一种黄花菜鲜味肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及食品技术领域，具体地，涉及一种黄花菜鲜味肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.黄花菜又名金针菜、忘忧草，属百合目，百合科多年生草本植物，是一种药食同源的食材，因其鲜美滋味和营养价值而深受人们的喜爱。鲜味肽是一种肽类鲜味剂，具有强烈的增鲜和增香等调味作用。目前黄花菜的研究主要集中在多糖多酚等功能性物质，对黄花菜蛋白的研究开发很少。且针对黄花菜相关调味品的研发还停留在简单的粗加工阶段，如将黄花菜与味精(i g)等简单混合后制得混合调味品，对黄花菜的鲜味任然没有深入了解。目前少有人对鲜味肽酶解提取分离纯化鉴定进行深入研究，关于黄花菜鲜味肽的探究也未有发现，鲜味肽资源开发等研究仍亟待加强。


技术实现要素：

3.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种黄花菜鲜味肽及其制备方法和应用。将黄花菜酶解得到含有鲜味肽的酶解液，经提纯后得到黄花菜鲜味肽；所述酶解方法为，用超声辅助法对黄花菜进行前处理，5000～7000u/l纤维素酶对黄花菜破壁，300～400ku/l中性蛋白酶和80～100ku/l风味蛋白酶在49～55℃，ph为5.87～6.50条件下酶解纤维素酶酶解液380～420min，能提高黄花菜的鲜味和多肽含量，增加蛋白回收率。所述黄花菜鲜味肽由不同分子量和感官风味的鲜味肽组成，具体地，包含氨基酸序列如seq id no:1～25中的一条或几条所示的鲜味肽。
4.本发明的第一个目的是提供一种黄花菜鲜味肽。
5.本发明的第二个目的是提供一种黄花菜的酶解方法。
6.本发明的第三个目的是提供所述黄花菜鲜味肽的制备方法。
7.本发明的第四个目的是提供所述黄花菜鲜味肽在制备食品、食品添加剂和/或保健产品中的应用。
8.本发明的第五个目的是提供一种含有所述的黄花菜鲜味肽的食品、食品添加剂和/或保健产品。
9.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
10.一种黄花菜鲜味肽，所述黄花菜鲜味肽包含氨基酸序列如seq id no:1～9中的一条或几条所示的的鲜味肽和/或氨基酸序列如seq id no:10～25中的一条或几条所示的的鲜味肽。
11.一种黄花菜的酶解方法，包含以下步骤：
12.s1：用水提取黄花菜，得到水提液；
13.s2：用5000～7000u/l的纤维素酶酶解水提液，得到纤维素酶酶解液；
14.s3：用中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解纤维素酶酶解液，得到含鲜味肽的黄花菜酶解液。
15.优选地，步骤s1中，用水提取黄花菜，超声辅助提取，得到水提液。
16.优选地，步骤s2中，用7000u/l的纤维素酶酶解水提液。
17.更优选地，步骤s2中，酶解后需灭酶。
18.优选地，所述中性蛋白酶的用量为300～400ku/l，所述风味蛋白酶的用量为80～100ku/l。
19.更优选地，所述中性蛋白酶的用量为300ku/l，所述风味蛋白酶的用量为80ku/l。
20.优选地，步骤s3酶解时间为380～420min，酶解温度为49～55℃，酶解ph为5.87～6.50。
21.更优选地，步骤s3酶解时间为6.4h，酶解温度为49℃，酶解ph为5.87。
22.最优选地，步骤s3中，酶解后需灭酶。
23.所述黄花菜鲜味肽的制备方法，用所述的黄花菜的酶解方法得到含鲜味肽的黄花菜酶解液，再依次经过超滤分离、凝胶色谱分离和反相液相纯化制备得到。
24.优选地，所述超滤分离的方法为，用水溶解含鲜味肽的黄花菜酶解液，通过相对分子量截留尺寸为3kda的超滤膜，收集分子量＜3kda的超滤组分a1。
25.优选地，所述凝胶色谱分离的方法为，用水复溶所述超滤组分a1，使用sephadex g-15凝胶层析柱分离，洗脱液为超纯水，流速为1ml/min，上样浓度为50mg/ml，上样量为1ml，玻璃层析分离柱规格为0.5cm
