一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用与流程

1.本发明属于功能蛋白技术领域，具体涉及一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用。


背景技术：

2.1993年lin,l f等人利用寡聚核苷酸探针从大鼠神经胶质瘤细胞系b49细胞中发现及对人的基因文库的筛选，分离克隆出一种神经营养因子，命名为胶质源性神经营养因子(gdnf)(lin lt et al.,1993)。gdnf是由脑组织中的神经胶质细胞分泌的具有重要生物功能的神经细胞营养因子，属于tgf-beta超家族的一员，具有促进神经元生长和分化的作用，对多巴胺能神经元和运动神经元显示出潜在的神经营养作用(henderson et al.,1994)，在参与神经细胞程序性死亡、促进神经元存活、参与轴突损伤的修复等方面也有重要作用(王运良，2004)。
3.国内外对gdnf的功能进行了广泛的研究，胚胎期gdnf可以促进神经系统的发育，成年时，gdnf可以修复神经炎症、损伤、退行性病变。sun m等应用单纯性疱疹病毒载体表达gdnf，在帕金森氏病鼠动物模型上，定向注入脑纹状体，发现gdnf对于小鼠具有明显的行为纠正作用(sun m,et al.,2005)。对帕金森患者的单侧豆状核注入gdnf的研究显示，有显著的、持续性的双侧症状改善效果，且无明显的不良反应(slevin jt et al.,2006)。
4.gdnf是一个含有二硫键的同源二聚体分泌型蛋白质。其前蛋白是含有18个氨基酸残基的信号肽序列，蛋白加工后的成熟蛋白含有134个氨基酸残基，含有两个糖基化位点。具有生物活性的蛋白二聚体的分子量约为32～42kd，单体分子量为18～22kd，生物活性较低。由于gdnf在组织中含量较低，靠生物提取无法大量获得，所以通过基因工程方法获得具有生物学活性的gdnf显得尤其重要。蛋白表达包括原核表达系统和真核表达系统，原核表达系统虽然操作简单，可容纳基因片段大，生产成本低，但是真核表达系统能够更好的保持蛋白生物学活性，保留糖基化、二硫键等生物学特征。
5.另一神经营养因子，脑细胞源性神经营养因子(bdnf，下同)是由脑细胞产生、分泌的一种重要生物功能的神经细胞营养因子。bdnf对中枢和外围的多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作用，如促进某些神经群的生存和分化，调控神经突轴的轫力，并与海马的学习、记忆以及脊髓痛疼机制有关等。更重要的是，bdnf对多巴胺能神经元的生存和生长有重要作用。它具有阻止凋亡细胞的死亡，增加络氨酸水解酶阳性神经元的生存和此神经元纤维的生长。因此bdnf作为一种强效神经保护因子被认为治疗某些中枢神经系统疾病的一个好的候选因子。
6.由于上述两种神经营养因子在体内表达生成较少或缺少，因此，通过体外生产获得大量、活性高的神经营养因子是本领域医药领域的迫切需求。目前，利用重组表达实现体外生产神经营养因子已经有相关报道，例如利用大肠杆菌原核表达神经营养因子属于较为常用的方法(参见cn 107793485、cn 101775072a和cn 101775072a)，然而原核表达生产神
经营养因子存在需诱导表达、包涵体表达后需多步纯化，操作繁琐，而且表达量较低、活性低。目前也有采用真核表达系统重组表达神经营养因子的报道，例如，公开号为cn 1364812a、名称为人胶质细胞衍生的神经营养因子及其衍生物及应用的中国专利报道了采用表达载体psvt7将靶基因转染到cho细胞中，筛选表达gdnf的细胞株，然后通过肝素亲和层析、离子交换层析等进行纯化，不仅操作繁杂，而且产量较低。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达重组神经营养因子融合蛋白及制备方法，具有稳定高表达的特点，且分离纯化操作简便。
8.本发明的目的还在于提供重组神经营养因子融合蛋白，不仅接近天然蛋白的二聚体结构而且还具有较高生物活性，为后续制备相关药物提供了优质材料。
9.本发明提供了一种重组神经营养因子的融合基因，包括神经营养因子基因序列、分泌信号肽tpa基因序列和fc基因序列。
10.优选的，所述重组神经营养因子的融合基因为分泌信号肽tpa基因序列-fc基因序列-神经营养因子基因序列或分泌信号肽tpa基因序列-神经营养因子基因序列-fc基因序列。
11.优选的，所述神经营养因子为gdnf或bdnf；
12.所述gdnf的核苷酸序列如seq id no:6，所述bdnf的核苷酸序列如seq id no:8。
13.优选的，所述分泌信号肽tpa基因序列如seq id no:9，所述fc基因序列如seq id no:10。
14.优选的，重组gdnf的融合基因为tpa基因序列-fc基因序列-gdnf基因序列，核苷酸序列如seq id no:11所示；
15.重组bdnf的融合基因为tpa基因序列-bdnf基因序列-fc基因序列，核苷酸序列如seq id no:12所示。
16.本发明提供了一种重组表达载体，包含所述融合基因。
17.优选的，骨架载体为ppbml-pnce。
18.本发明提供了一种重组细胞，包含所述融合基因或所述重组表达载体。
19.优选的，所述重组细胞为hek293细胞。
20.本发明提供了一种制备所述重组神经营养因子融合蛋白的方法，包括以下步骤：
21.1)构建含所述融合基因的重组表达载体；
