的细胞(例如，如通过细胞的祖先状态丧失和/或cd34表达丧失所证明的分化)，并随后在第二培养基中培养所述扩增的细胞，其中所述细胞进一步扩增并分化成自然杀伤细胞。该第一步骤和第二步骤包括在含有细胞因子的独特组合的培养基中培养细胞。一般而言，第一步骤中使用的培养基与第二步骤中使用的培养基不相同。在某些实施方式中，所述细胞的因子(例如，细胞因子)不包含在培养基的不明确的组分(例如，血清)中，举例来说，所述细胞的因子(例如，细胞因子，例如特定浓度的细胞因子)对于培养基的不明确的组分(例如，血清)来说是外源的。在某些实施方式中，所述方法是两步方法。在某些实施方式中，将第二步骤的培养基加入到来自第一步骤的细胞培养物中而无需改变来自第一步骤的培养基。在某些实施方式中，所述方法不包括其中接触(或培养)细胞的任何第三步骤或中间步骤。通过使用这两个步骤(例如，两步方法)的本文提供的方法产生的自然杀伤细胞在本文中被称为tsnk细胞。
13.在一个具体的实施方式中，本文提供的是产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的方法，其包括：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含外源白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或两种的第一培养基中，其中所述外源il-15和可选的scf和il-7是在所述培养基的非限定成分(undefined component)中存在的il-15、scf或il-7的量(如果有的话)之外附加的，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞分化为nk细胞；和(b)将来自第一步骤的细胞在包含外源白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，其中所述外源il-2是在所述培养基的非限定成分中存在的il-2的量(如果有的话)之外附加的，以产生激活的nk细胞群体。
14.在某些实施方式中，所述第一培养基包括含有白介素-15(il-15)，例如1ng/ml至50ng/ml；和人血清(例如，人血清ab)、胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)或小牛血清
(fetal calf serum,fcs)，例如1％至20％v/v，例如5％至20％v/v，干细胞因子(scf)，例如1ng/ml至50ng/ml，fms样酪氨酸激酶-3配体(flt-3配体)，例如1ng/ml至20ng/ml；白介素-7(il-7)，例如1ng/ml至50ng/ml；促血小板生成素(thrombopoietin,tpo)，例如1ng/ml至100ng/ml，例如1ng/ml至50ng/ml；白介素-2(il-2)，例如至多2000iu/ml，例如50iu/ml至500iu/ml；和/或肝素，例如0.1iu/ml至10iu/ml中的一种或多种的培养基。在一个具体的实施方式中，所述第一培养基包含il-15和干细胞因子(scf)或白介素-7(il-7)。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基包含il-15、scf和il-7。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基包含生长培养基、血清(例如，人血清(例如，人血清ab)、fbs或fcs)、scf、il-7和il-15。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基还包含flt-3配体(flt3-l)、tpo、il-2和/或肝素。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基包含生长培养基、10％人血清或胎牛血清、20ng/ml scf、10ng/ml flt3-l、20ng/ml il-7、20ng/ml tpo、200iu/ml il-2、10ng/ml il-15和1.5iu/ml肝素。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基不包含il-2。
15.在某些实施方式中，所述第一培养基包含x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm
h5100、imdm和/或rpmi-1640。在某些实施方式中，所述培养基包含o-乙酰基-肉毒碱(也称为乙酰肉毒碱、o-乙酰基-l-肉毒碱、oac或alcar)，例如约0.5mm-10mm。在一个实施方式中，所述培养基包含h3000和/或dmem:f12。在另一个实施方式中，所述培养基包含oac，例如约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm，和h3000和/或dmem:f12。在一个具体的实施方式中，所述培养基包含在另一个具体的实施方式中，所述培养基包含dmem:f12和约5mm的oac。在另一个具体的实施方式中，所述培养基包含h3000和约5mm的oac。
16.在某些实施方式中，在所述第一培养基中的所述培养包括使用饲养细胞，例如k562细胞，例如丝裂霉素c处理的k562细胞；外周血单核细胞(pbmc)，例如丝裂霉素c处理的pbmc；或组织培养贴壁干细胞，例如丝裂霉素c处理的组织培养贴壁干细胞的培养。在另一个实施方式中，在所述第一培养基中的所述培养不包括使用饲养细胞的培养。
17.在某些实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含il-2，例如10iu/ml至1000iu/ml；和人血清(例如，人血清ab)、胎牛血清(fbs)或小牛血清(fcs)，例如5％-15％fcs v/v；转铁蛋白，例如10μg/ml至50μg/ml；胰岛素，例如5μg/ml至20μg/ml；乙醇胺，例如5x10
–4至5x10
–5m；油酸，例如0.1μg/ml至5μg/ml；亚油酸，例如0.1μg/ml至5μg/ml；棕榈酸，例如0.05μg/ml至2μg/ml；牛血清白蛋白(bsa)，例如1μg/ml至5μg/ml；和/或植物凝集素，例如0.01μg/ml至1μg/ml中的一种或多种。在一个更具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含人血清、fbs或fcs(例如，10％v/v)、il-2、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白(bsa)和/或植物凝集素。在一个更具体的实施方式中，所述第二培养基包含伊思考夫改良杜尔贝可培养基(iscove’s modified dulbecco’smedium,imdm)、10％人血清、fbs或fcs、400iu/ml il-2、35μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、2x10-5
m乙醇胺、1μg/ml油酸、1μg/ml亚油酸、0.2μg/ml棕榈酸、2.5μg/ml bsa和
0.1μg/ml植物凝集素。
18.在某些实施方式中，所述第二培养基包含x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、el08-1d2、高级dmem(gibco)、myelocult
tm
h5100、imdm和/或rpmi-1640。在某些实施方式中，所述培养基包含o-乙酰基-肉毒碱或影响线粒体中乙酰-coa循环的化合物、thiazovivin、y-27632、pyintegrin、rho激酶(rock)抑制剂、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂或其它抗凋亡化合物/肽、nova-rs(sheffield bio-science)或其它小分子生长增强剂中的一种或多种。在某些实施方式中，所述培养基包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，所述培养基包含约0.5mm-10mm oac。在一个实施方式中，所述培养基包含h3000和/或dmem:f12。在另一个实施方式中，所述培养基包含oac，例如约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm，和h3000和/或dmem:f12。在一个具体的实施方式中，所述培养基包含在另一个具体的实施方式中，所述培养基包含dmem:f12和约5mm的oac。在另一个具体的实施方式中，所述培养基包含h3000和约5mm的oac。
19.在某些实施方式中，在所述第二培养基中的所述培养包括使用饲养细胞，例如k562细胞(例如，丝裂霉素c处理的k562细胞)或pbmc(例如，丝裂霉素c处理的pbmc)的培养，例如在细胞开始在所述第二培养基中的时间时，或者此后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天时。在另一个实施方式中，在所述第二培养基中的所述培养不包括使用饲养细胞的培养。在某些实施方式中，将第二培养基加入到来自第一培养步骤的细胞中而无需去除第一培养基。
20.在一个具体的实施方式中，本文提供的是产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的方法，其包括：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到如本文描述的第一培养基(例如，包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基)中，其中所述il-15和可选的scf和il-7是在所述培养基的非限定成分中存在的il-15、scf或il-7的量(如果有的话)之外附加的，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，其中所述il-2是在所述培养基的非限定成分中存在的il-2的量(如果有的话)之外附加的，以产生激活的nk细胞群体。
21.在另一个具体的实施方式中，本文提供的是产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的两步方法，其中所述方法的第一步骤包括在包含scf、il-7和il-15中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，其中所述scf、il-7和il-15是在所述培养基的非限定成分(例如，血清)中存在的il-15、scf或il-7的量(如果有的话)之外附加的，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和其中所述方法的第二步骤包括在包含il-2的第二培养基中扩增来自第一步骤的细胞，其中所述il-2是在所述培养基的非限定成分中存在的il-2的量(如果有的话)之外附加的，以产生激活的nk细胞。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基还包含fms样-酪氨酸激酶3配体(flt3-l)、促血小板生成素(tpo)、白介素-2(il-2)和/或肝素中的一种或多种(在
所述培养基的非限定成分中存在的量(如果有的话)之外附加的)。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基还包含约5％-20％胎牛血清或人血清。在另一个具体的实施方式中，所述scf在所述第一培养基中以约1至约150ng/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述flt3-l在所述第一培养基中以约1至约150ng/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述il-2在所述第一培养基中以约50至约1500iu/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述il-7在所述第一培养基中以约1至约150ng/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述il-15在所述第一培养基中以1至约150ng/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述tpo在所述第一培养基中以约1至约150ng/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述肝素在所述第一培养基中以约0.1至约30u/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，第二步骤中的所述il-2在所述第二培养基中以50至约1500iu/ml的浓度存在。在另一个具体的实施方式中，所述第二培养基另外包含小牛血清(fcs)、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白(bsa)和植物凝集素中的一种或多种(在所述培养基的非限定成分中存在的量(如果有的话)之外附加的)。
22.在某些具体的实施方式中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在某些其它具体的实施方式中，将所述细胞在所述第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在一个更具体的实施方式中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养21天，然后在所述第二培养基中培养21天。在另一个具体的实施方式中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养21天，然后在所述第二培养基中培养14天。
23.本文进一步提供的是通过以上描述的方法产生的自然杀伤细胞群体，在本文中称为tsnk细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)是cd3
–
cd56

。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)是cd3
–
cd56

cd16
–
。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)另外是cd94

cd117

。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)另外是cd161
–
。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)另外是nkg2d

。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞另外是nkp46

。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞另外是cd226

。
24.在某些实施方式中，大于90％、92％、94％、96％或98％的所述tsnk细胞是cd56

和cd16
–
。在有些实施方式中，至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的所述tsnk细胞是cd3
–
和cd56

。在其它实施方式中，大于90％、92％、94％、96％或98％的所述tsnk细胞是cd56

、cd16
–
和cd3
–
。在其它实施方式中，至少50％、52％、54％、56％、58％或60％的所述tsnk细胞是nkg2d

。在其它实施方式中，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的所述tsnk细胞是nkb1

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是nkat2

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是cd56

和cd16

。在更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％或70％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是nkp46

。在其它更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd117

。在其它更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％、40％或45％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd94

。在其它更具体的实施方式中，至少
10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd161
–
。在其它更具体的实施方式中，至少10％、12％、14％、16％、18％或20％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd226

。在更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％或40％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd7

。在更具体的实施方式中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd5

。
25.在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd117

细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含nkg2d 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkg2d

细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含nkp44 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkp44

细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd52 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52

细胞。在一个特定的实施方式中，tsnk细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd244 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd244

细胞。在一个特定的实施方式中，tsnk细胞群体包含cd244 cd117 细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含lfa-1 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％lfa-1 细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd94 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd94 细胞。
26.在另一个方面，本文提供的是包含产生nk细胞群体或nk祖细胞群体的本文描述的三个阶段的方法(和本文中称为“三阶段方法”)。通过使用这三个阶段(例如，三阶段方法)的本文提供的方法产生的自然杀伤细胞在本文中被称为通过三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞。在某些实施方式中，所述方法不包括其中接触(或培养)所述细胞的任何第四步骤或中间步骤。
27.在某些方面，所述三阶段方法包括第一阶段(“第1阶段”)，其包括将造血干细胞或祖细胞(例如，cd34

干细胞或祖细胞)在第一培养基中培养规定的时间周期，例如，如本文所描述的。在某些实施方式中，所述第一培养基含有促进造血祖细胞扩增的一种或多种因子、启动扩增中的造血祖细胞群体内的淋巴样细胞分化的一种或多种因子和/或模拟基质饲养细胞支持物(stromal feeder support)的一种或多种因子。在某些实施方式中，所述第一培养基包含一种或多种细胞因子(例如，flt3l、tpo、scf)。在某些实施方式中，所述第一培养基包含il-7。在某些实施方式中，所述第一培养基包含亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和/或gm-csf。在一个具体的实施方式中，所述第一培养基包含细胞因子flt3l、tpo和scf、il-7和亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和gm-csf。在具体的实施方式中，在所述第一培养基中，
cd34 细胞经历扩增成为谱系特异性祖细胞，该祖细胞然后变成cd34-。在某些实施方式中，在所述第一培养基中，cd34 细胞的扩增与细胞的分化相偶联(例如，如多潜能性丧失、祖细胞状态丧失、cd34表达丧失和/或cd34-谱系特异性祖细胞增加所证明的分化)。在某些实施方式中，在所述第一培养基中，cd34-谱系特异性祖细胞变成占优势的。在某些实施方式中，在第1阶段结束时，所述cd34-细胞占总群体的超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％或80％以上。在一个更具体的实施方式中，在第1阶段结束时，cd34-细胞占总群体的超过80％。
28.随后，在“第2阶段”中，将所述细胞在第二培养基中培养规定的时间周期，例如，如本文所描述的。在某些实施方式中，所述第二培养基含有可促进淋巴样细胞祖先进一步扩增的因子、可有助于沿着nk谱系发育的因子和/或模拟基质饲养细胞支持物的因子。在某些实施方式中，所述第二培养基包含一种或多种细胞因子(例如，flt3l、scf、il-15和/或il-7)。在某些实施方式中，所述第二培养基包含il-17和/或il-15。在某些实施方式中，所述第二培养基包含亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和/或gm-csf。在一个具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞因子flt3l、scf、il-15和il-7、il-17和il-15和亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和gm-csf。
29.随后，在“第3阶段”中，将所述细胞在第三培养基中培养规定的时间周期，例如，如本文所描述的。在某些实施方式中，所述第三培养基包含促进cd56 cd3-cd16-细胞的分化和功能性活化的因子。在一个实施方式中，这样的因子包含il2和il12和il18、il12和il15、il12和il18、il2和il12和il15和il18、或il2和il15和il18。在某些实施方式中，所述第三培养基包含模拟基质饲养细胞支持物的因子。在某些实施方式中，所述第三培养基包含一种或多种细胞因子(例如，scf、il-15、il-7、il-2)。在某些实施方式中，所述第三培养基包含亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和/或gm-csf。在一个具体的实施方式中，所述第三培养基包含细胞因子scf、il-15、il-7、il-2和亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和gm-csf。
30.在一个具体的实施方式中，所述三阶段方法用于产生nk祖细胞。在另一个具体的实施方式中，所述三阶段方法用于产生nk细胞。在某些实施方式中，所述三阶段方法用于产生激活的nk细胞。在某些实施方式中，所述三阶段方法在不存在基质饲养细胞支持物的情况下实施。
31.在某些实施方式中，将第2阶段培养基和/或第3阶段培养基加入到培养物中而无需除去来自前一个或多个阶段的培养基。在某些实施方式中，将第2阶段培养基加入到第1阶段培养物中而无需除去来自第1阶段培养的培养基，然后将第3阶段培养基加入到第2阶段培养物中而无需除去来自第2阶段培养的培养基。
32.在某些方面，本文描述的三阶段方法中使用的第一培养基可含有以上描述的以及该两步方法中的第一培养基和第二培养基的任意组分。在某些实施方式中，该三阶段方法中使用的所述第一培养基包括包含一种或多种以下成分的培养基：动物血清，例如人血清(例如，人血清ab)、胎牛血清(fbs)或小牛血清(fcs)，例如1％至20％v/v血清，例如5％至20％v/v血清；干细胞因子(scf)，例如1ng/ml至50ng/ml scf；fms样酪氨酸激酶-3配体(flt-3配体)，例如1ng/ml至30ng/ml flt-3配体；白介素-7(il-7)，例如1ng/ml至50ng/ml il-7；促血小板生成素(tpo)，例如1ng/ml至100ng/ml，例如1ng/ml至50ng/ml tpo；白介素-2(il-2)，例如至多2000iu/ml，例如50iu/ml至500iu/ml；和/或肝素，例如低分子量肝素
(lwh)，例如0.1iu/ml至10iu/ml肝素。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含以下成分中的一种或多种：抗生素，例如庆大霉素；抗氧化剂，例如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含oac。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含白介素-6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、g-csf、gm-csf和/或mip-1α。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，为第一培养基提供基础的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养培养基，例如商购的细胞/组织培养培养基，例如x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640；或是包含一般在已知细胞/组织培养培养基中所包括的组分的培养基，例如在包括的组分的培养基，例如在x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640中所包括的组分。
33.本文描述的三阶段方法中使用的第二培养基可含有以上描述的以及该两步方法中的第一培养基和第二培养基的任意组分。在某些实施方式中，该三阶段方法中使用的所述第二培养基包括包含一种或多种以下成分的培养基：动物血清，例如人血清(例如，人血清ab)、fbs或fcs，例如5％至20％v/v血清；scf，例如1ng/ml至50ng/ml scf；flt-3配体，例如1ng/ml至30ng/ml flt-3配体；il-7，例如1ng/ml至50ng/ml il-7；白介素-15(il-15)，例如1ng/ml至50ng/ml il-15；和/或肝素，例如lwh，例如0.1iu/ml至10iu/ml肝素。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含以下成分中的一种或多种：抗生素，例如庆大霉素；抗氧化剂，例如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含oac。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含白介素-6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、g-csf、gm-csf和/或mip-1α。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，为第二培养基提供基础的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养培养基，例如商购的细胞/组织培养培养基，例如x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm
h5100、imdm和/或rpmi-1640；或是包含一般在已知细胞/组织培养培养基中所包括的组分的培养基，例如在x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640中所包括的组分。
34.本文描述的三阶段方法中使用的第三培养基可含有以上描述的以及该两步方法
中的第一培养基和第二培养基的任意组分。在某些实施方式中，该三阶段方法中使用的所述第三培养基包括包含一种或多种以下成分的培养基：动物血清，例如人血清(例如，人血清ab)、fbs或fcs，例如5％至20％v/v血清；scf，例如1ng/ml至50ng/ml scf；flt-3配体，例如1ng/ml至30ng/ml flt-3配体；il-7，例如1ng/ml至50ng/ml il-7；il-15，例如1ng/ml至50ng/ml il-15；和白介素-2(il-2)，例如在0至2000iu/ml，例如50iu/ml至1000iu/ml il-2的范围内。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含以下成分中的一种或多种：抗生素，例如庆大霉素；抗氧化剂，例如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含oac。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含白介素-6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、g-csf、gm-csf和/或mip-1α。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，为第三培养基提供基础的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养培养基，例如商购的细胞/组织培养培养基，例如x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、el08-1d2、高级dmem(gibco)、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640；或是包含一般在已知细胞/组织培养培养基中所包括的组分的培养基，例如在x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640中所包括的组分。
35.在某些实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方式中，将所述第一培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方式中，将所述第一培养基和所述第二培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，或超过30天。
36.在某些实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养2-12天、3-11天，例如3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10或9-11天。在某些实施方式中，将所述第一培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养1-10天，例如1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8或7-9天。在某些实施方式中，将所述第一培养基和所述第二培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中培养2-27天，例如3-25天，例如3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19、18-20、19-21、20-22、21-23、22-24或23-25天。
37.在一个实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养7-9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5-7天；和在所述第三培养基中培养5-9天，即，将该细胞培养合计17-25天。
38.在一个具体的实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5天；和在所述第三培养基中培养7天，即，将该细胞总共培养21天。
39.在一个实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养7-9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5-7天；和在所述第三培养基中培养21-31天，即，将该细胞总共培养33-47天。
40.在一个具体的实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5天；和在所述第三培养基中培养21天，即，将该细胞总共培养35天。
41.在一个实施方式中，本文提供的是分离的nk祖细胞群体，其中所述nk祖细胞根据本文描述的三阶段方法来产生。
42.在另一个实施方式中，本文提供的是分离的nk细胞群体，其中所述nk细胞根据本文描述的三阶段方法来产生。
43.在另一个实施方式中，本文提供的是分离的nk细胞群体，其中所述nk细胞被激活，其中所述活化nk细胞根据本文描述的三阶段方法来产生。
44.虽然不受任何特定操作理论的束缚，但是本发明的发明人已经发现，在所述三阶段方法的某些时间点，可以分离出具有以下特征(例如，结构和功能特征)的细胞群体，所述特征区别于在所述三阶段方法的其它时间点分离的细胞群体的特征。例如，使用如本文描述的具有较短第三培养步骤的三阶段方法产生的细胞群体具有区别于使用如本文描述的具有较长第三步骤的三阶段方法产生的细胞群体的特征。例如，在所有其他都相同的情况下，分离自具有短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法的细胞群体区别于分离自具有长的第三培养步骤(例如，18-20、19-21、20-22或21-23天的第三培养步骤)的三阶段方法的细胞群体。这种分离自具有短的第三培养步骤的三阶段方法的截然不同的细胞群体构成了nk祖细胞群体(即，构成了包含nk祖细胞的百分比高于nk细胞的细胞群体)，而分离自具有长的第三培养步骤的三阶段方法的细胞群体构成了nk细胞群体(即，构成了包含nk细胞的百分比高于nk祖细胞的细胞群体)。
45.因此，本文提供的是通过本文描述的三阶段方法产生的分离的nk祖细胞群体。在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体(例如，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体)相关的cd3
–
cd56

细胞的百分比相比，所述nk祖细胞群体包含低百分比的cd3
–
cd56

细胞，例如该nk祖细胞群体包含约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd3
–
cd56

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd3
–
cd56

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd3
–
cd56

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体(例如，同与nk细胞群体相关的cd3
–
cd56

细胞的百分比相比，包含低百分比的cd3
–
cd56

细胞的nk祖细胞群体)包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过
4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd3
–
cd56

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。在特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含比cd56 细胞的比例高的cd56-细胞。在特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体在体内或离体分化为具有cd56 细胞比例增加的群体。
46.在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞另外是cd117

。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的在65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％之间的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。
47.在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞另外是cd161

。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd161

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd161

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的在40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％或70％-75％之间的所述cd3
–
cd56

细胞是cd161

。
48.在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞另外是nkp46

。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或90％以上的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在一个更具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的约25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的在25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％或85％-90％之间的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在一个更具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中的在25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％或50％-55％之间的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。
49.在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体含有cd56

cd16
–
细胞。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的cd3
–
cd56

细胞是cd16
–
。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的cd3
–
cd56

细胞是cd16

。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd16

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％或20％-25％之间的cd16

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd16

细胞。
50.在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞另外是cd16-。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞另外是cd117

和cd161

。在某些
6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生的nk祖细胞比使用包含较长的第三培养步骤(例如，18-20、19-21、20-22或21-23天的第三培养步骤)的三阶段方法产生的nk细胞以较高的效率植入骨髓(例如，体内)。
53.在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd161

细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的cd161 细胞，例如该nk祖细胞群体包含约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd161

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd161

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd161

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd161

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
54.在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的nkp46

细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的nkp46

细胞，例如该nk祖细胞群体包含约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％nkp46

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％nkp46

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的nkp46

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％nkp46

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
55.在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd56

cd16-细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的cd56

cd16-细胞，例如该nk祖细胞群体包含约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd56

cd16-细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd56

cd16-细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd56

cd16-细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd56

cd16-细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
56.在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，同与造血祖细胞群体相关的cd52

cd117 细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含较高百分比的cd52

cd117
细胞。在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd52

cd117 细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含较高百分比的cd52

cd117 细胞，例如该nk祖细胞群体包含约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或90％以上的cd52

cd117 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不少于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52

cd117 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％之间或95％以上的cd52

cd117 细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。在一个具体的实施方式中，包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含总共培养12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长、16天或更长、17天或更长、18天或更长、19天或更长、20天或更长或21天或更长的三阶段方法产生。在一个具体的实施方式中，包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含总共培养至少12天、13天或14天但培养不超过21-25天、25-30天或30-35天的三阶段方法产生。在一个具体的实施方式中，包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含总共培养21天的三阶段方法产生。
57.本文进一步提供的是通过本文描述的三阶段方法产生的分离的nk细胞群体，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较大百分比的cd3
–
cd56

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％cd3
–
cd56

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％cd3
–
cd56

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含在65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％之间的cd3
–
cd56

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk细胞群体使用包含长的第三培养步骤(例如，18-20、19-21、20-22或21-23天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
58.在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是cd117

，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较小百分比的cd3
–
cd56

cd117

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。
59.在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是cd161

，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较小百分比的cd3
–
cd56

cd161

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。
60.在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是nkp46

，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体
相比包含较大百分比的cd3
–
cd56

nkp46

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。
61.在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd117

细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含nkg2d 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkg2d

细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含nkp44 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkp44

细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd52 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52

细胞。在一个特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd244 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd244

细胞。在一个特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk细胞群体包含cd244 cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含lfa-1 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％lfa-1 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd94 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd94 细胞。
62.在一个具体的实施方式中，本文描述的nk祖细胞群体比nk细胞群体(例如，本文描述的nk细胞群体，例如与该nk祖细胞群体相比，具有较高百分比的cd56 细胞的nk细胞群体)具有植入骨髓(例如，体内)的更大能力。在一个具体的实施方式中，本文描述的nk祖细胞群体比nk细胞群体(例如，本文描述的nk细胞群体，例如具有高百分比的cd16 细胞的nk细胞群体)具备植入骨髓(例如，体内)的更大能力。在某些实施方式中，培养较短时间周期的nk祖细胞和/或nk细胞比培养较长时间周期的nk祖细胞和/或nk细胞以高于的效率植入骨髓。例如，在某些实施方式中，使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生的nk祖细胞群体比使用包含长的第三培养步骤(例如，18-20、19-21、20-22或21-23天的第三培养步骤)的三阶段方法产生的nk细胞群体以较高的效率植入骨髓(例如，体内)。本文描述的nk祖细胞群体的植入细胞也能够在体内(例如，在骨髓中)持续存在并且复制。虽然不受任何特定操作理论的束缚，但是相信本文描述的nk祖细胞群体的植入细胞比nk细胞群体的细胞以更大程度既在体内植入骨髓又在体内永存/复制的能力表明，这样的细胞对于用在nk细胞活性是有益的体内方法中是理想的。例如，在某
些实施方式中，本文描述的nk祖细胞群体可以在治疗(例如，造血系统癌症的治疗)的方法中使用，其中所述方法包括将所述nk祖细胞群体给予需要这种治疗的患者。根据这样的实施方式所述，来自这类nk祖细胞群体的所述细胞可以在体内持续高数目存在，最终成熟为nk细胞，从而获得所需的治疗效果。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体可以与促进nk祖细胞群体的细胞分化/成熟为nk细胞的第二药剂共同给予，例如，能够诱导nk细胞成熟/分化的第二药剂可以在将所述nk祖细胞群体给予所述患者之前、同时或之后给予。
63.因此，在另一个方面，本文提供的是tsnk细胞；和/或本文描述的nk祖细胞群体和/或使用本文描述的三阶段方法分离的nk细胞群体抑制肿瘤细胞增殖、治疗病毒感染或治疗癌症(例如，血液癌症和实体肿瘤)的用途。在某些实施方式中，所述tsnk细胞、nk祖细胞群体和/或nk细胞群体与免疫调节化合物(例如，本文描述的免疫调节化合物)或沙利度胺接触或与其联合使用。在某些实施方式中，所述tsnk细胞、nk祖细胞群体和/或nk细胞群体用免疫调节化合物(例如，本文描述的免疫调节化合物)或沙利度胺处理或与其联合使用。
64.在一个具体的实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在另一个实施方式中，所述癌症是血液癌症。在具体的实施方式中，所述癌症是成胶质细胞瘤、原发性导管癌、白血病、急性t细胞白血病、慢性髓样淋巴瘤(cml)、急性髓细胞白血病(aml)、慢性髓细胞白血病(cml)、肺癌、结肠腺癌、组织细胞性淋巴瘤、结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤或视网膜母细胞瘤。
65.在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞和/或从中产生nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)获自胎盘灌洗液、脐带血或外周血。在一个实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞和/或从中产生nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)获自胎盘，例如胎盘灌洗液。在一个实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞和/或从中产生nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)不获自脐带血。在一个实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞和/或从中产生nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)不获自外周血。在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞和/或从中产生nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)是来自胎盘灌洗液和脐带血(例如，来自与灌洗液相同的胎盘的脐带血)的混合细胞。在另一个具体的实施方式中，所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，可以通过合并或混合脐带血和胎盘灌洗液来获得混合的细胞。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比混合以获得所述混合的细胞。在一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5或3:1至1:3的比率混合。在另一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率混合。在一个更具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5(85％:15％)的比率混合。
66.在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:
20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的总有核细胞(tnc)含量的比率混合以获得所述混合的细胞。在一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5或3:1至1:3的比率混合。在另一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率混合。
67.在一个实施方式中，因此，本文提供的是治疗患有癌症或病毒感染的个体的方法，包括向所述个体给予有效量的分离的tsnk细胞。在另一个实施方式中，本文提供的是治疗患有癌症或病毒感染的个体的方法，包括向所述个体给予有效量的本文描述的分离的nk祖细胞群体，例如使用所描述的三阶段方法产生的分离的nk祖细胞群体。在另一个实施方式中，本文提供的是治疗患有癌症或病毒感染的个体的方法，包括向所述个体给予有效量的使用本文描述的三阶段方法产生的分离的nk细胞群体。在某些实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。在某些实施方式中，所述癌症是血液癌症。在一个具体的实施方式中，所述血液癌症是白血病。在另一个具体的实施方式中，所述血液癌症是淋巴瘤。在另一个具体的实施方式中，所述血液癌症是急性髓样白血病。在另一个具体的实施方式中，所述血液癌症是慢性淋巴细胞白血病。在另一个具体的实施方式中，所述血液癌症是慢性髓细胞白血病。
68.在一个具体的实施方式中，所述分离的tsnk细胞和/或本文描述的分离的nk祖细胞群体和/或使用本文描述的三阶段方法分离的nk细胞群体已经在所述给药之前用免疫调节化合物(例如，本文描述的免疫调节化合物)或沙利度胺处理。在一个具体的实施方式中，所述分离的tsnk细胞和/或本文描述的分离的nk祖细胞群体和/或使用本文描述的三阶段方法分离的nk细胞群体已经在所述给药之前用il2和il12和il18、il12和il15、il12和il18、il2和il12和il15和il18、或il2和il15和il18处理。在另一个具体的实施方式中，所述方法包括向所述个体给予(1)有效量的分离的tsnk细胞、有效量的分离的nk祖细胞群体或有效量的分离的nk细胞群体(使用本文描述的三阶段方法产生)；和(2)有效量的免疫调节化合物或沙利度胺。在本文的上下文中，“有效量”意指与患有所述癌症或所述感染但未曾给予所述tsnk细胞、所述nk祖细胞群体或所述nk细胞群体和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的个体相比，导致所述癌症或所述感染的一种或多种症状的可检测的改善的tsnk细胞的量或nk祖细胞群体或nk细胞群体中的细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的量。在一个具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是来那度胺(lenalidomide)或泊马度胺(pomalidomide)。在另一个实施方式中，所述方法另外包括向所述个体给予抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
69.在另一个实施方式中，本文提供的是抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使治疗有效量的tsnk细胞与所述肿瘤细胞接近，例如，使所述肿瘤细胞与所述tsnk细胞接触。在下文中，除非另有说明，否则术语“接近(proximity)”是指足够接近以致引发所需要的结果；例如，在某些实施方式中，术语接近是指接触。在另一个实施方式中，本文提供的是抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使治疗有效量的使用本文描述的三阶段方法产生的分离的nk祖细胞群体与所述肿瘤细胞接近，例如使所述肿瘤细胞与所述nk祖细胞接触。
70.在一个具体的实施方式中，使用本文描述的三阶段方法产生的所述分离的tsnk细
胞和/或所述分离的nk祖细胞群体或nk细胞群体在所述接触或引起接近(bringing into proximity)之前已经用免疫调节化合物(例如，以下本文描述的免疫调节化合物)或沙利度胺和/或il2和il12和il18、il12和il15、il12和il18、il2和il12和il15和il18、或il2和il15和il18进行处理。在另一个具体的实施方式中，使有效量的免疫调节化合物(例如，以下本文描述的免疫调节化合物)或沙利度胺另外与所述肿瘤细胞接近，例如，使所述肿瘤细胞与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触。在本文的上下文中，“有效量”意指同与所述tsnk细胞、nk祖细胞群体中的细胞或nk细胞群体中的细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺未接触或引起接近的相等个数的肿瘤细胞相比，导致所述肿瘤细胞的可检测抑制的tsnk细胞、nk祖细胞群体中的细胞或nk细胞群体中的细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的量。在另一个具体的实施方式中，所述方法还包括使有效量的抗癌化合物(例如，以下描述的抗癌化合物)与所述肿瘤细胞接近，例如，使所述肿瘤细胞与所述抗癌化合物接触。
71.在该方法的一个具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是血液癌症细胞。在另一个具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。在另一个实施方式中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、慢性髓样淋巴瘤(cml)细胞、急性髓细胞白血病细胞(aml)、慢性髓细胞白血病(cml)细胞、成胶质细胞瘤细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、结肠直肠癌细胞、前列腺癌细胞或结肠直肠腺癌细胞。在另一个具体的实施方式中，所述接触或引起接近发生在体外。在另一个具体的实施方式中，所述接触或引起接近发生在体内。在一个更具体的实施方式中，所述体内接触或引起接近发生在人体内。
72.在另一个方面，本文提供的是治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括向所述个体给予(1)来那度胺；(2)美法仑；和(3)扩增的nk细胞，其中所述nk细胞对于治疗所述个体的多发性骨髓瘤来说是有效的。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞是脐带血nk细胞或由脐带血造血细胞(例如，造血干细胞)产生的nk细胞。在另一个实施方式中，已通过本文描述的用于产生nk细胞的任何方法(例如，用于产生tsnk细胞的方法或使用三阶段方法产生nk细胞群体的方法)产生了所述nk细胞。在另一个实施方式中，所述nk细胞已在所述给予之前被扩增。在另一个实施方式中，所述来那度胺、美法仑和/或nk细胞是彼此单独给予的。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞是通过产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的两步方法产生的，其中所述方法的第一步骤包括在包含干细胞因子(scf)、白介素-7(il-7)和白介素-15(il-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，和其中所述scf、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和其中所述方法的第二步骤包括在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增来自第一步骤的细胞，以产生激活的nk细胞。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞群体通过如本文所描述的三阶段方法产生。
73.在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的其它具体的实施方式中，所述nk细胞通过包括以下步骤的方法产生：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩
增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体。
74.在另一个方面，本文提供的是治疗患有急性髓细胞白血病(aml)的个体的方法，包括向所述个体给予扩增的nk细胞(可选地通过用il2和il12和il18、il12和il15、il12和il18、il2和il12和il15和il18、或il2和il15和il18预处理而激活)，其中所述nk细胞对于治疗所述个体的aml来说是有效的。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞是脐带血nk细胞或由脐带血造血细胞(例如，造血干细胞)产生的nk细胞。在另一个实施方式中，已通过本文描述的用于产生nk细胞的任何方法(例如，用于产生tsnk细胞方法或使用如本文阐述的三阶段方法产生nk细胞群体的方法)产生了所述nk细胞。在另一个实施方式中，所述nk细胞已在所述给予之前被扩增。在治疗患有aml的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞通过产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的两步方法产生，其中所述方法的第一步骤包括在包含干细胞因子(scf)、白介素-7(il-7)和白介素-15(il-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，和其中所述scf、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和其中所述方法的第二步骤包括在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增来自第一步骤的细胞，以产生激活的nk细胞。在治疗患有aml的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞群体通过如本文所描述的三阶段方法产生。在一个特定的实施方式中，通过上述方法治疗的aml包含难治性aml、预后差aml或儿童aml。
75.在治疗患有aml的个体的方法的其它具体的实施方式中，所述nk细胞通过包括以下步骤的方法产生：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体。
76.在另一个方面，本文提供的是治疗患有慢性淋巴细胞白血病(cll)的个体的方法，包括向所述个体给予治疗有效剂量的(1)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；和(4)扩增的nk细胞(例如tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体，其中所述nk细胞对于治疗所述个体的所述cll来说是有效的。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞是脐带血nk细胞或由脐带血造血细胞(例如，造血干细胞)产生的nk细胞。在另一个实施方式中，已通过本文描述的用于产生nk细胞的任何方法(例如，用于产生tsnk细胞的方法或使用本文描述的三阶段方法产生nk细胞群体的方法)产生了所述nk细胞。在任何上述方法的一个具体的实施方式中，所述nk细胞在所述给予之前已扩增至少10天。在任何上述方法的一个具体的实施方式中，将所述来那度胺、美法仑、氟达拉滨和扩增的nk细胞单独地给予所述个体。在治疗患有cll的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞通过产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的两步方法产生，其中所述方法的第一步骤包括在包含干细胞因子(scf)、白介素-7(il-7)和白介素-15(il-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，和其中所述scf、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，
和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和其中所述方法的第二步骤包括在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增来自第一步骤的细胞，以产生激活的nk细胞。在治疗患有cll的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞群体通过如本文所描述的三阶段方法产生。
77.在治疗患有cll的个体的方法的其它具体的实施方式中，所述nk细胞通过包括以下步骤的方法产生：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体。
78.在一个方面，本文提供的是冷冻保存nk细胞(例如，tsnk细胞)群体的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体，和(c)将来自步骤(b)的nk细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在一个具体的实施方式中，所述步骤(c)还包括(1)制备细胞悬液溶液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步骤(1)的细胞悬液溶液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存的样品；和(4)在-80℃以下储存所述冷冻保存的样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)之间和在步骤(b)和(c)之间不包含中间步骤。
79.在另一个实施方式中，所述冷冻保存nk细胞(例如，tsnk细胞)群体的方法，包括：(a)将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子(scf)、il-2、白介素-7(il-7)、白介素-15(il-15)和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，和其中所述scf、il-2、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞；和(c)将来自步骤(b)的nk细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在一个具体的实施方式中，所述步骤(c)还包括(1)制备细胞悬液溶液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步骤(1)的细胞悬液溶液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存的样品；和(4)在-80℃以下储存所述冷冻保存的样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)之间和在步骤(b)和(c)之间不包含中间步骤，和/或在步骤(a)之前不包含额外培养步骤。
80.在某些实施方式中，将使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体和/或nk细胞群体冷冻保存，例如使用本文描述的方法冷冻保存。在某一个实施方式中，将使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体和/或nk细胞群体在冷冻保存培养基(例如，本文描述的冷冻保存培养基)中冷冻保存。在一个具体的实施方式中，使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体和/或nk细胞群体的冷冻保存包括(1)制备包含使用本文描述的三阶
段方法产生的nk祖细胞群体和/或nk细胞群体的细胞悬液溶液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步骤(1)的细胞悬液溶液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存的样品；和(4)在-80℃以下储存所述冷冻保存的样品。
81.在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞)比外周血自然杀伤细胞以可检测更高的水平表达微小rnas hsa-mir-380、hsa-mir-512、hsa-mir-517、hsa-mir-518c、hsa-mir-519b、hsa-mir-520a、hsa-mir-337、hsa-mir-422a、hsa-mir-549和hsa-mir-618中的一种或多种，如(例如)通过定量实时pcr(qrt-pcr)所确定的。在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)比外周血自然杀伤细胞以可检测更高的水平表达微小rnas hsa-mir-380、hsa-mir-512、hsa-mir-517、hsa-mir-518c、hsa-mir-519b、hsa-mir-520a、hsa-mir-337、hsa-mir-422a、hsa-mir-549和hsa-mir-618中的一种或多种，如(例如)通过定量实时pcr(qrt-pcr)所确定的。
82.在另一个具体的实施方式中，使免疫调节化合物或沙利度胺与所述tsnk细胞以足以使所述自然杀伤细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间引起接近。在另一个具体的实施方式中，使免疫调节化合物(例如，来那度胺或泊马度胺)或沙利度胺与所述tsnk细胞以足以使所述细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物(例如，来那度胺或泊马度胺)或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)表现出可检测更多的针对所述肿瘤细胞的细胞毒性的量和时间引起接近。在另一个具体的实施方式中，与未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)相比，所述tsnk细胞以较高水平表达bax、ccl5、ccr5、csf2、fas、gusb、il2ra或tnfrsf18中的一种或多种。在另一个具体的实施方式中，与未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)相比，所述tsnk细胞以较高水平表达actb、bax、ccl2、ccl3、ccl5、ccr5、csf1、csf2、ece1、fas、gnly、gusb、gzmb、il1a、il2ra、il8、il10、lta、prf1、ptgs2、ski和/或tbx21中的一种或多种。
83.在另一个具体的实施方式中，使免疫调节化合物或沙利度胺与使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞以足以使所述自然杀伤细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，nk祖细胞或nk细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间引起接近。在另一个具体的实施方式中，使免疫调节化合物(例如，来那度胺或泊马度胺)或沙利度胺与所述nk祖细胞或nk细胞以足以使所述细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物(例如，来那度胺或泊马度胺)或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，nk祖细胞或nk细胞)表现出可检测更多的针对所述肿瘤细胞的细胞毒性的量和时间引起接近。在另一个具体的实施方式中，与未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，nk祖细胞或nk细胞)相比，使用本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞或nk细胞以较高水平表达bax、ccl5、ccr5、csf2、fas、gusb、il2ra或tnfrsf18中的一种或多种。在另一个具体的实施方式中，与未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，nk祖细胞或nk细胞)相比，所述nk祖细胞或nk细胞以较高水平表达actb、bax、ccl2、ccl3、
ccl5、ccr5、csf1、csf2、ece1、fas、gnly、gusb、gzmb、il1a、il2ra、il8、il10、lta、prf1、ptgs2、ski和/或tbx21中的一种或多种。
84.在以上的治疗或肿瘤抑制的方法的某些实施方式中，tsnk细胞与其它自然杀伤细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血或外周血的自然杀伤细胞或通过不同的方法由造血细胞产生的自然杀伤细胞混合。在一个具体的实施方式中，tsnk细胞与使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体混合。在另一个具体的实施方式中，tsnk细胞与使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体混合。在具体的实施方式中，所述tsnk细胞与来自另一种来源或通过不同的方法制得的自然杀伤细胞(例如，使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体和/或nk细胞群体)以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
85.在以上的治疗或肿瘤抑制的方法的其它实施方式中，使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体与其它自然杀伤细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血或外周血的自然杀伤细胞或通过不同的方法由造血细胞产生的自然杀伤细胞混合。在具体的实施方式中，所述nk祖细胞与来自另一种来源或通过不同的方法制得的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
86.在以上的治疗或肿瘤抑制的方法的某些实施方式中，使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体与其它自然杀伤细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血或外周血的自然杀伤细胞或通过不同的方法由造血细胞产生的自然杀伤细胞混合。在具体的实施方式中，所述nk细胞与来自另一种来源或通过不同的方法制得的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
87.在另一个方面，本文提供的是包含分离的tsnk细胞的组合物。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞由造血细胞例如分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞占所述组合物中至少50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞占所述组合物中至少80％、85％、90％.95％、98％或99％的细胞。在某些实施方式中，所述组合物中大于90％、92％、94％、96％或98％的tsnk细胞是cd56

