一种电气石颗粒复合水凝胶及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料领域，具体是一种电气石颗粒复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
：：2.人类在社会活动的过程中，皮肤不可避免地会受到脱水、机械、化学损伤和微生物感染等创伤的伤害。当皮肤受损后，胶原纤维的组织结构就会被破坏，需要进行修复。在自身皮肤修复之前，性能良好的伤口敷料可以用来暂时替代皮肤，为创伤面提供一个良好的环境，促进伤口愈合。理想的伤口敷料应当具有以下功能：(1)良好的透气、保湿性；(2)易于粘附创伤组织；(3)柔软并具有一定的力学强度；(4)止血、抗菌效果显著；(5)良好的生物相容性。3.通过氢键、共价键和静电等作用交联而成的水凝胶具有三维网络结构，可以在水中溶胀而不失去结构的完整性，其柔软性、透气性和吸液保液性良好，可以吸收创伤组织面的渗出组织液并保持伤口周围环境的湿润；并且使用方便，伤口愈合后易于与组织面脱离，减轻患者疼痛。壳聚糖无毒、无抗原、无溶血效应，具有良好的粘附性和生物相容性，同时具备止血凝血、抗菌消炎等多种功能。聚乙烯醇不仅具有优异的力学性能，而且其生物可降解性、热稳定性和生物相容性显著。将壳聚糖与聚乙烯醇共混制备的壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶能结合各自的优点，在伤口敷料领域应用广泛。4.壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶中的氨基带正电荷，会通过静电作用促进带负电荷的红细胞粘附，诱导血小板的聚集和活化，从而促进凝血。但是内源性凝血需要负电荷激活，水凝胶的止血效率还有提升的空间。壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶虽然具有主动抗菌的性能，但是抗菌效果十分有限。目前大多数水凝胶在制备的过程中会引入化学交联剂，交联剂具有一定的毒性会影响水凝胶的生物相容性。申请号为202111178160.1的文献公布了一种改性壳聚糖-聚乙烯醇复合抗菌水凝胶及其制备方法，该复合水凝胶以二异氰酸酯作为交联剂，水凝胶具有良好的机械性能和抗菌效果。文献《chenhl,chengjw,ranlx,etal.aninjectableself-healinghydrogelwithadhesiveandantibacterialpropertieseffectivelypromoteswoundhealing[j].carbohydratepolymers,2018,201:522-531.》中通过构建壳聚糖和氧化魔芋糖苷之间形成席夫碱键，制备了一种可注射型水凝胶材料，该水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出显著的抗菌作用，并且动物实验表明该水凝胶材料具有促进伤口愈合的作用。上述研究制备的水凝胶均采用化学交联的方法实现分子链之间的交联，但是化学交联的方式是不可逆的，而且化学交联剂的引入会对水凝胶的生物相容性造成影响。技术实现要素：[0005]针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是，提供一种电气石颗粒复合水凝胶及其制备方法和应用。[0006]本发明解决所述方法技术问题的技术方案是，提供一种电气石颗粒复合水凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：[0007](1)配置壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液；[0008](2)将壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液混合，搅拌均匀得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；[0009](3)将电气石颗粒加入到去离子水和冰乙酸的混合溶剂中，经过超声处理使电气石颗粒均匀分散于混合溶剂中，制备电气石颗粒悬浊液；[0010](4)在超声、搅拌处理的同时，将电气石颗粒悬浊液逐滴加入到壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，然后再继续超声、搅拌处理使电气石颗粒分散均匀，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液；[0011](5)将电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液冷冻后，再解冻，完成一次冻融；共重复冻融若干次，得到复合物；[0012](6)将复合物置于无水乙醇中，对复合物进行脱水干燥，得到电气石颗粒复合水凝胶。