22.2)将步骤1)中所述重组表达载体转化至哺乳动物细胞中，从获得的重组细胞中筛选高表达细胞株进行培养，分离上清液，经纯化得到重组表达神经营养因子融合蛋白。
23.优选的，所述筛选高表达细胞株的方法包括用anti-fc elisa检测试剂盒检测融合蛋白表达量，选择一株蛋白表达量最高的细胞株进行培养。
24.优选的，所述纯化是用proteina柱进行纯化，用含igepal ca-630的loading buffer去除蛋白中的内毒素。
25.优选的，所述igepal ca-630的质量浓度为0.1～2％。
26.优选的，所述含igepal ca-630的loadingbuffer的流速为0.4～2ml/min。
27.本发明提供了一种所述重组神经营养因子的融合基因编码的融合蛋白，所述融合
蛋白为二聚体；所述融合蛋白包括神经营养因子和fc结构。
28.本发明提供了所述重组表达神经营养因子融合蛋白在促进神经元细胞生长和/或分化中的应用。
29.优选的，所述神经元包括多巴胺能神经元和/或运动神经元。
30.本发明提供了一种重组表达神经营养因子的方法，本发明将含有高表达启动子增强子的质粒为载体骨架，以神经营养因子、分泌信号肽tpa和fc形成的融合基因构建高表达重组载体，能够提高目标蛋白的胞外分泌效率，提高目标蛋白产量；将构建的重组载体转化至哺乳动物细胞表达系统中，由于载体中携带分泌信号肽tpa，目的蛋白可分泌至细胞外，直接收获培养上清即可进行纯化，简化了表达步骤且获得蛋白纯度较高；同时获得的目的蛋白在功能上比原核表达产物更接近天然产物；同时本发明fc结构同目标蛋白一同表达，获得的重组目的蛋白不仅能够形成天然的二聚体结构，并且具有较好的生物活性，能支持运动神经元和多巴胺能神经元等多种细胞的生长和分化以及相关疾病药物上的应用。在实验中产量一般以纳克级进行计算，而本发明提供的方法，每100ml培养上清可纯化制备出1～2mg具有高生物学活性、高纯度(95％以上)的gdnf/bdnf，因此本方法制备获得的gdnf/bdnf可以大量满足市场需求。
31.同时，本发明提供的方法在原料使用量一定的情况下，提高目的蛋白产量的同时，降低生产成本；本发明制备的重组蛋白为分泌型，存在于细胞培养液中，后续纯化，无需使用多种亲和层析柱，仅一步纯化即可获得较高纯度(95％以上)的目的蛋白，简化操作的同时节省了纯化工艺上时间成本和经济成本；
32.进一步的，本发明具体限定了所述神经营养因子包括gdnf或bdnf。实验证明，fc的插入位置对蛋白表达量和纯度有显著的影响，即构建tpa-fc-gdnf和tpa-bdnf-fc序列的细胞株蛋白表达量和纯度更高，可以达到临床级使用纯化要求；实验结果同样表明构建tpa-gdnf-fc和tpa-fc-bdnf的质粒制备的重组蛋白的纯度小于50％，且表达量相对较低。
33.进一步的，本发明提供的方法具体限定了纯化过程。目前关于重组神经营养因子融合蛋白的制备过程仅涉及表达和纯化步骤，没有去除内毒素。内毒素含量是重组蛋白的重要质量属性，也是能否应用于临床级产品生产的关键指标。重组蛋白内毒素含量偏高，对细胞有毒性作用，细胞生长不良，无法应用到科研和临床上。本发明在纯化过程中使用igepal ca-630去除内毒素，不仅有效降低目的蛋白内毒素含量(0.1eu/μg)，有利于神经生长和发育等方面的研究和应用；而且操作简单，便于放大，能够满足生产的要求。
附图说明
34.图1为本发明构建的高表达gdnf的质粒图谱；其中，图1-1为ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf的质粒图谱，图1-2为ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc的质粒图谱；
35.图2为本发明构建的高表达bdnf的质粒图谱；其中，图2-1为质粒ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc的质粒图谱，图2-2为质粒ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf的质粒图谱；
36.图3为本发明筛选高表达细胞株的单克隆及扩大后细胞生长状态；
37.图4为本发明ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf构建的阳性细胞株分泌的gdnf的sds-page分析结果(还原和非还原表示分别用与不用还原剂处理的洗脱样品)；
38.图5为本发明ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的gdnf的sds-page
分析结果(还原和非还原表示分别用与不用还原剂处理的洗脱样品)；
39.图6为本发明获得gdnf的westernblot分析结果；
40.图7为本发明ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf和ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc获得bdnf的sds-page分析结果(还原和非还原表示分别用与不用还原剂处理的洗脱样品)，其中左图为ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf表达的bdnf的sds-page分析结果，右图为ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc表达的bdnf的sds-page分析结果；