和cd16
–
。在其它实施方式中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的tsnk细胞是cd3
–
和cd56

。在其它实施方式中，至少50％、52％、54％、56％、58％或60％的所述细胞是nkg2d

。在其它实施方式中，少于10％、9％、8％、7％、6％、
5％、4％或3％的所述细胞是nkb1

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是nkat2

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是cd56

和cd16

。在更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％或70％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是nkp46

。在其它更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd117

。在其它更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％、40％或45％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd94

。在其它更具体的实施方式中，至少10％、12％、14％、16％、18％或20％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd226

。在更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％或40％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd7

。在更具体的实施方式中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd5

。
88.在另一个具体的实施方式中，所述分离的cd56

、cd16
–
tsnk细胞是来自单一个体。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd56

、cd16
–
自然杀伤细胞(tsnk细胞)包含来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞是来自与预计用所述tsnk细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述tsnk细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，tsnk细胞)表达可检测更多颗粒酶b或穿孔素的的量和时间接触或引起接近。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是以下描述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
89.在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
90.在一个更具体的实施方式中，所述组合物包含tsnk细胞和来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞。在一个具体的实施方式中，所述其它来源是胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方式中，所述其它来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述tsnk细胞与来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
91.在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含tsnk细胞和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液是来自与所述tsnk细胞相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述tsnk细胞不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中所有或实质上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母体细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所述胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90％、80％、70％、60％或50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，通过将0.9％nacl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方式
中，所述灌洗液经过处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如，下文中第5.2.1.1节中所描述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
92.在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含tsnk细胞和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述tsnk细胞相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述tsnk细胞不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自至少两个个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
93.在另一个方面，本文提供的是包含通过本文描述的三阶段方法产生的分离的nk祖细胞或nk细胞的组合物。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞或nk细胞由造血细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞或nk细胞占所述组合物中至少50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞或nk细胞占所述组合物中至少80％、85％、90％.95％、98％或99％的细胞。在某些实施方式中，所述组合物中大于90％、92％、94％、96％或98％的nk祖细胞或nk细胞是cd56

和cd16
–
。在其它实施方式中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的nk祖细胞或nk细胞是cd3
–
和cd56

。在其它实施方式中，至少50％、52％、54％、56％、58％或60％的所述细胞是nkg2d

。在其它实施方式中，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的所述细胞是nkb1

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述nk祖细胞或nk细胞是nkat2

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述nk祖细胞或nk细胞是cd56

和cd16

。在更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％或70％的所述cd3
–
、cd56

nk祖细胞或nk细胞是nkp46

。在其它更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述cd3
–
、cd56

nk祖细胞或nk细胞是cd117

。在其它更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％、40％或45％的所述cd3
–
、cd56

nk祖细胞或nk细胞是cd94

。在其它更具体的实施方式中，至少10％、12％、14％、16％、18％或20％的所述cd3
–
、cd56

nk祖细胞或nk细胞是cd226

。在更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％或40％的所述cd3
–
、cd56

nk祖细胞或nk细胞是cd7

。在更具体的实施方式中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的所述cd3
–
、cd56

nk祖细胞或nk细胞是cd5

。
94.在一个具体的实施方式中，所述分离的cd56

、cd16
–
nk祖细胞或nk细胞是来自单一个体。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd56

、cd16
–
自然杀伤细胞(nk祖细胞或nk细胞)包含来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞或nk细胞是来自与预计用所述nk祖细胞或nk细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞或nk细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述nk祖
细胞或nk细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，nk祖细胞或nk细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间接触或引起接近。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是以下描述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
95.在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
96.在一个更具体的实施方式中，所述组合物包含通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞和来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞。在一个具体的实施方式中，所述其它来源是胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方式中，所述其它来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述nk祖细胞或nk细胞与来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
97.在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液是来自与所述nk祖细胞或nk细胞相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述nk祖细胞或nk细胞不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中所有或实质上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母体细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所述胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90％、80％、70％、60％或50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，通过将0.9％nacl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液经过处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如，下文中第5.2.1.1节中所描述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
98.在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk祖细胞或nk细胞相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk祖细胞或nk细胞不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自至少两个个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在
另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
99.在另一个方面，本文提供的是组合物，例如药物组合物，其包含分离的nk祖细胞群体，例如通过本文描述的三阶段方法所产生。在一个具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体从造血细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体占所述组合物中至少50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体占所述组合物中至少80％、85％、90％.95％、98％或99％的细胞。在某些实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体中的不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的所述细胞是cd3
–
cd56

细胞。在某些实施方式中，不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在某些实施方式中，不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd161

。在某些实施方式中，不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在更具体的实施方式中，不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在某些实施方式中，所述cd3
–
cd56

细胞是cd16-。
100.在另一个具体的实施方式中，所述组合物中的所述分离的nk祖细胞是来自单一个体。在一个更具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞包括来自至少两个不同个体的nk祖细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物中的所述分离的nk祖细胞是来自与预计用所述nk祖细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述nk祖细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，nk祖细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间接触或引起接近。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是以下描述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
101.在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
102.在一个更具体的实施方式中，所述组合物包含来自另一种来源或通过另一种方法制备的nk祖细胞。在一个具体的实施方式中，所述其它来源是胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方式中，所述其它来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述组合物中的所述nk祖细胞群体与来自另一种来源或通过另一种方法制备的nk祖细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
103.在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含nk祖细胞群体和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液是来自与所述nk祖细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述nk祖细胞群体不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中
所有或实质上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母体细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所述胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90％、80％、70％、60％或50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，通过将0.9％nacl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液经过处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如以下描述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
104.在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含nk祖细胞群体和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk祖细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk祖细胞群体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自至少两个个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
105.3.1.定义
106.如本文所用的，术语“免疫调节化合物”和“imid
tm”不包括沙利度胺。
107.如本文所用的，“来那度胺”意指3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮(化学文摘社(chemical abstracts service)命名)或2,6-哌啶二酮,3-(4-氨基-1,3-二氢-1-氧代-2h-异吲哚-2-基)-(国际纯粹化学与应用化学联合会(international union of pure and applied chemistry,iupac)命名)。如本文所用的，“泊马度胺(pomalidomide)”意指4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。
108.如本文所用的，“多能”当涉及细胞时意指细胞具有分化成另一种细胞类型的细胞的能力。在某些实施方式中，“多能细胞”是具有生长为哺乳动物的机体近似260种细胞类型的任何亚类(subset)的能力的细胞。与多潜能细胞不同，多能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。
109.如本文所用的，“饲养细胞”是指与第二类型的细胞共培养以提供其中所述第二类型的细胞可以维持并且也许增殖的环境的一种类型的细胞。虽然不受任何理论的束缚，但是饲养细胞可以为靶细胞提供例如肽、多肽、电信号、有机分子(例如，类固醇)、核酸分子、生长因子(例如，bfgf)、其它因子(例如，细胞因子)和代谢营养物。在某些实施方式中，饲养细胞生长成单层。
110.如本文所用的，未进一步修饰的“自然杀伤细胞”或“nk细胞”包括来自任何组织来源的自然杀伤细胞。在一个实施方式中，所述nk细胞的特征为包含具有成熟nk细胞标志物cd16、低表达的cd56(“cd56dim”)和kirs的细胞的nk细胞群体。
111.如本文所用的，术语“nk祖细胞群体”是指包含尚有待于发育成成熟nk细胞的自然
杀伤细胞谱系的细胞的细胞群体，如通过(例如)表达一种或多种表型标志物(例如，cd56、cd16和kirs)的水平所指示。在一个实施方式中，所述nk祖细胞群体包含具有低cd16和高cd56的细胞。
112.如本文所用的，“胎盘灌洗液”意指已通过至少一部分胎盘(例如，人胎盘)，例如通过胎盘脉管系统的灌洗溶液，其包括在通过胎盘期间由灌洗溶液所收集的众多细胞。
113.如本文所用的，“胎盘灌洗液细胞”意指分离自或可分离自胎盘灌洗液的有核细胞，例如总有核细胞。
114.如本文所用的，“肿瘤细胞抑制”、“肿瘤细胞增殖的抑制”等包括例如通过杀死所述肿瘤细胞群体中的一个或多个肿瘤细胞，例如通过使例如tsnk细胞或包含tsnk细胞的细胞群体、使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体或nk细胞群体与肿瘤细胞群体接触或引起接近，例如使肿瘤细胞群体与tsnk细胞或包含tsnk细胞的细胞群体、使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体或nk细胞群体接触，从而减缓肿瘤细胞群体的生长。
115.如本文所用的，术语“造血细胞”包括造血干细胞和造血祖细胞。
116.如本文所用的，“不明确的组分”是培养基领域中的技术术语，是指其成分一般未提供或未定量的组分。“不明确的组分”的实例包括但不限于人血清(例如，人血清ab)和胎儿血清(例如，胎牛血清(fetal bovine serum)或小牛血清(fetal calf serum))。
117.如本文所用的，“ ”当用于指示特定细胞标志物的存在时意指在对同种型(isotype)对照的荧光激活细胞分选中可检测地存在细胞标志物；或者细胞标志物在定量或半定量rt-pcr中是在背景之上可检测的。
118.如本文所用的，
“–”
当用于指示特定细胞标志物的存在时意指在对同种型对照的荧光激活细胞分选中不可检测地存在细胞标志物；或者细胞标志物在定量或半定量rt-pcr中是在背景之上不可检测的。
119.方案1.分离的自然杀伤(nk)祖细胞群体，其中所述nk祖细胞按照以下方法产生：(i)在包含flt3l、tpo、scf、il-7、g-csf、il-6和gm-csf的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，(ii)随后在包含flt3l、scf、il-15和il-7、il-17和il-15、g-csf、il-6和gm-csf的第二培养基中培养所述细胞，和(iii)随后在包含scf、il-15、il-7、il-2、g-csf、il-6和gm-csf的第三培养基中培养所述细胞。
120.方案2.如方案1的分离的nk祖细胞群体，其中培养步骤(i)的持续时间为7-9天，其中培养步骤(ii)的持续时间为5-7天，和其中培养步骤(iii)的持续时间为5-9天。
121.方案3.如方案1的分离的nk祖细胞群体，其中培养步骤(i)的持续时间为7-9天，其中培养步骤(ii)的持续时间为5-7天，和其中培养步骤(iii)的持续时间为21-35天。
122.方案4.如方案1、2或3的分离的nk祖细胞群体，其中所述方法中使用的造血干细胞或祖细胞是cd34

。
123.方案5.如方案1、2或3的分离的nk祖细胞群体，其中所述造血干细胞或祖细胞包括来自人胎盘灌洗液的造血干细胞或祖细胞和来自脐带血的造血干细胞或祖细胞，其中所述胎盘灌洗液和所述脐带血是来自同一胎盘。
124.方案6.如方案1-5中任一项的分离的nk祖细胞群体，其中在步骤(i)结束时，cd34-细胞占总群体的超过80％。
125.方案7.如方案1-6中任一项的分离的nk祖细胞群体，其中所述群体包含不超过
40％的cd3
–
cd56 细胞。
126.方案8.如方案1-7中任一项的分离的nk祖细胞群体，其中所述群体包含cd52 cd117 细胞。
127.方案9.分离的自然杀伤(nk)祖细胞群体，其中所述群体包含不超过40％的cd3
–
cd56 细胞。
128.方案10.分离的自然杀伤(nk)祖细胞群体，其中所述群体包含cd52 cd117 细胞。
129.方案11.药物组合物，包含如方案1-10中任一项的分离的nk祖细胞群体。
130.方案12.抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使所述肿瘤细胞与如方案1-10中任一项的分离的nk祖细胞群体或如方案11的组合物接近。
131.方案13.如方案12的方法，其中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、成胶质细胞瘤细胞、白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、慢性髓样淋巴瘤(cml)细胞、急性髓细胞白血病细胞、慢性髓细胞白血病(cml)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、前列腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。
132.方案14.治疗有其需要的对象的造血系统癌症的方法，包括向所述对象给予如方案1-10中任一项的分离的nk祖细胞群体或如方案11的组合物。
133.方案15.如方案14的方法，其中所述造血系统癌症是急性髓样白血病。
134.4.附图简述
135.图1：用各种不同的培养基制剂从造血干细胞(hscs)分化的nk细胞的成倍扩增。误差棒代表来自三个供体的标准偏差。x轴：培养天数(d)。y轴：与第0天(培养开始)相比的成倍扩增。
136.图2：用nk2a培养基培养的nk细胞的表型表征。细胞用pe-抗cd56、fitc-抗cd3、percp-抗cd16进行三重标记。水平线、垂直线：荧光标记水平显著高于背景。
137.图3：用nk2a(ff)、nk2a(胎盘干细胞作为饲养细胞)、nk2a(msc作为饲养细胞)或两阶段nk培养基培养的nk细胞的成倍扩增。x轴：培养天数(d)。y轴：与第0天(培养开始)相比的成倍扩增。
138.图4：在培养开始后第45天，用nk2a(无饲养细胞)、两阶段nk培养基；用cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘干细胞(psc)作为饲养细胞的nk2a，用骨髓源性间充质干细胞(msc)作为饲养细胞的nk2a培养的nk细胞的细胞毒性。来自三个供体的代表性数据示于图4。
139.图5：在培养的第41天(d41)时nk细胞的表型表征。显示了来自3个单独供体的代表性数据。x轴：通过两阶段方法产生的nk细胞的百分比，所述细胞是cd3
–
cd56

、cd16
–
cd56

或cd16

cd56

；或者所述细胞表达nkb1、nkg2d、nkp46、cd94、cd117、cd226、cd7或cd5。在培养开始后第41天，在nk2a(无饲养细胞)、两阶段nk培养基；用cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘干细胞(psc)作为饲养细胞的nk2a、用骨髓源性间充质干细胞(msc)作为饲养细胞的nk2a中培养细胞。
140.图6：nk在nk2a培养基中培养期间，cd56

cd3
–
nk细胞群体中cd94和cd117的表达。从在nk2a培养基中培养的nk细胞中鉴定出主要的cd56

cd94

cd117

细胞群体，其与胚胎干细胞(esc)源性nk细胞(cd56

cd94

cd117
low/
–
)可区别。来自三个供体的代表性数据示于图6。x
轴：来自藻红蛋白(pe)标记的抗cd94的荧光。y轴：来自apc标记的抗cd117的荧光。水平线、垂直线：显著高于背景的荧光标记水平。d13、d20、d28、d35：cd34

细胞培养开始后的第13、20、28和35天。
141.图7：与仅有msc和nk2a培养基相比，胎盘干细胞对培养的nk细胞的影响。x轴：在无饲养层(ff)的nk2a培养基中培养的nk细胞；在用骨髓源性间充质干细胞(mcs)作为饲养层的nk2a培养基中培养的nk细胞；或用cd10

、cd34
–
、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘干细胞(pdac)作为饲养层的nk2a培养基中培养的nk细胞。y轴(左)：细胞毒性，表示为残余的肿瘤细胞的百分比(1.0＝100％)；用空心正方形表示细胞毒性。y轴(右)：使用所述两步方法的nk细胞成倍扩增；用星号表示成倍扩增。
142.图8a-8b：脐带血(ucb)和人胎盘灌洗液(hpp)的相对比率对融化后cd34

细胞纯度的影响。图8a：hpp体积含量(vol％)对cd34

lin
–
纯度的影响。x轴：合并的ucb和hpp(组合)中hpp的体积分数。y轴：cd34

lin
–
细胞的百分比。图8b：hpp tnc含量(tnc％)对cd34

lin
–
纯度的影响。y轴：cd34

lin
–
细胞的百分比。
143.图9：针对多种用pkh26-topro3标记的肿瘤细胞系的第35天培养的(d35)nk细胞的基于facs的细胞毒性测定。误差棒代表按一式三份进行的实验中的标准偏差。
144.图10：评估针对hct-116细胞的d35 nk细胞的细胞毒性的ldh释放测定。效应细胞(nk细胞)与肿瘤细胞(hct-116细胞)之比值标在x-轴上。
145.图11：k562肿瘤异种移植物模型中的d35 nk细胞体内细胞毒性。
146.图12：hct-116肿瘤异种移植物模型中的d35 nk细胞体内细胞毒性。
147.图13：u-87mg肿瘤异种移植物模型中的d35 nk细胞体内细胞毒性。
148.图14a-14b：在存在il-2(a)或il-15或在不存在细胞因子(b)的情况下，bt474肿瘤异种移植物模型中的d35 nk细胞体内细胞毒性。
149.图15a-15c：在图14b中所绘的体内研究终点时回收的bt474肿瘤异种移植物的系列切片的苏木精和伊红(h&e；a,左小图)和免疫组织化学(b,c)染色。在b和c中，绘出了人细胞核，箭头指向用cd56抗体(b,中间小图)和nkp46抗体(c,右小图)染色的细胞。
150.图16a-16b：k562细胞(a,顶上的小图)和d35 nk细胞(b,底下的小图)的免疫荧光分析。细胞核在所有图像中都被染色；位于左边的图像＝抗cd56；位于中心的图像＝抗nkg2d；位于右边的图像＝抗nkp46。比例尺＝50μm。
151.图17a-17f：来自小鼠的人肿瘤异种移植物的免疫荧光分析。a-d：在给予溶媒后成像的k562异种移植物(a)；静脉内(i.v.)给予的d35 nk细胞(b)；溶媒 il-2i.v.(c)；和d35 nk细胞 il-2i.v.(d)。e和f：给予溶媒 il-2i.v.后成像的bt474异种移植物(e)；和d35 nk细胞 il-2i.v(f)。细胞核在所有图像中都被染色；位于左边的图像＝抗cd56；位于中心的图像＝抗nkg2d；；位于右边的图像＝抗nkp46。比例尺＝50μm。
152.图18a-18d：表达人造血细胞因子(il-2和il-15)的nsgs小鼠中的两阶段d35 nk细胞在体内的生物分布和持久性。显示在转移后不同时间点(d＝天数)，与il-2(a,c)和il-15(b,d)治疗的小鼠中的小鼠cd45相比，人cd45(作为两阶段d35 nk细胞的标志物)的百分比。a,bs＝血液的分析；c,d＝肝脏的分析。
153.图19：通过荧光辅助细胞分选(facs)分析体外培养的两阶段d35 nk细胞的指定标志物：顶上＝cd56 vs.cd16 ；底下左＝cd56 vs.kir2dl2/dl3/ds2 ；底下右＝cd56
vs.kir3dl1/ds1 。
154.图20：体内过继转移后第28天检测的表达人造血细胞因子(il-15)的nsgs小鼠中的两阶段d35 nk细胞的体内成熟。顶上左＝小鼠cd45 vs.人cd45。右小图证明人cd45细胞群体的进一步分析：顶上＝cd56 vs.cd16 ；底下＝kir2dl2/dl3/ds2 vs.kir3dl1/ds1 。
155.图21：d35 nk细胞群体针对遗传诱导的原发性白血病干细胞的体外杀死活性。d35nk细胞群体细胞毒性的液体共培养物测定的结果。mll＝工程改造的表达mll-af9的cd34 细胞；thp1＝人急性单核细胞白血病细胞系；k562＝k562肿瘤细胞系。y-轴上的值为x106。
156.图22：d35 nk细胞群体的细胞毒性的甲基纤维素测定。绘出了使用来自图18中所显示的生物分布研究的离体分离的d35 nk细胞群体的细胞对aml集落形成细胞的杀死。mll＝工程改造的表达mll-af9的cd34 细胞；k562＝k562肿瘤细胞系。
157.图23a-23f：在mll移植后8周内白血病细胞检测的频率。a.mll细胞移植后治疗的示意图。da＝多柔比星和多西他赛；d＝实验的时间点(天)(第58天＝终点，除非小鼠提早死亡，如b和c的图所指)；nk＝d35 nk细胞群体。b.各图显示对照组—给予pbs(b)或il-15(c)的小鼠中的荧光细胞数以及仅给予il-15和化学疗法(d)的组和给予d35 nk细胞群体nk细胞加上il-15和化学疗法的组合(e)的组中的荧光细胞数。(f)提供c、d、e部分中所显示的结果总结。aml细胞的剩余量显示在y-轴；数值代表外周血中的aml细胞百分比。
158.图24a-24c：体内过继转移后4周，由第21天(d21)nk祖细胞群体产生的骨髓植入人细胞群体。
159.图25：体内过继转移后4周，骨髓植入d21 nk祖细胞群体的体内细胞周期分析。
160.图26：d21 nk祖细胞群体来源的骨髓植入cd56-cd16-祖细胞的离体分化。
161.图27：离体分化为成熟nk细胞的d21 nk祖细胞群体的细胞毒性活性。
162.图28：d21 nk祖细胞(nk-d21)和d35 nk细胞(nk-d35)细胞和包括外周血(pb)nk细胞在内的其它细胞与hl60细胞相比的相对端粒长度。
163.5.详述
164.本文提供的是从造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)产生并且扩增nk细胞的新型方法。本文还提供的是从造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)产生nk祖细胞群体和nk细胞群体的方法，例如三阶段方法。用于产生nk细胞和nk细胞群体以及nk祖细胞群体的造血细胞可以分离自任何来源，例如但不限于胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾脏或肝脏。在某些实施方式中，所述nk细胞、nk细胞群体或nk祖细胞群体从扩增的造血细胞，例如造血干细胞和/或造血祖细胞产生。在一个实施方式中，造血细胞从该类细胞的来源例如胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾脏,肝脏和/或骨髓收集。在一个具体的实施方式中，所述造血细胞在不使用饲养细胞的第一培养基中连续扩增和分化。然后，将所述细胞在存在饲养细胞的第二培养基中培养。在一个替代的实施方式中，所述培养是在不存在饲养细胞的第二培养基中进行。这样的分离、扩增和分化可以在集中处理站(central facility)中进行，其提供扩增的造血细胞用于运输到使用地点(例如，医院、军事基地、部队前线等)进行分散扩增和分化。
165.5.1.造血细胞
166.在本文公开的方法中可使用的造血细胞可以是能够分化为nk细胞和/或nk祖细胞
的任何造血细胞，例如前体细胞、造血祖细胞、造血干细胞等。造血细胞可获自组织来源，例如骨髓、脐带血、胎盘血、外周血、肝脏等或它们的组合。造血细胞可获自胎盘。在一个具体的实施方式中，所述造血细胞获自胎盘灌洗液。在一个实施方式中，所述造血细胞不获自脐带血。在一个实施方式中，所述造血细胞不获自外周血。来自胎盘灌洗液的造血细胞可以包含胎儿和母体造血细胞的混合物，例如其中母体细胞占造血细胞总数大于5％的混合物。优选地，来自胎盘灌洗液的造血细胞包含至少约90％、95％、98％、99％或99.5％的胎儿细胞。
167.在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞或从中产生使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体或nk细胞群体)获自胎盘灌洗液、脐带血或外周血。在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生tsnk细胞或从中产生使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体或nk细胞群体)是来自胎盘灌洗液和脐带血(例如，来自与灌洗液相同的胎盘的脐带血)的混合细胞。在另一个具体的实施方式中，所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，所述混合细胞可以通过将脐带血和胎盘灌洗液合并或混合而获得。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比混合以获得所述混合的细胞。在一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5或3:1至1:3的比率混合。在另一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率混合。在一个更具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5(85％:15％)的比率混合。
168.在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的总有核细胞(tnc)含量的比率混合以获得所述混合的细胞。在一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5或3:1至1:3的比率混合。在另一个具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率混合。
169.在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞，从中产生所述tsnk细胞或从中产生使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体或nk细胞群体)是来自脐带血和胎盘灌洗液二者，但是其中所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。
170.在某些实施方式中，所述造血细胞是cd34

细胞。在具体的实施方式中，可用于本文公开的方法中的造血细胞是cd34

cd38

或cd34

cd38
–
。在一个更具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

cd38
–
lin
–
。在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞是cd2
–
、cd3
–
、cd11b
–
、cd11c
–
、cd14
–
、cd16
–
、cd19
–
、cd24
–
、cd56
–
、cd66b
–
和/或血型糖蛋白a
–
中的一种或多种。在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞是cd2
–
、cd3
–
、cd11b
–
、cd11c
–
、cd14
–
、cd16
–
、
cd19
–
、cd24
–
、cd56
–
、cd66b
–
和血型糖蛋白a
–
。在另一个更具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

cd38
–
cd33
–
cd117
–
。在另一个更具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

cd38
–
cd33
–
cd117
–
cd235
–
cd36
–
。
171.在另一个实施方式中，所述造血细胞是cd45

。在另一个具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

cd45

。在另一个实施方式中，所述造血细胞是thy-1

。在一个具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

thy-1

。在另一个实施方式中，所述造血细胞是cd133

。在具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

cd133

或cd133

thy-1

。在另一个具体的实施方式中，所述cd34

造血细胞是cxcr4

。在另一个具体的实施方式中，所述cd34

造血细胞是cxcr4
–
。在另一个实施方式中，所述造血细胞是对kdr(血管生长因子受体2)呈阳性。在具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

kdr

、cd133

kdr

或thy-1

kdr

。在某些其它实施方式中，所述造血细胞是对醛脱氢酶(aldh

)呈阳性，例如，所述细胞是cd34

aldh

。
172.在某些其它实施方式中，所述cd34

细胞是cd45
–
。在具体的实施方式中，所述cd34

细胞(例如，cd34

、cd45
–
细胞)表达mirnas hsa-mir-380、hsa-mir-512、hsa-mir-517、hsa-mir-518c、hsa-mir-519b、hsa-mir-520a、hsa-mir-337、hsa-mir-422a、hsa-mir-549和/或hsa-mir-618中的一种或多种或全部。
173.在某些实施方式中，所述造血细胞是cd34
–
。
174.所述造血细胞也可缺少指示谱系定型(lineage commitment)的某些标志物或缺少发育纯真性(developmental naivet
é
)。例如，在另一个实施方式中，所述造血细胞是hla-dr
–
。在具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

hla-dr
–
、cd133

hla-dr
–
、thy-1

hla-dr
–
或aldh

hla-dr
–
。在另一个实施方式中，所述造血细胞是对于谱系标志物cd2、cd3、cd11b、cd11c、cd14、cd16、cd19、cd24、cd56、cd66b和血型糖蛋白a中的一种或多种、优选全部是阴性的。
175.因此，造血细胞可以根据存在指示未分化状态的标志物或者根据不存在指示至少一些谱系分化已发生的谱系标志物进行选择以供在本文公开的方法中使用。在下文中详细论述了根据特异性标志物的存在与否来分离细胞(包括造血细胞)的方法。
176.在本文提供的方法中使用的造血细胞可以是实质上均质的群体，例如，包含至少约95％、至少约98％或至少约99％的来自单一组织来源的造血细胞的群体，或包含表现出相同造血细胞相关细胞标志物的造血细胞的群体。例如，在各种不同的实施方式中，所述造血细胞可以包含至少约95％、98％或99％的来自骨髓、脐带血、胎盘血、外周血或胎盘(例如，胎盘灌洗液)的造血细胞。
177.在本文提供的方法中使用的造血细胞可获自单一个体(例如获自单一胎盘)或获自多个个体(例如可以是合并的)。在所述造血细胞获自多个个体并且是合并的情况下，所述造血细胞可获自相同组织来源。因此，在各种不同的实施方式中，所述合并的造血细胞是全部来自胎盘，例如胎盘灌洗液；全部来自胎盘血；全部来自脐带血；全部来自外周血等。
178.在某些实施方式中，在本文公开的方法中使用的造血细胞包含来自两种或两种以上组织来源的造血细胞。例如，在某些实施方式中，当将来自两种或两种以上来源的造血细胞混合用于在本文所述方法中使用时，用于产生tsnk细胞的众多造血细胞包含来自胎盘(例如，胎盘灌洗液)的造血细胞。在各种不同的实施方式中，用于产生tsnk细胞或使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体或nk细胞群体的造血细胞，包含来自胎盘和来自脐
带血；来自胎盘和外周血；来自胎盘和胎盘血或胎盘和骨髓的造血细胞。在一个优选的实施方式中，所述造血细胞包含来自胎盘灌洗液的造血细胞结合来自脐带血的造血细胞，其中所述脐带血和胎盘是来自相同个体，即，其中所述灌洗液和脐带血是匹配的。在其中所述造血细胞包含来自两种组织来源的造血细胞的实施方式中，来自所述来源的造血细胞可以按以下比率混合：例如，1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
179.5.1.1.胎盘造血干细胞
180.在某些实施方式中，在本文提供的方法中使用的造血细胞是胎盘造血细胞。如本文所用的，“胎盘造血细胞”意指获自胎盘本身且不获自胎盘血或不获自脐带血的造血细胞。在一个实施方式中，胎盘造血细胞是cd34