[0013]本发明解决所述复合水凝胶技术问题的技术方案是，提供一种所述方法制备得到的电气石颗粒复合水凝胶。[0014]本发明解决所述应用技术问题的技术方案是，提供一种所述电气石颗粒复合水凝胶的应用，其特征在于，将该电气石颗粒复合水凝胶应用于伤口敷料或人造软骨。[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果在于：[0016](1)本发明将电气石颗粒作为功能性添加剂，引入到壳聚糖和聚乙烯醇组成的水凝胶基质中，结合反复冻融的方法，通过电气石颗粒增强物理交联，并调控水凝胶表面荷电分布、抗菌和刺激细胞增殖的功能，无需引入化学交联剂即可制备出具有三维网络结构的生物相容性良好、体外凝血和抗菌效果显著的电气石/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶，可作为伤口敷料使用。[0017](2)本发明采用冻融法进行制备，制备过程简单、成本低、生产效率高、可实现大批量生产。[0018](3)本发明提供的复合水凝胶不需要引入化学交联剂，不含有毒或刺激性物质，具有优秀的生物相容性；通过引入电气石颗粒，增加了水凝胶激活内源性凝血的功能，提高了水凝胶的体外凝血性能；电气石颗粒的引入可以提高水凝胶的抗菌率；而且使用方便、成本低，可作为伤口敷料使用。[0019](4)本发明提供的复合水凝胶为三维网络结构、结构更加稳定。[0020](5)本发明通过引入电气石颗粒提高了水凝胶的溶胀性能，水凝胶具有良好的溶胀性能，达到溶胀平衡后的溶胀率为181％。附图说明[0021]图1是本发明实施例1制得的复合水凝胶的扫描电镜图；[0022]图2是本发明实施例2制得的复合水凝胶的扫描电镜图；[0023]图3是本发明实施例3制得的复合水凝胶的扫描电镜图；[0024]图4是本发明对比例1制得的水凝胶的扫描电镜图；[0025]图5是本发明实施例1-3和对比例1制得的水凝胶在pbs溶液随时间变化的溶胀曲线。具体实施方式[0026]下面给出本发明的具体实施例。具体实施例仅用于进一步详细说明本发明，不限制本发明权利要求的保护范围。[0027]本发明提供了一种电气石颗粒复合水凝胶的制备方法(简称方法)，其特征在于，该方法包括以下步骤：[0028](1)配置壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液：[0029]将壳聚糖溶解于去离子水和冰乙酸的混合溶剂中，搅拌均匀后得到壳聚糖溶液；[0030]将聚乙烯醇和去离子水混合，搅拌均匀后得到聚乙烯醇溶液；[0031]优选地，步骤(1)中，壳聚糖溶液的浓度为0.01～0.05g/ml，配置壳聚糖溶液的温度为20～30℃，搅拌时间为4～6h。[0032]优选地，步骤(1)中，壳聚糖的分子量为50～150×104；[0033]优选地，步骤(1)中，去离子水与冰乙酸的体积比为1～30:1～5(优选24:1)。[0034]优选地，步骤(1)中，聚乙烯醇溶液的浓度为0.05～0.15g/ml，配置聚乙烯醇溶液的温度为85～100℃，搅拌时间为4～6h。[0035](2)配置壳聚糖/聚乙烯醇溶液：将壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液混合，搅拌均匀得到均相的壳聚糖/聚乙烯醇溶液；[0036]优选地，步骤(2)中，壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液的体积比为1～5:1～5(优选1:1)，配置壳聚糖/聚乙烯醇溶液的温度为常温(即20～30℃)，搅拌时间为4～6h。[0037](3)配置电气石颗粒悬浊液：将电气石颗粒加入到去离子水和冰乙酸的混合溶剂中，经过超声处理使电气石颗粒均匀分散于混合溶剂中，制备电气石颗粒悬浊液；[0038]优选地，步骤(3)中，电气石颗粒的粒径为10nm～5μm(优选10nm～100nm)。[0039]优选地，步骤(3)中，电气石颗粒的质量为壳聚糖和聚乙烯醇的质量之和的1～20％(优选1～10％)。[0040]优选地，步骤(3)中，超声工艺是在10～100khz(优选20～25khz)的频率、20～2000w(优选50～250w)的功率下间隙超声15～35min；间隙超声中，每一次的超声时长为0～10s，相邻两次超声的时间间隔为0～10s。[0041](4)在超声、搅拌处理的同时，将电气石颗粒悬浊液逐滴加入到壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，然后再继续超声、搅拌处理使电气石颗粒分散均匀，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液；[0042]优选地，步骤(4)中，超声工艺是在10～100khz(优选20～25khz)的频率、20～2000w(优选50～250w)的功率下间隙超声30～60min，并在超声的同时持续磁力搅拌；间隙超声中，每一次的超声时长为0～10s，相邻两次超声的时间间隔为0～10s。