41.图8为本发明获得bdnf的westernblot分析结果；
42.图9为本发明获得的gdnf用c6细胞检测生物学活性ec
50
的结果(stemcell和r&d分别是商品化gdnf的检测结果)；
43.图10为本发明获得的bdnf用c6细胞检测生物学活性ec
50
的结果；
44.图11为abcam公司的商品化bdnf生物学活性ec
50
的检测结果；
45.图12为本发明获得的gdnf或bdnf对运动神经元和多巴胺能神经元的成熟没有不良影响，其中图12a是使用自产和r&d gdnf或bdnf培养的成熟运动神经元状态和特异性marker表达情况，图12b是使用自产和r&d gdnf或bdnf培养的成熟多巴胺能神经元状态和特异性marker表达情况。
具体实施方式
46.本发明提供了一种重组神经营养因子的融合基因，包括神经营养因子基因序列、分泌信号肽tpa基因序列和fc基因序列。
47.在本发明中，所述重组神经营养因子的融合基因优选为分泌信号肽tpa基因序列-fc基因序列-神经营养因子基因序列或分泌信号肽tpa基因序列-神经营养因子基因序列-fc基因序列。所述分泌信号肽tpa的氨基酸序列如seq id no:3
48.(mdamkrglccvlllcgavfvsps)所示，核苷酸序列如seq id no:9所示(atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagc)。所述分泌信号肽tpa的添加较未插入tpa的融合蛋白相比，显著提高gdnf或bdnf表达量。所述fc的氨基酸序列如seq id no:4(pkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk)所示，核苷酸序列如seq id no:10所示(ccaaagagctgcgacaagacacacacctgcccaccatgtccagcacctgagctgctgggaggaccaagcgtgttcctgtttcctccaaagcccaaggatacactgatgatctctaggacccctgaggtgacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacccagaggtgaagtttaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagtacaactccacctatcgcgtggtgtctgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaggagtataagtgtaaggtgtccaataaggccctgccagcccccatcgagaagaccatctctaaggcaaagggacagccaagggagcctcaggtgtacacactgcccccttccagagacgagctgaccaagaaccaggtgtctctgacatgcctggtgaagggcttctatccatccgatatcgccgtggagtgggagtctaatggccagcccgagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggctctttctttctgtattccaagctgaccgtggacaagtctcggtggcagcagggcaacgtgtttagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacacagaagtctctgagcctgtcccccggcaag)。fc结构的插入显著提高了gdnf或bdnf二聚体的形成效率，而且简化了纯化步骤，提高了蛋白纯度，并具有
较好的生物学活性。
49.在本发明中，所述神经营养因子优选包括gdnf或bdnf。所述gdnf的氨基酸序列如seq id no:5(mdamkrglccvlllcgavfvspspkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgktrmspdkqmavlprrernrqaaaanpensrgkgrrgqrgknrgcvltaihlnvtdlglgyetkeelifrycsgscdaaettydkilknlsrnrrlvsdkvgqaccrpiafdddlsflddnlvyhilrkhsakrcgci)所示，核苷酸序列如seq id no:6(atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagcccaaagagctgcgacaagacacacacctgcccaccatgtccagcacctgagctgctgggaggaccaagcgtgttcctgtttcctccaaagcccaaggatacactgatgatctctaggacccctgaggtgacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacccagaggtgaagtttaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagtacaactccacctatcgcgtggtgtctgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaggagtataagtgtaaggtgtccaataaggccctgccagcccccatcgagaagaccatctctaaggcaaagggacagccaagggagcctcaggtgtacacactgcccccttccagagacgagctgaccaagaaccaggtgtctctgacatgcctggtgaagggcttctatccatccgatatcgccgtggagtgggagtctaatggccagcccgagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggctctttctttctgtattccaagctgaccgtggacaagtctcggtggcagcagggcaacgtgtttagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacacagaagtctctgagcctgtcccccggcaagacgcgtatgagccccgataagcagatggccgtgctgcctcggagagagaggaacaggcaggcagcagcagcaaacccagagaattccaggggcaagggcaggcgcggacagaggggcaagaacagaggctgcgtgctgaccgccatccacctgaatgtgacagatctgggcctgggctacgagaccaaggaggagctgatcttccggtattgcagcggctcctgtgatgccgccgagaccacatacgacaagatcctgaagaacctgtctcggaatcggagactggtgagcgacaaagtgggccaggcctgctgtagacccatcgccttcgacgatgacctgtcctttctggatgacaatctggtgtatcacatcctgaggaagcactctgccaagcggtgcggctgtatctga)所示。bdnf的氨基酸序列如seq id no:7(mhsdparrgelsvcdsisewvtaadkktavdmsggtvtvlekvpvskgqlkqyfyetkcnpmgytkegcrgidkrhwnsqcrttqsyvraltmdskkrigwrfiridtscvctltikrgrtrpkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk)所示，核苷酸序列如seq id no:8(atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagcatgcactccgacccagcaaggagaggagagctgagcgtgtgcgatagcatctccgagtgggtgaccgccgccgacaagaagacagccgtggatatgagcggcggcaccgtgacagtgctggagaaggtgcccgtgtccaagggccagctgaagcagtacttctatgagaccaagtgcaaccctatgggctacacaaaggagggctgtaggggcatcgacaagcgccactggaattctcagtgtcggaccacacagagctatgtgcgggccctgaccatggactctaagaagagaatcggctggcggtttatcagaatcgatacatcctgcgtgtgcaccctgacaatcaagaggggccgcacgcgtccaaagagctgcgacaagacacacacctgcccaccatgtccagcacctgagctgctgggaggaccaagcgtgttcctgtttcctccaaagcccaaggatacactgatgatctctaggacccctgaggtgacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacccagaggtgaagtttaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagcccagggaggagcagtacaactccacctatcgcgtggtgtctgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaggagtataagtgtaaggtgtccaataaggccctgccagcccccatcg
fc-bdnf构建质粒在细胞表达中，获得的gdnf或bdnf二聚体量极少。因此，ppbml-pnce载体和由神经营养因子、tpa和fc形成的融合基因在hek293细胞能够确保正确表达并获得高生物学活性的蛋白。
59.得到重组质粒后，本发明将所述重组质粒转化至哺乳动物细胞中，筛选高表达细胞株进行培养，分离上清液，经纯化得到重组表达神经营养因子。
60.本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可，例如电转化。转化后，优选阳性克隆的筛选。所述筛选方法优选为采用g418进行筛选。所述筛选高表达细胞株的方法优选包括用anti-fc elisa检测试剂盒检测融合蛋白表达量，选择一株蛋白表达量最高的细胞株进行培养。分离上清液的方法优选离心。所述离心的条件优选200g，离心5min。收集上清液后，洗涤蛋白。洗涤后的蛋白进行纯化。