×
80cm，填料为sephadex g-15，检测器为紫外检测器，在214nm处测定吸光值，收集产物。
26.优选地，所述反相液相纯化的方法为，将凝胶色谱分离收集产物与水配成多肽溶液，用rp-hplc分离，色谱条件为：xbridge c18柱，流速1ml/min，紫外检测波长220nm，进样量50μl，流动相a：0.1％(v/v)甲酸-乙腈，流动相b：0.1％(v/v)甲酸-超纯水，体积比20％a和80％b等梯度洗脱，洗脱时间20min，收集产物。
27.所述黄花菜鲜味肽在制备食品、食品添加剂和/或保健产品中的应用。
28.一种含有所述的黄花菜鲜味肽的食品、食品添加剂和/或保健产品。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明公开的黄花菜鲜味肽酶解方法，能提高黄花菜的鲜味和多肽含量，增加黄花菜蛋白的回收率。酶解制备的含鲜味肽的黄花菜酶解液中，比不采用纤维素酶，而使用20min沸水浴后，加入复合酶酶解的方法，多肽含量增加了3倍。蛋白回收率提升到了41.37％，而未经任何酶处理的黄花菜水提液的蛋白回收率仅有11.68％。鲜味比未经任何酶处理的黄花菜水提液(鲜味评价2.0)提升了2倍以上。经过酶解后的含鲜味肽的黄花菜酶解液用超滤分离、凝胶色谱分离和反向液相色谱纯化，得到两组鲜味肽，其中组分1包含氨基酸序列如seq id no:1～9所示的鲜味肽，每种鲜味肽分子量为800～1500da，以甜味和弱鲜味为主；组分2包含氨基酸序列如seq id no:10～25所示的鲜味肽，每种鲜味肽分子量为400～800da，以咸味和鲜味为主。本发明制备得到的鲜味肽鲜味自然，风味独特且具有较高营养价值，为黄花菜蛋白和黄花菜鲜味调味品开发提供了经验和方法。
附图说明
31.图1为超滤组分鲜味评价图。
32.图2为凝胶层析分离结果。
33.图3为凝胶层析分离各组分的滋味特征。
34.图4为p1组分rp-hplc组分鲜味评价图。
35.图5为p3组分rp-hplc纯化组分图。
36.图6为p1组分中氨基酸序列分别如seq id no:1所示的鲜味肽质谱图。
37.图7为p1组分中氨基酸序列如seq id no:2所示的鲜味肽质谱图。
38.图8为p1组分中氨基酸序列如seq id no:3所示的鲜味肽质谱图。
39.图9为p1组分中氨基酸序列如seq id no:4所示的鲜味肽质谱图。
40.图10为p1组分中氨基酸序列如seq id no:5所示的鲜味肽质谱图。
41.图11为p1组分中氨基酸序列如seq id no:6所示的鲜味肽质谱图。
42.图12为p1组分中氨基酸序列如seq id no:7所示的鲜味肽质谱图。
43.图13为p1组分中氨基酸序列如seq id no:8所示的鲜味肽质谱图。
44.图14为p1组分中氨基酸序列如seq id no:9所示的鲜味肽质谱图。
45.图15为p3组分中氨基酸序列如seq id no:10所示的鲜味肽质谱图。
46.图16为p3组分中氨基酸序列如seq id no:11所示的鲜味肽质谱图。
47.图17为p3组分中氨基酸序列如seq id no:12所示的鲜味肽质谱图。
48.图18为p3组分中氨基酸序列如seq id no:13所示的鲜味肽质谱图。
49.图19为p3组分中氨基酸序列如seq id no:14所示的鲜味肽质谱图。
50.图20为p3组分中氨基酸序列如seq id no:15所示的鲜味肽质谱图。
51.图21为p3组分中氨基酸序列如seq id no:16所示的鲜味肽质谱图。
52.图22为p3组分中氨基酸序列如seq id no:17所示的鲜味肽质谱图。
53.图23为p3组分中氨基酸序列如seq id no:18所示的鲜味肽质谱图。
54.图24为p3组分中氨基酸序列如seq id no:19所示的鲜味肽质谱图。
55.图25为p3组分中氨基酸序列如seq id no:20所示的鲜味肽质谱图。
56.图26为p3组分中氨基酸序列如seq id no:21所示的鲜味肽质谱图。