[0043](5)将电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液冷冻后，再解冻，完成一次冻融；共重复冻融若干次，得到复合物；[0044]优选地，步骤(5)中，将电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液在-15℃～-30℃(即零下15℃～零下30℃)(优选-20℃)的环境中冷冻20～24h后，再在常温(即20～30℃)下解冻2～4h，完成一次冻融；共重复冻融3～5次。[0045](6)将复合物置于无水乙醇中，对复合物进行脱水干燥，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶即电气石颗粒复合水凝胶。[0046]本发明同时提供了一种所述方法制备得到的电气石颗粒复合水凝胶。[0047]本发明同时提供了一种所述电气石颗粒复合水凝胶的应用，其特征在于，将该电气石颗粒复合水凝胶应用于伤口敷料或人造软骨。[0048]性能测试：[0049](1)溶胀性能：称取干燥后复合水凝胶(1×1×0.2cm3)的重量，记为wd。将复合水凝胶浸入到盛有pbs溶液的烧杯中，然后把烧杯置于37℃恒温箱中，在特定的时间间隔后，用滤纸吸去溶胀后复合水凝胶表面残留的pbs溶液，再次称量记为ws。复合水凝胶溶胀率(sr)的计算公式如下：[0050][0051]其中，ws为复合水凝胶的湿重，wd为复合水凝胶的干重。每组实验重复3次，实验结果是3次测量的平均值和标准偏差。[0052](2)溶血性能：取适量的抗凝兔血，用pbs溶液以4:5的体积比稀释。首先，将复合水凝胶(0.001g)浸入10mlpbs溶液中，在37℃培养箱中孵育30min，并将不加样品的10mlpbs溶液和10ml去离子水分别设置为阴性和阳性对照。然后，在复合水凝胶、阴性对照组和阳性对照组中分别加入0.2ml稀释后的兔全血，置于37℃培养箱中再孵育1h。最后，将所有样品以3000r/min离心5min，测量在545nm波长处上清液的吸光度值。复合水凝胶溶血率(hr)的计算公式如下：[0053][0054]其中，abssample、absnegativecontrol、abspositivecontrol分别为复合水凝胶、阴性对照和阳性对照的吸光度值。每组实验重复6次，实验结果是6次测量的平均值和标准偏差。[0055](3)体外凝血性能：体外凝血性能通过体外凝血指数(bci)进行评价。首先，将复合水凝胶在37℃下干燥5min。然后，吸取100μl含有抗凝剂的新鲜家兔全血加入到每个复合敷料中，快速加入10μl、0.2mcacl2溶液，并在37℃下孵育5min。在没有复合水凝胶的玻璃烧杯中加入100μl抗凝全血和10μl、0.2mcacl2溶液，作为阴性对照。5min后，在不搅动凝结血液的情况下，缓慢滴加25ml去离子水用以回收未凝结的红细胞，在37℃以30r/min振荡孵育10min。最后，吸取烧杯中上清液，测量每个复合水凝胶在542nm波长处的吸光度。复合水凝胶bci的计算公式如下：[0056][0057]其中，is为复合水凝胶的吸光度，ic为对照组的吸光度。每组实验重复6次，实验结果是6次测量的平均值和标准偏差。[0058](4)抗菌性能：采用光密度法来评估复合水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效率。步骤包括：在2.5glb肉汤培养基中加入100ml蒸馏水，混匀后将液体营养培养基分装到锥形烧瓶中，在高温高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，静置至室温。将复合水凝胶转移至无菌手术台上进行紫外杀菌60min，将灭菌后的复合水凝胶(0.4g)放入到细菌培养管中。用ph＝7.2的lb液体培养基将菌液稀释到106cfu/ml浓度，吸取4ml稀释菌液加入到细菌培养管中，每组设置3个平行样。所有样品放在恒温摇床上，在37℃、120r/min的条件下孵育8h。8h后测定在600nm波长处的吸光度。复合水凝胶抗菌率的计算公式如下：[0059][0060]其中，ac为未加复合水凝胶培养的菌悬液的吸光度，as为加入复合水凝胶培养的菌悬液的吸光度。[0061](5)细胞毒性：复合水凝胶材料用紫外线照射灭菌30min，将灭菌好的复合水凝胶置于dmem培养液中，在培养箱(37℃、5％co2)内放置24h，制备材料浸提原液。随后，取一定体积的浸提原液使用dmem培养液稀释，制备浸提原液浓度为50％的浸提稀释液。