。在一个具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞占优势的是(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)cd34

cd38
–
细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞占优势的是(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)cd34

cd38

细胞。胎盘造血细胞可通过本领域技术人员已知的任何方式(例如，通过灌洗)从分娩后的哺乳动物(例如，人)胎盘中获得。
181.在另一个实施方式中，所述胎盘造血细胞是cd45
–
。在一个具体的实施方式中，所述造血细胞是cd34

cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞是cd34

cd45

。
182.5.2.自然杀伤细胞、自然杀伤细胞群体和自然杀伤祖细胞群体的产生
183.通过本发明所述方法产生nk细胞、nk细胞群体和nk祖细胞群体包括扩增造血细胞群体。在细胞扩增期间，造血细胞群体内的众多造血细胞分化为nk细胞。
184.5.2.1.tsnk细胞的产生
185.在一个实施方式中，本文提供的是产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的方法，其包括：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体。
186.在另一个实施方式中，本文提供的nk细胞通过nk细胞的扩增/分化和成熟的两步过程产生。第一和第二步骤包括在具有细胞因子的独特组合的培养基中培养所述细胞。在某些实施方式中，所述过程涉及(a)在第一培养基中培养和扩增造血细胞群体，其中所述造血细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞分化为nk细胞；和(b)在第二培养基中扩增来自步骤(a)的nk细胞，其中所述nk细胞经进一步扩增和分化，和其中所述nk细胞成熟(例如，活化或否则具有细胞毒性活性)。在某些实施方式中，所述方法包括在步骤(a)和(b)之间没有中间步骤、在步骤(a)之前没有额外培养步骤和/或在步骤(b)之后没有额外步骤(例如，成熟步骤)。
187.5.2.1.1.第一培养步骤
188.在某些实施方式中，本文提供的方法包括在第一培养基中培养和扩增造血细胞群体的第一步骤，其中所述造血细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞分化为nk细胞。
189.虽然不希望受任何参数、机制或理论的束缚，但是如本文提供的造血细胞的培养
导致所述造血细胞的连续扩增和从所述细胞向nk细胞和/或nk祖细胞群体的分化。在某些实施方式中，在本文提供的方法中使用的造血细胞(例如，干细胞或祖细胞)在使用饲养层的第一步骤中扩增并且分化。在其它实施方式中，造血细胞(例如，干细胞或祖细胞)在不使用饲养层的第一步骤中扩增并且分化。
190.造血细胞不依赖饲养细胞扩增和分化可以在与细胞培养和扩增相容的任何容器(例如，三角瓶、管、烧杯、培养皿、多孔板、袋等)中发生。在一个具体的实施方式中，造血细胞不依赖饲养细胞的扩增在袋(例如，柔韧的可透气的氟碳化合物培养袋(例如，得自american fluoroseal))中发生。在一个具体的实施方式中，其中扩增所述造血细胞的容器适合于运输(例如)至其中使扩增的nk细胞进一步扩增和分化的地点，例如医院或部队营区。
191.在某些实施方式中，造血细胞例如以连续方式在第一培养基中扩增并且分化。在一个实施方式中，所述第一培养基是不含动物成分的培养基。在本文提供的方法中可使用的示例性的不含动物成分的培养基包括但不限于伊格尔基础培养基(basal medium eagle,bme)、达尔伯克改良的伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium,dmem)、格拉斯哥极限必需培养基(glasgow minimum essential medium,gmem)、达尔伯克改良的伊格尔培养基/营养混合物f-12ham(dmem/f-12)、极限必需培养基(minimum essential medium,mem)、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(iscove’s modified dulbecco’s medium,imdm)、营养混合物f-10ham(ham’s f-10)、营养混合物f-12ham(ham’s f-12)、rpmi-1640培养基、威廉姆斯培养基e(williams’medium e)、(目录号stem cell technologies,vancouver,canada)、glycostem基础生长培养基technologies,vancouver,canada)、glycostem基础生长培养基培养基(invitrogen)、x-vivo
tm 10(lonza)、x-vivo
tm 15(lonza)、optmizer(invitrogen)、h3000(stemcell technologies)、cellgro complete
tm
(mediatech)、el08-1d2、myelocult
tm h5100或它们的任何改良变化形式或组合。
192.在优选的实施方式中，所述第一培养基包含白介素-15(il-15)，和一种或多种其它培养基补充剂(例如，营养物、细胞因子和/或其它因子)。适合于在本文提供的方法中使用的培养基补充剂包括(例如，但不限于)血清(例如，人血清ab、胎牛血清(fbs)或小牛血清(fcs))、维生素、牛血清白蛋白(bsa)、氨基酸(例如，l-谷氨酰胺)、脂肪酸(例如，油酸、亚油酸或棕榈酸)、胰岛素(例如，重组人胰岛素)、转铁蛋白(铁饱和人转铁蛋白)、β-巯基乙醇、干细胞因子(scf)、fms样酪氨酸激酶3配体(flt3-l)、细胞因子例如白介素-2(il-2)、白介素-7(il-7)、促血小板生成素(tpo)、肝素或o-乙酰基-肉毒碱(也称为乙酰肉毒碱、o-乙酰基-l-肉毒碱或oac)。在一个具体的实施方式中，本文使用的培养基包含人血清ab。在另一个具体的实施方式中，本文使用的培养基包含fbs。在另一个具体的实施方式中，本文使用的培养基包含oac。
193.在某些实施方式中，所述第一培养基不包含粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白介素-6(il-6)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip1α)或白血病抑制因子(lif)中的一种或多种。
194.因此，在一个方面，本文提供的是产生nk细胞的两步方法，其中所述第一步骤包括在第一培养基中在不存在饲养细胞时扩增并且分化造血细胞群体，其中在所述造血细胞群体内的众多造血细胞在所述扩增期间分化为nk细胞，和其中所述培养基包含浓度为1至约
150ng/ml的il-15、浓度为约1至约150ng/ml的scf、浓度为约50至约1500iu/ml的il-2、浓度为约1至约150ng/ml的il-7和浓度为约0.1至约30iu/ml的肝素，和其中所述scf、il-2、il-7、il-15和肝素不包含在所述培养基的不明确的组分(例如，血清)中。在某些实施方式中，所述培养基包含o-乙酰基-肉毒碱(也称为乙酰肉毒碱、o-乙酰基-l-肉毒碱或oac)或影响线粒体中乙酰-coa循环的化合物、thiazovivin、y-27632、pyintegrin、rho激酶(rock)抑制剂、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂或其它抗凋亡化合物/肽、nova-rs(sheffield bio-science)或其它小分子生长增强剂中的一种或多种。在某些实施方式中，所述培养基包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，所述培养基包含约0.5mm-10mm oac。在一个实施方式中，所述培养基包含h3000和/或dmem:f12和约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm oac。在该方法的一个具体的实施方式中，所述培养基是在另一个具体的实施方式中，所述培养基包含h3000和约5mm的oac。在另一个具体的实施方式中，所述培养基包含dmem:f12和约5mm的oac。所述oac可以在本文提供的培养方法期间的任何时间添加。在某些实施方式中，将所述oac加入到第一培养基中和/或在第一培养步骤期间加入。在有些实施方式中，将所述oac在培养的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天时加入到第一培养基中。在一个具体的实施方式中，将所述oac在第一培养步骤的第7天加入到第一培养基中。在一个更具体的实施方式中，将所述oac在培养的第7天加入到第一培养基中且在整个第一和第二培养步骤中存在。在某些实施方式中，将所述oac加入到第二培养基中和/或在第二培养步骤期间加入。在有些实施方式中，将所述oac在培养的第22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35天加入到第二培养基中。
195.在另一个具体的实施方式中，所述培养基是补充约5-20％bsa、约1-10μg/ml重组人胰岛素、约10-50μg/ml铁饱和人转铁蛋白和约10-50μmβ-巯基乙醇的imdm。在另一个具体的实施方式中，所述培养基不包含il-11、il-3、同源框-b4(hoxb4)和/或甲基纤维素中的一种或多种或任一种。
196.在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约0.1至约500ng/ml、约5至约100ng/ml或约20ng/ml的scf。在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约10至约2000iu/ml、或约100至约500iu/ml、或约200iu/ml的il-2。在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约0.1至约500ng/ml、约5至约100ng/ml、或约20ng/ml的il-7。在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约0.1至约500ng/ml、约5至约100ng/ml、或约10ng/ml的il-15。在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约0.05至约100u/ml、或约0.5至约20u/ml、或约1.5u/ml的肝素。
197.在该方法的又一个具体的实施方式中，所述培养基还包含浓度为约1至约150ng/ml的fms样-酪氨酸激酶3配体(flt-3l)、浓度为约1至约150ng/ml的促血小板生成素(tpo)或两者的组合。在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约0.1至约500ng/ml、约5至约100ng/ml、或约20ng/ml的flt-3l。在其它具体的实施方式中，所述培养基包含浓度为约0.1至约500ng/ml、约5至约100ng/ml、或约20ng/ml的tpo。
198.在该方法的一个更具体的实施方式中，所述第一培养基是其包含约
20ng/ml scf、约20ng/ml il-7、约10ng/ml il-15。在该方法的另一个更具体的实施方式中，所述第一培养基是其包含约20ng/ml scf、约20ng/ml flt3-l、约200iu/ml il-2、约20ng/ml il-7、约10ng/ml il-15、约20ng/ml tpo和约1.5u/ml肝素。在另一个具体的实施方式中，所述第一培养基还包含10％人血清(例如，人血清ab)或胎儿血清(例如，fbs)。
199.在另一个实施方式中，造血细胞通过以下方法扩增：将所述细胞例如在所述第一培养基中，在以与未接触或引起接近所述免疫调节化合物的相等个数的造血细胞相比在给定时间内足以引起所述造血细胞增殖的可检测增加的时间和量与免疫调节化合物(例如，tnf-α抑制性化合物)接触或接近的情况下进行培养。参见例如，美国专利申请公布第2003/0235909号，授权为美国专利第7,498,171号，所述专利申请和专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是氨基取代的异吲哚啉。在一个优选的实施方式中，所述免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；或4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。在另一个优选的实施方式中，所述免疫调节化合物是泊马度胺或来那度胺。在另一个实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、笼形包合物(clathrate)、对映异构体、非对映异构体、外消旋体或立体异构体混合物：
[0200][0201]
其中x和y中的一个为c＝o，x和y中的另一个为c＝o或ch2，且r2为氢或低级烷基。在另一个实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、笼形包合物(clathrate)、对映异构体、非对映异构体、外消旋体或立体异构体混合物：
[0202][0203]
其中x和y中的一个为c＝o，而另一个为ch2或c＝o；
[0204]
r1为h、(c1–
c8)烷基、(c3–
c7)环烷基、(c2–
c8)烯基、(c
2-c8)炔基、苄基、芳基、(c
0-c4)烷基
–
(c
1-c6)杂环烷基、(c
0-c4)烷基
–
(c
2-c5)杂芳基、c(o)r3、c(s)r3、c(o)or4、(c
1-c8)烷基
–
n(r6)2、(c
1-c8)烷基
–
or5、(c
1-c8)烷基
–
c(o)or5、c(o)nhr3、c(s)nhr3、c(o)nr3r3’
、c(s)nr3r3’
或(c
1-c8)烷基
–
o(co)r5；
[0205]
r2为h、f、苄基、(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基或(c
2-c8)炔基；
[0206]
r3和r3’
独立地为(c
1-c8)烷基、(c
3-c7)环烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、苄基、芳
基、(c
0-c4)烷基
–
(c
1-c6)杂环烷基、(c
0-c4)烷基
–
(c
2-c5)杂芳基、(c
0-c8)烷基
–
n(r6)2、(c
1-c8)烷基
–
or5、(c
1-c8)烷基
–
c(o)or5、(c
1-c8)烷基
–
o(co)r5或c(o)or5；
[0207]
r4为(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、(c
1-c4)烷基
–
or5、苄基、芳基、(c
0-c4)烷基
–
(c
1-c6)杂环烷基或(c
0-c4)烷基
–
(c
2-c5)杂芳基；
[0208]
r5为(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、苄基、芳基或(c
2-c5)杂芳基；
[0209]
每次出现的r6独立地为h、(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、苄基、芳基、(c
2-c5)杂芳基或(c
0-c8)烷基
–
c(o)o
–
r5，或者各r6基团可连接在一起形成杂环烷基基团；
[0210]
n为0或1；和
[0211]
*代表手性碳中心。
[0212]
在另一个实施方式中，所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、笼形包合物(clathrate)、对映异构体、非对映异构体、外消旋体或立体异构体混合物：
[0213][0214]
其中：
[0215]
x和y中的一个为c＝o，而另一个为ch2或c＝o；
[0216]
r为h或ch2ocor’；
[0217]
(i)r1、r2、r3或r4中的每一个彼此相互独立地为卤代(halo)、1至4个碳原子的烷基或1至4个碳原子的烷氧基，或(ii)r1、r2、r3或r4中的一个为硝基或-nhr5，而r1、r2、r3或r4中的剩余的为氢；
[0218]
r5为氢或1至8个碳原子的烷基；
[0219]
r6为氢、1至8个碳原子的烷基、苯并(benzo)、氯或氟；
[0220]
r’为r
7-chr
10-n(r8r9)；
[0221]
r7为间亚苯基或对亚苯基或-(c
nh2n
)-，其中n具有0至4的值；
[0222]
r8和r9中的每一个彼此相互独立地为氢或1至8个碳原子烷基，或者r8和r9结合在一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-ch2ch2x1ch2ch2–
，其中x1为-o-、-s-或-nh-；
[0223]r10
为氢、1至8个碳原子的烷基或苯基；和
[0224]
*代表手性碳中心。
[0225]
在一个具体的实施方式中，造血细胞的扩增在补充20％bits(牛血清白蛋白、重组人胰岛素和转铁蛋白)、scf、flt-3配体、il-3和4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮(10μm的0.05％dmso)的imdm中进行。在一个更具体的实施方式中，约5x107个造血细胞(例如，cd34

细胞)在培养基中扩增至约5x10
10
个细胞至约5x10
12
个细胞，再将其再悬浮于100ml的imdm中以产生扩增的造血细胞群体。优选地，将扩增的造血细胞群体冷冻保存以有利于运输。
[0226]
在各种具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％、70％.75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的所述造血细胞分化为nk细胞。
[0227]
在某些实施方式中，如本文描述的扩增和分化造血细胞的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体在扩增和分化期间维持在约2x104和约6x106个细胞/毫升之间，例如在约2x104和约2x105个细胞/毫升之间。在某些其它实施方式中，如本文描述的扩增和分化造血细胞的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体维持在不超过约1x105个细胞、1x104个细胞或1x103个细胞/毫升。在某些其它实施方式中，如本文描述的扩增和分化造血细胞的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体维持在不超过约1x105个细胞/毫升、2x105个细胞/毫升、3x105个细胞/毫升、4x105个细胞/毫升、5x105个细胞/毫升、6x105个细胞/毫升、7x105个细胞/毫升、8x105个细胞/毫升、9x105个细胞/毫升、1x106个细胞/毫升、2x106个细胞/毫升、3x106个细胞/毫升、4x106个细胞/毫升、5x106个细胞/毫升、6x106个细胞/毫升、7x106个细胞/毫升、8x106个细胞/毫升或9x106个细胞/毫升。在某些实施方式中，本文提供的是本文描述的培养细胞的方法，其中达到每cm2约1x103至5x103、5x103至1x104、1x104至5x104、5x104至1x105、1x105至5x105、5x105至1x106、1x106至5x106、5x106至1x107、1x107至5x107或5x107个以上细胞的密度。
[0228]
造血细胞经扩增和分化为nk细胞的时间可以为例如约3天至约120天。在一个实施方式中，所述分化时间为约7天至约75天。在另一个实施方式中，所述分化时间为约14天至约50天。在一个具体的实施方式中，所述分化时间为约21天至约28天。
[0229]
5.2.1.2.第二步骤
[0230]
在本文提供的方法中，所述造血细胞(例如，干细胞或祖细胞)和由第一步骤产生的自然杀伤细胞在第二步骤中例如不使用饲养层或在存在饲养细胞的情况下进一步扩增并且分化。如本文提供的细胞培养导致来自第一步骤的nk细胞的连续扩增、分化以及成熟。在第二步骤中，所述nk细胞以连续方式在第二培养基(例如，包含与第一培养基不同的细胞因子和/或生物活性分子)中扩增、分化和成熟。在某些实施方式中，所述第二培养基是不含动物成分的培养基。示例性的不含动物成分的细胞培养培养基如上所述。
[0231]
因此，在一个方面，本文提供的是产生nk细胞的方法，包括在存在饲养细胞并且与白介素-2(il-2)接触或接近的情况下，在第二培养基中扩增如上所述来自第一步骤的nk细胞。在具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含il-2(例如，10iu/ml至1000iu/ml)和以下成分中的一种或多种：人血清(例如，人血清ab)、胎牛血清(fbs)或小牛血清(fcs)，例如5％-15％fcs v/v；转铁蛋白，例如10μg/ml至50μg/ml；胰岛素，例如5μg/ml至20μg/ml；乙醇胺，例如5x10
–4至5x10
–5m；油酸，例如0.1μg/ml至5μg/ml；亚油酸，例如0.1μg/ml至5μg/ml；棕榈酸，例如0.05μg/ml至2μg/ml；牛血清白蛋白(bsa)，例如1μg/ml至5μg/ml；和/或植物凝集素，例如0.01μg/ml至1μg/ml。在一个更具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含fbs或fcs(例如，10％fcs v/v)、il-2、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白(bsa)和植物凝集素。在一个更具体的实施方式中，所述第二培养基包含伊思考夫改良杜尔贝可培养基(imdm)、10％fbs或fcs、400iu il-2、35μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、2x10-5
m乙醇胺、1μg/ml油酸、1μg/ml亚油酸(sigma-aldrich)、0.2μg/ml棕榈酸(sigma-aldrich)、2.5μg/ml bsa(sigma-aldrich)和0.1μg/ml植物凝集素。
[0232]
在某些实施方式中，所述第二培养基不包含粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白介素-6(il-6)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip1α)或白
血病抑制因子(lif)中的一种或多种。
[0233]
除了所述方法以外，本文提供的是作为组合物的任何以上描述的培养基。
[0234]
当使用时，可以从各种细胞类型建立饲养细胞。这些细胞类型的实例包括但不限于成纤维细胞、干细胞(例如，组织培养贴壁胎盘干细胞)、血液细胞(例如，外周血单核细胞(pbmc))和癌性细胞(例如，慢性髓细胞白血病(cml)细胞例如k562)。在一个具体的实施方式中，在所述第二培养基中的所述培养包括使用饲养细胞，例如k562细胞和/或外周血单核细胞(pbmc)的培养，例如在细胞开始在所述第二培养基中的时间时，此后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天时。在某些实施方式中，饲养细胞是可选地来自与它们所支持的细胞不同的物种。例如，小鼠胚胎成纤维细胞(得自原代培养物或端粒酶化的细胞系)可以支持人nk细胞。
[0235]
在某些实施方式中，可选地通过辐射(例如，γ-辐射)或用抗有丝分裂剂(例如，丝裂霉素c)处理使饲养细胞失活以防止它们比所支持的细胞长得更快，但允许支持nk细胞的重要因子的合成。例如，可以按抑制增殖但允许支持人胚胎干(hes)细胞的重要因子合成的剂量(约4000rad的γ辐射)对细胞进行辐射。
[0236]
用于第二步骤的nk细胞的培养可以在与细胞培养和扩增相容的任何容器(例如，三角瓶、管、烧杯、培养皿、多孔板、袋等)中发生。在一个具体的实施方式中，依赖饲养细胞的nk细胞的培养在袋(例如，柔韧的可透气的氟碳化合物培养袋(例如，得自american fluoroseal))中发生。在一个具体的实施方式中，其中培养所述nk细胞的容器适合于运输(例如)至其中使扩增的nk细胞进一步扩增、分化和成熟的地点，例如医院或部队营区。
[0237]
来自步骤1的细胞向tsnk细胞的分化可以例如通过流式细胞术检测nk细胞特异性标志物进行评估。nk细胞特异性标志物包括但不限于cd56、cd94、cd117和nkp46。通过nk细胞的形态特征，例如大尺寸、丰富内质网(er)中的高蛋白质合成活性和/或预先形成的颗粒，也可以对分化进行评估。
[0238]
来自步骤1的细胞向tsnk细胞的扩增和分化的时间可以为例如约3天至约120天。在一个实施方式中，所述分化时间为约7天至约75天。在另一个实施方式中，所述分化时间为约14天至约50天。在一个具体的实施方式中，所述分化时间为约10天至约21天。
[0239]
造血细胞向nk细胞的分化可以通过例如流式细胞术检测标志物例如cd56、cd94、cd117、nkg2d、dnam-1和nkp46进行评估。通过nk细胞的形态特征，例如大尺寸、丰富内质网(er)中的高蛋白质合成活性和/或预先形成的颗粒，也可以对分化进行评估。nk细胞(例如，tsnk细胞)的成熟可以通过检测一种或多种功能性相关标志物(makers)例如cd94、cd161、nkp44、dnam-1、2b4、nkp46、cd94、kir和激活受体的nkg2家族(例如，nkg2d)进行评估。nk细胞(例如，tsnk细胞)的成熟也可以通过检测不同发育阶段期间的特异性标志物进行评估。例如，在一个实施方式中，nk祖细胞是cd34

、cd45ra

、cd10

、cd117
–
和/或cd161
–
。在另一个实施方式中，nk祖细胞是cd34

、cd45ra

、cd10
–
、cd117

和/或cd161
–
。在另一个实施方式中，未成熟的nk细胞是cd34
–
、cd117

、cd161

、nkp46
–
和/或cd94/nkg2a
–
。在另一个实施方式中，cd56
bright
nk细胞是cd117

、nkp46

、cd94/nkg2a

、cd16
–
和/或kir
/
–
。在另一个实施方式中，cd56
dim
nk细胞是cd117
–
、nkp46

、cd94/nkg2a
/
–
、cd16 和/或kir

。在一个具体的实施方式中，nk细胞(例如，tsnk细胞)的成熟通过cd161
–
、cd94

和/或nkp46

nk细胞(例如，tsnk细胞)的百分比来确定。在一个更具体的实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％或70％的成熟nk细胞(例如，tsnk细胞)是nkp46

。在另一个更具体的
实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的成熟nk细胞(例如，tsnk细胞)是cd94

。在另一个更具体的实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的成熟nk细胞(例如，tsnk细胞)是cd161
–
。
[0240]
在某些实施方式中，造血细胞向nk细胞的分化通过检测例如cd3、cd7或cd127、cd10、cd14、cd15、cd16、cd33、cd34、cd56、cd94、cd117、cd161、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、2b4或to-pro-3的表达水平(使用例如抗这些细胞标志物中的一种或多种的抗体)进行评估。这样的抗体可以与可检测的标记缀合，例如，作为荧光标记，例如fitc、r-pe、percp、percp-cy5.5、apc、apc-cy7或apc-h7。
[0241]
5.2.2.使用三阶段方法产生nk祖细胞群体和nk细胞群体
[0242]
在一个实施方式中，本文提供的是产生nk细胞群体或nk祖细胞群体的三阶段方法。在某些实施方式中，根据本文描述的三阶段方法，如本文描述的扩增和分化造血细胞的方法以产生nk祖细胞群体或nk细胞群体包括将包含所述造血细胞的细胞群体在扩增和分化期间维持在约2x104和约6x106个细胞/毫升之间，例如在约2x104和约2x105个细胞/毫升之间。在某些其它实施方式中，如本文描述的扩增和分化造血细胞的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体维持在不超过约1x105个细胞/毫升。在某些其它实施方式中，如本文描述的扩增和分化造血细胞的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体维持在不超过约1x105个细胞/毫升、2x105个细胞/毫升、3x105个细胞/毫升、4x105个细胞/毫升、5x105个细胞/毫升、6x105个细胞/毫升、7x105个细胞/毫升、8x105个细胞/毫升、9x105个细胞/毫升、1x106个细胞/毫升、2x106个细胞/毫升、3x106个细胞/毫升、4x106个细胞/毫升、5x106个细胞/毫升、6x106个细胞/毫升、7x106个细胞/毫升、8x106个细胞/毫升或9x106个细胞/毫升。
[0243]
在某一个实施方式中，所述三阶段方法包括第一阶段(“第1阶段”)，其包括将造血干细胞或祖细胞(例如，cd34

干细胞或祖细胞)在第一培养基中培养规定的时间周期，例如，如本文所描述的。在某些实施方式中，所述第一培养基含有促进造血祖细胞扩增的一种或多种因子、启动扩增中的造血祖细胞群体内的淋巴样细胞分化的一种或多种因子和/或模拟基质饲养细胞支持物的一种或多种因子。在某些实施方式中，所述第一培养基包含一种或多种细胞因子(例如，flt3l、tpo、scf)。在某些实施方式中，所述第一培养基包含il-7。在某些实施方式中，所述第一培养基包含亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和/或gm-csf。在一个具体的实施方式中，所述第一培养基包含细胞因子flt3l、tpo和scf、il-7和亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和gm-csf。在具体的实施方式中，在第一培养基中，cd34 细胞经历扩增成为谱系特异性祖细胞，该祖细胞然后变成cd34-。在某些实施方式中，该扩增快速发生。在某些实施方式中，在第1阶段结束时，所述cd34-细胞占总群体的超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％或80％以上。在一个更具体的实施方式中，在第1阶段结束时，cd34-细胞占总群体的超过80％。
[0244]
在某些实施方式中，随后，在“第2阶段”中，将所述细胞在第二培养基中培养规定的时间周期，例如，如本文所描述的。在某些实施方式中，所述第二培养基含有可促进淋巴样细胞祖先进一步扩增的因子、可有助于沿着nk谱系发育的因子和/或模拟基质饲养细胞支持物的因子。在某些实施方式中，所述第二培养基包含一种或多种细胞因子(例如，flt3l、scf、il-15和/或il-7)。在某些实施方式中，所述第二培养基包含il-17和/或il-15。在某些实施方式中，所述第二培养基包含亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和/或gm-csf。在一个
具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞因子flt3l、scf、il-15和il-7、il-17和il-15和亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和gm-csf。
[0245]
在某些实施方式中，随后，在“第3阶段”中，将所述细胞在第三培养基中培养规定的时间周期，例如，如本文所描述的。在某些实施方式中，所述第三培养基包含促进cd56 cd3-cd16-细胞(其可以是nk祖细胞)的分化和功能性活化的因子。在一个实施方式中，这样的因子包含il2和il12和il18、il12和il15、il12和il18、il2和il12和il15和il18、或il2和il15和il18。在某些实施方式中，所述第三培养基包含模拟基质饲养细胞支持物的因子。在某些实施方式中，所述第三培养基包含一种或多种细胞因子(例如，scf、il-15、il-7、il-2)。在某些实施方式中，所述第三培养基包含亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和/或gm-csf。在一个具体的实施方式中，所述第三培养基包含细胞因子scf、il-15、il-7、il-2和亚-ng/ml浓度的g-csf、il-6和gm-csf。
[0246]
在一个具体的实施方式中，所述三阶段方法用于产生nk祖细胞群体。在另一个具体的实施方式中，所述三阶段方法用于产生nk细胞群体。在某些实施方式中，所述三阶段方法在不存在基质饲养细胞支持物的情况下实施。在某些实施方式中，所述三阶段方法在不存在外源添加的类固醇(例如，可的松(cortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)或其衍生物)的情况下实施。
[0247]
在某些实施方式中，本文描述的三阶段方法中使用的第一培养基可含有以上描述的以及该两步方法中的第一培养基或第二培养基的任意组分。在某些实施方式中，该三阶段方法中使用的所述第一培养基包括包含一种或多种以下成分的培养基：动物血清，例如人血清(例如，人血清ab)、胎牛血清(fbs)或小牛血清(fcs)，例如1％至20％v/v血清，例如5％至20％v/v血清；干细胞因子(scf)，例如1ng/ml至50ng/ml scf；fms样酪氨酸激酶-3配体(flt-3配体)，例如1ng/ml至30ng/ml flt-3配体；白介素-7(il-7)，例如1ng/ml至50ng/ml il-7；促血小板生成素(tpo)，例如1ng/ml至100ng/ml，例如1ng/ml至50ng/mltpo；白介素-2(il-2)，例如至多2000iu/ml，例如50iu/ml至500iu/ml；和/或肝素，例如低分子量肝素(lwh)，例如0.1iu/ml至10iu/ml肝素。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含以下成分中的一种或多种：抗生素，例如庆大霉素；抗氧化剂，例如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含oac。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含白介素-6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、g-csf、gm-csf和/或mip-1α。在某些实施方式中，所述第一培养基另外包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，为第一培养基提供基础的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养培养基，例如商购的细胞/组织培养培养基，例如x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640；或是包含一般在已知细胞/组织培养培养基中所包括的组分的培养基，例如在包括的组分的培养基，例如在x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或
rpmi-1640中所包括的组分。
[0248]
在某些实施方式中，本文描述的三阶段方法中使用的第二培养基可含有以上描述的以及该两步方法中的第一培养基或第二培养基的任意组分。在某些实施方式中，该三阶段方法中使用的所述第二培养基包括包含一种或多种以下成分的培养基：动物血清，例如人血清(例如，人血清ab)、fbs或fcs，例如5％至20％v/v血清；scf，例如1ng/ml至50ng/ml scf；flt-3配体，例如1ng/ml至30ng/ml flt-3配体；il-7，例如1ng/ml至50ng/ml il-7；白介素-15(il-15)，例如1ng/ml至50ng/ml il-15；和/或肝素，例如lwh，例如0.1iu/ml至10iu/ml肝素。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含以下成分中的一种或多种：抗生素，例如庆大霉素；抗氧化剂，例如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含oac。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含白介素-6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、g-csf、gm-csf和/或mip-1α。在某些实施方式中，所述第二培养基另外包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，为第二培养基提供基础的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养培养基，例如商购的细胞/组织培养培养基，例如x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640；或是包含一般在已知细胞/组织培养培养基中所包括的组分的培养基，例如在x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640中所包括的组分。
[0249]
在某些实施方式中，本文描述的三阶段方法中使用的第三培养基可含有以上描述的以及该两步方法中的第一培养基或第二培养基的任意组分。在某些实施方式中，该三阶段方法中使用的所述第三培养基包括包含一种或多种以下成分的培养基：动物血清，例如人血清(例如，人血清ab)、fbs或fcs，例如5％至20％v/v血清；scf，例如1ng/ml至50ng/ml scf；flt-3配体，例如1ng/ml至30ng/ml flt-3配体；il-7，例如1ng/ml至50ng/ml il-7；il-15，例如1ng/ml至50ng/ml il-15；和白介素-2(il-2)，例如在0至2000iu/ml，例如50iu/ml至1000iu/ml il-2的范围内。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含以下成分中的一种或多种：抗生素，例如庆大霉素；抗氧化剂，例如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；亚硒酸钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含oac。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含白介素-6(il-6)、白血病抑制因子(lif)、g-csf、gm-csf和/或mip-1α。在某些实施方式中，所述第三培养基另外包含一种或多种抗氧化剂，例如holo-转铁蛋白、胰岛素溶液、还原型谷胱甘肽、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、b-巯基乙醇、o-乙酰基-l-肉毒碱、n-乙酰基半胱氨酸、( /-)硫辛酸、烟酰胺或白藜芦醇。在某些实施方式中，为第三培养基提供基础的培养基是本领域技术人员已知的细胞/组织培养培养基，例如商购的细胞/组织培养培养基，例如x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、
imdm和/或rpmi-1640；或是包含一般在已知细胞/组织培养培养基中所包括的组分的培养基，例如在x-vivo
tm 10、x-vivo
tm 15、optmizer、h3000、cellgro complete
tm
、dmem:ham’s f12(“f12”)(例如，2:1比率，或高葡萄糖或低葡萄糖dmem)、高级dmem(gibco)、el08-1d2、myelocult
tm h5100、imdm和/或rpmi-1640中所包括的组分。
[0250]
在某些实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方式中，将所述第一培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方式中，将所述第一培养基和所述第二培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，或超过30天。
[0251]
在某些实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养2-12天、3-11天，例如3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10或9-11天。在某些实施方式中，将所述第一培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养1-10天，例如1-3、2-4、3-5、4-6、5-7、6-8或7-9天。在某些实施方式中，将所述第一培养基和所述第二培养基中所培养的细胞在所述第三培养基中培养2-27天，例如3-25天，例如3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-16、15-17、16-18、17-19、18-20、19-21、20-22、21-23、22-24或23-25天。
[0252]
在一个具体的实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5天；和在所述第三培养基中培养7天，即，将该细胞总共培养21天。
[0253]
在一个具体的实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养7-9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5-7天；和在所述第三培养基中培养21-35天，即，将该细胞总共培养35天。在一个更具体的实施方式中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第二培养基中进行所述培养之前在所述第一培养基中培养9天；在所述第三培养基中进行所述培养之前在所述第二培养基中培养5天；和在所述第三培养基中培养21天，即，将该细胞总共培养35天。
[0254]
5.3.nk细胞的分离
[0255]
自然杀伤细胞的分离方法是本领域已知的并且可用于分离本文描述的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)或使用三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞。可以通过用抗cd56和cd3的抗体对来自组织来源(例如，外周血)的细胞染色并对cd56

cd3
–
细胞选择来分离或富集nk细胞。可以使用商购的试剂盒，例如nk细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)来分离nk细胞，例如tsnk细胞。还可以通过除去包含nk细胞(例如，tsnk细胞)的细胞群体中除nk细胞以外的细胞来分离或富集nk细胞，例如tsnk细胞。例如，可以通过使用例如抗cd3、cd4、cd14、cd19、cd20、cd36、cd66b、cd123、hla dr和/或cd235a(血型糖蛋白a)中的一种或多种的抗体
的耗尽展示出非nk细胞标志物的细胞来分离或富集nk细胞，例如tsnk细胞。可以使用商购的试剂盒(例如，nk细胞阴性分离试剂盒(dynal biotech))进行阴性分离。可以对通过这些方法分离的细胞另外进行分选(例如)以把cd16