61.在本发明中，所述纯化优选是用proteina柱进行纯化，用含igepal ca-630的loadingbuffer去除蛋白中的内毒素。所述igepal ca-630的浓度优选为0.1～2％，更优选为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.5％、2％，最优选为1％。去内毒素的流速可以是0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min、2ml/min，但不限于此，流速为0.4～2ml/min，更优选为1ml/min。较其他试剂(c7bzo、triton x 114、异丙醇、1,2-己二醇、asb-14、chaps)比，igepal ca-630去除内毒素的效果最佳。
62.在本发明中所述的重组融合蛋白gdnf/bdnf、重组蛋白gdnf/bdnf、重组gndf/bdnf蛋白、二聚体gdnf/二聚体bdnf指代均是对应于指本发明方法制备的重组神经营养因子融合蛋白(重组gdnf/bdnf融合蛋白)。
63.本发明中如“gdnf/bdnf”表示gdnf或bdnf，可以用于基因或蛋白上的表述。
64.鉴于制备的重组表达神经营养因子具有较高的生物活性，本发明提供了所述重组表达神经营养因子在促进神经元细胞生长和/或分化中的应用。
65.在本发明中，所述神经元优选包括多巴胺神经元和/或运动神经元。
66.下面结合实施例对本发明提供的一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
67.蛋白纯化过程中缓冲液试剂成分如表1所示：
68.表1缓冲液试剂成分
69.序号成分工作浓度1glycerol(甘油)10～60％2mgso41～2mm3k2hpo450～72mm4kh2po410～17mm5氨苄青霉素20～100μg/ml6蛋白上样缓冲液6
ⅹ
7丙烯酰胺10～30％8sds8～12％9过硫酸铵5～10％
10temed0.04～0.1％12蛋白marker12～180kda13tris-hcl5～200mm14nacl20～500mm15igepalca-6300.1～5％16glycine20～500mm17proteina1～5ml18g418100～1000μg/ml19hcl15～30％20naoh0.1～0.5m21乙醇20％22乙酸钠10～50mm
70.表2 loading buffer试剂成分
71.序号成分工作浓度1tris-hcl5～200mm2nacl20～500mm3hcl15～30％
72.表3 elute buffer试剂成分
73.序号成分工作浓度1glycine20～500mm2nacl20～500mm
74.表4 neutralize buffer试剂成分
75.序号成分工作浓度1tris-hcl5～200mm2hcl15～30％
76.实施例1
77.高表达质粒ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf和ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc的构建方法
78.1.1质粒酶切
79.取已有的ppbml-pnce质粒和人工合成的tpa-fc-gdnf或tpa-bdnf-fc融合蛋白序列(南京金斯瑞公司合成)分别在37℃酶切2h，酶切体系如下表5和表6所示，其中内切酶包括xba i(厂家：neb，货号：r0145l)和bamhi(厂家：neb，货号：r3131l)，cutsmart是内切酶试剂盒中的一种成分。
80.表5 ppbml-pnce质粒酶切体系
81.组分体积xbai3μlbamhi3μlppbml-pnce10μlcutsmart3μl
ddh2o11μl
82.表6融合蛋白序列酶切体系
83.组分体积xbai5μlbamhi5μltpa-fc-gdnf或tpa-bdnf-fc30μlcutsmart5μlddh2o5μl
84.1.2dna片段回收并连接
85.用dna纯化回收试剂盒回收，具体操作参考试剂盒说明书(厂家：天根生物，货号：dp209-03)。dna回收后进行连接(t4 dna连接酶，厂家：neb，货号：m0202v)，连接体系如表7所示。连接程序是22℃连接60min。
86.表7连接体系
87.组分体积ppbml-pnc回收片段3μltpa-fc-gdnf回收片段或tpa-bdnf-fc回收片段14μlt4dna连接酶1μlt4dna连接酶缓冲buffer(10
×
)2μl
88.1.3连接产物转化及质粒验证
89.转化体系：将连接产物加入trans5α感受态细胞(厂家：北京全式金，货号：cd201-02)中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min，加入500ul lb培养基，37℃250rpm震荡培养箱培养30min；12000rpm/min，离心1min，留取100μl上清，重悬菌体并涂布于氨苄抗性的lb固体平板，37℃生化培养箱培养16～18h。次日挑取单克隆，37℃，250rpm震荡培养箱培养10h，质粒小提试剂盒提取质粒，具体质粒提取步骤参考试剂盒说明书(厂家：天根生物，货号：dp103-03)。xba i和bamhi双酶切验证，并对质粒测序。即得到构建成功的ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf(图1-1)或ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc质粒(图2-1)。