将培养好的l929细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板(100μl/孔，细胞密度为1×105/ml)，将接种后的96孔培养板置于培养箱内继续培养24h。24h后倒弃培养基中的稀释液，用pbs液清洗3次后，换用50％浸提稀释液，每组设置3个平行样，阴性对照组为dmem培养液。换用完成后将96孔培养板在培养箱内培养24h，24h后每孔加入质量浓度为0.5％的mtt溶液20μl，继续培养4h。4h后吸去各孔内培养液，用pbs冲洗每个孔后，加入dmso溶液150μl，室温下振荡培养板10min后置于37℃培养箱，15min后取出，测量在570nm波长处的吸光度。[0062]实施例1[0063](1)将0.2g的壳聚糖(分子量为120×104)加入到9.6ml去离子水和0.4ml冰乙酸的混合溶剂中，常温下磁力搅拌4h后得到壳聚糖溶液；[0064]将1g聚乙烯醇和10ml去离子水混合，90℃水浴的条件下磁力搅拌4h后得到聚乙烯醇溶液；[0065](2)将壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液按体积比为1:1混合，常温搅拌4h得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；[0066](3)将0.06g粒径为50nm的电气石颗粒加入到去离子水和冰乙酸的混合溶剂中，以20khz频率、功率200w、超声2s、间隔2s的方式超声20min，配置电气石颗粒悬浊液；[0067](4)将电气石颗粒悬浊液逐滴加入到壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，滴加的同时以20khz频率、功率200w、超声2s、间隙2s的方式超声45min伴随磁力搅拌，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液；[0068](5)将混合溶液在-20℃冷冻22h后，常温下进行2h的解冻，完成一次冻融；共重复冻融3次；[0069](6)将复合物置于无水乙醇中，采用无水乙醇脱水的方式进行干燥，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶。[0070]对比例1[0071](1)将0.2g的壳聚糖(分子量为120×104)加入到9.6ml去离子水和0.4ml冰乙酸的混合溶剂中，常温下磁力搅拌4h后得到壳聚糖溶液；[0072]将1g聚乙烯醇和10ml去离子水混合，90℃水浴的条件下磁力搅拌4h后得到聚乙烯醇溶液；[0073](2)将壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液按体积比为1:1混合，常温搅拌4h得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；[0074](3)将壳聚糖/聚乙烯醇溶液在-20℃冷冻22h后，常温下进行2h的解冻，完成一次冻融；共重复冻融3次；[0075](5)将复合物置于无水乙醇中，采用无水乙醇脱水的方式进行干燥，得到壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶。[0076]水凝胶的抗菌率测定结果如表1所示：[0077]表1[0078]样品大肠杆菌抗菌率(％)金黄色葡萄球菌抗菌率(％)实施例190.02±1.16％76.25±5.37％对比例185.26±0.99％63.88±7.57％[0079]水凝胶的细胞存活率测定结果如表2所示：[0080]表2[0081]样品细胞存活率(％)实施例192.03±1.09％对比例193.21±1.14％[0082]根据细胞毒性结果，实施例1和对比例1的生物安全等级均为i级，属于轻微毒性范畴，可以作为伤口敷料使用。[0083]由表1和表2可以看出，实施例1与对比例1相比，电气石颗粒的引入提高了水凝胶的体外凝血和抗菌能力，使得水凝胶的体外凝血指数降低了66.33％，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率分别提高了4.76％、16.22％。