57.图27为p3组分中氨基酸序列如seq id no:22所示的鲜味肽质谱图。
58.图28为p3组分中氨基酸序列如seq id no:23所示的鲜味肽质谱图。
59.图29为p3组分中氨基酸序列seq id no:24所示的鲜味肽质谱图。
60.图30为p3组分中氨基酸序列seq id no:25所示的鲜味肽质谱图。
61.图31为葡萄糖标准曲线图。
62.图32为纤维素酶加酶量对还原糖含量影响图。
63.图33为酶解前后水解度变化图(a)不同酶水解度情况变化表(b)。
64.图34为酶解时间对中性蛋白酶效果的影响。
65.图35为酶解温度对中性蛋白酶效果的影响。
66.图36为酶解ph对中性蛋白酶效果的影响。
67.图37加酶量对中性蛋白酶效果的影响。
68.图38为酶解时间对风味蛋白酶效果的影响。
69.图39酶解温度对风味蛋白酶效果的影响。
70.图40为酶解ph对风味蛋白酶效果的影响。
71.图41加酶量对风味蛋白酶效果的影响。
72.图42为酶解温度和酶解时间对水解度交互作用的等高线图和响应面。
73.图43为酶解ph和酶解时间对水解度交互作用的等高线图和响应面。
74.图44为酶解温度和酶解ph对水解度交互作用的等高线图和响应面。
75.图45为酶解ph和酶解时间对感官评价交互作用的等高线图和响应面。
76.图46为酶解温度和酶解时间对感官评价交互作用的等高线图和响应面。
77.图47为酶解温度和酶解ph对感官评价交互作用的等高线图和响应面。
78.图48为酶解前后蛋白回收率对比。
79.图49为牛血清蛋白标准曲线图。
具体实施方式
80.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
81.中性蛋白酶(100000u/g)、风味蛋白酶(20000u/g)、纤维素酶(50000u/g)、木瓜蛋白酶(800000u/g)、碱性蛋白酶(200000u/g)和胰蛋白酶(250000u/g)购于上海源叶生物技术有限公司。高氯酸、乙醇、三氯乙酸、磷酸、硝酸、氯化钠、氢氧化钾、氯仿、甲醇和甜菜碱均为分析纯。实验所有仪器与设备如表1所述。
82.表1主要仪器与设备
[0083][0084][0085]
实施例1黄花菜鲜味肽的酶解
[0086]
将祁东县黄花菜用粉碎机打成粉末状，过60目筛网，4℃冰箱保存备用。取2g黄花菜粉末，加50ml水进行提取，调节温度至50℃，超声辅助提取功率为300w，时间为1h，超声完毕后进行搅拌。使用酸度调节剂将搅拌完全的黄花菜混合物溶液ph值调节至4.8，加体积比1.4％(7000u/l)纤维素酶，在50℃条件下酶解处理3h，酶解完毕后100℃水浴灭酶15min。将纤维素酶处理完毕的酶解液的ph值调节至5.9，温度调节至50℃，加入中性蛋白酶和风味蛋白酶，其中，中性蛋白酶加酶量为0.3g(300ku/l)，风味蛋白酶加酶量为0.4g(80ku/l)，酶解时间为6.4h，酶解完毕后100℃水浴灭酶15min。在环境温度4℃下，5000r/min离心15min，过滤，收集黄花菜蛋白酶解液上清液，冻干保存，用于后续分离纯化和鉴定。
[0087]
实施例2超滤分离
[0088]
一、实验方法
[0089]
超滤是利用压力将不同分子量的物质进行分离纯化的方法，通过使用不同尺寸大
小的超滤膜，使小分子溶质和溶剂穿过，将大分子溶质留在膜的一边，从而达到分级的目的。超滤分离技术操作简单，分离纯化的效果好且成本低廉。
[0090]
将实施例1冻干的含鲜味肽的黄花菜酶解液组分溶于超纯水(1：20，w/v)中，并通过相对分子量截留尺寸为3kda和5kda的超滤膜，于4℃下进行超滤分离，组分a1，a2和a3分别对应于分子量＜3kda、3～5kda和＞5kda的组分。收集超滤得到的所有组分，冻干，并于-80℃下保存备用，复溶于水经过感官评价后，确定最佳组分。
[0091]
选择七名感官评价人员(4女3男)，以味精作为鲜味评价标准，根据浓度不同制定评分表，每组评价打分三次。
[0092]
表2鲜味评价标准表
[0093]
味精浓度(mg/ml)02468101214161820鲜味得分012345678910