和cd16
–
细胞分离开。
[0256]
可以通过例如流式细胞术、荧光激活细胞分选术(facs)或优选地使用与特异性抗体缀合的微珠的磁细胞分选术完成细胞分离。可以例如使用磁激活细胞分选(macs)技术分离细胞，macs技术是一种基于颗粒结合包含一种或多种特异性抗体(例如，抗cd56抗体)的磁珠(例如，直径约0.5-100μm)的能力来分离颗粒的方法。可以使用例如automacs
tm
分离器(miltenyi)实施并自动化进行磁细胞分离。可以在磁性微球上进行多种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后，将珠与细胞混合以使其结合。然后，使细胞通过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在一个实施方式中，然后可将这些细胞分离并和与抗另外的细胞表面标志物的抗体偶联的磁珠再混合。使这些细胞再次通过磁场以分离出结合两种抗体的细胞。然后，可以将这样的细胞稀释至单独的培养皿(例如，微量滴定培养皿)中供克隆分离用。
[0257]
5.4.胎盘灌洗液
[0258]
根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞，例如tsnk细胞和nk祖细胞和nk细胞群体可以由造血细胞产生，例如，由来自任何来源例如胎盘组织、胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾脏、肝脏等的造血干细胞或祖细胞产生。在某些实施方式中，所述造血干细胞是来自胎盘灌洗液和来自与用于产生胎盘灌洗液相同的胎盘的脐带血的混合造血干细胞。胎盘灌洗液包含胎盘灌洗液细胞，其可以例如通过在美国专利第7,045,148号和第7,468,276号中公开的方法获得，所述专利的公开内容以其全部内容并入本文。
[0259]
5.4.1.细胞收集组合物
[0260]
可以通过使用胎盘细胞收集组合物灌洗哺乳动物(例如，人)分娩后的胎盘收集胎盘灌洗液和灌洗液细胞，从中可以分离出造血干细胞或祖细胞或者可用于肿瘤抑制或治疗具有肿瘤细胞、癌症或病毒感染的个体，例如，与nk细胞(例如，tsnk细胞)或根据本文提供的三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞群体组合。可以通过用任何生理上可接受的溶液(例如，盐水溶液、培养基或更复杂的细胞收集组合物)灌洗胎盘而从胎盘收集灌洗液。适合于灌洗胎盘并且适合于收集和保存灌洗液细胞的细胞收集组合物在相关的美国申请公布号2007/0190042中有详细描述，所述专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
[0261]
所述细胞收集组合物可以包含适合于收集和/或培养干细胞的任何生理上可接受的溶液，例如盐水溶液(例如，磷酸缓冲盐溶液、克氏溶液(kreb’s solution)、改良的克氏溶液、伊格尔氏溶液(eagle’s solution)、0.9％nacl等)、培养基(例如，dmem、h.dmem等)等。
[0262]
所述细胞收集组合物可以包含趋于保存胎盘细胞的一种或多种组分，即在从收集时间到培养时间防止胎盘细胞死亡或延缓胎盘细胞死亡、减少细胞群体中死亡的胎盘细胞数目等。这样的组分可以是例如细胞凋亡抑制剂(例如，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂或jnk抑制剂)；血管扩张药(例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽(anp)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质素释放激素、硝普钠、肼屈嗪(hydralazine)、腺苷三磷酸、腺苷、吲哚美辛(indomethacin)或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1h-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮(clonazepam))；tnf-α抑制
剂；和/或携氧全氟碳化合物(例如，全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
[0263]
所述细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、核糖核酸酶(rnase)或脱氧核糖核酸酶(dnase)等。这样的酶包括但不限于胶原酶(例如，胶原酶i、ii、iii或iv，来自溶组织梭状芽孢杆菌(clostridium histolyticum)的胶原酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶(liberase)、透明质酸酶等。
[0264]
所述细胞收集组合物可以包含杀细菌或抑细菌有效量的抗生素。在某些非限制性的实施方式中，所述抗生素是大环内酯(例如，妥布霉素(tobramycin))、头孢菌素(例如，头孢氨苄(cephalexin)、头孢拉定(cephradine)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)、头孢克肟(cefixime)或头孢羟氨芐(cefadroxil))、克拉霉素(clarithromycin)、红霉素(erythromycin)、青霉素(penicillin)(例如，青霉素v)或喹诺酮(例如，氧氟沙星(ofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)或诺氟沙星(norfloxacin))、四环素(tetracycline)、链霉素(streptomycin)等。在一个特定的实施方式中，所述抗生素对革兰氏( )和/或革兰氏(
–
)细菌例如绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)等是有活性的。
[0265]
所述细胞收集组合物也可以包含一种或多种下列化合物：腺苷(约1mm至约50mm)；d-葡萄糖(约20mm至约100mm)；镁离子(约1mm至约50mm)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在(例如，合成的或天然存在的胶体、多糖例如右旋糖酐或聚乙二醇，其以约25g/l至约100g/l或约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如，丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素c或维生素e，其以约25μm至约100μm存在)；还原剂(例如，n-乙酰基半胱氨酸，其以约0.1mm至约5mm存在)；防止钙进入细胞的药剂(例如，维拉帕米(verapamil)，其以约2μm至约25μm存在)；硝酸甘油(例如，约0.05g/l至约0.2g/l)；抗凝血剂，在一个实施方式中，其以足以帮助防止残余血液凝结的量存在(例如，肝素或水蛭素(hirudin)，其以约1000单位/l至约100,000单位/l的浓度存在)；或含有阿米洛利(amiloride)的化合物(例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，其以约1.0μm至约5μm存在)。
[0266]
5.4.2.胎盘的收集与处理
[0267]
一般而言，人胎盘在出生后在其娩出后不久进行回收。在一个优选的实施方式中，在知情同意后并且在取得患者的完整病历并且与胎盘有关后从患者回收胎盘。优选地，病历在分娩后继续。
[0268]
在灌洗液回收之前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，在分娩后，回收胎盘中的脐带血。胎盘可以经受常规脐带血回收过程。典型地，使用针或插管并借助于重力以使胎盘放血(参见，例如anderson，美国专利号5,372,581；hessel等人，美国专利号5,415,665)。通常将针或插管置于脐静脉中，并且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。这样的脐带血回收可以商业性进行，例如lifebank inc.,cedar knolls,n.j.,viacord,cord blood registry and cryocell。优选地，胎盘经重力放血而无需其它操作从而使脐带血回收期间的组织破坏减到最小。
[0269]
典型地，把胎盘从分娩或生产房间送到另一个位置(例如，实验室)以用于回收脐
method)收集的胎盘细胞通常几乎只是胎儿细胞。
[0277]
在一个实施方式中，封闭回路灌洗方法可以如下进行。在分娩后约48小时以内获得分娩后的胎盘。夹紧脐带并在夹子上方切割。可以将脐带丢弃，或者可加工回收例如脐带干细胞和/或加工脐带膜用于生产生物材料。可以在灌洗期间保留羊膜，或者可以例如使用钝剥离法用手指把羊膜与绒毛膜分离开。如果在灌洗之前把羊膜与绒毛膜分离开，则可以将羊膜丢弃，或者例如通过酶促消化加工获得干细胞或者生产例如羊膜生物材料，例如，在美国申请公布号2004/0048796中所描述的生物材料。在例如使用消毒纱布清洁胎盘的所有可见血块和残留血液之后，通过例如部分切割脐带膜以暴露脐带的横截面来暴露脐带血管。鉴别血管并例如通过将闭合的鳄鱼夹向前通过每根血管的切割末端将血管开口。然后，将连接到灌洗装置或蠕动泵的装置(例如，塑料管)插入每根胎盘动脉里面。所述泵可以是适合于该目的任何泵，例如蠕动泵。然后，将连接到无菌收集储罐(例如，血袋，例如250ml收集袋)的塑料管插入胎盘静脉。作为另外一种选择，将连接到泵的管插入胎盘静脉，并将连接到收集储罐的管插入胎盘动脉之一或两者。然后，用大量的灌洗溶液(例如，约750ml的灌洗溶液)灌洗胎盘。然后，例如通过离心作用收集灌洗液中的细胞。
[0278]
在一个实施方式中，在灌洗期间把近端脐带夹紧，更优选地，在胎盘中脐带插入的4-5cm(厘米)以内夹紧脐带。
[0279]
一般而言，在放血过程中来自哺乳动物胎盘的第一次收集的灌洗液被脐带血和/或胎盘血的残留红色血液细胞染色。随着灌洗的进行，灌洗液变得更无色并且残留的脐带血细胞被清洗出胎盘。一般而言，30至100ml的灌洗液对开始冲洗来自胎盘的血液已足够，但是根据观察的结果可以使用更多或更少的灌洗液。
[0280]
灌洗胎盘所使用的灌洗液体积可以根据要收集的胎盘细胞数、胎盘大小、从单个胎盘进行收集的次数等而变化。在各种不同的实施方式中，灌洗液的体积可以为50ml至5000ml、50ml至4000ml、50ml至3000ml、100ml至2000ml、250ml至2000ml、500ml至2000ml或者750ml至2000ml。典型地，在放血后用700-800ml的灌洗液灌洗胎盘。
[0281]
可以在几小时或几天的过程中灌洗胎盘多次。当将胎盘灌洗多次时，可以将其在无菌条件下在容器或其它合适的器皿中维持或培养，并且用细胞收集组合物或标准灌洗溶液(例如，生理盐水溶液，例如磷酸缓冲盐溶液(“pbs”)，加或不加抗凝血剂(例如，肝素、华法林钠、香豆素、双羟基香豆素)和/或加或不加抗微生物剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mm)；抗生素，例如链霉素(例如，40-100μg/ml)、青霉素(例如，40u/ml)、两性霉素b(例如，0.5μg/ml)灌洗。在一个实施方式中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌洗液，从而在灌洗液的灌洗和收集之前，将胎盘维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或2天或3天或更多天。可以将灌洗的胎盘维持一个或多个另外的时间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或24小时以上，并且用例如700-800ml灌洗液进行第二次灌洗。可以将胎盘灌洗1、2、3、4、5次或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时灌洗一次。在一个优选的实施方式中，重复胎盘的灌洗和灌洗溶液(例如，胎盘细胞收集组合物)的收集直至回收的有核细胞的数目低于100个细胞/ml。可以在不同的时间点进一步加工处理灌洗液以单独地回收时间依赖性的细胞(例如，总有核细胞)群体。也可以将来自不同时间点的灌洗液合并。
[0282]
5.4.4.胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞
[0283]
典型地，来自单次胎盘灌洗的胎盘灌洗液包含约100
×
106至约500
×
106个有核细胞，包括造血细胞，从中可以通过本文公开的方法产生nk细胞(例如，tsnk细胞)或根据本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞或nk细胞。在某些实施方式中，所述胎盘灌洗液或灌洗液细胞包含cd34

细胞，例如造血干细胞或祖细胞。在一个更具体的实施方式中，这样的细胞可包含cd34

cd45
–
干细胞或祖细胞、cd34

cd45

干细胞或祖细胞等。在某些实施方式中，在从中分离造血细胞之前，将所述灌洗液或灌洗液细胞冷冻保存。在某些其它实施方式中，所述胎盘灌洗液包含或者所述灌洗液细胞包含仅胎儿细胞或胎儿细胞和母体细胞的组合。
[0284]
5.5.nk细胞和nk祖细胞
[0285]
5.5.1.tsnk细胞
[0286]
在一个方面，本文提供的是tsnk细胞，其是通过本文描述的两步方法产生的nk细胞(参见，例如第5.2.1节)。本文进一步提供的是包含通过本文描述的方法(例如，两步方法)产生的tsnk细胞的细胞群体。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)是cd3
–
cd56

。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)是cd3
–
cd56

cd16
–
。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)另外是cd94

cd117

。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)另外是cd161
–
。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞(例如，tsnk细胞)另外是nkg2d

。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞另外是nkp46

。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞另外是cd226

。
[0287]
在某些实施方式中，大于50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％的所述tsnk细胞是cd56

和cd16
–
。在其它实施方式中，至少50％、60％、70％、80％、82％、84％、86％、88％或90％的所述tsnk细胞是cd3
–
和cd56

。在其它实施方式中，至少50％、52％、54％、56％、58％或60％的所述tsnk细胞是nkg2d

。在其它实施方式中，少于30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的所述细胞是nkb1

。在某些其它实施方式中，少于30％、20％、10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是nkat2

。在某些其它实施方式中，少于30％、20％、10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是cd56

和cd16

。在更具体的实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％或70％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是nkp46

。在其它更具体的实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd117

。在其它更具体的实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd94

。在其它更具体的实施方式中，至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd161
–
。在其它更具体的实施方式中，至少10％、12％、14％、16％、18％或20％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd226

。在更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％或40％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd7

。在更具体的实施方式中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd5

。
[0288]
在特定的实施方式中，tsnk细胞群体包含其比例大于cd56 细胞的cd56-细胞。在特定的实施方式中，tsnk细胞群体在体内或离体分化为具有比例增加的cd56 细胞的群体。
[0289]
在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd117

细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞
群体包含nkg2d 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkg2d

细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含nkp44 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkp44

细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd52 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52

细胞。在一个特定的实施方式中，tsnk细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd244 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd244

细胞。在一个特定的实施方式中，tsnk细胞群体包含cd244 cd117 细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含lfa-1 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％lfa-1 细胞。在一个实施方式中，tsnk细胞群体包含cd94 细胞。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd94 细胞。
[0290]
在各种其它实施方式中，可以将tsnk细胞与(例如)以下nk细胞以(例如)约1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或约9:1的比率组合：其中所述nk细胞已从组织来源中分离出来但尚未扩增；nk细胞已从组织来源分离出来并且已扩增，或者通过不同方法产生的nk细胞，例如cd56

cd16

自然杀伤细胞。如上下文中所使用的，“分离的”意指细胞已从其正常组织环境中除去。
[0291]
tsnk细胞可以具有胎儿基因型或母体基因型。例如，因为作为适合于产生tsnk细胞的造血细胞来源的分娩后胎盘包含来自胎儿和来自母体的组织和细胞，所以胎盘灌洗液可以包含仅胎儿细胞或实质上大多数的胎儿细胞(例如，大于约90％、95％、98％或99％)，或者可以包含胎儿细胞和母体细胞的混合物(例如，胎儿细胞占灌洗液总有核细胞的小于约90％、80％、70％、60％或50％)。在一个实施方式中，所述tsnk细胞仅来源于胎儿胎盘造血细胞，例如，从胎盘的封闭回路灌洗中获得的细胞，其中所述灌洗产生包含实质上大多数的胎儿胎盘造血细胞或仅包含胎儿胎盘造血细胞的灌洗液。在另一个实施方式中，所述tsnk细胞来源于胎儿细胞和母体细胞，例如，通过盘法(参见上文)灌洗获得的细胞，其中所述灌洗产生包含胎儿和母体胎盘细胞混合物的灌洗液。因此，在一个实施方式中，本文提供的是胎盘来源的中间体自然杀伤细胞群体，其中实质上大多数具有胎儿基因型。在另一个实施方式中，本文提供的是胎盘来源的中间体自然杀伤细胞群体，其包含具有胎儿基因型的自然杀伤细胞和具有母体表型的自然杀伤细胞。
[0292]
本文还提供的是包含不通过本文描述的方法产生的自然杀伤细胞的tsnk细胞群体。例如，在一个实施方式中，本文提供的是也包含从例如脐带血、外周血、骨髓或两种或两种以上前述来源的组合中分离的自然杀伤细胞或者通过除本文描述的方法以外的方法扩增的nk细胞的tsnk细胞群体。这样的tsnk细胞群体可以包含tsnk细胞和其它nk细胞，例如，
以约1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、10:1、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95或约1:100等的比率。
[0293]
在某些实施方式中，所述分离的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)或富集的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)群体可以通过检测一种或多种功能性相关标志物，例如cd94、cd161、nkp44、dnam-1、2b4、nkp46、cd94、kir和激活受体的nkg2家族(例如，nkg2d)进行评估。在有些实施方式中，所述分离的或富集的自然杀伤细胞的纯度可以通过检测cd56、cd3和cd16中的一种或多种来证实。
[0294]
可选地，所述细胞毒性活性分离的或富集的自然杀伤细胞可以例如在细胞毒性测定中使用肿瘤细胞，例如培养的k562、ln-18、u937、weri-rb-1、u-118mg、ht-29、hcc2218、kg-1或u266肿瘤细胞等作为靶细胞进行评估。
[0295]
5.5.2.nk祖细胞
[0296]
在一个实施方式中，本文提供的是分离的nk祖细胞群体，其中所述nk祖细胞根据上文第5.2.2节中所描述的三阶段方法产生。
[0297]
在一个实施方式中，同与nk细胞群体(例如通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体)相关的cd3
–
cd56 细胞的百分比相比，所述分离的nk祖细胞群体包含低百分比的cd3
–
cd56 细胞，例如该nk祖细胞群体包含约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd3
–
cd56 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd3
–
cd56 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd3
–
cd56 细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体(例如，同与nk细胞群体相关的cd3
–
cd56 细胞的百分比相比，包含低百分比的cd3
–
cd56 细胞的nk祖细胞群体)包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd3
–
cd56 细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
[0298]
在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞另外是cd117

。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中在65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％之间的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。
[0299]
在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56 细胞另外是cd161 。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述cd3
–
cd56 细胞是cd161 。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述cd3
–
cd56 细胞是cd161 。在另
一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中在40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％或70％-75％之间的所述cd3
–
cd56 细胞是cd161 。
[0300]
在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56 细胞另外是nkp46 。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或90％以上的所述cd3
–
cd56 细胞是nkp46 。在一个更具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中约25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56 细胞是nkp46 。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56 细胞是nkp46 。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中在25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％之间或90％以上的所述cd3
–
cd56 细胞是nkp46 。在一个更具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体中在25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％或50％-55％之间的所述cd3
–
cd56 细胞是nkp46 。
[0301]
在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体含有cd56

cd16
–
细胞。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的cd3
–
cd56

细胞是cd16
–
。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的cd3
–
cd56

细胞是cd16

。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd16

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％或20％-25％之间的cd16

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd16

细胞。
[0302]
在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56 细胞另外是cd16-。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56 细胞另外是cd117 和cd161 。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56 细胞另外是cd16-、cd117 和cd161 。在某些实施方式中，所述nk祖细胞群体中的所述cd3
–
cd56 细胞另外是cd16-、cd117 、cd161 和nkp46 。
[0303]
在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含不超过约40％cd3
–
cd56 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含cd52 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52 细胞。在一个特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含cd244 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd244 细胞。在一个特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体包含cd244 cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含lfa-1 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含
不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％lfa-1 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含cd94 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd94 细胞。
[0304]
在特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含其比例高于cd56 细胞的cd56-细胞。在特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体在体内或离体分化为具有cd56 细胞比例增加的群体。
[0305]
在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd34
–
cd117

细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的cd34
–
cd117

细胞，例如该nk祖细胞群体包含约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd34
–
cd117

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd34
–
cd117

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd34
–
cd117

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd34
–
cd117

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
[0306]
在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd161

细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的cd161 细胞，例如该nk祖细胞群体包含约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd161

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd161

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd161

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd161

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
[0307]
在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的nkp46

细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的nkp46

细胞，例如该nk祖细胞群体包含约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％nkp46

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％nkp46

细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的nkp46

细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％nkp46

细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所
述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
[0308]
在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd56

cd16-细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含低百分比的cd56

cd16-细胞，例如该nk祖细胞群体包含约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd56

cd16-细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％cd56

cd16-细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在0％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％或45％-50％之间的cd56

cd16-细胞。在有些实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％或不超过15％cd56

cd16-细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
[0309]
在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，同与造血祖细胞群体相关的cd52

cd117 细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含较高百分比的cd52

cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，同与nk细胞群体相关的cd52

cd117 细胞的百分比相比，通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体包含较高百分比的cd52

cd117 细胞，例如该nk祖细胞群体包含约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或90％以上的cd52

cd117 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含不少于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52

cd117 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞群体包含在50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％之间或95％以上的cd52

cd117 细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。在一个具体的实施方式中，包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含总共培养12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长、16天或更长、17天或更长、18天或更长、19天或更长、20天或更长或21天或更长的三阶段方法产生。在一个具体的实施方式中，包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含总共培养至少12天、13天或14天但培养不超过21-25天、25-30天或30-35天的三阶段方法产生。在一个具体的实施方式中，包含cd52

cd117 细胞的所述nk祖细胞群体使用包含总共培养21天的三阶段方法产生。
[0310]
在一个具体的实施方式中，本文描述的nk祖细胞比nk细胞(例如，使用可比较的方法产生的nk细胞)具备植入骨髓(例如，体内)的更大能力。例如，在某些实施方式中，使用包含短的第三培养步骤(例如，4-6、5-7、6-8或7-9天的第三培养步骤)的三阶段方法产生的nk祖细胞比使用包含较长的第三培养步骤(例如，18-20、19-21、20-22或21-23天的第三培养步骤)的三阶段方法产生的nk细胞以较高的效率植入骨髓(例如，体内)。在另一个实施方式中，本文描述的nk祖细胞比外周血(pb)来源的nk细胞具备较长的端粒。
[0311]
5.5.3.通过三步方法产生的nk细胞
[0312]
在另一个实施方式中，本文提供的是分离的nk细胞群体，其中所述nk细胞根据上文第5.2.2节中所描述的方法产生。
[0313]
在一个实施方式中，本文提供的是通过本文描述的三阶段方法产生的分离的nk细胞群体，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较大百分比的cd3
–
cd56 细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％cd3
–
cd56 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％cd3
–
cd56 细胞。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含在65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％之间的cd3
–
cd56 细胞。在另一个具体的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk细胞群体使用包含长的第三培养步骤(例如，18-20、19-21、20-22或21-23天的第三培养步骤)的三阶段方法产生。
[0314]
在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是cd117

，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较小百分比的cd3
–
cd56

cd117

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。
[0315]
在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是cd161

，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较小百分比的cd3
–
cd56

cd161

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。
[0316]
在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是nkp46

，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较大百分比的cd3
–
cd56

nkp46

细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。
[0317]
在某些实施方式中，所述nk细胞群体中的所述cd3
–
cd56

细胞包含cd3
–
cd56

细胞，其另外是cd16-，其中所述nk细胞群体与通过本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体相比包含较大百分比的cd3
–
cd56

cd16-细胞，例如通过相同三阶段方法产生的nk祖细胞群体，只是用于产生该nk祖细胞群体的第三培养步骤具有比用于产生该nk细胞群体的第三培养步骤短的持续时间。在另一个实施方式中，使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞具备比外周血(pb)来源的nk细胞长的端粒。
[0318]
在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd117 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd117

细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含nkg2d 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkg2d

细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含nkp44 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％nkp44

细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd52 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd52

细胞。在一个特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk细胞群体包含cd52 cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd244 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd244

细胞。在一个特定的实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的所述nk细胞群体包含cd244 cd117 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含lfa-1 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％lfa-1 细胞。在一个实施方式中，通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体包含cd94 细胞。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞群体包含不超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％cd94 细胞。
[0319]
5.6.nk细胞和nk祖细胞与胎盘灌洗液的组合
[0320]
本文进一步提供的是包含使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)、根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体与胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞和/或贴壁胎盘细胞组合的组合物，例如，用于在抑制一种肿瘤细胞或多种肿瘤细胞的增殖中使用。
[0321]
5.6.1.nk细胞和灌洗液或灌洗液细胞的组合
[0322]
本文进一步提供的是包含使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体与胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞组合的组合物。在一个实施方式中，例如，本文提供的是补充使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体的胎盘灌洗液的体积。在具体的实施方式中，例如，每毫升的胎盘灌洗液补充约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个的使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体。在另一个实施方式中，向胎盘灌洗液细胞补充使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体。在某些其它实施方式中，当胎盘灌洗液细胞与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)、nk细胞群体或nk祖细胞群体组合时，所述胎盘灌洗液细胞一般占细胞总数的约、大于约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。在某些其它实施方式中，当使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体与众多的胎盘灌洗液细胞和/或混合的自然杀伤细胞组合时，所述nk细胞或nk细胞群体或nk祖细胞群体一般占细胞总数的约、大于约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％。在某些其它实施方式中，
当使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体用来补充胎盘灌洗液时，其中悬浮所述细胞的溶液(例如，盐水溶液、培养基等)的体积占灌洗液加上细胞的总体积的约、大于约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、6％、4％、2％或1％，其中在补充之前将所述nk细胞或nk祖细胞悬浮至约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个细胞/毫升。
[0323]
在其它实施方式中，细胞的任何上述组合进而与脐带血或来自脐带血的有核细胞组合。
[0324]
本文进一步提供的是获自两种或两种以上来源(例如，两个或两个以上胎盘)并且混合(例如，合并)的合并胎盘灌洗液。这样的合并灌洗液可以包含来自每一种来源的近似相等体积的灌洗液，或者可以包含来自每一种来源的不同体积的灌洗液。可以随机选择每一种来源的相对体积，或者可以基于例如一种或多种细胞的因子(例如，细胞因子、生长因子、激素等)的浓度或量；来自每一种来源的灌洗液中胎盘细胞的数目；或来自每一种来源的灌洗液的其它特征进行选择。来自同一个胎盘的多次灌洗的灌洗液可以进行类似地合并。
[0325]
类似地，本文提供的是获自两种或两种以上来源(例如，两个或两个以上胎盘)并且合并的胎盘灌洗液细胞和胎盘来源的中间体自然杀伤细胞。这样的合并细胞可以包含来自两种或两种以上来源的近似相等数目的细胞，或者来自合并来源中的一种或多种的不同数目的细胞。来自每一种来源的相对数目的细胞可以基于例如要合并的细胞中的一种或多种特异性细胞类型的数目(例如，cd34

细胞的数目)等进行选择。
[0326]
本文进一步提供的是使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体，和这样的细胞与胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞的组合，已对其进行了测定以确定根据例如给定数目的nk细胞或nk细胞群体或nk祖细胞群体或给定体积的灌洗液所预期的肿瘤抑制程度或量(即效力)。例如，使细胞的等分试样或样品数与已知数目的肿瘤细胞在所述肿瘤细胞将增殖的条件下接触或引起接近，并且将在存在胎盘灌洗液、灌洗液细胞、胎盘自然杀伤细胞或其组合的情况下肿瘤细胞随时间(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更长时间)的增殖速率与在不存在灌洗液、灌洗液细胞、胎盘自然杀伤细胞或其组合的情况下相等个数的肿瘤细胞的增殖速率进行比较。细胞的效力可以表示为例如将肿瘤细胞的生长抑制例如约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％等所需要的细胞个数或溶液体积。
[0327]
在某些实施方式中，提供使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体作为药物级可给予的单位。这样的单位可以按以下单独的体积提供：例如15ml、20ml、25ml、30nl、35ml、40ml、45ml、50ml、55ml、60ml、65ml、70ml、75ml、80ml、85ml、90ml、95ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml等。可以提供这样的单位以便含有规定个数的细胞，例如nk细胞或nk细胞群体或nk祖细胞群体与其它nk细胞或灌洗液细胞组合，例如1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个细胞/毫升，或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个细胞/单位。在具体的实施方式中，所述单位可以包含约、至少约或至多约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106个或更多个nk细胞或nk祖细胞/毫升，或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、
1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个细胞/单位。可以提供这样的单位以含有规定数目的nk细胞或nk细胞群体或nk祖细胞群体和/或任何其它细胞。
[0328]
在上述实施方式中，所述nk细胞或nk细胞群体、或nk祖细胞群体或者nk细胞或nk细胞群体、或nk祖细胞群体与其它nk细胞、灌洗液细胞或灌洗液的组合对于受体来说可以是自体的(即，获自该受体)，或者对受体来说可以是异源的(即，获自该受体以外的至少一个其他个体)。
[0329]
在某些实施方式中，对每单位的细胞进行标记以指明体积、细胞个数、细胞类型、该单位是否已富集了特定类型的细胞、和/或该单位中给定细胞数或给定毫升数的单位效力(即，该单位中的细胞是否引起一种或多促特定类型的肿瘤细胞增殖的可测量的抑制)中的一种或多种。
[0330]
5.6.2.nk细胞或nk祖细胞与贴壁胎盘干细胞的组合
[0331]
在其它实施方式中，使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体，或单独或与胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞组合，补充分离的贴壁胎盘细胞，例如胎盘干细胞和胎盘多能细胞，如(例如)在hariri的美国专利第7,045,148号和第7,255,879号及在美国专利申请公布第2007/0275362号中所描述，所述专利和专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。“贴壁胎盘细胞”意指贴附在组织培养表面(例如，组织培养塑料)上的细胞。在本文公开的组合物和方法中可使用的贴壁胎盘细胞不是滋养层细胞、胚胎生殖细胞或胚胎干细胞。在某些实施方式中，贴壁胎盘干细胞在如上所述的过程(例如，两步方法)期间用作饲养细胞。
[0332]
使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体，单独的或与胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞组合，可以补充例如1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个贴壁胎盘细胞/毫升，或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个贴壁胎盘细胞。该组合中的贴壁胎盘细胞可以是例如已培养例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群体倍增或更多次群体倍增的贴壁胎盘细胞。
[0333]
分离的贴壁胎盘细胞当在原代培养物中培养或在细胞培养物中扩增时贴附至组织培养基底例如组织培养容器表面(例如，组织培养塑料)。培养中的贴壁胎盘细胞呈现出一般成纤维细胞样星形外观，其多个胞质突从中央细胞体中伸出。然而，由于贴壁胎盘细胞显示出比成纤维细胞数目更多的此类胞质突，因此所述贴壁胎盘细胞在形态上与相同条件下培养的成纤维细胞是可区分的。在形态上，贴壁胎盘细胞与造血干细胞也是可区分的，造血干细胞在培养时一般呈现出更圆的或鹅卵石形态。
[0334]
在本文提供的组合物和方法中可使用的分离的贴壁胎盘细胞和贴壁胎盘细胞群体表达可用于鉴别和/或分离包含所述贴壁胎盘细胞的细胞或细胞群体的多种标志物。在本文提供的组合物和方法中可使用的贴壁胎盘细胞和贴壁胎盘细胞群体包括直接从胎盘或其任何部分(例如，羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜板、胎盘绒毛叶、脐带血等)中获得的贴壁胎盘细胞和含有贴壁胎盘细胞的细胞群体。在一个实施方式中，所述贴壁胎盘干细胞群体是培养中的贴壁胎盘干细胞群体(即，两种或两种以上)，例如，容器(例如，袋)中的群体。
[0335]
所述贴壁胎盘细胞一般表达标志物cd73、cd105和cd200和/或oct-4而不表达cd34、cd38或cd45。贴壁胎盘干细胞也可表达hla-abc(mhc-1)和hla-dr。这些标志物可以用于鉴别贴壁胎盘细胞和区别来自其它细胞类型的贴壁胎盘细胞。因为所述贴壁胎盘细胞可表达cd73和cd105，所以它们可以具有间充质干细胞样特征。cd34、cd38和/或cd45的表达缺乏将贴壁胎盘干细胞鉴别为非造血干细胞。
[0336]
在某些实施方式中，本文描述的分离的贴壁胎盘细胞可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。
[0337]
在某些实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在某些其它实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。在一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd34
–
、cd10

和cd105

，如通过流式细胞术所检测。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞是胎盘干细胞。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

胎盘细胞是多能贴壁胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

胎盘细胞具有分化为神经表型的细胞、成骨表型的细胞或成软骨表型的细胞的潜能。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞另外是cd200

。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞另外是cd90

或cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞另外是cd90

或cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在一个更具体的实施方式中，所述cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

贴壁胎盘细胞另外是cd90

或cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在另一个更具体的实施方式中，所述cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

贴壁胎盘细胞另外是cd90

和cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在另一个更具体的实施方式中，所述cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

、cd90

、cd45
–
贴壁胎盘细胞另外是cd80
–
和cd86
–
，如通过流式细胞术所检测。
[0338]
在一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd200

、hla-g

。在一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd73

和cd105

。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
或cd45
–
。在一个更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
、cd45
–
、cd73

和cd105

。在另一个实施方式中，当在允许胚胎样小体形成的条件下培养时，所述分离的贴壁胎盘细胞产生一个或多个胚胎样小体。
[0339]
在另一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd73

、cd105

、cd200

。在所述群体的一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是hla-g

。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
或cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
和cd45
–
。在一个更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
、cd45
–
和hla-g

。在另一个具体的实施方式中，当在允许胚胎样小体形成的条件下培养时，所述分离的贴壁胎盘细胞产生一个或多个胚胎样小体。
[0340]
在另一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd200

、oct-4

。在一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd73

和cd105

。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是hla-g

。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
和cd45
–
。在一个更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
、cd45
–
、cd73

、cd105

和hla-g

。在另一个具体的实施方式中，当在允许胚胎样
小体形成的条件下培养时，所述分离的贴壁胎盘细胞也产生一个或多个胚胎样小体。
[0341]
在另一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd73

、cd105

和hla-g

。在一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
或cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
和cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，所述贴壁干细胞还是oct-4

。在另一个具体的实施方式中，所述贴壁干细胞还是cd200

。在一个更具体的实施方式中，所述贴壁干细胞还是cd34
–
、cd38
–
、cd45
–
,oct-4

和cd200

。
[0342]
在另一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd73

、cd105

干细胞，其中在允许胚胎样小体形成的条件下，所述细胞产生一个或多个胚胎样小体。在一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
或cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
和cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，分离的贴壁胎盘细胞还是oct-4

。在一个更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是oct-4

、cd34
–
、cd38
–
和cd45
–
。
[0343]
在另一个实施方式中，所述贴壁胎盘干细胞是oct-4

干细胞，其中当在允许胚胎样小体形成的条件下培养时，所述贴壁胎盘干细胞产生一个或多个胚胎样小体，和其中所述干细胞已鉴定为可检测地抑制癌细胞增殖或肿瘤生长。
[0344]
在各种不同的实施方式中,至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的所述分离的贴壁胎盘细胞是oct-4

。在上述群体的一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd73

和cd105

。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd34
–
、cd38
–
或cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，所述干细胞是cd200

。在一个更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞还是cd73

、cd105

、cd200

、cd34
–
、cd38
–
和cd45
–
。在另一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞已扩增，例如，传代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
[0345]
在任何上述实施方式的一个更具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞表达abc-p(胎盘-特异性abc转运蛋白；参见，例如allikmets等人,cancer res.58(23):5337-9(1998))。
[0346]
在另一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞cd29

、cd44

、cd73

、cd90

、cd105

、cd200

、cd34
–
和cd133
–
。在另一个实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞组成性地分泌il-6、il-8和单核细胞化学引诱蛋白(mcp-1)。
[0347]
每一个以上提及的分离的贴壁胎盘细胞可以包含直接从哺乳动物胎盘获得和分离的细胞，或者已培养和传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30次或30次以上的细胞，或者它们的组合。以上描述的多种分离的肿瘤细胞抑制性贴壁胎盘细胞可以包含约、至少或不超过1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个分离的贴壁胎盘细胞。
[0348]
5.6.3.包含贴壁胎盘细胞条件化培养基的组合物
[0349]
本文还提供的是包含使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体和另外地包含条件化培养基的组合物的用途，其中所述组合物是肿瘤抑制性的，或者在癌症或病毒感染的治疗中是有效的。如本文描述的贴壁胎盘细胞可以用于产生肿瘤细胞抑制性、抗癌或抗病毒的条件化培
养基，即包含所述细胞所分泌或排泄的具有可检测的肿瘤细胞抑制效果、抗癌效果或抗病毒效果的一种或多种生物分子的培养基。在各种不同的实施方式中，所述条件化培养基包括其中所述细胞已增殖(即，已培养)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天的培养基。在其它实施方式中，所述条件化培养基包括其中这样的细胞已生长至至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％汇合或至多100％汇合的培养基。这样的条件化培养基可以用于支持单独的细胞(例如，胎盘细胞)群体，或另一类细胞群体的培养。在另一个实施方式中，本文提供的条件化培养基包括其中已培养了分离的贴壁胎盘细胞(例如，分离的贴壁胎盘干细胞或分离的贴壁胎盘多能细胞)和除分离的贴壁胎盘细胞以外的细胞(例如，非胎盘干细胞或多能细胞)的培养基。
[0350]
这样的条件化培养基可以与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体、胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞的任何或任何组合混合以形成肿瘤细胞抑制性、抗癌或抗病毒的组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含按体积小于一半的条件化培养基，例如按体积计约或小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0351]
因此，在一个实施方式中，本文提供的是包含使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和来自分离的贴壁胎盘细胞培养物的培养基的组合物，其中所述分离的贴壁胎盘细胞(a)贴附至基底；和(b)是cd34
–
、cd10

和cd105

；其中所述组合物可检测地抑制肿瘤细胞的生长或增殖，或是抗癌的或抗病毒的。在一个具体的实施方式中，所述分离的贴壁胎盘细胞是cd34
–
、cd10

和cd105

，如通过流式细胞术所检测。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞是胎盘干细胞。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

胎盘细胞是多能贴壁胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

胎盘细胞具有分化为神经表型的细胞、成骨表型的细胞或成软骨表型的细胞的潜能。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞另外是cd200

。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞另外是cd90

或cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在另一个更具体的实施方式中，所述分离的cd34
–
、cd10