[0084]实施例2[0085](1)将0.1g的壳聚糖(分子量为120×104)加入到9.6ml去离子水和0.4ml冰乙酸的混合溶剂中，常温下磁力搅拌4h后得到壳聚糖溶液；[0086]将1.4g聚乙烯醇和10ml去离子水混合，90℃水浴的条件下磁力搅拌4h后得到聚乙烯醇溶液；[0087](2)将壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液按体积比为1:1混合，常温搅拌4h得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；[0088](3)将0.09g粒径为100nm的电气石颗粒加入到去离子水和冰乙酸的混合溶剂中，以20khz频率、功率200w、超声2s、间隔2s的方式超声20min，配置电气石颗粒悬浊液；[0089](4)将电气石颗粒悬浊液逐滴加入到壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，滴加的同时以20khz频率、功率200w、超声2s、间隙2s的方式超声45min伴随磁力搅拌，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液；[0090](5)将混合溶液在-20℃冷冻22h后，常温下进行2h的解冻，完成一次冻融；共重复冻融3次；[0091](6)将复合物置于无水乙醇中，采用无水乙醇脱水的方式进行干燥，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶。[0092]实施例3[0093](1)将0.15g的壳聚糖(分子量为120×104)加入到9.6ml去离子水和0.4ml冰乙酸的混合溶剂中，常温下磁力搅拌4h后得到壳聚糖溶液；[0094]将1.05g聚乙烯醇和10ml去离子水混合，85℃水浴的条件下磁力搅拌4h后得到聚乙烯醇溶液；[0095](2)将壳聚糖溶液和聚乙烯醇溶液按体积比为1:1混合，常温搅拌4h得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；[0096](3)将0.084g粒径为80nm的电气石颗粒加入到去离子水和冰乙酸的混合溶剂中，以20khz频率、功率200w、超声2s、间隔2s的方式超声30min，配置电气石颗粒悬浊液；[0097](4)将电气石颗粒悬浊液逐滴加入到壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，滴加的同时以20khz频率、功率200w、超声2s、间隙2s的方式超声45min伴随磁力搅拌，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇混合液；[0098](5)将混合溶液在-22℃冷冻22h后，常温下进行2h的解冻，完成一次冻融；共重复冻融3次；[0099](6)将复合物置于无水乙醇中，采用无水乙醇脱水的方式进行干燥，得到电气石/壳聚糖/聚乙烯醇复合水凝胶。[0100]由图1-4可以看出，电气石颗粒的引入使得实施例1、实施例2和实施例3三种复合水凝胶表面的孔隙数量增多，孔径尺寸增大而且分布的更加均匀。其中，实施例1复合水凝胶的三维网络结构更加规整，更能符合伤口敷料的要求(如图1所示)。对比例1水凝胶表面以小孔为主，数量较少而且分布的不均匀(如图4所示)。[0101]水凝胶在pbs溶液中达到平衡后的溶胀结果如表3所示：[0102]表3[0103]样品溶胀率实施例1181％实施例2150％实施例3167％对比例1136％[0104]由图5和表3可以看出，在前3h内，水凝胶快速吸收pbs溶液，溶胀率增加的比较快。随着时间的延长，水凝胶的溶胀速率增长的越来越缓慢，最终水凝胶在6h左右达到溶胀平衡。实施例1的复合水凝胶在pbs溶液中达到平衡后的溶胀率为181％，实施例2的复合水凝胶在pbs溶液中达到平衡后的溶胀率为150％，实施例3的复合水凝胶在pbs溶液中达到平衡后的溶胀率为167％，而对比例1的复合水凝胶在pbs溶液中达到平衡后的溶胀率仅为136％。[0105]水凝胶的溶血率测定结果如表4所示：[0106]表4[0107]样品溶血率实施例11.29±0.08％实施例22.20±0.18％实施例31.57±0.12％对比例12.31±0.18％[0108]由表4可以看出，水凝胶的溶血率均小于5％，符合溶血率的标准要求。[0109]水凝胶的bci结果如表5所示：[0110]表5[0111]样品bci实施例122.79±1.72％实施例240.15±2.11％实施例331.37±1.12％对比例167.69±1.80％[0112]由表5可以看出，材料的bci越低，说明材料的体外凝血效果越好。与对比例1相比，电气石颗粒的引入使得实施例1、实施例2和实施例3的bci指数有所下降，说明电气石颗粒的引入提高了复合水凝胶体外凝血性能。电气石颗粒的引入提高了复合水凝胶的溶胀性能，具有良好溶胀性能的材料可以迅速的吸收血液中的液体成分，促进红细胞和血小板的聚集。此外，电气石颗粒由于其自发极化作用会使其产生一定量的负电荷，血液离体后接触到带负电荷的电气石时，可有效激活xii因子参与到内源性凝血反应促进血液凝固，在快速液体吸收和电荷刺激的共同作用下材料的止血效率明显提高。[0113]本发明未述及之处适用于现有技术。当前第1页12当前第1页12