90.实施例2
91.高表达细胞株的构建和筛选
92.1.电转及阳性克隆筛选
93.1.1质粒电转
94.选择稳定生长的hek293细胞(购自珠海凯瑞生物科技有限公司)，活率大于95％，取1
×
106细胞，离心去除上清获得细胞。用100μl电转液buffer 10重悬细胞，分别加入1μg ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf或ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc和pehypbase质粒，混匀，同时设空白细胞对照组(无质粒)，转移到电转杯中，用lonza电转仪电转(调成hek293 atcc模式)，电转完毕后用dmem 10％fbs培养基重悬细胞，铺在6孔板中，置于37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
95.1.2阳性克隆筛选
96.贴壁生长24h后，用solase细胞消化液消化贴壁的hek293细胞，用dmem 10％fbs重悬细胞，手动计数后调整细胞密度，并加入800μg/ml g418，铺至24孔板中，2
×
104cells/
孔，1ml/孔，每两天等体积换液。g418药杀10天，可见阳性克隆形成。弃除g418，加入dmem 10％fbs培养基继续培养，待长满50％以上，冻存3～5支细胞(备注：gdnf阳性克隆细胞或bdnf阳性克隆细胞)，用于后续试验。
97.实施例3
98.重组质粒ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc(谱图见图1-2)和ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf(谱图见图2-2)的构建方法
99.按照实施例1的方法将ppbml-pnce质粒和人工合成的tpa-gdnf-fc或tpa-fc-bdnf融合蛋白序列构建重组载体。按照实施例2的方法获得阳性克隆。
100.实施例4
101.高表达细胞株的筛选
102.g418筛选实施例2和3获得的阳性细胞群，待长满50％以上，用solase细胞消化液消化成单细胞，用dmem 10％fbs培养基重悬，vi-cell计数，利用有限稀释法，稀释至最低生长条件的细胞数，100μl/孔接种到96孔板，置于37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。培养12天，选取汇合度达到50％以上的单克隆，转移至24孔板，用dmem 10％fbs培养基扩大培养。
103.单克隆的生长情况以及单克隆转移到6孔板扩大培养后悬浮培养的细胞形态如图3所示。
104.24孔板培养5天，再扩大到6孔板，用无血清kop293培养基(购自珠海凯瑞生物科技有限公司)继续扩大培养。选择细胞密度生长到80％，状态较好的细胞株，vi-cell计数，调整细胞密度1
×
106cells/ml，4ml/孔，接种到6孔板悬浮培养5天，分别收取0.5ml细胞上清液，用anti-fc elisa检测试剂盒检测蛋白表达情况。根据检测结果，分别从ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf、ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc、ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc和ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf构建的阳性细胞中筛选gdnf或bdnf表达量最高的一株细胞，继续扩大培养冻存保种。elisa检测结果如表8所示。
105.表8 elisa检测结果
[0106][0107][0108]
表8中，不同数值代表elisa检测水平，吸光值越高说明目的蛋白表达越高。其中tpa-gdnf-fc和tpa-fc-bdnf所有的克隆表达都较低；tpa-fc-gdnf克隆1、2、5、7表达较高，其中tpa-fc-gdnf克隆1是本发明筛选获得的ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf高表达细胞株；tpa-bdnf-fc克隆1、3、6表达较高，其中tpa-bdnf-fc克隆6是本发明筛选获得的ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc高表达细胞株。
[0109]
实施例5
[0110]
将实施例4筛选的高表达细胞株接种及重组蛋白分离纯化
[0111]
1.粗蛋白分离
[0112]
选择tpa-fc-gdnf克隆1和tpa-bdnf-fc克隆6作为gdnf或bdnf高表达细胞株，待细
胞密度达到6～8
×
106cells/ml，按如下条件操作：接种密度1
×
106cells/ml，250mlkop293培养基、1l摇瓶，水平摇床转速120rpm。置于37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
[0113]
培养4～5天，细胞密度达到6～8
×