、cd105

贴壁胎盘细胞另外是cd90

或cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在一个更具体的实施方式中，所述cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

贴壁胎盘细胞另外是cd90

或cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在另一个更具体的实施方式中，所述cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

贴壁胎盘细胞另外是cd90

和cd45
–
，如通过流式细胞术所检测。在另一个更具体的实施方式中，所述cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

、cd90

、cd45
–
贴壁胎盘细胞另外是cd80
–
和cd86
–
，如通过流式细胞术所检测。
[0352]
在另一个实施方式中，本文提供的是包含使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和来自分离的贴壁胎盘细胞培养物的培养基的组合物，其中所述分离的贴壁胎盘细胞(a)贴附至基底；和(b)表达cd200和hla-g，或表达cd73、cd105和cd200，或表达cd200和oct-4，或表达cd73、cd105和hla-g，或表达cd73和cd105并且当所述群体在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群体中形成一个或多个胚胎样小体，或表达oct-4并且当所述群体在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在包含所述胎盘干细胞的胎盘细胞群体中形成一个或多个胚胎样小体；其中所述组合物可检测地抑制肿瘤细胞的生长或增殖，或是抗癌的或
抗病毒的。在一个具体的实施方式中，所述组合物还包含众多的所述分离的胎盘贴壁细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含众多的非胎盘细胞。在一个更具体的实施方式中，所述非胎盘细胞包含cd34

细胞，例如造血祖细胞，例如外周血造血祖细胞、脐带血造血祖细胞或胎盘血造血祖细胞。所述非胎盘细胞也可以包含干细胞，例如间充质干细胞，例如骨髓源性间充质干细胞。所述非胎盘细胞也可以是一种或多种类型的成体细胞或细胞系。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含抗增殖剂，例如抗mip-1α或抗mip-1β抗体。
[0353]
在一个具体的实施方式中，通过以上描述的细胞或细胞组合之一调节的培养基获自与众多肿瘤细胞共培养的众多的分离的贴壁胎盘细胞，其中分离的贴壁胎盘细胞与肿瘤细胞的比率为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1或约5:1。例如，所述条件化培养基或上清液可获自包含约1x105个分离的贴壁胎盘细胞、约1x106个分离的贴壁胎盘细胞、约1x107个分离的贴壁胎盘细胞或约1x108个分离的贴壁胎盘细胞或更多的培养物。在另一个具体的实施方式中，所述条件化培养基或上清液获自包含约1x105至约5x105个分离的贴壁胎盘细胞和约1x105个肿瘤细胞；约1x106至约5x106个分离的贴壁胎盘细胞和约1x106个肿瘤细胞；约1x107至约5x107个分离的贴壁胎盘细胞和约1x107个肿瘤细胞；或约1x108至约5x108个分离的贴壁胎盘细胞和约1x108个肿瘤细胞的共培养物。
[0354]
5.7.细胞的保存
[0355]
细胞，例如使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体或包含造血干细胞或祖细胞的胎盘灌洗液细胞，可以在允许长期储存的条件下或放置在抑制细胞死亡(例如，通过抑制细胞凋亡或坏死)的条件下进行保存。
[0356]
可以通过将细胞收集组合物通过至少一部分胎盘(例如，通过胎盘脉管系统)来产生胎盘灌洗液。所述细胞收集组合物包含对保存灌洗液中所含细胞起作用的一种或多种化合物。这样的胎盘细胞收集组合物可以包含细胞凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟碳化合物，如相关美国申请公布号20070190042中所描述，该专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。
[0357]
在一个实施方式中，通过使灌洗液或细胞群体与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟碳化合物的细胞收集组合物接近，从哺乳动物(例如，人)分娩后的胎盘中收集灌洗液或胎盘细胞群体，其中与细胞凋亡抑制剂未接触或引起接近的细胞群体相比，所述细胞凋亡抑制剂以足以降低或防止胎盘细胞(例如，贴壁胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞)群体中的细胞凋亡的量和时间存在。例如，可以用细胞收集组合物灌洗胎盘，并从中分离胎盘细胞，例如总有核胎盘细胞。在一个具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。在另一个具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是jnk抑制剂。在一个更具体的实施方式中，所述jnk抑制剂不调节贴壁胎盘细胞(例如，贴壁胎盘干细胞或贴壁胎盘多能细胞)的分化或增殖。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物包含处于分离的相中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟碳化合物。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物包含处于乳浊液中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟碳化合物。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物另外包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一个实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟碳化合物是在使所述胎盘细胞与所述细胞收集组合物
引起接近的时间时处于约0℃和约25℃之间。在另一个更具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟碳化合物是在使所述胎盘细胞与所述细胞收集组合物接引起近的时间时处于约2℃和10℃之间，或处于约2℃和约5℃之间。在另一个更具体的实施方式中，所述引起接近在所述细胞群体的运输期间进行。在另一个更具体的实施方式中，所述引起接近在所述细胞群体的冷冻和融化期间进行。
[0358]
在另一个实施方式中，可以收集胎盘灌洗液和/或胎盘细胞并且通过使所述灌洗液和/或细胞与细胞凋亡抑制剂和保存器官的化合物引起接近进行保存，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触或引起接近所述细胞凋亡抑制剂的灌洗液或胎盘细胞相比足以降低或防止细胞凋亡的量和时间存在。在一个具体的实施方式中，所述保存器官的化合物是uw溶液(美国专利号4,798,824中有描述；也称为viaspan
tm
；也参见southard等人,transplantation 49(2):251-257(1990)或stern等人的美国专利号5,552,267中描述的溶液，所述专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在另一个实施方式中，所述保存器官的组合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一个实施方式中，所述胎盘细胞收集组合物另外包含处于两相或作为乳浊液的携氧全氟碳化合物。
[0359]
在所述方法的另一个实施方式中，在灌洗期间，使胎盘细胞与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟碳化合物、保存器官的化合物或其组合的细胞收集组合物引起接近。在另一个实施方式中，在通过灌洗收集之后，使胎盘细胞与所述细胞收集化合物引起接近。
[0360]
典型地，在胎盘细胞的收集、富集和分离期间，优选地减少或消除由于低氧和机械应力所造成的细胞胁迫。因此，在所述方法的另一个实施方式中，在收集、富集或分离期间，使胎盘灌洗液或胎盘细胞群体在所述保存期间暴露于低氧条件少于六小时，其中低氧条件是低于正常血氧浓度的氧浓度。在一个更具体的实施方式中，所述灌洗液或胎盘细胞群体在所述保存期间暴露于所述低氧条件少于两小时。在另一个更具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间，所述胎盘细胞群体暴露于所述低氧条件少于一小时或少于三十分钟，或者不暴露于低氧条件。在另一个具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间，所述胎盘细胞群体不暴露于切变应力。
[0361]
本文提供的细胞，例如胎盘灌洗液细胞、造血细胞，例如cd34

造血干细胞；使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体；分离的贴壁胎盘细胞，全都可以例如在冷冻保存培养基中在小容器(例如，安瓿或有隔片小瓶(septumvial))中进行冷冻保存。在某些实施方式中，本文提供的细胞以约1x104–
5x108个细胞/ml的浓度进行冷冻保存。在具体的实施方式中，本文提供的细胞以约1x106–
1.5x107个细胞/ml的浓度进行冷冻保存。在更具体的实施方式中，本文提供的细胞以约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、1.5x107个细胞/ml的浓度进行冷冻保存。
[0362]
合适的冷冻保存培养基包括但不限于生理盐水；培养基，包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如商购的细胞冷冻培养基，例如c2695、c2639或c6039(sigma)；cs2、cs5或cs10(biolife solutions)。在一个实施方式中，冷冻保存培养基包含dmso(二甲基亚砜)，浓度为例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％(v/v)。冷冻保存培养基可包含另外的试剂，例如甲基纤维素、右旋糖酐、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、海藻糖和/或甘油。在某些实施方式中，所述冷冻保存培养基包含约1％-10％dmso、约25％-75％右旋糖酐和/或约20-60％人血清白蛋白(hsa)。在某些实施方式中，所述
冷冻保存培养基包含约1％-10％dmso、约25％-75％海藻糖和/或约20-60％人hsa。在一个具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5％dmso、55％右旋糖酐和40％hsa。在一个更具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5％dmso、55％右旋糖酐(10％w/v的生理盐水)和40％hsa。在另一个具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5％dmso、55％海藻糖和40％hsa。在一个更具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含5％dmso、55％海藻糖(10％w/v的生理盐水)和40％hsa。在另一个具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含cs5。在另一个具体的实施方式中，所述冷冻保存培养基包含cs10。
[0363]
本文提供的细胞可以通过任何多种方法和在细胞培养、扩增或分化的任何阶段进行冷冻保存。例如，本文提供的细胞可以在从来源组织或器官(例如，胎盘灌洗液或脐带血)分离之后马上或者在上述方法的第一或第二步骤期间或之后进行冷冻保存。在某些实施方式中，所述造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)在从来源组织或器官分离之后的约1、5、10、15、20、30、45分钟以内或者约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时以内进行冷冻保存。在某些实施方式中，所述细胞是在从来源组织或器官分离之后的1、2或3天以内进行冷冻保存。在某些实施方式中，所述细胞是如上所述在第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天之后进行冷冻保存。在有些实施方式中，所述细胞是如上所述在第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天并且如上所述在第二培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天之后进行冷冻保存。在有些实施方式中，当nk细胞或nk祖细胞使用本文描述的三阶段方法制备时，所述细胞是在第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天之后；和/或在第二培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天之后；和/或在第三培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天之后进行冷冻保存。在一个具体的实施方式中，nk祖细胞使用本文描述的三阶段方法制备，并且所述细胞是在第一培养基中培养9天之后；在第二培养基中培养5天之后；和在第三培养基中培养7天之后进行冷冻保存。
[0364]
在一个方面，本文提供的是冷冻保存nk细胞(例如，tsnk细胞)群体的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体，和(c)将来自步骤(b)的nk细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在一个具体的实施方式中，所述步骤(c)还包括(1)制备细胞悬液溶液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步骤(1)的细胞悬液溶液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存的样品；和(4)在-80℃以下储存所述冷冻保存的样品。在某些实施方式中，所述方法包括在步骤(a)和(b)之间和在步骤(b)和(c)之间无中间步骤和/或在步骤(a)之前无额外培养步骤。
[0365]
在另一个实施方式中，所述冷冻保存nk细胞(例如，tsnk细胞)群体的方法包括：
(a)在包含干细胞因子(scf)、il-2、白介素-7(il-7)、白介素-15(il-15)和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，和其中所述scf、il-2、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞；和(c)将来自步骤(b)的nk细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在一个具体的实施方式中，所述步骤(c)还包括(1)制备细胞悬液溶液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步骤(1)的细胞悬液溶液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存的样品；和(4)在-80℃以下储存所述冷冻保存的样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)之间和在步骤(b)和(c)之间都不包含中间步骤。
[0366]
本文提供的细胞优选地在控制速率的冷冻器中冷却，例如，在冷冻保存期间以约0.1、0.3、0.5、1或2℃/min的速率。优选的冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，优选地约-125℃至约-140℃。冷冻保存的细胞可以在融化使用之前转移到液氮中。在有些实施方式中，例如，一旦安瓿达到了约-90℃，就将它们转移到液氮储存区。冷冻保存的细胞优选地在约25℃至约40℃的温度下，优选地至约37℃的温度进行融化。在某些实施方式中，所述冷冻保存的细胞在冷冻保存约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时或冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天之后进行融化。在某些实施方式中，所述冷冻保存的细胞在冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个月之后进行融化。在某些实施方式中，所述冷冻保存的细胞在冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年之后进行融化。
[0367]
合适的融化培养基包括但不限于生理盐水、plasmalyte培养基，包括例如生长培养基，例如rpmi培养基。在优选的实施方式中，所述融化培养基包含一种或多种培养基补充剂(例如，营养物、细胞因子和/或其它因子)。适合于融化本文提供的细胞的培养基补充剂包括(例如)但不限于血清(例如，人血清ab、胎牛血清(fbs)或小牛血清(fcs))、维生素、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、氨基酸(例如，l-谷氨酰胺)、脂肪酸(例如，油酸、亚油酸或棕榈酸)、胰岛素(例如，重组人胰岛素)、转铁蛋白(铁饱和人转铁蛋白)、β-巯基乙醇、干细胞因子(scf)、fms样-酪氨酸激酶3配体(flt3-l)、细胞因子例如白介素-2(il-2)、白介素-7(il-7)、白介素-15(il-15)、促血小板生成素(tpo)或肝素。在一个具体的实施方式中，可用于本文提供的方法中的融化培养基包括rpmi。在另一个具体的实施方式中，所述融化培养基包含plasmalyte。在另一个具体的实施方式中，所述融化培养基包含约0.5-20％fbs。在另一个具体的实施方式中，所述融化培养基包含约1、2、5、10、15或20％fbs。在另一个具体的实施方式中，所述融化培养基包含约0.5％-20％hsa。在另一个具体的实施方式中，所述融化培养基包含约1、2.5、5、10、15或20％hsa。在一个更具体的实施方式中，所述融化培养基包含rpmi和约10％fbs。在另一个更具体的实施方式中，所述融化培养基包含plasmalyte和约5％has。
[0368]
本文提供的冷冻保存方法可以进行优化以允许长期储存或处于通过例如细胞凋亡或坏死抑制细胞死亡的条件下。在一个实施方式中，所述融化后的细胞包含大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的活细胞，如通过例如自动细胞计数器或锥虫蓝方法所确定。在另一个实施方式中，所述融化后的细胞包含约0.5、1、5、10、15、20或
25％的死细胞。在另一个实施方式中，所述融化后的细胞包含约0.5、1、5、10、15、20或25％的早凋亡细胞。在另一个实施方式中，约0.5、1、5、10、15或20％的融化后的细胞在融化之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天之后经历细胞凋亡，例如，如通过细胞凋亡测定(例如，to-pro3或annv/pi细胞凋亡测定试剂盒)所确定。在某些实施方式中，所述融化后的细胞在使用本文提供的方法培养、扩增或分化之后重新冷冻保存。
[0369]
5.8.包含nk细胞的组合物
[0370]
5.8.1.tsnk细胞
[0371]
在有些实施方式中，本文提供的是包含分离的tsnk细胞的组合物。在一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞由造血细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞占所述组合物中至少50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞占所述组合物中至少80％、85％、90％.95％、98％或99％的细胞。在某些实施方式中，所述组合物中大于90％、92％、94％、96％或98％的tsnk细胞是cd56

和cd16
–
。在其它实施方式中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的tsnk细胞是cd3
–
和cd56

。在其它实施方式中，至少50％、52％、54％、56％、58％或60％的所述细胞是nkg2d

。在其它实施方式中，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的所述细胞是nkb1

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是nkat2

。在某些其它实施方式中，少于10％、8％、6％、4％或2％的所述tsnk细胞是cd56

和cd16

。在更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％或70％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是nkp46

。在其它更具体的实施方式中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd117

。在其它更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％、40％或45％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd94

。在其它更具体的实施方式中，至少10％、12％、14％、16％、18％或20％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd226

。在更具体的实施方式中，至少20％、25％、30％、35％或40％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd7

。在更具体的实施方式中，至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的所述cd3
–
、cd56

tsnk细胞是cd5

。
[0372]
在另一个具体的实施方式中，所述分离的cd56

、cd16
–
tsnk细胞是来自单一个体。在一个更具体的实施方式中，所述分离的cd56

、cd16
–
自然杀伤细胞(tsnk细胞)包含来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞。在另一个具体的实施方式中，所述tsnk细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述tsnk细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，tsnk细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间接触或引起接近。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是以下描述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
[0373]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0374]
在一个更具体的实施方式中，所述组合物包含tsnk细胞和来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞。在一个具体的实施方式中，所述其它来源是胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方式中，所述其它来源是外周血。在更具体的实施方式中，所
述tsnk细胞与来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
[0375]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含tsnk细胞和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液是来自与所述tsnk细胞相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述tsnk细胞不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所有或实质上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母体细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所述胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90％、80％、70％、60％或50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，通过将0.9％nacl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液经过处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如，下文中第5.2.1.1节中所描述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0376]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含tsnk细胞和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述tsnk细胞相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述tsnk细胞不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自至少两个个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0377]
5.8.2.使用所述三阶段方法产生的nk祖细胞
[0378]
在有些实施方式中，本文提供的是组合物，例如药物组合物，其包含使用本文描述的三阶段方法产生的分离的nk祖细胞群体。在一个具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体从造血细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体占所述组合物中至少50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体占所述组合物中至少80％、85％、90％.95％、98％或99％的细胞。在某些实施方式中，所述分离的nk祖细胞群体中不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的细胞是cd3
–
cd56

细胞。在某些实施方式中，不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在某些实施方式中，不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述
cd3
–
cd56

细胞是cd161

。在某些实施方式中，不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在更具体的实施方式中，不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在某些实施方式中，所述cd3
–
cd56

细胞是cd16-。
[0379]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物中的所述分离的nk祖细胞是来自单一个体。在一个更具体的实施方式中，所述分离的nk祖细胞包括来自至少两个不同个体的nk祖细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物中的所述分离的nk祖细胞是来自与预计用所述nk祖细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述nk祖细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述nk祖细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，nk祖细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间接触或引起接近。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是以下描述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
[0380]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0381]
在一个更具体的实施方式中，所述组合物包含来自另一种来源或通过另一种方法制备的nk祖细胞。在一个具体的实施方式中，所述其它来源是胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方式中，所述其它来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述组合物中的所述nk祖细胞群体与来自另一种来源或通过另一种方法制备的nk祖细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
[0382]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含使用本文描述的三阶段方法产生的nk祖细胞群体和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液是来自与所述nk祖细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述nk祖细胞群体不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中所有或实质上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母体细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所述胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90％、80％、70％、60％或50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，通过将0.9％nacl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液经过处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如以下描述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0383]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含nk祖细胞群体和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk祖细胞群体相同的个
体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk祖细胞群体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自至少两个个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0384]
5.8.3.使用所述三阶段方法产生的nk细胞
[0385]
在有些实施方式中，本文提供的是组合物，例如药物组合物，其包含使用本文描述的三阶段方法产生的分离的nk细胞群体。在一个具体的实施方式中，所述分离的nk细胞群体从造血细胞，例如分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方式中，所述分离的nk细胞群体占所述组合物中至少50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的nk细胞群体占所述组合物中至少80％、85％、90％.95％、98％或99％的细胞。在某些实施方式中，所述分离的nk细胞群体中的不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的细胞是cd3
–
cd56

细胞。在某些实施方式中，不少于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd117

。在某些实施方式中，不少于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述cd3
–
cd56

细胞是cd161

。在某些实施方式中，不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在更具体的实施方式中，不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的所述cd3
–
cd56