[0094]
取200mg的超滤组分冻干品分别溶解于10ml蒸馏水中，配置20mg/ml的样品溶液，感官评价员品尝3次，与味精溶液进行对比，得到相应的评分。
[0095]
二、实验结果
[0096]
结果如图1所示，a1组分具有明显的鲜味特征，苦味较弱。与a1组分相比，a2和a3组分和在鲜味的强度方面较弱，且苦味相对较强，低分子量肽组分(＜3kda)在花生、大豆、酱油和食用菌中均表现出高度浓郁的鲜味，选择鲜味特性较强的分子量＜3kda的组分进行下一步分离纯化。
[0097]
实施例3凝胶色谱分离
[0098]
一、实验方法
[0099]
将实施例2得到的鲜味较强的超滤组分a1冻干品，经超纯水复溶，配置成蛋白浓度为20mg/ml的水溶液，使用sephadex g-15凝胶层析柱(1.0
×
70cm)进一步分离鲜味较高的组分。用超纯水作为洗脱液进行洗脱，流速为1ml/min，上样浓度为50mg/ml，上样量为1ml。玻璃层析分离柱规格：0.5cm
×
80cm，填料：sephadex g-15，检测器：紫外检测器。利用自动组分收集器每2min收集一管，在214nm处测定吸光值。一共分离获得4种成分，分别命名为p1、p2、p3和p4，对应4个分离峰，分别为f1、f2、f3和f4，分别将每种分离峰对应的组分收集，合并，浓缩和冻干，并通过感官评价确定鲜味最强的组分，感官评价方法见实施例2。
[0100]
二、实验结果
[0101]
如图2所示，sephadex g-15具有良好的分离效果，并且可以有效地收集不同的组分。一共分离得到4个组分(p1～p4)。
[0102]
凝胶色谱分离各组分的滋味特征如图3所示，p1组分的滋味主要是鲜味和甜味，鲜味和甜味评分分别为6.15和5.21；p2组分也具有一定的鲜味和甜味特征，但相较于p1弱，所以优先选择p1组分；p3组分为鲜味最强的组分，滋味以咸鲜味为主，鲜味评分和咸味评分分别为7.44和6.96；p4则各项滋味指标都相对较弱，所以选择p1和p3组分进行进一步纯化。凝胶分离所得到的组分鲜味特征明显，具有一定的咸味或甜味，几乎没有苦味。
[0103]
实施例4反向液相纯化收集
[0104]
一、实验方法
[0105]
将实施例3分离纯化所得的经鲜味感官评价得分最高组分p1和p3的冻干粉分别与蒸馏水配成浓度为25mg/ml的多肽溶液，利用微孔滤膜(0.25μm)进行过滤处理后，滤液进入
rp-hplc系统进行进一步分离纯化。
[0106]
色谱条件为：xbridge c18(3
×
150mm column 5μm)，流速1ml/min，紫外检测波长220nm，进样量50μl，流动相a：0.1％(v/v)甲酸-乙腈，流动相b：0.1％(v/v)甲酸-超纯水，体积比20％a和80％b等梯度洗脱，洗脱时间20min。
[0107]
二、实验结果
[0108]
结果如图4和5所示，组分p1主要收集了2个组分(p
1-1
和p
1-2
)，组分p3则收集了6个组分(p
1-1
～p
1-6
)。
[0109]
实施例5鲜味肽序列的鉴定
[0110]
一、实验方法
[0111]
反相高效液相色谱法，根据分子的疏水性强弱进行不同物质分离的色谱法，可以用于非极性、极性等不同物质间的分离纯化，仪器操作简便，分离效果和分离效率都较高。
[0112]
将反相液相纯化的组分，经真空旋转浓缩仪旋干后，加入超纯水复溶，利用微孔滤膜(0.25μm)进行过滤处理后，进行uplc-q-orbitrap-ms/ms纯化鉴定鲜味肽的氨基酸序列和分子量。
[0113]
色谱条件：hypersil gold c18色谱柱(2.1
×
100mm，1.9μm)；柱温：30℃；流速：0.3μl/min；进样量：1μl；流动相a：0.1％(v/v)甲酸-水；流动相b：0.1％(v/v)甲酸-乙腈。洗脱梯度(体积比计)：0～5min(5％b)，5～33min(5～55％b)，33～34min(55～90％b)，34～39min(90％b)，39～40min(90～4％b)，40～60min(4％b)。
[0114]