106cells/ml停止培养，在200g下离心5min收集上清。将收集后的上清等份装入透析袋中(透析袋预先用水煮10min)，每个透析袋约50ml左右，放入5倍体积loadingbuffer中透析，磁力搅拌器透析，400rpm、室温、2h。透析后以12000g、室温、离心10min的条件收集上清液，用于亲和层析。如果收集获得的培养上清体积较大，可考虑使用超滤浓缩装置，具体操作如下：细胞密度达到6～8
×
106cells/ml停止培养，200g，离心5min收集上清；使用超滤浓缩装置将收集后的上清浓缩20倍，然后加入20倍体积的loadingbuffer混匀，再使用超滤浓缩装置浓缩20倍，浓缩后产物直接用于亲和层析。
[0114]
2.蛋白纯化
[0115]
用loadingbuffer(100mm tris-hcl，150mmnacl，ph＝7.5)预先平衡proteina柱，约30ml、2ml/min。处理后的细胞上清液缓慢加入proteina柱中，流速控制在0.4ml/min。上样结束后，加loadingbuffer去除杂蛋白，直到od
280
《0.02mg/ml为止；加含有igepal ca-630的loadingbuffer去除内毒素，体积约为60ml，流速为1ml/min；加loadingbuffer去除igepal ca-630，直到od
280
《0.02mg/ml为止。清洗结束后，加入蛋白洗脱液elutebuffer(100mm glycine，150mmnacl，ph＝3)彻底洗脱gdnf/bdnf蛋白，1.5ml离心管分管收集蛋白溶液，1ml/管，4度冰箱放置过夜。24h后按1:1的比例加入neutralizebuffer(100mm tris-hcl，ph＝8.0)中和蛋白的ph。洗脱后获得gdnf或bdnf进行sds-page分析。
[0116]
上述loadingbuffer的nacl浓度太高会导致目的蛋白不结合proteina柱，浓度太低会导致杂蛋白、小分子等杂质去除不干净，影响目的蛋白纯度。loadingbuffer中的nacl浓度在其他实施例可以是20mm、50mm、100mm、150mm、200mm、300mm、500mm，但不限于此，nacl浓度为20～500mm，优先选择150mm。透析后离心10min收集上清液。
[0117]
蛋白上样时流速可以是0.2ml/min、0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1ml/min、2ml/min，但不限于此，流速为0.2～2ml/min，优先选择0.4ml/min。上样结束后，加loadingbuffer去除杂蛋白。
[0118]
上述柱上去除内毒素，加含有igepal ca-630的loadingbuffer去除内毒素，igepal ca-630的浓度可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.5％、2％，但不限于此，ca-630的浓度为0.1～2％，本发明优先选择1％。去内毒素的流速可以是0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min、2ml/min，但不限于此，流速为0.4～2ml/min，优先选择1ml/min。
[0119]
由ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf构建的阳性细胞株分泌的重组gdnf的sds-page电泳结果如图4所示。由图4可知，还原sds是以单体形式存在；非还原sds 95％是以二聚体形式存在，没有单体形式的蛋白，只有少量蛋白形成高聚体(《5％)。说明纯化的蛋白95％都是以有活性的二聚体形式存在。经浓度测定，每100ml培养上清可纯化制备出1～2mg具有高生物学活性的gdnf。而ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的重组gdnf的sds-page电泳结果如图5所示。表达质粒ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc表达的gdnf，不仅收获二聚体量极少，且纯度较低。经浓度测定，每100ml培养上清纯化获得的gdnf低于0.1mg。ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf构建的阳性细胞株分泌的重组gdnf的western blot鉴定结果如图6所示。
[0120]
ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的重组bdnf的sds-page电泳结果和ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf构建的阳性细胞株分泌的重组gdnf的sds-page电泳结果如图7所示。每100ml培养上清中ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的重组bdnf为1～2mg，而ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf构建的阳性细胞株分泌的重组bdnf低于0.1mg。ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的重组bdnf的表达量明显高于ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf构建的阳性细胞株的重组蛋白表达量。重组bdnf的westernblot鉴定结果如图8所示。