细胞是nkp46

。在某些实施方式中，所述cd3
–
cd56

细胞是cd16-。
[0386]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物中的所述分离的nk细胞是来自单一个体。在一个更具体的实施方式中，所述分离的nk细胞包含来自至少两个不同个体的nk细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物中的所述分离的nk细胞是来自与预计用nk细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述nk细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述nk细胞比未接触或引起接近所述免疫调节化合物或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，nk细胞)表达可检测更多的颗粒酶b或穿孔素的量和时间接触或引起接近。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是以下描述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。
[0387]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0388]
在一个更具体的实施方式中，所述组合物包含来自另一种来源或通过另一种方法制备的nk细胞。在一个具体的实施方式中，所述其它来源是胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方式中，所述其它来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述组合物中的所述nk细胞群体与来自另一种来源或通过另一种方法制备的nk细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、
50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率混合。
[0389]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液是来自与所述nk细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述nk细胞群体不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中所有或实质上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞是胎儿细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母体细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的所述胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90％、80％、70％、60％或50％的细胞。在另一个具体的实施方式中，通过将0.9％nacl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方式中，所述灌洗液经过处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如以下描述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0390]
在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含nk细胞群体和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞是来自与所述nk细胞群体不同的个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一个更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞是来自至少两个个体。在另一个具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一个具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，以下描述的抗癌化合物中的一种或多种。
[0391]
5.9.tsnk细胞和使用所述三阶段方法产生的nk细胞和nk祖细胞的应用
[0392]
本文提供的使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体，可以用于治疗患有癌症的个体(例如，具有实体肿瘤细胞和/或血液癌症细胞的个体)或患有病毒感染的人的方法。在一些这样的实施方式中，使用本文描述的方法产生的nk细胞的有效剂量范围为1x104至5x104、5x104至1x105、1x105至5x105、5x105至1x106、1x106至5x106、5x106至1x107个或更多个细胞/千克体重。本文提供的使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体，也可以用于抑制肿瘤细胞增殖的方法。
[0393]
5.9.1.患有癌症的个体的治疗
[0394]
在一个实施方式中，本文提供的是治疗患有癌症(例如，血液癌症或实体肿瘤)的个体的方法，包括向所述个体给予治疗有效量的使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体。在某些实施方式中，所述个体患有自然杀伤细胞缺乏症，例如缺少针对个体的癌症有活性的nk细胞。在
一个具体的实施方式中，所述方法另外包括向所述个体给予分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞，例如治疗有效量的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在另一个具体的实施方式中，所述方法另外包括向所述个体给予有效量的免疫调节化合物(例如，以上描述的免疫调节化合物)或沙利度胺。如本文所用的，“有效量”是例如导致个体所患癌症的一种或多种症状的可检测改善、进展减轻或消除的量。
[0395]
在一个具体的实施方式中，所述癌症是血液癌症，例如白血病或淋巴瘤。在更具体的实施方式中，所述癌症是急性白血病，例如急性t细胞白血病、急性髓细胞白血病(aml)、急性前髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性成巨核细胞白血病、前体b急性成淋巴细胞白血病、前体t急性成淋巴细胞白血病、伯基特白血病(burkitt’s leukemia)(伯基特淋巴瘤(burkitt’s lymphoma))或急性双表型白血病；慢性白血病，例如慢性髓样淋巴瘤、慢性髓细胞白血病(cml)、慢性单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)/小淋巴细胞淋巴瘤或b-细胞前淋巴细胞白血病；毛细胞淋巴瘤；t-细胞前淋巴细胞白血病；或淋巴瘤，例如组织细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤(例如，瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia))、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞赘生物(例如，浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病)、结节外边缘区b细胞淋巴瘤(malt淋巴瘤)、结节边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、t细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性nk细胞白血病、成体t细胞白血病/淋巴瘤、结节外nk/t细胞淋巴瘤、鼻型、肠病变型t细胞淋巴瘤、肝脾t细胞淋巴瘤、母细胞性nk细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病(赛谢综合征(sezary syndrome))、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴细胞增殖性紊乱(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病)、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤(未分类)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(hodgkin’s lymphoma)或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在另一个具体的实施方式中，所述癌症是多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。
[0396]
在某些其它具体的实施方式中，所述癌症是实体肿瘤，例如癌，例如腺癌、肾上腺皮质癌、结肠腺癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、导管细胞癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如，恶性黑色素瘤)、非黑色素瘤皮肤癌或未分类的癌；硬纤维瘤样肿瘤；促结缔组织增生的小圆细胞肿瘤；内分泌肿瘤；尤因肉瘤(ewing sarcoma)；生殖细胞肿瘤(例如，睾丸癌、卵巢癌、绒毛膜癌、内胚层窦肿瘤、生殖细胞瘤等)；肝胚细胞瘤(hepatosblastoma)；肝细胞癌；神经母细胞瘤；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤；骨肉瘤；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；或维尔姆斯肿瘤。在另一个实施方式中，所述实体肿瘤是胰腺癌或乳癌。在其它实施方式中，所述实体肿瘤是听神经瘤；星形细胞瘤(例如，i级纤维性星形细胞瘤、ii级低级星形细胞瘤；iii级间变性星形细胞瘤；或iv级多形性成胶质细胞瘤)；脊索瘤；颅咽管瘤；神经胶质瘤(例如，脑干神经胶质瘤；室管膜瘤；混合型神经胶质瘤；视神经神经胶质瘤；或亚室管膜瘤)；成胶质细胞瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；转移性脑肿瘤；少突神经胶质瘤；成松果体细胞瘤；脑垂体肿瘤；原始神经外胚肿瘤；或神经鞘瘤(schwannoma)。在另一个实施方式中，所述癌症是前列腺癌。
[0397]
在某些实施方式中，患有癌症(例如，血液癌症或实体肿瘤)的个体(例如，患有自然杀伤细胞缺乏症的个体)是已在所述给予之前接受骨髓移植的个体。在某些实施方式中，
所述骨髓移植是在所述癌症的治疗中。在某些其它实施方式中，所述骨髓移植是在除所述癌症以外的病症的治疗中。在某些实施方式中，所述个体除了骨髓移植以外还接受了免疫抑制剂。在某些实施方式中，已进行骨髓移植的个体在所述给药的时间表现出移植物抗宿主病(gvhd)的一种或多种症状。在某些其它实施方式中，向在表现出移植物抗宿主病(gvhd)的症状之前已进行骨髓移植的个体给予所述细胞。
[0398]
在某些具体的实施方式中，患有癌症(例如，血液癌症)的个体在所述给予之前已接受了至少一个剂量的tnfα抑制剂，例如(enbrel)。在具体的实施方式中，在所述癌症诊断的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月以内，所述个体已接受所述剂量的tnfα抑制剂。在一个具体的实施方式中，已接受一个剂量的tnfα抑制剂的个体表现出急性髓样白血病。在一个更具体的实施方式中，已接受了一个剂量的tnfα抑制剂并且表现出急性髓样白血病的个体还表现出在血液细胞中缺失5号染色体的长臂。在另一个实施方式中，患有癌症(例如，血液癌症)的个体表现出费城(philadelphia)染色体。
[0399]
在某些其它实施方式中，所述个体中的癌症(例如，血液癌症或实体肿瘤)对一种或多种抗癌药物来说是难治的。在一个具体的实施方式中，所述癌症对(甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate))来说是难治的。
[0400]
在某些实施方式中，所述个体中的癌症(例如，血液癌症)对至少一种抗癌药物起反应；在该实施方式中，将本文描述的胎盘灌洗液、分离的胎盘灌洗液细胞、分离的自然杀伤细胞(例如，胎盘自然杀伤细胞，例如胎盘来源的中间体自然杀伤细胞)、分离的混合自然杀伤细胞或tsnk、nk祖细胞或nk细胞和/或其组合以及可选的免疫调节化合物作为辅助治疗或作为与所述抗癌药物的组合疗法添加。在某些其它实施方式中，患有癌症(例如，血液癌症)的个体已用至少一种抗癌药物治疗并且在所述给予之前已复发。在某些实施方式中，待治疗的个体患有难治性癌症。在一个实施方式中，用本文描述的细胞的癌症治疗方法抵抗(例如，防止或延迟)癌症的复发。在一个实施方式中，本文描述的癌症治疗方法导致所述癌症缓解1个月或1个月以上，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或12个月以上，1年或以上、2年或以上、3年或以上或4年或以上。
[0401]
在一个实施方式中，本文提供的是治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，包括向所述个体给予(1)来那度胺；(2)美法仑；和(3)扩增的nk细胞，其中所述nk细胞对于治疗所述个体的多发性骨髓瘤来说是有效的。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞是脐带血nk细胞或由脐带血造血细胞(例如，造血干细胞)产生的nk细胞。在另一个实施方式中，已通过本文描述的用于产生nk细胞(例如，用于产生tsnk细胞)的任何方法产生了所述nk细胞。在另一个实施方式中，所述nk细胞已在所述给予之前被扩增。在另一个实施方式中，所述来那度胺、美法仑和/或nk细胞是彼此单独给予的。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞通过包括以下步骤的方法产生：将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子(scf)、il-2、白介素-7(il-7)、白介素-15(il-15)和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，和其中所述scf、il-2、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；并且将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增。
[0402]
在另一个实施方式中，本文提供的是治疗患有急性髓细胞白血病(aml)的个体的
方法，包括向所述个体给予扩增的nk细胞(可选地通过用il2和il12和il18、il12和il15、il12和il18、il2和il12和il15和il18、或il2和il15和il18预处理而激活)，其中所述nk细胞对于治疗所述个体的aml来说是有效的。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞是脐带血nk细胞或由脐带血造血细胞(例如，造血干细胞)产生的nk细胞。在另一个实施方式中，已通过本文描述的用于产生nk细胞的任何方法(例如，用于产生tsnk细胞的方法或使用三阶段方法产生nk细胞群体的方法)产生了所述nk细胞。在另一个实施方式中，所述nk细胞已在所述给予之前被扩增。在治疗患有aml的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞通过产生激活的自然杀伤(nk)细胞群体的两步方法产生，其中所述方法的第一步骤包括将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子(scf)、白介素-7(il-7)和白介素-15(il-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增，和其中所述scf、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和其中所述方法的第二步骤包括在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增来自第一步骤的细胞，以产生激活的nk细胞。在治疗患有aml的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞群体通过如本文所描述的三阶段方法产生。在一个特定的实施方式中，待通过上述方法治疗的aml包括包含难治性aml、预后差aml或儿童aml。本领域已知的用于给予nk细胞以治疗难治性aml、预后差aml或儿童aml的方法可以做修改用于该目的；参见例如miller等人,2005,blood 105:3051-3057；rubnitz等人,2010,j clin oncol.28:955-959，所述各文献以其全部内容作为参考并入本文。
[0403]
在治疗患有aml的个体的方法的其它具体的实施方式中，所述nk细胞通过包括以下步骤的方法产生：(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白介素-15(il-15)并可选地包含干细胞因子(scf)和白介素-7(il-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述il-15和可选的scf和il-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；和(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞群体。
[0404]
在另一个实施方式中，本文提供的是治疗患有慢性淋巴细胞白血病(cll)的个体的方法，包括向所述个体给予治疗有效剂量的(1)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；和(4)扩增的nk细胞，例如tsnk细胞，其中所述nk细胞对于治疗所述个体的所述cll来说是有效的。在一个具体的实施方式中，所述nk细胞是脐带血nk细胞或从脐带血造血干细胞产生的nk细胞。在另一个实施方式中，已通过本文描述的用于产生nk细胞(例如，用于产生tsnk细胞)的任何方法产生了所述nk细胞。在任何上述方法的一个具体的实施方式中，所述nk细胞已在所述给予之前扩增至少10天。在任何上述方法的一个具体的实施方式中，将所述来那度胺、美法仑、氟达拉滨和扩增的nk细胞单独地给予所述个体。在治疗患有cll的个体的方法的某些具体的实施方式中，所述nk细胞通过包括以下步骤的方法产生：将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子(scf)、il-2、白介素-7(il-7)、白介素-15(il-15)和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，和其中所述scf、il-2、il-7和il-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，和其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的众多造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为nk细胞；并且将来自步骤(a)的细胞在包含白介素-2(il-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的nk细胞。
[0405]
5.9.2.肿瘤细胞增殖的抑制
[0406]
本文进一步提供的是抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括使使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体与所述肿瘤细胞引起接近，例如，使所述肿瘤细胞与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体接触。可选地，使分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞与所述肿瘤细胞和/或使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体引起接近。在另一个具体的实施方式中，使免疫调节化合物(例如，以上描述的免疫调节化合物)或沙利度胺另外与所述肿瘤细胞和/或使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体引起接近，使得同不与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体引起接近的相同类型的肿瘤细胞相比，可检测地降低所述肿瘤细胞的增殖。可选地，使分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞与已接触或接近免疫调节化合物的肿瘤细胞和/或使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体接近。
[0407]
如本文所用的，在某些实施方式中，“接触”相对于细胞来说在一个实施方式中涵盖了胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)、根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体和/或分离的混合自然杀伤细胞与肿瘤细胞之间的直接物理(例如，细胞—细胞)接触。在另一个实施方式中，“接触”涵盖了在相同物理空间中的存在，例如，将胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、自然杀伤细胞(例如，胎盘中间体自然杀伤细胞)、本文描述的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)、根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体和/或分离的混合自然杀伤细胞置于与肿瘤细胞相同的容器(例如，培养皿、多孔板)中。在另一个实施方式中，通过(例如)将所述胎盘灌洗液或细胞，例如胎盘灌洗液细胞、混合自然杀伤细胞或自然杀伤细胞(例如，胎盘中间体自然杀伤细胞)注射或输注到个体(例如，包含肿瘤细胞的人，例如癌症患者)来实现胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、混合自然杀伤细胞、胎盘中间体自然杀伤细胞或本文描述的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)、根据本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体与肿瘤细胞的“接触”。“接触”在免疫调节化合物和/或沙利度胺的背景中意指，例如所述细胞与所述免疫调节化合物和/或沙利度胺彼此直接物理接触或放置在相同的物理体积(例如，细胞培养容器或个体)内。
[0408]
在一个具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是血液癌症细胞，例如白血病细胞或淋巴瘤细胞。在更具体的实施方式中，所述癌症是急性白血病，例如急性t细胞白血病细胞、急性髓细胞白血病(aml)细胞、急性前髓细胞白血病细胞、急性成髓细胞白血病细胞、急性成巨核细胞白血病细胞、前体b急性成淋巴细胞白血病细胞、前体t急性成淋巴细胞白血病细胞、伯基特白血病(伯基特淋巴瘤)细胞或急性双表型白血病细胞；慢性白血病细胞，例如慢性髓样淋巴瘤细胞、慢性髓细胞白血病(cml)细胞、慢性单核细胞白血病细胞、慢性淋巴细胞白血病(cll)/小淋巴细胞淋巴瘤细胞或b-细胞前淋巴细胞白血病细胞；毛细胞淋巴瘤细胞；t-细胞前淋巴细胞白血病细胞；或淋巴瘤细胞，例如组织细胞性淋巴瘤细胞、淋巴浆细胞淋巴瘤细胞(例如，瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症细胞)、脾边缘区淋巴瘤细胞、浆细胞赘生物细胞(例如，浆细胞骨髓瘤细胞、浆细胞瘤细胞、单克隆免疫球蛋白沉积病或重链病)、结节外边缘区b细胞淋巴瘤(malt淋巴瘤)细胞、结节边缘区b细胞淋巴瘤(nmzl)细胞、滤泡性
淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤细胞、血管内大b细胞淋巴瘤细胞、原发性渗出性淋巴瘤细胞、t细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、侵袭性nk细胞白血病细胞、成体t细胞白血病/淋巴瘤细胞、结节外nk/t细胞淋巴瘤-鼻型细胞、肠病变型t细胞淋巴瘤细胞、肝脾t细胞淋巴瘤细胞、母细胞性nk细胞淋巴瘤细胞、蕈样肉芽肿病(赛谢综合征)、原发性皮肤cd30阳性t细胞淋巴细胞增殖性紊乱(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或淋巴瘤样丘疹病)细胞、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤细胞、外周t细胞淋巴瘤(未分类)细胞、间变性大细胞淋巴瘤细胞、霍奇金淋巴瘤细胞或结节淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤细胞。在另一个具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞或骨髓增生异常综合征细胞。
[0409]
在具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞，例如癌细胞，例如，腺癌细胞、肾上腺皮质癌细胞、结肠腺癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、导管细胞癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、鼻咽癌细胞、黑色素瘤细胞(例如，恶性黑色素瘤细胞)、非黑色素瘤皮肤癌细胞或未分类的癌细胞；硬纤维瘤样肿瘤细胞；促结缔组织增生的小圆细胞肿瘤细胞；内分泌肿瘤细胞；尤因肉瘤细胞；生殖细胞肿瘤细胞(例如，睾丸癌细胞、卵巢癌细胞、绒毛膜癌细胞、内胚层窦肿瘤细胞、生殖细胞瘤细胞等)；肝胚细胞瘤(hepatosblastoma)细胞；肝细胞癌细胞；神经母细胞瘤细胞；非横纹肌肉瘤软组织肉瘤细胞；骨肉瘤细胞；视网膜母细胞瘤细胞；横纹肌肉瘤细胞；或维尔姆斯肿瘤细胞。在另一个实施方式中，所述肿瘤细胞是胰腺癌细胞或乳癌细胞。在其它实施方式中，所述实体肿瘤细胞是听神经瘤细胞；星形细胞瘤细胞(例如，i级纤维性星形细胞瘤细胞、ii级低级星形细胞瘤细胞；iii级间变性星形细胞瘤细胞；或iv级多形性成胶质细胞瘤细胞)；脊索瘤细胞；颅咽管瘤细胞；神经胶质瘤细胞(例如，脑干神经胶质瘤细胞；室管膜瘤细胞；混合型神经胶质瘤细胞；视神经神经胶质瘤细胞；或亚室管膜瘤细胞)；成胶质细胞瘤细胞；成神经管细胞瘤细胞；脑膜瘤细胞；转移性脑肿瘤细胞；少突神经胶质瘤细胞；成松果体细胞瘤细胞；脑垂体肿瘤细胞；原始神经外胚肿瘤细胞；或神经鞘瘤细胞。在另一个实施方式中，所述肿瘤细胞是前列腺癌细胞。
[0410]
如本文所用的，“治疗有益的”和“治疗益处”包括但不限于，例如肿瘤尺寸的减小；肿瘤扩大的减轻或停止；减少或预防转移性疾病；组织样品(例如，血液样品)中每单位体积癌细胞数减少；所述个体所患的特定癌症或肿瘤的任何症状的临床改善、所述个体所患的特定癌症的任何症状的减轻或恶化停止。
[0411]
5.9.3.使用nk细胞、nk细胞群体和nk祖细胞群体和其它抗癌剂治疗癌症
[0412]
使用所述使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体治疗患有癌症的个体，可以是包括一种或多种其它抗癌剂的抗癌疗法方案的一部分。另外或作为另外一种选择，使用所述使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或本文描述的nk细胞群体或nk祖细胞群体治疗患有癌症的个体，可以用于补充包括一种或多种其它抗癌剂的抗癌疗法。这样的抗癌剂是本领域熟知的。除了使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和可选的灌洗液、灌洗液细胞、除了使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以外的自然杀伤细胞以外，可以给予患有癌症的个体(例如，具有肿瘤细胞的个体)的具体的抗癌剂包括但不限于：阿西维辛(acivicin)；阿
柔比星(aclarubicin)；盐酸阿考达唑(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿霉素(adriamycin)；adrucil；阿地白介素(aldesleukin)；六甲蜜胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；醋酸阿美蒽醌(ametantrone acetate)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；安曲霉素(anthramycin)；天冬酰胺酶(例如，得自erwinia chrysan；erwinaze)；曲林菌素(asperlin)；阿瓦斯丁(avastin)(贝伐珠单抗(bevacizumab))；阿扎胞苷(azacitidine)；阿扎替派(azetepa)；阿佐霉素(azotomycin)；巴马司他(batimastat)；苯佐替派(benzodepa)；比卡鲁胺(bicalutamide)；盐酸比生群(bisantrene hydrochloride)；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)；布喹那钠(brequinar sodium)；溴匹立明(bropirimine)；白消安(busulfan)；放线菌素c(cactinomycin)；卡鲁睾酮(calusteronen)；卡醋胺(caracemide)；卡贝替姆(carbetimer)；卡铂(carboplatin)；卡莫司汀(carmustine)；盐酸卡柔比星(carubicin hydrochloride)；卡折来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；塞来考昔(celecoxib)(cox-2抑制剂)；cerubidine；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；西罗霉素(cirolemycin)；顺铂(cisplatin)；克拉屈滨(cladribine)；甲磺酸克立那托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；阿糖胞苷(cytarabine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；放线菌素d(dactinomycin)；盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)；地西他滨(decitabine)；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎呱宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎呱宁(dezaguanine mesylate)；地吖醌(diaziquone)；多西他赛(docetaxel)；多柔比星(doxorubicin)；盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)；屈洛昔芬(droloxifene)；柠檬酸屈洛昔芬(droloxifene citrate)；丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)；达佐霉素(duazomycin)；依达曲沙(edatrexate)；盐酸依氟鸟氨酸(eflomithine hydrochloride)；依沙芦星(elsamitrucin)；爱施巴(elspar)；恩洛铂(enloplatin)；恩普氨酯(enpromate)；依匹哌啶(epipropidine)；盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸依索比星(esorubicin hydrochloride)；雌莫司汀(estramustine)；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑(etanidazole)；依托泊苷(etoposide)；磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)；凡毕复(etopophos)；etoprine；盐酸法倔唑(fadrozole hydrochloride)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维a胺(fenretinide)；氟尿苷(floxuridine)；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶(fluorouracil)；氟西他滨(flurocitabine)；磷喹酮(fosquidone)；福司曲星钠(fostriecin sodium)；吉西他滨(gemcitabine)；盐酸吉西他滨(gemcitabine hydrochloride)；羟基脲(hydroxyurea)；idamycin；盐酸伊达比星(idarubicin hydrochloride)；异环磷酰胺(ifosfamide)；伊莫福新(ilmofosine)；异丙铂(iproplatin)；伊立替康(irinotecan)；盐酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)；醋酸兰瑞肽(lanreotide acetate)；来曲唑(letrozole)；醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)；盐酸利阿唑(liarozole hydrochloride)；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；洛莫司汀(lomustine)；盐酸洛索蒽醌(losoxantrone hydrochloride)；马索罗酚(masoprocol)；美登素(maytansine)；盐酸氮芥(mechlorethamine hydrochloride)；醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；醋酸美仑孕酮(melengestrol acetate)；美法仑(melphalan)；美诺立尔(menogaril)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤
(methotrexate)；甲氨蝶呤钠(methotrexate sodium)；氯苯氨啶(metoprine)；美妥替哌(meturedepa)；米丁度胺(mitindomide)；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素(mitocromin)；米托洁林(mitogillin)；米托马星(mitomalcin)；丝裂霉素(mitomycin)；米托司培(mitosper)；米托坦(mitotane)；盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride)；麦考酚酸(mycophenolic acid)；诺考达唑(nocodazole)；诺拉霉素(nogalamycin)；奥马铂(ormaplatin)；奥昔舒仑(oxisuran)；紫杉醇(paclitaxel)；培门冬酶(pegaspargase)；培利霉素(peliomycin)；奈莫司汀(pentamustine)；硫酸培洛霉素(peplomycin sulfate)；培磷酰胺(perfosfamide)；哌泊溴烷(pipobroman)；哌泊舒凡(piposulfan)；盐酸吡罗蒽醌(piroxantrone hydrochloride)；普卡霉素(plicamycin)；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼莫司汀(prednimustine)；盐酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)；proleukin；purinethol；嘌罗霉素(puromycin)；盐酸嘌罗霉素(puromycin hydrochloride)；吡唑呋林(pyrazofurin)；rheumatrex；利波腺苷(riboprine)；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈(safingol hydrochloride)；司莫司汀(semustine)；辛曲秦(simtrazene)；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate sodium)；司帕霉素(sparsomycin)；盐酸锗螺胺(spirogermanium hydrochloride)；螺莫司汀(spiromustine)；螺铂(spiroplatin)；链黑霉素(streptonigrin)；链佐星(streptozocin)；磺氯苯脲(sulofenur)；tabloid；他利霉素(talisomycin)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；泰素帝(taxotere)；替加氟(tegafur)；盐酸替洛蒽醌(teloxantrone hydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷(teniposide)；替罗昔隆(teroxirone)；睾内酯(testolactone)；thiamiprine；硫鸟嘌呤(thioguanine)；塞替派(thiotepa)；噻唑呋林(tiazofurin)；替拉扎明(tirapazamine)；toposar；柠檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)；醋酸曲托龙(trestolone acetate)；trexall；磷酸曲西立滨(triciribine phosphate)；三甲曲沙(trimetrexate)；葡糖醛酸三甲曲沙(trimetrexate glucuronate)；曲普瑞林(triptorelin)；盐酸妥布氯唑(tubulozole hydrochloride)；乌拉莫司汀(uracil mustard)；乌瑞替派(uredepa)；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱(vinblastine sulfate)；硫酸长春新碱(vincristine sulfate)；长春地辛(vindesine)；硫酸长春地辛(vindesine sulfate)；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯(vinglycinate sulfate)；硫酸长春罗辛(vinleurosine sulfate)；酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)；硫酸长春罗定(vinrosidine sulfate)；硫酸长春利定(vinzolidine sulfate)；伏氯唑(vorozole)；折尼铂(zeniplatin)；净司他丁(zinostatin)；和盐酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)。
[0413]
其它抗癌药物包括但不限于：20-表-1,25-二羟基维生素d3；5-乙炔基尿嘧啶(5-ethynyluracil)；阿比特龙(abiraterone)；阿柔比星(aclarubicin)；酰夫文(acylfulvene)；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；all-tk拮抗剂；六甲蜜胺(altretamine)；氨莫司汀(ambamustine)；3,4-二羟基苄胺肟(amidox)；氨磷汀(amifostine)；氨基乙酰丙酸；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶(amsacrine)；阿那格雷(anagrelide)；阿那曲唑(anastrozole)；穿心莲内酯(andrographolide)；血管生成抑制剂；拮抗剂d；拮抗剂g；安雷利克斯(antarelix)；抗背侧形态发生蛋白-1；抗雄激素(antiandrogen)，前列腺癌；抗雌激素(antiestrogen)；抗瘤酮
(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)；细胞凋亡基因调制剂(modulators)；细胞凋亡调节剂(regulators)；脱嘌呤核酸(apurinic acid)；ara-cdp-dl-ptba；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦(atamestane)；阿莫司汀(atrimustine)；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼(azasetron)；阿扎毒素(azatoxin)；氮杂酪氨酸；浆果赤霉素iii衍生物；balanol；巴马司他(batimastat)；bcr/abl拮抗剂；苯并二氢卟吩(benzochlorins)；苯甲酰星孢菌素(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin b；桦木酸(betulinic acid)；bfgf抑制剂；比卡鲁胺(bicalutamide)；比生群(bisantrene)；双氮丙啶基精胺(bisaziridinylspermine)；双奈法德(bisnafide)；bistratene a；比折来新(bizelesin)；breflate；溴匹立明(bropirimine)；布度钛(budotitane)；丁硫堇(buthionine sulfoximine)；卡泊三醇(calcipotriol)；卡弗他丁c(calphostin c)；camptosar(也称作campto；伊立替康(irinotecan))喜树碱衍生物；卡培他滨(capecitabine)；氨甲酰基氨基三唑；羧基酰氨基三唑；carest m3；carn 700；软骨源性抑制剂；卡折来新(carzelesin)；酪蛋白激酶抑制剂(icos)；粟精胺(castanospermine)；杀菌肽b(cecropin b)；西曲瑞克(cetrorelix)；绿素类(chlorlns)；氯喹喔啉磺酰胺(chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素(cicaprost)；顺-卟啉(cis-porphyrin)；克拉屈滨(cladribine)；氯米芬(clomifene)类似物；克霉唑(clotrimazole)；collismycin a；collismycin b；考布他汀a4(combretastatin a4)；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托(crisnatol)；cryptophycin 8；cryptophycin a衍生物；curacin a；环戊烯蒽醌类(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；十八烷基磷酸阿糖胞苷(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子；细胞生长抑素(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨(decitabine)；脱水代代宁b(dehydrodidenmin b)；地洛瑞林(deslorelin)；地塞米松(dexamethasone)；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生(dexrazoxane)；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌(diaziquone)；代代宁b(didemnin b)；3,4-二羟荃苯并氧肟酸(didox)；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；dioxamycin；二苯基螺莫司汀(diphenylspiromustine)；多西他赛(docetaxel)；二十二醇(docosanol)；多拉司琼(dolasetron)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；多柔比星(doxorubicin)；屈洛昔芬(droloxifene)；屈大麻酚(dronabinol)；倍癌霉素sa(duocarmycin sa)；依布硒(ebselen)；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；榄香烯(elemene)；乙嘧替氟(emitefur)；表柔比星(epirubicin)；依立雄胺(epristeride)；雌莫司汀(estramustine)类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑(etanidazole)；磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)；依西美坦(exemestane)；法倔唑(fadrozole)；法扎拉滨(fazarabine)；芬维a胺(fenretinide)；非格司亭(filgrastim)；非那雄胺(finasteride)；黄酮吡多(flavopiridol)；氟卓斯汀(flezelastine)；fluasterone；氟达拉滨(fludarabine)(例如，fludara)；fluorodaunorunicin hydrochloride；福酚美克(forfenimex)；福美坦(formestane)；福司曲星(fostriecin)；福莫司汀(fotemustine)；钆替沙林(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓(gallium nitrate)；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克(ganirelix)；明胶酶抑制剂；吉西他滨
(gemcitabine)；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素(hypericin)；伊班膦酸(ibandronic acid)；伊达比星(idarubicin)；艾多昔芬(idoxifene)；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新(ilmofosine)；伊洛马司他(ilomastat)；伊马替尼(imatinib)(例如，)、咪喹莫德(imiquimod)；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍(iobenguane)；碘阿霉素(iododoxorubicin)；4-依波米醇(4-ipomeanol)；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定(irsogladine)；isobengazole；isohomohalicondrin b；伊他司琼(itasetron)；jasplakinolide；kahalalide f；三醋酸层状素n(lamellarin-n triacetate)；兰瑞肽(lanreotide)；leinamycin；来格司亭(lenograstim)；硫酸香菇多糖(lentinan sulfate)；leptolstatin；来曲唑(letrozole)；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林 雌激素 黄体酮(leuprolide estrogen progesterone)；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑(levamisole)；利阿唑(liarozole)；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂(lobaplatin)；蚯蚓磷脂(lombricine)；洛美曲索(lometrexol)；氯尼达明(lonidamine)；洛索蒽醌(losoxantrone)；洛索立宾(loxoribine)；勒托替康(lurtotecan)；德克萨卟啉镥(lutetium texaphyrin)；利索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美坦新(maitansine)；制甘糖酶素a(mannostatin a)；马立马司他(marimastat)；马索罗酚(masoprocol)；maspin；基质溶素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔(menogaril)；merbarone；美替瑞林(meterelin)；甲硫氨酸酶(methioninase)；甲氧氯普胺(metoclopramide)；mif抑制剂；米非司酮(mifepristone)；米替福新(miltefosine)；米立司亭(mirimostim)；米托胍腙(mitoguazone)；二溴卫矛醇(mitolactol)；丝裂霉素类似物；米托萘胺(mitonafide)；有丝分裂毒素成纤维细胞生长因子-肥皂草蛋白(saporin)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫法罗汀(mofarotene)；莫拉司亭(molgramostim)；抗egfr抗体(例如，爱必妥(erbitux)(西妥昔单抗(cetuximab)))；抗cd19抗体；抗cd20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))；抗双唾液酸神经节苷脂(antidisialoganglioside)(gd2)抗体(例如，单克隆抗体3f8或ch14》18)；抗erbb2抗体(例如，赫赛汀(herceptin))；人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质a 分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇(mopidamol)；芥末抗癌剂；印度洋海绵b(mycaperoxide b)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；n-乙酰基地那林(n-acetyldinaline)；n-取代的苯甲酰胺；那法瑞林(nafarelin)；nagrestip；纳洛酮 喷他佐辛(naloxone pentazocine)；napavin；naphterpin；那托司亭(nartograstim)；奈达铂(nedaplatin)；奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronic acid)；尼鲁米特(nilutamide)；nisamycin；一氧化氮调制剂(nitric oxide modulators)；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；奥利美生(oblimersen)o
6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽(octreotide)；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼(ondansetron)；昂丹司琼(ondansetron)；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂(ormaplatin)；奥沙特隆(osaterone)；奥沙利铂(oxaliplatin)(例如，floxatin)；oxaunomycin；紫杉醇(paclitaxel)；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸(pamidronic acid)；人参三醇(panaxytriol)；帕诺米芬(panomifene)；副球菌素(parabactin)；帕折普汀(pazelliptine)；培门冬酶(pegaspargase)；培得星(peldesine)；木聚硫钠(pentosan polysulfate sodium)；喷司他
丁(pentostatin)；pentrozole；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺(perfosfamide)；紫苏子醇(perillyl alcohol)；吩嗪霉素(phenazinomycin)；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶血性链球菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱(pilocarpine hydrochloride)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；帕斯婷a(placetin a)；帕斯婷b(placetin b)；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠(porfimer sodium)；泊非霉素(porfiromycin)；泼尼松(prednisone)；丙基双吖啶酮；前列腺素j2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白a的免疫调节剂；蛋白激酶c抑制剂；微藻(microalgal)蛋白激酶c抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素(purpurins)；吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；吡多醇羟乙酯化(pyridoxylated)血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞(raltitrexed)；雷莫司琼(ramosetron)；ras法呢基蛋白质转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-gap抑制剂；脱甲基化的瑞替普汀(retelliptine demethylated)；羟乙膦酸铼re 186；根霉素(rhizoxin)；核糖酶；rii视黄酰胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽(romurtide)；罗喹美克(roquinimex)；rubiginone b1；ruboxyl；沙芬戈(safingol)；saintopin；sarcnu；sarcophytol a；沙格司亭(sargramostim)；sdi 1模拟物；司莫司汀(semustine)；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃(sizofiran)；索布佐生(sobuzoxane)；硼卡钠(sodium borocaptate)；苯乙酸钠；solverol；促生长因子(somatomedin)结合蛋白；索纳明(sonermin)；膦门冬酸(sparfosic acid)；穗霉素d(spicamycin d)；螺莫司汀(spiromustine)；脾脏五肽(splenopentin)；海绵抑制素1(spongistatin 1)；角鲨胺(squalamine)；stipiamide；基质溶素(stromelysin)抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明(suramin)；苦马豆素(swainsonine)；他莫司汀(tallimustine)；他莫昔芬甲碘化物(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀(tauromustine)；他扎罗汀(tazarotene)；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟(tegafur)；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷(teniposide)；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺激素；乙基锡初红紫素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明(tirapazamine)；二氯环戊二烯钛(titanocene bichloride)；topsentin；托瑞米芬(toremifene)；翻译抑制剂；维a酸(tretinoin)；三乙酰尿苷(triacetyluridine)；曲西立滨(triciribine)；三甲曲沙(trimetrexate)；曲普瑞林(triptorelin)；托烷司琼(tropisetron)；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)；ubc抑制剂；乌苯美司(ubenimex)；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽(vapreotide)；variolin b；vectibix(帕尼单抗(panitumumab))维拉雷琐(velaresol)；藜芦明(veramine)；verdins；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨(vinorelbine)；vinxaltine；αvβ3人源化抗单抗(vitaxin)；伏氯唑(vorozole)；welcovorin(亚叶酸(leucovorin))；希罗达(xeloda)(卡培他滨(capecitabine))；扎诺特隆(zanoterone)；折尼铂(zeniplatin)；亚苄维(zilascorb)；和净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)。
[0414]
在有些实施方式中，使用所述使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或本文描述的nk细胞群体或nk祖细胞群体治疗患有癌症的个体，是抗体依赖性细胞介
导的细胞毒性(adcc)的抗癌疗法方案的一部分。在一个实施方式中，所述adcc方案包括将一种或多种抗体(例如，以上段落中描述的抗体)与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或本文描述的nk细胞群体或nk祖细胞群体组合的给药。几种类型的癌症可以使用这样的dcc方法进行治疗，所述癌症包括但不限于急性成淋巴细胞白血病(all)或其它b-细胞恶性肿瘤(淋巴瘤和白血病)、神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳癌和头颈部癌症。在具体的实施方式中，所述adcc疗法包括将以下抗体抗egfr抗体(例如，爱必妥(erbitux)(西妥昔单抗(cetuximab)))、抗cd19抗体、抗cd20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))、抗双唾液酸神经节苷脂(gd2)抗体(例如，单克隆抗体3f8或ch14》18)或抗erbb2抗体(例如，赫赛汀(herceptin))中的一种或多种与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或本文描述的nk细胞群体或nk祖细胞群体组合的给药。
[0415]
5.9.4.病毒感染的治疗
[0416]
在另一个实施方式中，本文提供的是治疗患有病毒感染的个体的方法，包括向所述个体给予治疗有效量的使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体。在某些实施方式中，所述个体患有自然杀伤细胞缺乏症，例如缺少针对个体的病毒感染有活性的nk细胞。在某些具体的实施方式中，所述给予另外包括向所述个体给予分离的胎盘灌洗液、分离的胎盘灌洗液细胞、分离的自然杀伤细胞(例如，胎盘自然杀伤细胞，例如胎盘来源的中间体自然杀伤细胞)、分离的混合自然杀伤细胞中的一种或多种和/或其组合。在某些具体的实施方式中，在所述给药之前，使使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体与免疫调节化合物(例如，上述免疫调节化合物)或沙利度胺接触或引起接近。在某些其它具体的实施方式中，所述给予包括除给予所述使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以外，还将免疫调节化合物(例如，以上描述的免疫调节化合物)或沙利度胺给予所述个体，其中所述量是例如导致所述病毒感染的一种或多种症状可检测改善、进展减轻或消除的量。在具体的实施方式中，所述病毒感染是被腺病毒科(adenoviridae)、微小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、嗜肝病毒科(hepadnaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、乳头瘤病毒科(papilommaviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)或披膜病毒科(togaviridae)的病毒感染。在更具体的实施方式中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,hiv)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、甲型肝炎病毒(hepatitis a virus,hav)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、埃-巴二氏病毒(epstein-barr virus,ebv)、单纯疱疹病毒1型(herpes simplex type 1,hsv1)、单纯疱疹病毒2型(herpes simplex type 2,hsv2)、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,cmv)、人疱疹病毒8型(human herpesvirus type 8,hhv8)、带状疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus,vzv)或带状疱疹病毒(shingles virus))、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)、丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,hcv)、丁型肝炎病毒(hepatitis d virus,hdv)、戊型肝炎病毒(hepatitis evirus,hev)、流感病毒(例如，甲型流感病毒(influenza a virus)、乙型流感病毒(influenza b virus)、丙型流感病毒(influenza c virus)或托高土病毒(thogotovirus))、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、乳头状瘤病
毒、狂犬病病毒或风疹病毒。
[0417]
在其它更具体的实施方式中，所述病毒是腺病毒a种，血清型12、18或31；腺病毒b种，血清型3、7、11、14、16、34、35或50；腺病毒c种，血清型1、2、5或6；d种，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49或51；e种，血清型4；或f种，血清型40或41。
[0418]
在某些其它更具体的实施方式中，所述病毒是阿波衣病毒(apoi virus,apoiv)、aroa病毒(aroa virus,aroav)、巴格扎病毒(bagaza virus,bagv)、斑齐病毒(banzi virus,banv)、博博衣病毒(bouboui virus,bouv)、cacipacore病毒(cacipacore virus,cpcv)、卡勒岛病毒(carey island virus,civ)、牛骨山脊病毒(cowbone ridge virus,crv)、登革热病毒(dengue virus,denv)、埃杰山病毒(edge hill virus,ehv)、gadgets gully病毒(gadgets gully virus,ggyv)、伊列乌斯病毒(ilheus virus,ilhv)、以色列-土耳其脑膜脑脊髓炎病毒(israel turkey meningoencephalomyelitis virus,itv)、日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus,jev)、朱格拉病毒(jugra virus,jugv)、朱蒂亚帕病毒(jutiapa virus,jutv)、凯丹姆病毒(kadam virus,kadv)、凯多各病毒(kedougou virus,kedv)、科科贝拉病毒(kokobera virus,kokv)、科坦戈病毒(koutango virus,kouv)、卡萨努森林病病毒(kyasanur forest disease virus,kfdv)、兰加特病毒(langat virus,lgtv)、meaban病毒(meaban virus,meav)、摩多克鼠病毒(modoc virus,modv)、蒙大拿鼠耳蝙蝠白细胞脑炎病毒(montana myotis leukoencephalitis virus,mmlv)、澳洲墨莱溪谷脑炎病毒(murray valley encephalitis virus,mvev)、恩塔亚病毒(ntaya virus,ntav)、鄂木斯克出血热病毒(omsk hemorrhagic fever virus,ohfv)、波瓦桑病毒(powassan virus,powv)、里奥布拉伏病毒(rio bravo virus,rbv)、罗亚尔农场病毒(royal farm virus,rfv)、萨博亚病毒(saboya virus,sabv)、圣路易斯脑炎病毒(st.louis encephalitis virus,slev)、sal vieja病毒(sal vieja virus,svv)、san perlita病毒(san perlita virus,spv)、索马里滋里夫病毒(saumarez reef virus,srev)、塞皮克病毒(sepik virus,sepv)、坦布苏病毒(tembusu virus,tmuv)、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,tbev)、为勒尼病毒(tyuleniy virus,tyuv)、乌干达s病毒(uganda svirus,ugsv)、乌苏土病毒(usutu virus,usuv)、韦塞尔斯布朗病毒(wesselsbron virus,wessv)、西尼罗河病毒(west nile virus,wnv)、yaounde病毒(yaounde virus,yaov)、黄热病病毒(yellow fever virus,yfv)、yokose病毒(yokose virus,yokv)或寨卡病毒(zika virus,zikv)。
[0419]
在其它实施方式中，将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和可选的胎盘灌洗液和/或灌洗液细胞作为包括一种或多种其它抗病毒剂的抗病毒疗法方案的一部分给予患有病毒感染的个体。可以给予患有病毒感染的个体的具体的抗病毒剂包括但不限于：咪喹莫德(imiquimod)、鬼臼毒素(podofilox)、盾叶鬼臼树脂(podophyllin)、干扰素α(ifnα)、reticolos、壬苯醇醚-9(nonoxynol-9)、阿昔洛韦(acyclovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、伐昔洛韦(valaciclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、西多福韦(cidofovir)；金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)；利巴韦林(ribavirin)；扎那米韦(zanamavir)和奥司他韦(oseltaumavir)；蛋白酶抑制剂，例如茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、利托那韦(ritonavir)或沙奎那韦
(saquinavir)；核苷反转录酶抑制剂，例如去羟肌苷(didanosine)、拉米夫定(lamivudine)、司他夫定(stavudine)、扎西他滨(zalcitabine)或齐多夫定(zidovudine)；和非核苷反转录酶抑制剂，例如奈韦拉平(nevirapine)或依法韦仑(efavirenz)。
[0420]
5.9.5.给药
[0421]
细胞，例如胎盘灌洗液细胞，例如来自胎盘灌洗液的有核细胞、混合自然杀伤细胞和/或分离的自然杀伤细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体的数目的确定以及免疫调节化合物(例如，免疫调节化合物)或沙利度胺的量的确定可以彼此独立地进行。
[0422]
5.9.5.1.细胞的给药
[0423]
在某些实施方式中，使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体以导致所述个体的可检测治疗益处的任何量(例如，有效量)或数目在个体中使用(例如，给予个体)，其中所述个体患有病毒感染、癌症或具有肿瘤细胞，例如具有肿瘤细胞、实体肿瘤或血液癌症的个体，例如癌症患者。可以将这样的细胞以绝对细胞数目向这样的个体给予，例如所述个体可以给予约、至少约或至多约1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
或1x10
11
个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体。在其它实施方式中，可以将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以相对细胞数目向这样的个体给予，例如所述个体可以给予每千克个体约、至少约或至多约1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
或1x10
11
个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体。在其它实施方式中，可以将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以相对细胞数目向这样的个体给予，例如所述个体可以给予每千克个体约、至少约或至多约1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108或5x108个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体。可以根据使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和可选的胎盘灌洗液细胞和/或除使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以外的自然杀伤细胞的数目和所述个体的肿瘤细胞的数目(例如，所估计数目)之间的近似比率，将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体给予这样的个体。例如，可以将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以与个体中的肿瘤细胞数目的比率为约、至少约或至多约1:1、1:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1给予所述个体。所述个体中的肿瘤细胞数目可以是估计的，例如通过统计来自个体的组织样品(例如，血液样品、生物活检样品等)中的肿瘤细胞数目。在具体的实施方式中，例如，对于实体肿瘤，所述计数是结合一个或多个肿瘤成像进行的，以获得近似肿瘤体积。在一个具体的实施方式中，除了使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体、可选的胎盘灌洗液细胞和/或除使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体以外的自然杀伤细胞以外，还向所述个体给予免疫调节化合物或沙利度胺，例如有效量的免疫调节化合物或沙利度
胺。
[0424]
在某些实施方式中，抑制(例如，在个体中)肿瘤细胞增殖的方法；治疗在个体中患有自然杀伤细胞缺乏症的个体的方法；或治疗患有病毒感染的个体的方法；或治疗患有癌症的个体(例如，具有肿瘤细胞、血液癌症或实体肿瘤的个体)的方法，包括使所述肿瘤细胞与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞中的一种或多种接近或给予所述个体。在具体的实施方式中，所述方法另外包括使所述肿瘤细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接近或给予所述个体。
[0425]
在一个具体的实施方式中，例如，在个体中患有自然杀伤细胞缺乏症(例如，nk细胞数目的缺少或在nk细胞中对癌症、肿瘤或病毒感染的细胞的反应性的缺少)的个体的治疗；或患有癌症或病毒感染的个体的治疗，或肿瘤细胞增殖的抑制，包括使所述肿瘤细胞与补充分离的胎盘灌洗液细胞或胎盘灌洗液的使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体引起接近或给予所述个体。在具体的实施方式中，每毫升约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体补充了约或至少约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多分离的胎盘灌洗液个细胞/毫升或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个分离的胎盘灌洗液细胞。在其它更具体的实施方式中，每毫升约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体补充了约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ml的灌洗液或约1单位的灌洗液。
[0426]
在另一个具体的实施方式中，在个体中患有自然杀伤细胞缺乏症的个体的治疗；患有癌症的个体的治疗；患有病毒感染的个体的治疗；或肿瘤细胞增殖的抑制，包括使所述肿瘤细胞与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体接近或给予所述个体，其中所述细胞补充了贴壁胎盘细胞，例如贴壁胎盘干细胞或多能细胞，例如cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘细胞。在具体的实施方式中，使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体补充了每毫升约1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108个或更多个贴壁胎盘干个细胞或1x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x10
10
、5x10
10
、1x10
11
个或更多个贴壁胎盘细胞，例如贴壁胎盘干细胞或多能细胞。
[0427]
在另一个具体的实施方式中，在个体中患有自然杀伤细胞缺乏症的个体的治疗；
患有癌症的个体的治疗；患有病毒感染的个体的治疗；或肿瘤细胞增殖的抑制，使用免疫调节化合物或沙利度胺与使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体的组合来进行，其中所述细胞补充了条件化培养基，例如，通过cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘细胞调节的培养基，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml的干细胞-条件化培养基/单位灌洗液或每104、105、106、107、108、109、10
10
或10
11
个使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体。在某些实施方式中，所述组织培养塑料-贴壁胎盘细胞是在美国专利号7,468,276和美国专利申请公布号2007/0275362中描述的多能贴壁胎盘细胞。所述专利和专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在另一个具体的实施方式中，所述方法另外包括使所述肿瘤细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接近或给予所述个体。
[0428]
在另一个具体的实施方式中，在个体中患有自然杀伤细胞缺乏症的个体的治疗；患有癌症的个体的治疗；患有病毒感染的个体的治疗；或肿瘤细胞增殖的抑制，其中所述使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体补充了胎盘灌洗液细胞，使所述灌洗液细胞在所述引起接近之前与白介素-2(il-2)引起接近一段时间周期。在某些实施方式中，在所述引起接近之前，所述时间周期为约、至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48小时。
[0429]
可以将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和可选的灌洗液或灌洗液细胞在抗癌疗法过程期间给予患有病毒感染的个体、患有癌症的个体或具有肿瘤细胞的个体一次；或者可以给予多次，例如，在疗法期间，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次或每1、2、3、4、5、6或7天一次或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36周或36周以上一次。在其中使用细胞和免疫调节化合物或沙利度胺的实施方式中，所述免疫调节化合物或沙利度胺以及细胞或灌洗液可以一起给予所述个体，例如，在同一种制剂中；分开地，例如，在独立的制剂中，以大致相同的时间；或可以分开给予，例如，在不同的用药时间表或在同一天的不同时间。类似地，在其中使用细胞和抗病毒化合物或抗癌化合物的实施方式中，所述抗病毒化合物或抗癌化合物以及细胞或灌洗液可以一起给予所述个体，例如，在同一种制剂中；分开地，例如，在独立的制剂中，以大致相同的时间；或可以分开给予，例如，在不同的用药时间表或在同一天的不同时间。可以给予使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体和灌洗液或灌洗液细胞而不考虑过去是否已经将使用本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体、灌洗液或灌洗液细胞给予所述个体。
[0430]
6.试剂盒
[0431]
本文提供的是药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，其中装有本文描述的组合物中的一种或多种，例如，包含通过本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或使用本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或nk祖细胞群体的组合物。可选地，与这样的容器附在一起是由管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式的通知书，该通知书反映出由生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。
[0432]
本文所包括的试剂盒可以根据本文描述的方法来使用，例如，抑制肿瘤细胞生长
的方法和/或治疗癌症(例如，造血系统癌症)的方法和/或治疗病毒感染的方法。在一个实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包含通过本文描述的方法产生的nk细胞(例如，tsnk细胞)或nk细胞群体或nk祖细胞群体或其组合物。在一个具体的实施方式中，本文提供的是包含tsnk细胞或其组合物的试剂盒。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是包含通过本文描述的三阶段方法产生的nk细胞群体或其组合物的试剂盒。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是包含nk祖细胞群体或其组合物的试剂盒。在具体的实施方式中，所述试剂盒中的所述nk祖细胞群体通过本文描述的方法(例如，本文描述的三阶段方法)产生。
7.实施例
[0433]
7.1.实施例1：来自人胎盘灌洗液和脐带血的造血干细胞的回收
[0434]
人胎盘灌洗液(hpp)和脐带血(ucb)细胞一般使用ficoll或氯化铵进行纯化以获得总有核细胞(tnc)。然后将tnc用于阳性选择程序中以根据生产商的方案(stemcell technologies,inc.)使用抗cd34珠和robosep分离cd34

细胞。在本实验中，分离出纯度大于90％的cd34

细胞。作为另外一种选择，将人祖细胞富集试剂盒(stemcell technologies,inc.)用于阴性选择程序中以通过使用人祖细胞富集混合物(cocktail)和抗下列人细胞表面抗原的单克隆抗体耗尽谱系定型细胞：cd2、cd3、cd11b、cd11c、cd14、cd16、cd19、cd24、cd56、cd66b和血型糖蛋白a。使用所述阴性选择，从原材料中回收了90％的cd 34

细胞。所回收的hsc的细胞组成汇总于表1。
[0435]
表1.富集的造血干细胞(hsc)的细胞组成。对于3个供体的群体平均值计算了标准偏差。
[0436] 平均值％标准偏差lin-cd34