质谱条件：扫描离子：正离子模式；扫描范围：150～2000m/z；扫描方式：full ms，dd ms 2分辨率：full ms：70000，dd-ms2：17500；碰撞能量：10ev，20ev，30ev。
[0115]
用de novo tm
软件可根据质谱片段信息分析自动选择肽的分子量，选择平均局部置信度(alc)大于85％的肽段，参考总离子流图选择最佳鲜味肽组分。
[0116]
biopep数据库(http://www.uwm.edu.pl)可用于预测已经鉴定的鲜味肽的潜在生物活性。通过查询数据库，确定了目标肽序列中具有特定味觉活性类型的片段的数目和氨基酸残基的数目。通过分析和计算获得目标肽中生物活性片段的出现频率，以预测其味觉活性。
[0117]
二、试验结果
[0118]
de novo tm
软件的分析结果如表3和4所示，在p1组分中鉴定出9种alc高于90％的肽，鉴定出的肽的长度由6～13个氨基酸组成，分子量为66～1314da。p1组分的鲜味肽主要以甜味和鲜味为主，他们的氨基酸组成主要以疏水性氨基酸为主，这些氨基酸的滋味可能更多与肽的二三级结构有关。就氨基酸组成而言，甘氨酸(gly)，除了是弱鲜味的氨基酸外，还是在肽段中容易形成β-转角这种特殊二级结构的氨基酸，丝氨酸(ser)拥有特殊的侧链基团，在拥有甜味的同时还是鲜味肽的重要组成，许多长链鲜味肽中都有一定含量的丝氨酸。图6～14为p1组分中氨基酸序列分别如seq id no:1～9所示的鲜味肽质谱图。
[0119]
在p3组分中鉴定出16种alc高于85％的肽，在这些由4～6个氨基酸组成的短肽中，氨基酸种类，数量和排序可能是鲜味肽呈鲜作用的主要原因。天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)被认为是主要的鲜味氨基酸，这些鲜味肽的肽段中鲜味氨基酸的比例升高。除了鲜味氨基酸，这些短肽中芳香族氨基酸也起到了重要的作用，原因可能是π键与鲜味受体之间存在电荷吸引作用力，使鲜味肽和鲜味受体之间的结合更为紧密。图15～30为p3组分中氨基
酸序列分别如seq id no:10～25所示的鲜味肽质谱图。
[0120]
表3 p1组分鲜味肽鉴定情况表
[0121][0122][0123]
表4 p3组分鲜味肽鉴定情况表
[0124][0125]
biopep数据库的预测结果见表5和表6。由表5可以看出，p1组分中除了tcglsnwarga以外所有鲜味肽都应该具有鲜味，这些鲜味肽中都含有谷氨酸(e)和天冬氨酸(d)形成的鲜味片段，其中evvpsh的鲜味片段频率得分最高。tcglsnwarga、tpellnr和syevrap具有滋味增强作用，syevrap的鲜味增强预测结果最明显，出现频率较高的丝氨酸、甘氨酸和精氨酸片段可能对鲜味的产生起到了关键作用。p3组分中具有鲜味片段的短肽有7个，其中出现频率最高的是evefr，rvlggl和wavar这2个肽段虽然不含有鲜味片段，却具有咸味增强作用。预测含有鲜味的鲜味肽中大部分都含有苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)等芳香族氨基酸片段，苯环与鲜味受体之间存在疏水相互作用能使鲜味肽与受体的结合更加紧密。p3组分的咸鲜味更强可能是因为组分中具有滋味增强的多肽更多，这些短肽几乎都具有苦味抑制作用和收敛性，虽然疏水片段的出现频率较高可能会降低其鲜味表达。
[0126]
表5 p1组分鲜味肽活性预测表
[0127][0128][0129]
注：带*的鲜味肽还具有滋味增强作用，-代表无相应数据或片段。
[0130]
表6 p3组分鲜味肽活性预测表
[0131][0132]
注：带*的鲜味肽还具有滋味增强作用。
[0133]
实施例6纤维素酶添加量对酶解的影响
[0134]
一、实验方法
[0135]