[0121]
实施例6
[0122]
蛋白生物活性检测
[0123]
选择生长良好的c6细胞，solase细胞消化液消化，vi-cell计数，调节细胞密度至5x103cells/ml，按照500cells/孔、100μl/孔接种到96孔板。将实施例6生产获得的gdnf/bdnf蛋白分别添加到各孔，设置蛋白终浓度0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，每组3个重复。置于37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱内培养72h。10μl/孔添加cck-8solution，轻微振荡混匀，置于37℃，5％co2浓度，饱和湿度的培养箱内孵育1h，酶标仪检测od450吸光值，excel折线图计算gdnf或bdnf蛋白ec
50
值。
[0124]
ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf构建的阳性细胞株分泌的重组gdnf蛋白生物学活性检测结果如图9所示。结果显示，本发明的gdnf ec
50
值为0.01～0.02μg/ml，购买stemcell公司的重组gdnf蛋白(货号：78058)，来源于大肠杆菌原核表达系统，其ec
50
值为3μg/ml，本发明的gdnf ec
50
值显著小于stemcell公司的gdnf，表明本发明的gdnf生物学活性显著高于stemcell公司的gdnf；购买r&d公司的重组gdnf蛋白(货号：212-gd)，来源于小鼠骨髓瘤细胞表达系统，其ec
50
值为0.01μg/ml左右，与本发明差异不显著，本发明100ml可纯化1～2mg gdnf蛋白，鉴于r&d公司gdnf的价格，本发明在成本上还是比其有更明显的优势。
[0125]
ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的重组bdnf蛋白生物学活性检测结果如图10所示，购买abcam公司的重组bdnf蛋白(货号：ab206642)来源于大肠杆菌原核表达系统，其生物学活性检测结果如图11所示。结果显示，本发明的bdnf ec
50
值为0.01～0.02μg/ml，abcam公司的重组bdnf ec
50
值为0.5～0.8μg/ml，本发明的bdnf ec
50
值显著小于abcam公司的重组bdnf，表明本发明的bdnf生物学活性显著高于abcam公司的重组bdnf；同时本发明100ml可纯化1～2mg bdnf蛋白，鉴于abcam公司重组bdnf的价格，本发明在成本上同样比其有更明显的优势。
[0126]
ppbml-pnc-tpa-gdnf-fc和ppbml-pnc-tpa-fc-bdnf构建的阳性细胞株分泌的gdnf蛋白和bdnf蛋白生物学活性检测结果显示：同ppbml-pnc-tpa-fc-gdnf构建的阳性细胞株分泌的gdnf蛋白和ppbml-pnc-tpa-bdnf-fc构建的阳性细胞株分泌的bdnf蛋白活性相当，差别不大。
[0127]
实施例6
[0128]
蛋白生物功能检测
[0129]
首先用r&d和自产gdnf或bdnf分别配制运动神经元和多巴胺能神经元分化试剂盒，用于验证不同方法获得gdnf或bdnf的生物功能。分化步骤如下：选择生长良好的hpsc细胞，solase细胞消化液消化，vi-cell计数，调节细胞密度，按照5
×
105cells/孔、2ml/孔接种到6孔板，在培养不同阶段选择不同的分化培养基，具体分化步骤详见说明书(试剂盒参
照安徽中盛溯源生物科技有限公司配制)。等到细胞生长到成熟阶段，拍照观察细胞形态，记录细胞特征。拍照结束之后，solase细胞消化液消化，离心收集细胞沉淀，用qpcr检测试剂盒(厂家：北京全式金，货号：aq131-04)检测运动神经元和多巴胺能神经元特异性marker的表达情况。
[0130]
细胞图片及qpcr检测结果如图12所示，其中图12a表示运动神经元细胞形态及标志性marker表达情况，图12b图表示多巴胺能神经元细胞形态及标志性marker表达情况。结果显示，r&d与本发明gdnf分化培养获得的运动神经元及多巴胺能神经元在细胞形态上无显著差异，都表现出各自特有的纤维状结构及细胞形态；在标志性marker表达上也无显著差异，都表达各自特有的标志性marker，表达量较高且无差异。在实验分化过程中r&d gdnf使用浓度10ng/ml，本发明gdnf使用浓度8ng/ml，由结果可得到，更低的使用量达到了同样的效果，本技术重组表达的gdnf的活性有明显的优势。
[0131]
有上述实施例结果可知，本发明通过构建高表达载体，使用细胞表达系统，筛选高表达细胞株，获得了具有高生物学活性的二聚体gdnf或bdnf。不仅操作简单，产量高，而且纯化简单省时，获得的二聚体gdnf或bdnf纯度高、内毒素符合临床使用要求，降低生产成本，解决了市面上重组gdnf或bdnf表达量低、价格昂贵、生物学活性低等缺点，有利于gdnf或bdnf蛋白大规模生产、工艺放大及运动神经元等相关细胞和疾病上的应用。
[0132]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。