75.16.2lin-cd34
–
cd38
–
9.82.4lin-cd34
–
cd133

0.90.2lin-cd34
–
cd117

7.20.5
[0437]
7.2.实施例2：造血干细胞向自然杀伤细胞的不含饲养细胞的扩增和分化
[0438]
将cd34

细胞在下列培养基制剂中培养至多48天，并且取细胞等分试样用于进行细胞计数、细胞活力评估、自然杀伤细胞分化的表征及功能性评价
[0439]
nk1培养基：gbgm(glycostem基生长培养基,glycostem目录号cct-scb500,clear cell technology)，其中补充了青霉素/链霉素(目录号15140,gibco)、20ng/ml scf(目录号255-sc,r&d systems)、10ng/ml flt-3配体(目录号308-fk,r&d system)、20ng/ml tpo(目录号288-tp,r&d system)、20ng/ml il-7(目录号207-il,r&d systems)、200iu/ml il-2(目录号202-il,r&d systems)和10ng/ml il-15(目录号247-il,r&d systems)。
[0440]
nk2培养基：dmem(目录号mt-10-013-cv,fisher)：ham’s f12(目录号bw12-615f,fisher)(1:2)，其中补充了2mm l-谷氨酰胺(目录号25030,invitrogen)、1％青霉素/链霉素、20％人血清ab(目录号100-512,gemcell)、5ng/ml亚硒酸钠(目录号s9133,sigma)、50μm乙醇胺(目录号e0135,sigma)、25μmβ-巯基乙醇(目录号21985,invitrogen)、20mg/ml抗坏血酸(目录号47863,sigma)、5ng/ml il-3(目录号203-il,r&d systems)、20ng/ml scf、10ng/ml flt-3配体、20ng/ml il-7和10ng/ml il-15。
[0441]
nk3培养基：x-vivo 20(目录号bw04-448q,fisher)，其中补充了青霉素/链霉素、10％人血清ab(目录号100-512,gemcell)和500iu/ml il-2。
[0442]
nk2a培养基：gbgm，其中补充了10％人血清ab、1％青霉素/链霉素、20ng/ml scf、10ng/ml flt-3配体、20ng/ml tpo、20ng/ml il-7、200iu/ml il-2、10ng/ml il-15和1.5iu/ml肝素(目录号h3149,sigma)。
[0443]
nk2b1培养基：dmem:ham’s f12(1:2)，其中补充了2mm l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、20％人血清ab、5ng/ml亚硒酸钠、50μm乙醇胺、25μmβ-巯基乙醇、20μg/ml抗坏血酸、5ng/ml il-3、20ng/ml scf、10ng/ml flt-3配体、20ng/ml il-7和10ng/ml il-15。
[0444]
nk2b2培养基：dmem:ham’s f12(1:2)，其中补充了2mm l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、20％人血清ab、5ng/ml亚硒酸钠、50μm乙醇胺、25μmβ-巯基乙醇、20μg/ml抗坏血酸、200iu/ml il-2、20ng/ml scf、10ng/ml flt-3配体、20ng/ml il-7和10ng/ml il-15。
[0445]
nk2c培养基：rpmi 1640(目录号22400105,invitrogen)，其中补充了10％fbs(目录号sh30070.03,hyclone)、2mm l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、50ng/ml scf、50ng/ml flt-3配体、100iu/ml il-2、20ng/ml il-7和20ng/ml il-15。
[0446]
nk2d培养基:无血清培养基(stemspan,目录号09650,stem cell technologies,vancouver,canada)，其中补充了1μm合成的糖皮质激素地塞米松(dexamethosone)(dex,目录号d4902,sigma,st louis,mo)、40ng/ml胰岛素样生长因子1(igf-1,目录号291-g1-250,r&d systems,minneapolis,mn)、100ng/ml scf、40μg/ml脂质(富含胆固醇的脂质混合物；目录号c7305-1g,sigma,st louis,mo)、5ng/ml il-3、200iu/ml il-2、20ng/ml il-7和20ng/ml il-15。
[0447]
在不同时间点收集的细胞用rpmi1640(无苯酚(phenol free))和5％fbs洗涤两次，用荧光缀合的抗体(表2和表3)在4℃下标记15min并通过流式细胞术(facscanto,bd)和flowjo细胞计数软件(tree star)分析。
[0448]
表2.用于细胞标记的抗体
[0449]
[0450][0451]
表3.nk表面受体的流式细胞术表征分组
[0452] fitcpepercpapcapc-cy7空白
ꢀꢀꢀꢀꢀ
同种型
ꢀꢀꢀꢀꢀ
组1cd3cd56cd16
ꢀꢀ
组2cd16nkb1cd56nkg2dcd3组3cd16nkat2cd56nkp46cd3组4cd16cd94cd56cd117cd3组5cd16cd226cd56 cd3组6cd16cd7cd56cd5cd3
[0453]
使用pkh26/to-pro-3标记的细胞毒性测定。靶肿瘤细胞用pkh26(cat#pkh26gl,sigma-aldrich)(一种由于其亲脂性脂族残基而插入细胞质膜中的染料)标记，然后置于96孔u型底组织培养板中并在补充有10％fbs的200μl rpmi 1640中以多种效应子与靶标(e:t)之比值与扩增的nk细胞一起孵育。将培养物在37℃下在5％co2中孵育4小时。孵育后，收获细胞，将to-pro-3(invitrogen目录号t3605)(一种不透过膜的dna染色剂)加入到培养物(至1μm终浓度)中，然后进行facs分析。细胞毒性表示为总pkh26 靶肿瘤细胞内死细胞(pkh26 to-pro-3 )的百分比。
[0454]
cd34

细胞扩增和向nk细胞分化的优化。在所测试的培养基制剂nk1、nk2和nk3中，nk1培养基在第21天(d21)显示出500倍的扩增。nk2和nk3培养基既不维持细胞增殖也不维持细胞分化。对nk1培养基进行进一步的培养基优化，并且将后续培养基命名为nk2a、nk2b、nk2c和nk2d。使用nk2a培养基培养的cd34

细胞在第55天(d55)显示出105倍的扩增。根据得自nk1、2和3培养基的成倍扩增、分化和细胞毒性的结果，实施了第二批nk2a、nk2b、nk2c和nk2d培养基制剂，并且在d55实现了105倍的扩增(如图1中所示)。nk2b培养基显示出近似3x104倍的扩增。在nk2c培养基中的培养在21天中导致3x102倍的扩增，然后细胞活力下降。
在整个实验的持续时间，nk2d培养基不维持细胞。
[0455]
在第48天(d48)，nk2a培养基中大致90％的nk细胞是cd56

cd3
–
。在cd56

cd3
–
群体中，超过98％的细胞是cd56

cd16
–
(如图2中所示)，尽管58％表达激活受体nkg2d，68％是nkp46

，17％是cd226

(如表4a和表4b中所示)。
[0456]
表4a、表4b.在d48时扩增的nk细胞的表型表征
[0457][0458][0459]
另外，在培养的第21天，在nk2a培养基中培养的97.8％的细胞和在nk2b培养基中培养的93.1％的细胞是cd56

cd16
–
。
[0460]
7.3.实施例3：在cnk培养基中培养nk细胞增强nk细胞的扩增和细胞毒性
[0461]
在第27天(d27)，将在nk2a培养基中培养的cd34

细胞在下列培养基之中进一步培养：
[0462]
·
两阶段培养基，其包含cnk培养基和维持培养基。cnk培养基是imdm(invitrogen)，其中补充了10％fcs(hyclone)、200iu/ml il-2(r&d systems)、35μg/ml转铁蛋白(sigma-aldrich)、5μg/ml胰岛素(sigma-aldrich)、2x10-5
m乙醇胺(sigma-aldrich)、1μg/ml油酸(sigma-aldrich)、1μg/ml亚油酸(sigma-aldrich)、0.2μg/ml棕榈酸(sigma-aldrich)、2.5μg/ml bsa(sigma-aldrich)和0.1μg/ml植物凝集素(pha-p,sigma-aldrich)。将在nk2a培养基中培养的cd56

cd3
–
nk细胞以2.5x105个活细胞/ml在细胞培养物处理的24孔板或t型三角瓶中的cnk培养基中再悬浮。将丝裂霉素c处理的同种异体pbmc和k562细胞(慢性髓细胞白血病细胞系)作为饲养细胞一并加入到cnk培养基中至终浓度为1x106个/ml。将nk细胞在37℃下在5％co2中培养5-6天。5-6天后，每3-4天将相等体积的维持培养基(含有10％fcs、2％人ab血清、抗生素、l-谷氨酰胺和400单位il-2/ml的imdm)加入到培养物中。
[0463]
·
nk2a(pdac)培养基，其中含有丝裂霉素c处理的cd34
–
、cd10

、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘干细胞作为饲养细胞；
[0464]
·
nk2a(msc)培养基，其中含有丝裂霉素c处理的间充质干细胞(msc)作为饲养细胞；或
[0465]
·
不含饲养细胞的nk2a(ff)培养基作为对照。
[0466]
与nk2a(ff)、nk2a(pdac)和nk2a(msc)相比，两阶段培养基增强了cd34

细胞的成
倍扩增，特别是在第27天(d27)和第48天(d48)之间。参见图3。
[0467]
到第35天，在两阶段培养基中，cd34

细胞的比例已减少至近似4％，而cd56 cd3
–
已增加至近似80％。在第45天(d45)，与在nk2a(ff)、nk2a(pdac)和nk2a(msc)中培养的nk细胞相比，在两阶段培养基中培养的细胞显示出最高的细胞毒性(如图3中所示)。第41天的表型表征(如图5中所示)显示出细胞中nkp46和cd226表达增加，这表明细胞毒性增强的可能解释。在d41，cd226

细胞的比例从nk2a培养基中的0.9％
±
0.8％增加至两阶段培养基中的13％
±
4％；nkp46

细胞的比例从nk2a培养基中的55.4％
±
8.7％增加至两阶段培养基中的80％
±
7.85％。在d48，cd226 细胞的比例从nk2a培养基中的17.3％
±
14.3％增加至两阶段培养基中的52.3％
±
11.64％；nkp46

细胞的比例从nk2a培养基中的67.9％
±
5.4％增加至两阶段培养基中的86％
±
4％。在所测试的条件下，nkg2d表达无显著差异。cd226和nkp46的表达变化示于下表5。
[0468]
表5.在第41天(d41)和第48天(d48)时cd226和nkp46在nk2a(ff)和两阶段培养基中培养的nk细胞上的表达。对3个供体计算了标准偏差。
[0469]
d41 nk2a(ff)两阶段cd226％平均值0.9％13％ 标准偏差0.8％4％nkp46％平均值55.4％80％ 标准偏差8.7％7.85％d48 nk2a(ff)两阶段cd226％平均值17.3％52.3％ 标准偏差14.3％11.6％nkp46％平均值67.9％86％ 标准偏差5.4％4％
[0470]
7.4.实施例4：两阶段培养基培养的自然杀伤细胞和来源于胚胎干细胞(esc)的自然杀伤细胞的比较
[0471]
将在两阶段培养基中的培养的nk细胞与来源于胚胎干细胞(esc)的nk细胞相比较，后一种nk细胞通过woll等人,blood 113(4):6094-6101(2009)的方法产生。具体地说，在两种细胞类型的培养过程中观察到cd94和cd117的表达水平的差异。图6显示从第7天(d7)至第35天(d35)，两阶段nk细胞中cd117的表达较高或“ ”，而cd94的表达逐渐增加。在第35天(d35)，约44％的cd56

cd3
–
(两步)细胞是cd94

cd117

细胞，37.6％的cd56

cd3
–
细胞是cd94
–
cd117

，14.7％的cd56

cd3
–
细胞是cd94

cd117
–
。照此，从培养的第14天至第35天，通过所述两步方法产生的nk细胞与来源于esc的nk细胞可区别，其中的78％仍是cd117
low/
–
。cd117表达的这种差异是有用的，这是因为cd117

nk细胞对来自多种组织的肿瘤细胞系是具有细胞毒性，如以下实施例6中所述。
[0472]
这些结果表明tsnk细胞的分化进展不同于esc来源的nk细胞，而且tsnk细胞与esc来源的nk细胞可区别。
[0473]
7.5.实施例5：pdac增强在nk2a培养基中培养的自然杀伤细胞的成倍扩增
[0474]
为了评估cd10

、cd34
–
、cd105

、cd200

组织培养塑料-贴壁胎盘干细胞(在本实施例中称为pdac)对造血干细胞(hsc)分化为自然杀伤细胞的影响，hsc用丝裂霉素c处理的
pdac或骨髓源性间充质干细胞(msc)以10:1pdac/msc:hsc的比率在第0天和第21天进行刺激，同时用无饲养细胞的培养物作为对照。用nk2a培养基作为培养基。发现与仅有培养基相比，pdac增强培养的nk细胞的成倍扩增。然而，发现在有或没有饲养层生长的细胞之间的细胞毒性无显著差异。用msc处理的细胞显示出最高的成倍扩增，但是最低的细胞毒性，如图7中所示。
[0475]
7.6.实施例6：使用两阶段培养基扩增的nk细胞的细胞毒性活性
[0476]
本实施例证明了从使用以上描述的两阶段过程扩增并且分化的cd34

细胞产生的nk细胞对肿瘤细胞系具有细胞毒性。
[0477]
乳酸脱氢酶(ldh)释放测定。使用cytotox非放射性细胞毒性测定试剂盒(promega,目录号g1780)进行ldh释放测定。在本测定中，用来源于供体匹配的人胎盘灌洗液(hpp)和脐带血单位(combos单位)的培养的nk细胞作为效应细胞，而用某些肿瘤细胞系细胞作为靶细胞。根据本研究中所使用的三个单位，hpp细胞的百分比为56.6％
±
28.3％。将效应细胞和靶细胞置于96孔u型底组织培养板中并且在补充了2％人ab血清(gemini,目录号100-512)的100μl无酚红的rpmi 1640(invitrogen,目录号11835-030)中以多种效应子与靶标(e:t)之比值孵育。将培养物在37℃下在5％co2中孵育4小时。孵育后，将50μl上清液转移到酶法测定板中，如生产商所提供的方法检测ldh活性，并且在elisa读数器(synergy ht,biotek)中在490nm下测量吸光值。根据以下方程计算细胞毒性：％细胞毒性＝(样品
–
效应子自发值-靶标自发值)/(靶标最大值-靶标自发值)*100，其中“效应子自发值”是从效应细胞自发释放ldh的对照；“靶标自发值”是从靶细胞自发释放ldh的对照；和“靶标最大值”是当基本100％的细胞溶解时最大ldh释放的对照。
[0478]
人胎盘灌洗液(hpp)cd34 细胞和脐带血(ucb)cd34 细胞的分离。hpp和ucb细胞使用ficoll或氯化铵进行纯化以获得总有核细胞(tnc)。然后将tnc用于阳性选择程序中以使用抗cd34珠和根据生产商(stemcell technologies,inc.)提供的方案的robosep分离cd34

细胞。在本实验中，分离出纯度大于90％的cd34

细胞。
[0479]
肿瘤细胞对所培养的两阶段nk细胞的敏感性研究。将肿瘤细胞系(表6)包括人乳癌(hcc2218)、人结肠直肠腺癌(ht-29)、人慢性髓细胞白血病(cml)、人急性髓样白血病(aml)、人成胶质细胞瘤(ln-18和u-118mg)、人多发性骨髓瘤(u266)、人组织细胞性淋巴瘤(u937)和人视网膜母细胞瘤(weri-rb-1)与两阶段nk细胞共培养。所述两阶段培养的nk细胞包括在nk2a培养基中培养21天、然后在cnk培养基中培养21天的那些，和在nk2a培养基中培养28天后在cnk培养基中培养14天的那些。在4小时共培养后，通过乳酸脱氢酶(ldh)释放测定法测量nk细胞的细胞毒性。在效应子:靶标(e:t)比率为10:1时，后者一般比前者显示出更高的细胞毒性(表6)。在肿瘤细胞系中，ln-18对nk介导的杀死最敏感，随后依次是k562、u937、weri-rb-1、u-118mg、ht-29、hcc2218、kg-1和u266。
[0480]
因此，tsnk细胞对多种癌细胞系显示出显著的细胞毒性。似乎还表明可以通过将在nk2a培养基中的培养周期从21天延长至28天来提高nk细胞毒性。
[0481]
表6.靶向肿瘤细胞系的培养的tsnk细胞的细胞毒性
[0482][0483]
*n：供体数
[0484]
人胎盘灌洗液(hpp)cd34

细胞和脐带血(ucb)cd34

细胞的微小rna谱。使用mirvana
tm mirna分离试剂盒(ambion,目录号1560)，对纯化的供体匹配的hpp和ucb cd34 细胞进行微小rna(mirna)制备。将cd34

细胞(0.5至1.5x106个细胞)在变性溶胞缓冲液中破坏。然后，对样品进行酸-苯酚 氯仿抽提以分离小rna物质高度富集的rna。加入100％乙醇使样品达到25％乙醇。当该溶胞产物/乙醇混合物通过玻璃纤维过滤器时，大rna物质被固定，而在滤液中收集小rna物质。然后将滤液的乙醇浓度提高至55％，将混合物通过第二玻璃纤维过滤器，在该过滤器中小rna变成固定化。将该rna洗涤几次，并且在低离子强度溶液中洗脱。所回收的小rna的浓度和纯度通过在260nm和280nm下测量其吸光度来确定。在所测试的所有供体(n＝3)中，发现对hpp cd34 细胞独特的mirna包括hsa-mir-380、hsa-mir-512、hsa-mir-517、hsa-mir-518c、hsa-mir-519b和hsa-mir-520a。
[0485]
7.7.实施例7：从合并的ucb和hpp分离cd34

细胞
[0486]
本实施例证明了从合并的脐带血(ucb)和人胎盘灌洗液(hpp)(combo)分离cd34

细胞。为了评价ucb:hpp混合比，如下进行了3种不同的混合比的并行比较：(1)完全合并：1x ucb(完全体积) 1x hpp(完全体积)；(2)hpp的部分合并(33％)：1x ucb(完全体积) 0.33x hpp(1/3的hpp体积)；和(3)hpp的部分合并(10％)：1x ucb(完全体积) 0.10x hpp(1/10的hpp体积)。总计进行了n＝3实验重复。记录初始tnc和体积。然后，对合并的样品纯化cd34

细胞，并且在融化后确定cd34

纯度。然后根据融化后cd34

纯度vs.体积或细胞计数(tnc)分数(作为combo的％)的图，通过作图确定最佳混合比。如图8中所示，终点cd34

纯度与hpp体积含量良好相关，但是与hpp tnc含量的相关性不太好。整体来说，发现ucb 85％v/v,hpp 15％v/v是获得纯度80％及以上的cd34

细胞的最佳混合比。
[0487]
7.8.实施例8：使用基于的培养基的nk细胞培养的比较
[0488]
本实施例证明了使用两种基于gbgm的培养基(三阶段过程和两阶段过程)的nk细胞培养过程的比较。两种过程总结于表7。两种过程均利用gbgm作为胎盘来源的nk细胞和cd34

细胞分化的基础培养基。
[0489]
表7.三阶段过程和两阶段过程的总结
[0490][0491]
实验参数如下概述：
[0492]
供体批次：
[0493]
(1)来自新鲜ucb的cd34

细胞：n＝6
[0494]
(2)来自新鲜“combo”的cd34

细胞：n＝2
[0495]
(3)来自冷冻保存的“combo”cd34 ：n＝8
[0496]
规模：多孔培养皿至t-25，至多多个t-75三角瓶，1至80ml培养体积
[0497]
过程方法：
[0498]
(1)两阶段过程
[0499]
(2)三阶段过程
[0500]
饲养细胞的使用：
[0501]
(1)无饲养细胞
[0502]
(2)有失活的k562&pbmc饲养细胞，在第21天添加到培养物中
[0503]
接种密度：20000
–
50000个细胞/ml
[0504]
产生了来自新鲜ucb或新鲜combo的cd34

细胞，并使用实施例7、10和11中所述的方法冷冻保存。将培养物维持在37℃、》90％湿度和5％co2培养箱中。整个过程监测细胞生长(细胞计数)并且每周更换两次培养基以将细胞浓度维持在5x104–
1x106个/ml的范围内。通过在第21天和第35天进行表型分析来监测分化。当使用饲养细胞时，在nk培养的第21天，用丝裂霉素-c(16μg/ml,2h,37℃)使培养3天的新鲜k562和融化后的allo-pbmc失活，将其以1x106个/ml加入到两阶段过程条件中。将分化nk归一化至0.5x106个/ml。在第35天，在进行了最终细胞计数之后，使用新鲜培养的和pkh标记的k562细胞(10:1e:t比率,4h,37℃)进行基于流式细胞术的细胞毒性测定以评价nk功能性。
[0505]
结果
[0506]
在第35天，使用两种过程，来源于新鲜ucb的cd34

细胞的tnc扩增倍数的中值是可比较的。两阶段过程看起来获得了比用于新鲜组合(combo)来源的cd34

细胞的三阶段过程更高的tnc扩增倍数。对于使用两种过程的来源于融化后的组合的cd34

细胞来说，整体tnc
扩增倍数是可比较的，但是其显著低于来源于新鲜ucb或新鲜组合的那些。总之，在培养结束时，三阶段和两阶段过程均获得了相似的细胞产率。
[0507]
在第21天，来源于ucb或组合的细胞上的表型有明显差异。与三阶段过程(平均6.1％)相比，两阶段过程导致产生了更高的cd56

cd3
–
nk细胞百分比(平均14.7％)。分化程度(例如，cd56

cd3
–
水平)似乎是供体依赖性的。在所有情况下，cd3

cd56
–
(t-细胞)和cd3

cd56

(nkt样细胞)群体的百分比均是最小的。
[0508]
在第35天，对于分化nk细胞来说，发现两种过程均是有效的，如通过高终点cd56

cd3
–
纯度水平所证明的(对于两阶段和三阶段过程，分别为87.2％和90.1％)。在两阶段过程中添加饲养细胞似乎增强nk表型纯度(无饲养细胞时为75.3％；有饲养细胞时为87.2％)，而使用三阶段过程未发现饲养细胞对nk纯度的可观察到的益处(无饲养细胞时为90.1％；有饲养细胞时为84.7％)。
[0509]
培养的nk细胞在整个过程中维持了它们的cd16
–
表型。在不存在时饲养细胞的情况下，两阶段过程似乎获得了比另一个条件(《2％)稍微更多的cd56

cd3

细胞(平均11.2％)。在两种过程中，pbmc和k562饲养细胞的存在显著上调/激活nk细胞群体上的某些nk功能性标志物(nkp46、dnam-1、cd94)。整体来说，发现当饲养条件完全相同时，在两种过程之间nk纯度和功能性标志物表达谱(profiles)是可比较的。
[0510]
如通过4小时体外k562细胞毒性测定所确定的，发现当饲养细胞条件完全相同时，培养的nk细胞的功能性在两种过程中是可比较的。饲养细胞激活的nk细胞在体外杀死k562细胞时是非常有效的，其对于两阶段和三阶段过程分别具有93.2％和93.6％特异性溶胞的平均特异性溶胞。
[0511]
总之，发现当使用相同饲养细胞条件时，两阶段和三阶段过程对于nk细胞获得了可比较的生长、表型(纯度和激活标志物)和体外功能性。与三阶段过程相比，两阶段过程提供了简单方便的nk细胞培养。
[0512]
7.9.实施例9：使用多种基础培养基的nk细胞培养的比较
[0513]
本研究旨在评价使用不同基础培养基的cd34

来源的nk细胞的分化和扩增。
[0514]
实验条件总结于表8中。如实施例11所述培养细胞。所有实验都在多孔培养皿/t-三角瓶的规模下组织并维持在37℃、》90％湿度和5％co2培养箱中。在整个过程中监测细胞生长(细胞计数)并且每周更换两次培养基以将细胞浓度维持在5x104–
1x106个/ml的范围内。通过在第21天和第35天的表型分析监测分化。在第21天，使培养3天的新鲜k562和融化后的allo-pbmc失活并以1x106个/ml加入到发育中的nk细胞培养物中。将nk细胞归一化至0.5x106个/ml。在第35天，在进行了最终的细胞计数后，使用新鲜培养的和pkh标记的k562细胞(10:1e:t比率,4h,37℃)进行基于流式细胞术的细胞毒性测定以评价nk功能性。
[0515]
表8.用于多种基础培养基评价的实验条件的总结
[0516][0517]
生长得率
[0518]
在第35天，stemspan h3000和optmizer对gbgm显示出可比较的生长得率(tnc扩增倍数)。cellgro、x-vivo 15、aim-v、x-vivo 10、dmem:f12、dmem:f12 w/5mm oac显示出比gbgm低的生长得率。
[0519]
表型分析
[0520]
在第35天(终点)，gbgm获得了约80％纯度的cd56

cd3
–
细胞。optmizer和stemspan h3000获得了约50％纯度的cd56

cd3
–
细胞。dmem:f12产生了约35％纯度的cd56

cd3
–
细胞。aim-v、x-vivo 10、x-vivo 15和cellgro培养基产生了约《30％纯度的cd56

cd3
–
细胞。发现在培养期间向dmem:f12基础培养基中添加oac会大大提高终点nk纯度；在培养的第35天，cd56

cd3
–
的百分比从35％提高到72％。
[0521]
细胞毒性/功能性
[0522]
发现在培养期间向dmem:f12基础培养基中添加5mm oac会大大提高nk细胞的激活状态和体外功能性。oac的添加还显著提高了nk激活标志物nkp46、nkg2d、dnam-1和cd94的水平。第35天nk细胞的体外功能性(k562细胞毒性)同样从21.4％急剧提高到97.1％。
[0523]
整体来说，nk细胞性能由于5mm oac的添加而获得显著提高。
[0524]
7.10.实施例10：nk细胞的储存和冷冻保存
[0525]
本实施例证明了储存和冷冻保存nk细胞的方法。使用以上实施例中所述的规程，将分离自人胎盘灌洗液(hpp)和脐带血细胞的cd34

造血干细胞扩增并分化为nk细胞。在从hpp和脐带血分离(在第0天)后马上或者在nk细胞的第一生长期期间(分离后第9天、第14天、第21天或第35天)将细胞冷冻保存。
[0526]
将细胞在以下冷冻保存制剂中冷冻保存：制剂1-右旋糖酐冷冻保存培养基：5％dmso(sigma aldrich,d2650)，55％右旋糖酐(10％w/v的生理盐水)(10％lmd的0.9％氯化钠注射液,hospira)，40％has(octapharma)；制剂2-海藻糖冷冻保存培养基：5％dmso，55％海藻糖(10％w/v的生理盐水)，40％hsa；制剂3-cs2(biolife solutions)；制剂
4-cs5(biolife solutions)；制剂5-cs10(biolife solutions)；制剂6-无血清冷冻培养基(sigma-aldrich,目录号6295)；制剂7-甘油冷冻培养基(sigma-aldrich,目录号c6039)；或制剂8
–
dmso和无血清冷冻培养基(sigma-aldrich,目录号2639)。
[0527]
将在不同时间点收集的细胞用培养基或盐水溶液洗涤几次。然后，将细胞离心以获得细胞沉淀。取出上清液，细胞沉淀用冷冻保存培养基悬浮至约1x10
6-1.5x107个或更多个细胞/毫升。将细胞悬液等分装到1ml或2ml有隔片小瓶中并在2-8℃下保温10分钟左右。随后，将细胞在控制速率冷冻机(thermo)中以0.5℃/min冷冻。将冷冻小瓶转移至低温冷冻机中以用于在液氮蒸汽中储存。可以将冷冻保存的nk细胞在使样品轻轻旋转的37℃水浴中快速融化直至所有可见冰融化。可以用预热的培养基稀释细胞样品。
[0528]
7.11.实施例11：nk细胞的储存和冷冻保存
[0529]
本实施例证明了储存和冷冻保存nk细胞的另一种方法。使用如上所述的规程，将分离自人胎盘灌洗液(hpp)和脐带血细胞的cd34

造血干细胞扩增并分化为nk细胞。从hpp和脐带血分离(第0天)后马上或者在nk细胞的第一生长期期间(在分离后第9天、第14天、第21天或第35天)将细胞冷冻保存。
[0530]
通过将右旋糖酐-40和has以60％右旋糖酐-40v/v、40％has(来自25％溶液)v/v)的比率混合来制备细胞悬液溶液。
[0531]
用50％右旋糖酐-40v/v、40％hsa(25％溶液)v/v、10％dmso v/v制备2x冷冻溶液。首先，将dmso缓慢加入到右旋糖酐-40中并充分混合。随后，将25％的hsa溶液缓慢加入到该溶液中并混合。在使用之前，将所得溶液充分混合并使其恢复至室温。
[0532]
冷冻保存程序
[0533]
估计细胞数目并将其作为细胞悬液归一化至在细胞悬液溶液中的15x106个。确定细胞悬液的体积并将等体积的新鲜制备的2x冷冻溶液缓慢加入并混合。记录冷冻溶液中的最终细胞悬液体积并分配至多个小瓶中。对保留的培养上清液进行mycoalert测试以检测支原体污染。对一个保留小瓶进行融化后试验以确定融化后活力、细胞回收和细胞表征。
[0534]
7.12.实施例12：冷冻保存/融化的nk细胞的分析
[0535]
活力测定。将在如实施例10或11中的多种制剂中冷冻保存的nk细胞融化。将细胞以2x10
6-3x107个细胞/ml的密度冷冻。与新鲜细胞或预冷冻细胞相比，使用自动细胞计数器(invitrogen)在融化后的第0天、第3天和第18天对融化的nk细胞评价细胞活力。简而言之，将10μl的细胞样品与10μl的锥虫蓝混合。将细胞混合物吸移到室载玻片中，将该载玻片插入到仪器中并对细胞计数。根据不同的冷冻保存制剂，冻融后的细胞显示出约80％至》90％活力的细胞活力。
[0536]
细胞凋亡测定。在融化后的第0天、第3天和第18天，还使用bd annv/pi细胞凋亡测定试剂盒对融化的nk细胞评价细胞凋亡。简而言之，用1x冷pbs洗涤细胞两次并在1x结合缓冲液(bd annexin v/pi细胞凋亡试剂盒，部件号556547，结合缓冲液的组合物，部件号51-66121e 0.1m hepes/naoh(ph 7.4)，1.4m nacl，25mm cacl2。对于1x稀释为1份10x缓冲液对9份蒸馏水)中再悬浮。将100μl的含有近似100,000个细胞的细胞悬液转移到facs管中。将100μl的1x结合缓冲液、5μl的annv-fitc和5μl的pi-pe加入到该管中。然后将该管轻轻涡旋并避光孵育15分钟。随后，加入400μl的1x结合缓冲液。在1小时以内分析样品。用于建立
象限与门的对照是未染色的细胞、仅用annv-fitc而不用pi染色的细胞和仅用pi而不用annv染色的细胞。将凋亡细胞定量为作为尺寸散点图(fsc vs ssc)上的“细胞”门控的事件群体的％。根据不同的冷冻保存制剂，冻融后的细胞显示出约5-25％的死/迟凋亡细胞和10-25％的早凋亡细胞。整体来说，与其它制剂相比，制剂1(5％dmso,55％右旋糖酐(10％w/v的生理盐水),40％has)、制剂2(5％dmso,55％海藻糖(10％w/v的生理盐水),40％hsa)、制剂4-cs5(biolife solutions)和制剂5(cs10(biolife solutions))显示出较高的细胞活力和较低的凋亡细胞。
[0537]
7.13.实施例13：过程中的冷冻保存细胞库的评价
[0538]
本实施例证明了过程中的冷冻保存细胞库(in-process cryopreserved cell banking)的评价。使用spanholtz等,plos one.5(2):e9221(2010)中所描述的方法，使用hs-ab或fbs作为血清来源，用ucb cd34

细胞起始细胞培养。确定并调整细胞浓度，并且根据需要补充培养基。在第7、9、10或14天，从细胞培养物中取出近似106–
3x106个细胞，离心后再悬浮于冷冻保存培养基(5.5％v/v右旋糖酐-40,10％v/v hsa,5％v/vdmso)中。将细胞在控制速率的冷冻机中冷冻后转移到液体相氮气中储存供冷冻保存。将每小瓶约1ml细胞以范围为106–
107个/ml的浓度进行冷冻保存。将剩余的培养物继续到终点(第35天)，称为“新鲜(无过程中的冷冻保存)”。在细胞培养的第21、28和35天进行表型分析。在培养的第35天(终点)评估体外功能性(k562细胞毒性,10:1e:t)。
[0539]
过程中的冷冻保存培养样品(第9天和第14天)的融化后性能进行了如下评价。在37℃水浴中快速融化细胞库小瓶。然后，用rpmi-fbs培养基稀释细胞，离心，再悬浮并且接种到培养基中。将各培养条件继续至累计从培养过程开始算起的第35天。以与它们的“新鲜”对应物相同的方式进行分析(细胞计数、活力、表型分析、功能性评估)。
[0540]
结果
[0541]
在第9、10和14天，不考虑过程中的时间点或细胞浓度，过程中的冷冻保存样品全都获得了极好的融化后活力(96.2％-97.3％锥虫蓝阴性，86.1％-93.2％annexin-v阴性/to-pro-3阴性)。过程中的库对培养结束(第35天)的得率损失不具有负面影响。用hs-ab或hs-ab作为血清来源，在融化后的第9天或第14天和“新鲜”条件之间，最终细胞得率是可比较的。
[0542]
发现在第21/28/35天时间点的成熟nk细胞的表型谱(profile)分别在“新鲜”和“融化后”培养物之间是相当可比较的。发现表型纯度(cd56

cd3
–
)同样是可比较的。某些nk功能性标志物(cd94,nkg2d)的表达由于不同批次之间的差异度而稍有不同。
[0543]
在k562细胞毒性测定中，发现融化后第9/14天培养的nk细胞获得了与未进行过程中冷冻保存的培养的nk细胞相比低～0-20％的特异性k562溶胞读数。然而，考虑到与nk细胞毒性功能相关的表面标志物的表达水平(dnam1、nkp46、nkg2d等)没有同时降低，因此需要用另外的供体和测定重复证实趋势。整体来说，在培养的第9/14天时的过程中的冷冻保存对过程结果具有最小的影响。
[0544]
7.14.实施例14：用于nk细胞剂量施用的融化后培养基的开发
[0545]
本实施例证明了在动物中用于nk细胞剂量施用的融化后培养基的开发。测试了注射培养基和细胞密度对nk细胞活力、细胞毒性、细胞回收和团块形成的影响。通过锥虫蓝染色评估活力；通过facs(10:1比率的nk:k562)评估细胞毒性，和通过显微测定评估团块成
形。对于多种类型的注射培养基和细胞密度的结果见表9-12。
[0546]
表9.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0547][0548]
表10.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0549][0550]
表11.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0551][0552]
表12.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0553][0554]
结果显示plasmalyte 1％hsa注射培养基维持的nk细胞具有比pbs 1％fbs注射培
养基更好的活力和细胞毒性。将细胞在注射培养基中悬浮后，细胞毒性还随时间降低。当细胞在plasmalyte 1％hsa中悬浮时，未观察到细胞密度对活力和细胞毒性的影响。1小时后，nk细胞还在pbs 1％fbs或plasmalyte 1％hsa培养基中发生沉降；然而，细胞看起来不聚集。最后，在冷冻-融化过程中未观察到细胞回收和活力的明显损失。
[0555]
7.15.实施例15：nk细胞剂量施用的融化后培养基的开发
[0556]
还测试了多种hsa浓度对nk细胞活力、细胞毒性、细胞回收和团块形成的影响。使用了来自实施例14的相同方法。对于多种类型的注射培养基和细胞密度的结果见表13-16。
[0557]
表13.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0558][0559]
表14.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0560][0561]
表15.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0562][0563]
表16.所测试的规定条件的细胞回收、活力、细胞毒性和团块形成
[0564][0565]
结果显示在所测试的三种注射培养基中在融化后的4小时以内良好维持活力。另外，在所有三种注射培养基中，细胞毒性随时间降低。然而，在较高浓度的has中，降低水平较小，而plasmalyte 5％hsa维持了最高的细胞毒性。还观察到在所有三种注射培养基中nk细胞不聚集。整体来说，plasmalyte似乎是比pbs更好的注射培养基候选者。
[0566]
7.16.实施例16：无il-2的nk细胞的培养
[0567]
本实施例证明了在不存在il-2的情况下nk细胞的培养。通过实施例11中所述的两阶段过程进行细胞培养。在第一培养基中测试了il-2的五种不同浓度：0、200、500、1000、2000u/ml。
[0568]
结果表明培养物中发育的nk细胞似乎是il-2对生长无响应。nk细胞的纯度似乎不取决于il-2：在不存在il-2的情况下，nk细胞分化为cd56

cd3
–
表型。il-7、il-15和scf的组合似乎对体外nk细胞发育是足够的。
[0569]
7.17.实施例17：cd34 胎盘造血细胞朝向自然杀伤(nk)细胞的培养和表征
[0570]
本实施例描述了cd34 胎盘造血细胞朝向自然杀伤(nk)细胞群体的扩增和分化的三步培养过程。在本实施例中还描述并表征了该培养过程的三步/阶段培养过程的35天之后获得的细胞群体(称为“d35 nk细胞”)。
[0571]
材料和方法
[0572]
造血干细胞(hsc)朝向nk细胞的扩增和分化的培养过程。将cd34 细胞在gbgm培养基中进行培养(glycostem therapeutics；参见spanholtz等人,plos one(2010)5(2):9221)并取细胞的等分试样评估细胞计数、细胞活力、淋巴细胞分化的表征和功能性评价。为了启动体外扩增和nk谱系定型，将cd34 细胞接种到gbgm培养基中。在无饲养细胞的培养物中在如下三个阶段中培养细胞：
[0573]
第1阶段(9天)：gbgm加10％人血清ab(hs)、lwh肝素、tpo、scf、il-7、flt3l(25
–
27ng/ml)；
[0574]
第2阶段(5天)：gbgm加10％hs、lwh肝素、scf、il-7、flt3l、il-15(20
–
27ng/ml)；和
[0575]
第3阶段(21天)：gbgm加10％hs、scf、il-7、flt3l、il-15(20
–
27ng/ml)、il-2(1000u/ml)。
[0576]
乳酸脱氢酶(ldh)释放测定。ldh是一种在细胞裂解时释放的稳定胞质酶。使用cytotox比色细胞毒性测定试剂盒(promega,目录号g1780)进行ldh释放的测定并且用培养的d35 nk细胞作为效应细胞，而用肿瘤细胞作为靶细胞。将效应细胞和靶细胞置于96孔u型底组织培养板并在100μl无酚红但补充2％人ab血清的rpmi 1640(invitrogen,目录号11835-030)中以多种效应细胞-靶标(e:t)比率进行孵育。培养物在37℃下在5％co2中孵
育4小时。孵育后，将50μl上清液转移到酶法测定板中。按生产商提供的方案检测ldh活性并在elisa读数器(synergy ht,biotek)中在490nm下测量吸光值。根据下列方程计算细胞毒性：％细胞毒性＝(样品
–
效应细胞自发值
–
靶标自发值)/(靶标最大值
–
靶标自发值)x100。
[0577]
体外细胞毒性分析。使用培养的d35 nk细胞作为效应细胞并使用肿瘤细胞作为靶细胞，进行了直接细胞毒性测定。肿瘤细胞用pkh26(sigma-aldrich catalog#pkh26-gl)(参见ferlazzo g等,2004,pnas usa 101(47):16606-11；lee-macary ae等,2001,jimmunol methods 252(1-2):83-92)(一种由于其亲脂性脂族残基而插入细胞质膜中的染料)标记，然后置于96孔u型底组织培养板中并在补充有10％fbs的200μl rpmi 1640中以多种效应子与靶标(e:t)之比值与培养的d35 nk细胞一起孵育。将培养物在37℃下在5％co2中孵育4小时。孵育后，收获细胞，将to-pro-3(invitrogen catalog#t3605)(一种不透过膜的dna染色剂)加入到培养物(至1μm终浓度)中，然后使用bd facscanto i进行facs分析。细胞毒性表示为总pkh26