纤维素酶(50000u/g)购于上海源叶生物技术有限公司。取2g实施例1的黄花菜粉末，加50ml水进行提取，调节温度至50℃，超声辅助提取功率为300w，时间为1h，超声完毕后进行搅拌。分别添加体积比0.2％(1000u/l)、0.6％(3000u/l)、1.0％(5000u/l)、1.4％(7000u/l)、1.8％(9000u/l)和2.0％(10000u/l)的纤维素酶，在50℃，ph4.8条件下水解3h，在100℃水浴中灭酶15min，再4℃条件下5000r/min离心15min后取上清液，测定还原糖含量，平行测定3组，通过还原糖的量确定纤维素酶的酶解情况。
[0136]
水解度测定和蛋白回收率计算：
[0137]
甲醛滴定法：吸取10ml酶解液定容到50ml容量瓶中，取10ml加水40ml配置成水溶液，用0.02mol naoh标准溶液调节到ph 8.2，加入10ml中性甲醛溶液混匀，用naoh标准溶液滴定到ph 9.2，记录消耗体积为v1，同时取50ml蒸馏水作空白对照，记录消耗naoh标准溶液
为v2，计算其氨基态氮含量a。计算公式：
[0138][0139]
其中：c为naoh标准滴定溶液浓度，mol/l；14.008为消耗碱量换算为氮的系数；v为测定用样品溶液体积，ml。
[0140]
水解度(％)＝(氨基态氮含量/总氮含量)
×
100％，总氮采用微量凯式定氮法。
[0141]
蛋白回收率计算公式：
[0142][0143]
式中：c为蛋白回收率(％)；m为原料总蛋白质含量，g；m1为酶解上清液蛋白质含量，g。
[0144]
二、实验结果
[0145]
(1)纤维素酶酶解工艺探究：以540nm处测得的吸光值为纵坐标，葡萄糖标品的浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线，如图31，相关系数r2＝0.9996，线性关系良好。
[0146]
(2)纤维素酶添加情况分析：黄花菜中多糖和含量较高，自身内源酶的作用不能使蛋白质充分释放，需要使用纤维素酶对进行破碎处理，释放其鲜味物质成分，纤维素酶可以提高蛋白质溶出率，对蛋白水解也有一定帮助。如图32所示，在节约成分和考虑得率的情况下在酶用量体积比在1.0～1.4％(5000～7000u/l)的条件下，还原糖的含量跨度差异最大，效果增加最为明显，因此选用体积比1.4％(7000u/l)的纤维素酶对黄花菜进行破壁处理，还原糖含量能达到48.33％。
[0147]
实施例7内切蛋白酶种类对酶解的影响
[0148]
一、试验方法
[0149]
取实施例1的黄花菜粉末2g，加50ml水进行提取，调节温度至50℃，超声辅助提取功率为300w，时间为1h，超声完毕后进行搅拌。在55℃，ph＝7的条件下，分别加入木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶四种酶各0.3g，酶解5h，酶解后在100℃水浴中灭酶15min，纱布过滤后4℃条件下5000r/min离心10min，取上清液测定水解度测定方法同实施例6。
[0150]
二、实验结果
[0151]
通过图33可以看出，酶解后的水解度较水提法有着较大的提高，选取的四种内切蛋白酶对黄花菜蛋白酶解均表现出一定的酶解效果，对比各种蛋白酶的酶解效果，发现中性蛋白酶对黄花菜蛋白的酶解效率最好，其水解度高达16.87％，此外，碱性和中性蛋白酶是由枯草杆菌提取的内切蛋白酶，与其他内切蛋白酶相比，适合植物蛋白的水解和利用，蛋白酶解后的酶解产物苦味较低，因此选择中性蛋白酶作为酶解黄花菜蛋白的内切酶。中性蛋白酶用于提升蛋白的回收率，让黄花菜蛋白更多的酶解进入酶解液中，也具有提升蛋白水解度的作用，黄花菜蛋白主要是不溶性蛋白。
[0152]
实施例8中性蛋白酶酶解时间对酶解的影响
[0153]
一、实验方法
[0154]
称取实施例1的黄花菜粉末2g，加50ml水进行提取，调节温度至50℃，超声辅助提取功率为300w，时间为1h，超声完毕后进行搅拌。加入0.3g(300ku/l)中性蛋白酶，调节ph值
为7，分别在50℃的温度下酶解4、5、6、7和8h，每组实验平行3次，研究酶解时间对水解度和蛋白回收率的影响，计算方法同实施例6。
[0155]
二、实验结果
[0156]