靶肿瘤细胞内死细胞(pkh26

to-pro-3

)的百分比。
[0578]
生物分布和功效研究的体内小鼠模型。使用6～8周龄的雌性nsg(nod-cgprkdc-scid-il2rg-tmlwjl-sz)小鼠(the jackson laboratory；bar harbor,maine)进行该研究。体内功效研究如表17中所示建立。
[0579]
表17.用于评估体内d35 nk细胞功效的研究组
[0580][0581][0582]
*nks＝d35 nk细胞
[0583]
把小鼠关养在微隔离饲养室(microisolator housing)中并在研究开始前几天进行隔离检疫。将用基质胶(matrigel)重悬浮的处于指数生长期的总计5
×
106个k562细胞或6
×
106个hct-116细胞或2
×
106个u087mg细胞经皮下植入小鼠的右胁腹区。在细胞植入后，每天监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分配到各组，采用肿瘤体积最接近平均值的小鼠。在随机化后的当天开始用d35 nk细胞治疗并且仅将一个剂量的d35 nk细胞给予小鼠。施用途径为i.v.(6x 106个nk细胞/小鼠)或i.t.(6x106个nk细胞/小鼠)注射，如表17中所述。使用公式v＝l
×w×h×
π/6，测量肿瘤体积，式中l和w代表肿瘤的较长和较短的直径，且h代表肿瘤的高度。在整个研究中，肿瘤体积和体重每周测量两次。观
察动物的来自d35 nk细胞治疗的可能的毒性效应。当肿瘤体积达到》1,500mm3或原始体重的减轻超出20％或发生肿瘤溃疡或小鼠变成濒死的时，实施不按时间表的处死。实验结束时，对对照组和各治疗组的肿瘤生长速率进行统计学分析。
[0584]
统计学分析。得自不同实验的结果描述为平均值
±
平均值的标准偏差(stdev)。当p值为0.05或更小时，结果被认为有显著性。
[0585]
结果
[0586]
d35 nk细胞针对肿瘤细胞的体外细胞毒性。评估了第35天培养的(d35)nk细胞群体针对肿瘤细胞系的细胞毒性活性。如图9中所示，在效应子与靶标(e:t)之比值为10:1时，培养的d35 nk细胞证明针对多种肿瘤细胞系包括ntera-2cl.d1(nt2/d1,睾丸癌)、pc-3(前列腺腺癌)、u-87mg(成胶质细胞瘤)、k562(慢性髓细胞白血病(cml))、kg-1a(急性髓样白血病(aml))和bt474(乳癌)有溶细胞活性，如通过基于facs的体外细胞毒性测定所检测，其中肿瘤细胞用pkh26-topro标记。与所测试的其它细胞系相比，d35 nk细胞群体细胞毒性针对raji细胞(淋巴瘤)是有效的但是效力最低。使用ldh释放测定，还测量了d35 nk细胞针对hct-116细胞(结肠直肠癌)的细胞毒性，如图10中所示。
[0587]
d35 nk细胞针对小鼠异种移植的肿瘤的细胞毒性。对d35 nk细胞群体针对免疫缺陷小鼠中的异种移植肿瘤的体内功效进行了研究。如图11-14b中所示，d35 nk细胞群体的单一剂量给药表现出在多种肿瘤的异种移植nsg小鼠模型中的肿瘤生长抑制。图11证明了在第13天时cml(k562细胞)的生长抑制。图12证明了在第28天时结肠直肠癌(hct-116细胞)的生长抑制。图13证明了在第24天时成胶质细胞瘤(u-87mg细胞)的生长抑制。在乳癌(bt474细胞)的异种移植物模型中，在存在和不存在细胞因子il-2或il-15的情况下给予d35 nk细胞群体。如图14a和图14b中所示，在存在和不存在il-2或il-15的情况下均观察到d35 nk细胞群体的生长抑制效应。
[0588]
d35 nk细胞群体在bt474异种移植nsg模型中展示肿瘤浸润能力。对来自以上描述的d35 nk细胞群体治疗的bt474异种移植物实验的终点的bt474异种移植物的离体免疫组织化学(ihc)分析(图14b)揭示出d35 nk细胞群体归巢至且浸润到nsg小鼠中已建立的bt474肿瘤异种移植物中。具体地说，肿瘤异种移植物切片的成像揭示出与肿瘤浸润的d35 nk细胞群体共定位的坏死肿瘤细胞(用苏木精和伊红(h&e)染色显现；图15a)，如通过荧光标记的抗cd56(图15b)和抗nkp46(图15c)所检测。这些结果表明d35 nk细胞群体具有针对肿瘤的体内溶细胞活性。
[0589]
7.18.实施例18：针对异种移植肿瘤的d35 nk细胞活性的表征
[0590]
在本实施例中，评估了d35 nk细胞群体单用和与il-2组合针对小鼠异种移植物模型中的k562和rpmi8226肿瘤的治疗功效。
[0591]
材料和方法
[0592]
小鼠。nsg(nod-cgprkdc-scid-il2rg-tmlwjl-sz)雌性，来自jackson laboratories。
[0593]
细胞。将来自cml细胞系k562的细胞与基质胶一起按5百万个细胞/胁腹进行皮下注射。使用了rpmi8226、bt474、hl-60三种多发性骨髓瘤(mm)细胞系。培养的d35 nk细胞群体作为新鲜细胞悬液供应用于立即输注。
[0594]
治疗方案。在肿瘤建立(肿瘤尺寸＝100mm3)后开始用通过三阶段方法制备的
d35nk细胞群体治疗。根据肿瘤负担分布将实验组随机化。治疗组见表18。
[0595]
表18.(组1-4、9-10＝被分析的样品；组5-8、11-12＝预期的样品)
[0596]
组别肿瘤模型小鼠数#治疗剂量和施用途径施用体积1k5628对照溶媒(i.v.)0.4ml2k5628nks*6.0e6(i.v.)0.4ml3k5628对照溶媒 il-2(i.v.)0.4ml4k5628nks6.0e6 il-2(i.v.)0.4ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5rpmi8228对照溶媒(i.v.)0.4ml6rpmi8228nks6.0e6(i.v.)0.4ml7rpmi8228对照溶媒 il-2(i.v.)0.4ml8rpmi8228nks6.0e6 il-2(i.v.)0.4ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
9bt4748对照溶媒 il-2(i.v.)0.4ml10bt4748nks6.0e6 il-2(i.v.)0.4ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
11hl-608对照溶媒 il-2(i.v.)0.4ml12hl-608nks6.0e6 il-2(i.v.)0.4ml
[0597]
*nks＝d35 nk细胞
[0598]
免疫组织化学。使用下列抗体进行免疫组织化学：对于cd56的检测，抗ncam克隆123c3小鼠单克隆igg1(来自abcam ab9272)，第二抗体af594缀合的山羊抗小鼠igg1(来自invitrogen)；对于nkg2d的检测，克隆id11小鼠单克隆igg(来自abcam ab35033)，第二抗体af488缀合的山羊抗小鼠igg1(来自invitrogen)；和对于nkp46的检测，山羊多克隆igg(来自r&d systems af1850)，第二抗体af488缀合的驴抗山羊igg(来自invitrogen)。在异种移植物切除后，将各肿瘤的一半放入液氮中冷冻并且于-80℃下储存。另一半立即在最佳切割温度(oct)介质中包埋并在液氮中冷冻。用恒冷切片机(cryostat)(leica,deerfield、il)切成五(5)μm切片。这些切片在pbs中洗涤后暴露于含有2x酪蛋白溶液、5％马血清和0.3％triton-x100的pbs的蛋白质阻断溶液在室温(rt)下60min。然后将在阻断溶液中稀释(1:50)的第一抗体应用于细胞并在4℃下孵育过夜，第二天早上，将样品在pbs中洗涤并将在阻断溶液中稀释(1:500)的第二抗体应用于细胞，在室温下30分钟。然后将载玻片在pbs中洗涤并将600nm dapi溶液在室温下应用10分钟以显现细胞核。所有载玻片都用含水介质固定用于荧光分析(vectashield,vector laboratories)。免疫组织化学图像用nikon eclipse显微镜e800型捕获，该显微镜配备有高分辨率数字照相机(nikon dxm1200f)，该照相机与电脑(pc)相连，电脑(pc)安装有nis elements软件用于图像捕获和存档。这些实验的对照是新鲜制备的d35 nk细胞和在细胞离心涂片(cytospin)载玻片上制备的k562细胞。
[0599]
结果
[0600]
在完成d35 nk细胞群体治疗时间表之后，从小鼠中切除异种移植物。将各肿瘤的一半立即放入液氮中冷冻并且于-80℃下储存。另一半立即在最佳切割温度(oct)介质中包埋并在液氮中冷冻。用恒冷切片机(leica,deerfield、il)切成5μm切片。用这些切片进行苏
木精和伊红(h&e)染色以用于常规组织学和免疫荧光研究。
[0601]
进行了免疫荧光实验以证实抗体是有特异性的。如图16a中所示，k562细胞不表达cd56、nkg2d或nkp46标志物。如图16b中所示，新鲜制备的d35 nk细胞群体对这三个标志物染色呈阳性。对于各抗体，在同种型对照中未观察到抗体的非特异性结合的背景。
[0602]
如图17b所证明的，在输注106个细胞的d35 nk细胞群体之后，该细胞以高功效定位于k562肿瘤并且在体内大量存活下来。这为cd56抗原(左)与nkg2d(中心)的阳性信号的共定位所证明。在存在d35 nk细胞群体的细胞的情况下并且在存在和不存在il-2的情况下，k562肿瘤细胞杀伤通过肿瘤细胞群体中颗粒(凋亡核)数目增加得到证明，如图17b(无il-2)和图17d(有il-2)中所示。相比之下，颗粒性在溶媒对照(无d35nk细胞群体或il-2的k562肿瘤细胞)中没有观察到，如图17a中所示，图17a描绘生长中的肿瘤的形态。虽然不希望受到任何理论或机制的束缚，但是组织病理学观察结果表明在d35 nk细胞群体给药后肿瘤体积的消退很可以是由于细胞凋亡引起的。
[0603]
d35 nk群体治疗的bt474小鼠异种移植物肿瘤模型的免疫组织化学证明了单独的il-2(图17e)引发肿瘤细胞毒性的能力因d35 nk细胞群体(图17f)的给药而增加。
[0604]
因此，这些结果证明了d35 nk细胞表现出针对多种人肿瘤类型的溶细胞活性。
[0605]
7.19.实施例19：在小鼠中使用3个阶段过程培养的d35细胞的表征
[0606]
本实施例描述了d35 nk细胞群体的生物分布和表型表征研究。
[0607]
材料和方法
[0608]
造血干细胞(hscs)朝向nk细胞的扩增和分化。为了启动体外扩增和nk谱系定型，将cd34 细胞接种到gbgm培养基中。在存在低剂量(50
–
250pg/ml)细胞因子(il-6、lif、g-csf、gm-csf、mip-1a)的情况下，在如上所述的三个阶段中，在无饲养细胞培养物中培养细胞。
[0609]
生物分布和功效研究的体内小鼠模型。使用6～8周龄的雌性nsg(nod-cgprkdc-scid-il2rg-tmlwjl-sz)小鼠(the jackson laboratory；bar harbor,maine)进行该研究。把小鼠关养在微隔离饲养室中并在研究开始前几天进行隔离检疫。将用基质胶(matrigel)重悬浮的处于指数生长期的总计5
×
106个k562细胞经皮下植入小鼠的右胁腹区。在细胞植入后，每天监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分配到各组，采用肿瘤体积最接近平均值的小鼠。在随机化后的当天开始用d35nk细胞群体治疗并且仅将一个剂量的d35 nk细胞群体的细胞给予小鼠。施用途径为i.v.(6x 106个nk细胞/小鼠)或肿瘤内(i.t.)(6x 106个nk细胞/小鼠)注射，如表17中所述。使用公式v＝l
×w×h×
π/6，测量肿瘤体积，式中l和w代表肿瘤的较长和较短的直径，且h代表肿瘤的高度。在整个研究中，肿瘤体积和体重每周测量两次。观察动物的来自d35 nk细胞群体治疗的可能的毒性效应。当肿瘤体积达到》1,500mm3或原始体重的减轻超出20％或发生肿瘤溃疡或小鼠变成濒死的时，实施不按时间表的处死。实验结束时，对对照组和各治疗组的肿瘤生长速率进行统计学分析。
[0610]
甲基纤维素集落形成测定。根据生产商的方案(stemcell technologies,inc.)，进行甲基纤维素集落形成测定，也称为集落形成细胞(colony forming cell,cfc)测定。简而言之，将cd34 细胞悬液或试验细胞置于补充如每板不同细胞密度所指示的细胞因子的甲基纤维素培养基中。对于每一种细胞密度，进行一式三份测定，然后进行2至3周孵育。使
用光学显微镜术进行集落评价和列举。
[0611]
统计学分析。得自不同实验的结果描述为平均值
±
平均值的标准偏差(stdev)。当p值为0.05或更小时，结果被认为有显著性。
[0612]
结果
[0613]
在小鼠中的生物分布和持久性。在具有人il-3、scf和gm-csf转基因表达的nsg免疫缺陷小鼠中，在过继转移后，分析d35 nk细胞群体的细胞的体内生物分布和持久性以对人造血微环境建模。动物通过亚致死辐射(260rad)预先条件化，然后通过尾静脉(i.v.)输注(6x106个细胞/动物)给予d35 nk细胞群体。在四周内通过流式细胞术分析转移的人细胞的持久性、组织分布和细胞表面表型。在该研究的过程中，每天注射人重组il-2或il-15细胞因子对动物进行治疗以确定d35 nk细胞群体对临床相关辅助细胞因子疗法的体内响应。
[0614]
在过继转移后的每周四个时间点(第7、14、21和28天)分析外周血、脾脏、肝脏和骨髓中的转移的人细胞。通过流式细胞术分析外周血和骨髓中和肝脏和脾脏细胞悬液中的细胞表面人cd45表达，检测d35 nk细胞群体的细胞。如图18b和图18d中所示，在接受il-15辅助疗法的动物中，在整个4周时程内，d35 nk细胞群体的细胞以1-5％的受体小鼠cd45 细胞的相对频率在外周血中持续存在。在il-15治疗的动物中，在转移后21天，人cd45 细胞在肝脏中达到相对于受体小鼠cd45 细胞群体多达20％的频率(图18d)，表明d35 nk细胞的肝脏特异性归巢。在相同动物中，在整个4周时程内，d35 nk细胞群体的细胞在脾脏和骨髓中也是容易可检测的。与共同给予il-15的小鼠(图18b和图18d)相比，在接受il-2辅助疗法的动物(图18a和图18c)中检测到明显更低水平的人细胞，表明il-15提高d35 nk细胞群体的细胞的体内存活和/或持久性。
[0615]
这些结果证明d35 nk细胞群体的细胞在小鼠中持续存在至少四周。
[0616]
在小鼠中三阶段d35 nk细胞的表型和功能性成熟。分析以上描述的生物分布研究的d35 nk细胞群体的离体检测的细胞对cd16(nk细胞成熟的一种功能性相关标志物)的表达。如图19中所示，d35 nk细胞群体的细胞在体外具有低水平(小于5％)的cd56 cd16 、cd56 kir2dl2/dl3/ds2 和cd56 kir3dl1/ds1细胞，这与由扩增的胎盘cd34 干细胞产生的未成熟nk表型一致。如图20中所示，在il-15治疗的nsgs小鼠中，d35 nk细胞群体的细胞显示cd16表达的体内进行性增加，达到了多达50％的cd56 cd16 和超过90％的cd56 kir 。此外，如上述研究所述，在过继转移后四周时，在外周血中检测到d35 nk细胞群体的细胞。这些结果一起提供关于d35 nk细胞群体的细胞的体内功能性成熟的证据。
[0617]
这些结果证明d35 nk细胞群体的相当大部分未成熟的(cd16-)细胞在体内变成cd16 ，表明表型和功能性成熟。
[0618]
d35 nk细胞群体的抗肿瘤活性。在本实验中，使用遗传诱发的白血病模型(综述于mulloy等人,cell cycle.2008nov 1；7(21):3314-9.epub 2008nov 8)来测试d35 nk细胞群体针对同种异体白血病起始细胞和正常非转化脐带血(“ucb”)cd34 细胞对照的特异性细胞毒性活性。使用两种不同的方法测量细胞毒性活性。
[0619]
简而言之，在第一种方法中，将正常和白血病祖细胞在液体测定中共培养，并且在培养4小时后，对共培养物中的剩余靶细胞数目进行计数来测量d35 nk细胞诱导的细胞毒性。在第二种方法中，将正常cd34 和白血病祖细胞与d35 nk细胞群体一起共培养4小时，然后平板接种到第二集落形成细胞测定的甲基纤维素培养基中。使用甲基纤维素集落形成测
定作为d35 nk细胞群体针对正常和白血病干/祖细胞的特异性细胞毒性活性的读出。图21和图22中显示的结果证明与d35 nk细胞群体共培养，白血病祖细胞活性被完全抑制，而对正常的同种异体cd34 祖细胞无影响。
[0620]
这些结果证明d35 nk细胞群体表现出针对表达mll-af9融合蛋白的工程改造的ucb cd34 细胞的细胞毒性(这些工程改造的cd34 细胞在移植到免疫缺陷小鼠之后可发育成白血病细胞)但是没有针对正常ucb cd34 细胞的证据，因为白血病祖细胞的克隆发生(clonogenicity)被消除。
[0621]
d35 nk细胞群体抑制异种移植物疾病。在实验中使用遗传诱导的白血病模型来评估d35 nk细胞群体的体内细胞毒性。如图23a示意图所示，在用mll-af9融合基因转导的ucb cd34 细胞的移植后，小鼠在第8天、第9天和第10天用化学疗法(da：阿糖胞苷(cytarabine)(50mg/kg)/多柔比星(doxorubicin)(1.5mg/kg))进行治疗。在第11天给予d35 nk细胞群体的细胞(6x 106个细胞/小鼠)和il-15。对表达gfp的mll细胞进行facs分析以测量在实验终点的残余的白血病细胞的频率，定义为移植后第58天，除非小鼠较早死亡。显示了对照组即给予pbs(图23b)或il-15(图23c)的小鼠或给予单独的il-15和化学疗法(图23d)或d35 nk细胞群体加上il-15和化学疗法的组合(图23e)的那些组的代表性曲线图。如图23f中所示，在第58天，在对照组中，65％的小鼠是对aml细胞呈阳性；在用化学疗法治疗的组中，40％的小鼠是对aml细胞呈阳性；和在用化学疗法和d35 nk细胞群体二者治疗的组中，没有小鼠是对aml细胞呈阳性。
[0622]
这些结果证明在人异种移植物白血病模型中，d35 nk细胞群体抑制在化学疗法后白血病疾病的体内复发。
[0623]
7.20.实施例20：自然杀伤祖细胞群体的产生和表征
[0624]
本实施例描述了cd34 胎盘造血细胞朝向自然杀伤(nk)祖细胞群体的扩增和分化的三步培养过程。本实施例还描述并表征了在该培养过程的21天之后获得的nk祖细胞群体。
[0625]
材料和方法
[0626]
造血干细胞(hsc)朝向nk祖细胞群体的扩增和分化的培养过程。将cd34 细胞在gbgm培养基中进行培养(glycostem therapeutics；参见spanholtz等人,plos one(2010)5(2):9221；gbgm是基于imdm并含有人衍生蛋白或人重组蛋白的一种无动物源性组分的培养基)并取细胞的等分试样评估细胞计数、细胞活力、淋巴细胞分化的表征和功能性评价。为了启动体外扩增和nk谱系定型，将cd34 细胞接种到gbgm培养基中，在无饲养细胞的培养物中，在存在低剂量(50
–
250pg/ml)细胞因子(il-6、lif、g-csf、gm-csf、mip-1a)的情况下，在如下三个阶段中培养细胞：
[0627]
第1阶段(9天)：gbgm加10％人血清ab(hs)、lwh肝素、tpo、scf、il-7、flt3l(25
–
27ng/ml)；
[0628]
第2阶段(5天)：gbgm加10％hs、lwh肝素、scf、il-7、flt3l、il-15(20
–
27ng/ml)；和
[0629]
第3阶段(7天)：gbgm加10％hs、scf、il-7、flt3l、il-15(20
–
27ng/ml)、il-2(1000u/ml)。
[0630]
用于植入研究的体内小鼠模型。使用6～8周龄的雌性nsg(nod-cgprkdc-scid-il2rg-tmlwjl-sz)小鼠(the jackson laboratory；bar harbor,maine)进行该研究。把小
鼠关养在微隔离饲养室中并在研究开始前几天进行隔离检疫。在随机化后的当天开始用d21 nk祖细胞群体的细胞治疗，并且仅将一个剂量的d21 nk祖细胞群体给予小鼠。施用途径为i.v.(d21 nk祖细胞群体的6x 106个细胞/小鼠)或i.t.(6x106个d21 nk祖细胞/小鼠)注射，如表17中所述。使用公式v＝l
×w×h×
π/6，测量肿瘤体积，式中l和w代表肿瘤的较长和较短的直径，且h代表肿瘤的高度。在整个研究中，肿瘤体积和体重每周测量两次。观察动物的来自d21 nk祖细胞群体治疗的可能的毒性效应。当肿瘤体积达到》1,500mm3或原始体重的减轻超出20％或发生肿瘤溃疡或小鼠变成濒死的时，实施不按时间表的处死。实验结束时，对对照组和各治疗组的肿瘤生长速率进行统计学分析。
[0631]
铬(
51
cr)释放细胞毒性。将效应细胞(d21 nk祖细胞群体的细胞)以适宜的浓度接种到圆底96孔板中的100μl等分试样/孔测定培养基(rpmi1640 10％fbs p/s)中。将靶肿瘤细胞与10μci铬酸钠一起在37℃下孵育60分钟，然后用测定培养基洗涤三次。然后，将
51
cr标记的肿瘤细胞以指定的效应子与靶标(e:t)之比值加入到效应细胞中。在37℃下在5％co2培养箱中进行孵育4小时。所有培养按一式三份进行并根据以下公式计算％细胞毒性：100x(试验
51
cr释放
–
自发
51
cr释放)/(最大
51
cr释放
–
自发
51
cr释放)，其中最大计数和自发计数分别是由在测定培养基中与2％triton x一起孵育的靶细胞的一式三份计算得出。
[0632]
统计学分析。得自不同实验的结果描述为平均值
±
平均值的标准偏差(stdev)。当p值为0.05或更小时，结果被认为有显著性。
[0633]
结果
[0634]
d21 nk祖细胞群体的体内生物分布分析证明高水平的人细胞在骨髓中的持久性，达到了过继转移后四周，相对于受体小鼠cd45 细胞的频率》10％。如图24a中所示。骨髓植入细胞是cd56-cd16-(图24b)，表达低cd117并且是标志物2b4(cd244)的》50％(图24c)，表明nk祖细胞表型。这种表型群体在d35 nk细胞的过继转移后也检测到，但频率低～10倍。通过brdu的过夜掺入以通过从头(de novo)dna合成标记细胞的体内s期细胞周期进入，测试了骨髓植入d21 nk祖细胞群体的体内细胞周期进入。如图25中所示，来源于骨髓的d21 nk祖细胞群体的细胞经历了高速率(》35％brdu 细胞)的体内循环，表明这种群体的活性更新(active turnover)与它们所观察的体内扩增一致。
[0635]
从给药后28天的骨髓样品中回收的骨髓植入cd56-cd16-d21 nk祖细胞群体的细胞通过facs分选法纯化后在nk细胞培养培养基(imdm加10％fbs、2％hs、il-2(200u/ml))中进行离体培养以便确定它们的nk分化潜能。如图26中所示，在nk培养培养基中生长的d21 nk祖细胞群体的细胞可以分化为cd56 cd16 表型成熟的nk细胞。这些来源于d21 nk祖细胞群体的骨髓植入细胞的离体分化的cd56 nk细胞在铬(
51
cr)释放细胞毒性测定中针对k562靶细胞进行了测试。将来源于d21 nk祖细胞群体的细胞的分化的cd56 nk细胞的细胞毒性活性与nk-92细胞系以及通过体外基质共培养产生的人cd34 细胞来源的nk细胞进行比较。如图27中所示，与两种阳性对照nk细胞类型相比，来源于d21 nk祖细胞群体的细胞的分化的cd56 nk细胞显示出以相等的效应细胞与靶细胞之比类似的或更高的细胞毒性活性。
[0636]
总之，d21 nk祖细胞群体的骨髓植入群体的这些离体分析与它们的nk-细胞功能性分化潜能一致，表明这些细胞在转移后保持体内自我更新的能力。
[0637]
综上所述，本实施例证明了nk祖细胞群体表现出在骨髓中迁移和植入的能力。这些骨髓植入细胞是对2b4(cd244)呈阳性，提示它们是nk祖细胞。
[0638]
7.21.实施例21：nk祖细胞群体和nk细胞群体的比较
[0639]
本实施例比较了d21 nk祖细胞群体的细胞和使用以上描述的3-步骤过程培养的d35 nk细胞群体的细胞的表型。在体外分型(profiling)实验中，使用facs，基于五次重复实验，与88.5％ /-11.2％的d35 nk细胞群体的细胞相比，29.9％ /-13.4％的d21 nk祖细胞群体的细胞是cd56 cd3-。另外，与49.0％ /-20.4％的d35 nk细胞群体的细胞相比，12.3％ /-5.6％的d21 nk祖细胞群体的细胞是nkp46 。
[0640]
7.22.实施例22：d21 nk祖细胞群体和d35 nk细胞群体的比较
[0641]
在本实施例中，总结了得自实施例17-21中所述的实验的结果和结论。这些结果证明已成功地建立了由分离自供体匹配的脐带血和人胎盘来源的干细胞(其得自足月的人胎盘)的cd34 细胞产生人nk细胞群体的培养方法。这种培养方法是无饲养细胞的，并且基于祖细胞扩增，然后通过细胞因子包括促血小板生成素、干细胞因子、flt3配体、il-7、il-15和il-2支持的向nk细胞群体分化。从包含cd34 造血祖细胞(或造血干细胞，hsc)的群体向包含nk细胞的群体的递级进展最终导致产生具有近似90％cd3-cd56 表型的nk细胞群体并且与在35天内达到的平均10,000倍扩增相关。所得的细胞群体是cd16-并且表达低水平的kir，表明该群体包含占优势的未成熟的nk细胞表型。然而，值得注意的是，该细胞群体还显示针对宽范围的肿瘤细胞系靶标的活性体外细胞毒性。
[0642]
hsc来源的nk细胞群体的体内持久性、成熟和功能性活性在经工程改造以表达人细胞因子scf、gm-csf和il-3的免疫缺陷(nsg)小鼠(nsgs小鼠)中进行了评估。每周三次腹膜内注射人il-2或il-15以测试细胞因子补充对体内转移的nk细胞群体的影响。在转移后的7天间隔时间最多到第28天时，nk细胞群体的存在和详细免疫表型在外周血(pb)、骨髓(bm)、脾脏和肝脏样品中进行了评估。在没有细胞因子补充的情况下，非常少的来自该nk细胞群体的细胞在任何时间点是可检测的。il-2的给药导致可检测但是来自该人nk细胞群体的细胞的持久性有适度提高。il-15补充的效应显著更大，导致在循环中转移的nk群体细胞的稳固持久性，并且很可能在受体小鼠的肝脏中的特异性归巢和扩增。
[0643]
体内转移后，显著大部分的人cd56 细胞表达cd16和kir，表明完全生理性nk分化。在体外细胞毒性测定中，离体分离的人cd56 细胞有效杀死k562靶标。与外周血、脾脏和肝脏相反，bm含有明显大部分的为cd56/cd16双阴性(dn)但对cd244和cd117呈阳性的人细胞，表明在cd34 来源的细胞产物的cd56-馏分中残留的祖细胞功能。bm植入群体在nk细胞群体培养中在较早的扩增阶段更高，但是在第35天培养的产物中保持(preserved)。这些细胞在bm中的频率随时间增加，并且显示出基于转移后28天体内brdu标记的继续循环，提示显著体内祖细胞潜能。有兴趣的是，分离自bm的dn细胞在离体情况下可有效地分化为具有针对k562的体外细胞毒性活性的成熟cd56 cd16 nk细胞。这些bm植入细胞在体内可提供祖细胞群体以在人体内产生成熟nk细胞库(pool)。
[0644]
使用最小残留疾病(minimal residual disease,mrd)的遗传工程人aml异种移植物模型进一步探索了hsc来源的nk细胞群体的体内活性。得自这些实验的数据表明在化学疗法后接受nk细胞群体的动物中，aml复发被显著抑制。
[0645]
7.23.实施例23：d21和d35 nk细胞的端粒长度
[0646]
在本实施例中，评估了使用以上描述的三阶段过程培养的d21和d35细胞的dna端粒长度。
[0647]
在有丝分裂之前，细胞dna通过dna聚合酶复制。该酶不复制染色体的两个非常末端
–
端粒区。为此，端粒在每一次细胞分裂之后变得更短，并因此端粒起到“有丝分裂钟(mitotic clock)”的作用。端粒有保持染色体末端完整性的功能。在正常细胞中，端粒缩短导致细胞衰老。脊椎动物端粒由重复几百次到几千次的6个核苷酸(ttaggg)组成。端粒长度有种特异性，范围为人类中的5-20千碱基(kb)到小鼠中的20-150kb。
[0648]
7.23.1.材料和方法
[0649]
端粒pna-fitc方法。使用端粒pna试剂盒/流式细胞术的fitc(目录号k5327,dako,agilent technologies公司)评估细胞端粒序列的检测。该试剂盒的探针不识别亚端粒(subtelomeric)序列并且与传统的端粒限制片段(trf)测量相反，该方法允许估计不包括亚端粒的端粒长度。
[0650]
对照细胞。使用下列对照细胞：hl60细胞系、nk92细胞系、pbmc来源的nk细胞、ccrf-cem、ntera2和nhdf成体成纤维细胞细胞系。
[0651]
分析方法。使用探针荧光的对数标度(log scale)fl1-h和dna染色和线性标度(linear scale)fl3-h，通过流式细胞术分析样品。前向散射侧向散射，fl1-h和fl3-h值获救了(在一个变体中，fl3-a和fl#w值也可获救)。
[0652]
计算。rtl＝(平均fl1样品细胞(有探针)
–
平均fl1样品细胞(无探针))x对照细胞的dna指数x100/(平均fl1对照细胞(有探针)
–
平均fl1对照细胞(无探针))x样品细胞的dna指数。
[0653]
7.23.2.结果与讨论
[0654]
使用端粒pna-fitc方法来测量使用本文描述的三阶段过程培养的第21天和第35天nk细胞与ccrf-cem(t淋巴母细胞样细胞系)、hl60(前髓母细胞细胞系)、ntera2(睾丸胚胎癌细胞系)、nhdf(正常人皮肤成纤维细胞)、nk92细胞系和外周血(pb)nk细胞相比的端粒长度。预期的ccrf-cem的端粒长度为近似15-20kb，而hl60的端粒长度为近似15kb。由于各测定间的差异性，试验结果表示为与hl60相比的相对端粒长度(rtl)(％rtl＝端粒长度
试验
/端粒长度
hl60 x 100)。如图28中所示，nk92细胞具有比第21天nk细胞(nk-d21)和第35天nk细胞(nk-d35)更长的端粒长度。商购的获自两个供体的pb nk细胞显示具有与来自两个不同供体的nk-d21和nk-d35相比更短的端粒长度。这些结果表明nk-d21和nk-d35细胞比pb nk细胞更多未成熟的和更少分化的，因此具有比pb nk细胞更高的进一步扩增和分化潜能。
[0655]
等同实施方式
[0656]
本发明并不局限于由本文描述的具体实施方式限定的范围。实际上，除所述的那些以外，根据以上描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。这样的修改计划落入所附权利要求书的范围内。
[0657]
本文所引用的所有参考文献以它们的全部内容作为参考并入本文并且用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用以其全部内容作为参考并入本文用于所有目的一样。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容并且不应该解释为由于在先发明而不授权本发明从而使该出版物在先的许可。