如图34所示，在4～5h阶段，蛋白质水解度不断提高，蛋白质充分水解在5h达到最大值为16.29％，蛋白质回收率在6h达到最高峰36.98％，随着时间的增加最终两项指标都基本保持恒定，在节省成本条件下，5h是水解度提升最好的选择。随着时间的增加，底物被消耗，水解度和蛋白回收率都呈下降趋势，原因可能是酶活力也随着时间的推移而下降。
[0157]
实施例9中性蛋白酶酶解温度对酶解的影响
[0158]
一、试验方法
[0159]
实验方法与实施例8相同，酶解时间为5h，在40、45、50、55、60℃的温度下酶解，每组实验平行3次，研究蛋白酶解温度对水解度和蛋白回收率的影响，计算方法同实施例6。
[0160]
二、实验结果
[0161]
不同的温度条件下，水解度和蛋白回收率情况如图35所示。随着酶解温度的升高，含鲜味肽的黄花菜酶解液的水解度不断提高，在50～55℃的条件下，蛋白质水解度达到最高峰值区间，水解度在55℃时达到最高的17.02％，50～55℃时蛋白质的水解度变化情况处于最高且稳定状态，蛋白质回收率在40～55℃区间的变化不大，最佳的酶解温度应该为55℃，此时的蛋白质回收率为34.90％。
[0162]
实施例10中性蛋白酶酶解ph对酶解的影响
[0163]
一、实验方法
[0164]
实验方法与实施例9相同，酶解温度为50℃，调节ph值为5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5和8.0，每组实验平行3次，研究蛋白酶解ph对水解度和蛋白回收率的影响，计算方法同实施例6。
[0165]
二、实验结果
[0166]
结果如图36所示，在酸性ph的条件下，中性蛋白酶的水解度处于最高阶段，在ph＝5.5时，中性蛋白酶的水解度最高为16.50％，同时蛋白回收率却处于相对较低的阶段；随着ph的升高，蛋白质回收率逐渐升高，水解度开始下降，在ph＝6.5～7.0的阶段，蛋白质回收率最高，为35.39％。中性蛋白酶属于内切酶，优先酶切蛋白质两端的特定氨基酸序列，在酸性条件下中性蛋白酶活力较弱，同时酸性条件和温度刺激促进了氨基酸的释放，水解度提高。随着ph的提高后，中性蛋白酶的活力提高，开始酶解一些不溶性蛋白，酶解液中总氮上升。达到一定平衡后，蛋白回收率液液随之增加并保持恒定，在降低成本的理念上分析，ph＝6.0时蛋白质回收率和水解能达到较好的平衡。
[0167]
实施例11中性蛋白酶添加量对酶解的影响
[0168]
一、实验方法
[0169]
实验方法与实施例10相同，调节ph值为7，分别加入0.1(100ku/l)、0.2(200ku/l)、0.3(300ku/l)、0.4(400ku/l)和0.5g(500ku/l)中性蛋白酶，每组实验平行3次，研究中性蛋白酶添加量对水解度和蛋白回收率的影响，计算方法同实施例6。
[0170]
二、实验结果
[0171]
如图37所示，随着酶添加量的提高，蛋白质水解度逐渐提高达到一定平衡后不再有剧烈变化，蛋白回收率先升后降，整体变化范围也较小，综合考虑成本和效率情况，选择
0.3g(300ku/l)的中性蛋白酶加酶量能达到最好收益。
[0172]
实施例12中性蛋白酶酶解条件正交实验分析
[0173]
一、实验方法
[0174]
在实施例8～11的基础上，以酶解温度(a)、ph值(b)、酶解时间(c)和加酶量(d)为变量，进行四因素三水平的正交实验分析，采用spss21.0进行实验数据分析，讨论酶解温度(a)、ph值(b)、酶解时间(c)和加酶量(d)对酶解度的影响，确定了最佳酶解工艺参数，水解度和蛋白回收率的影响，计算方法同实施例6。
[0175]
表7中性蛋白酶正交试验分析因子及水平表
[0176][0177]
二、实验结果
[0178]
中性蛋白酶正交分析结果如表8所示，由中性蛋白酶正交实验可以得出水解度最佳的方案应该为a2b2c2d3，主次因素次序分别为b＞c＞d＞a，蛋白回收率最佳方案为a1b3c3d3，主次因素次序为b＞c＞d＞a，按照综合评分的原则，参考酶解温度(a)对提升水解度和蛋白质回收率的影响均最小，综合则酶解温度(a)优先考虑50℃。酶解ph(b)在ph＝6.0的条件下，能达到蛋白质回收率最高，且能降低调节ph所需的成本。酶解时间(c)是蛋白质回收率提升的最主要因素，但对水解度却影响较小，考虑到主次优先原则，选择6h作为最佳酶解时间。加酶量(d)作为两个因变量的次要影响因素，0.3g(300ku/l)的酶添加量最合适。因此最佳的工艺为a2b3c3d3，在此条件下得到的水解度和蛋白回收率分别为18.57％和34.67％。
[0179]
表8黄花菜蛋白中性蛋白酶酶解实验方案及结果
[0180][0181]
[0182]
实施例13风味酶酶解时间对酶解的影响
[0183]
一、实验方法
[0184]
称取实施例1的黄花菜粉末2g，加50ml水进行提取，调节温度至50℃，超声辅助提取功率为300w，时间为1h，超声完毕后进行搅拌。加入0.3g(60ku/l)风味蛋白酶，调节ph值为7，分别在50℃的温度下酶解1、2、3、4、5、6、7、8和9h，每组实验平行3次，研究酶解时间对水解度和鲜味评分的影响，水解度计算方法同实施例6，鲜味感官评价方法见实施例2。
[0185]
二、实验结果
[0186]
如图38所示，随着酶解时间的增加，水解度稳步提升。在5h后，水解度达到一个相对稳定的区间，外切酶作用开始显现，鲜味评分在6h达到最高值7.6。随着时间的增加，底物被消耗，同时黄花菜粉末因为多糖的含量提高会产生一定的聚集效应，阻碍底物的继续水解，酶活力也随着时间的推移而下降，鲜味评分也出现明显的降低。从节约成本和最高风味评分的条件分析，最佳的酶解时间应该为6h。
[0187]
实施例14风味酶酶解温度对酶解的影响
[0188]
一、实验方法
[0189]
实验方法与实施例13相同，酶解时间为6h，在40、45、50、55和60℃的温度下酶解，每组实验平行3次，研究风味蛋白酶酶解温度对水解度和鲜味评分的影响，水解度计算方法同实施例6，鲜味感官评价方法见实施例2。
[0190]
二、实验结果
[0191]
如图39所示，随着酶解温度的升高，含鲜味肽的黄花菜酶解液的水解度不断提高，在45～55℃的条件下，蛋白质水解度达到最高峰值区间，水解度在55℃时达到最高的20.74％，50～55℃时蛋白质的水解度处于最高且稳定状态，鲜味评分在55℃达到最高的评分7.6分，所有最佳的温度条件应该55℃。随着温度的持续升高，水解度和鲜味评分持续下降，可能过高的温度导致风味酶的效果下降。
[0192]
实施例15风味酶酶解ph对酶解的影响
[0193]
一、实验方法
[0194]
实验方法与实施例14相同，调节ph值为5.0、5.5、6.0、6.5、7和7.5，酶解温度为50℃，每组实验平行3次，研究风味蛋白酶酶解ph对水解度和鲜味评分的影响，水解度计算方法同实施例6，鲜味感官评价方法见实施例2。
[0195]
二、实验结果
[0196]
由于风味酶属于内外切混合酶，在不同的ph条件下内外切酶的活力不同，ph处于弱酸性的情况下，内切酶活力较强呈鲜水解度较高的情况，但部分苦味氨基酸的释放可能会引起鲜味评分降低。如图40所示，在ph＝5.5时，中性蛋白酶的水解度最高为21.31％，鲜味评分却出处于相对降低的位置；随着ph的升高，ph＝6.5的条件下内切酶的活性开始下降，从而导致水解度大幅下降。在处于ph＝7.0～7.5的阶段，外切酶的活性开始提升，鲜味评分逐渐升高，在ph＝7.0达到峰值，水解度也得到了一定的提升，在ph呈酸性时，酶解产物的复溶性也会下降，综合多个影响因素，ph＝7.0应该是最理想的条件。
[0197]
实施例16风味酶酶解添加量对酶解的影响
[0198]
一、实验方法
[0199]
实验方法与实施例15相同，分别加入0.1(20ku/l)、0.2(40ku/l)、0.3(60ku/l)、
0.4(80ku/l)和0.5g(100ku/l)风味蛋白酶，调节ph值为7，每组实验平行3次，研究蛋白酶添加量对水解度和鲜味评分的影响，水解度计算方法同实施例6，鲜味感官评价方法见实施例2。
[0200]
二、实验结果
[0201]
如图41所示，添加0.4g(80ku/l)的风味酶添加量时，水解度能达到最高峰值，在0.4g(80ku/l)左右时，鲜味评分的变化相对稳定。加酶量较低时，酶会与底物充分结合，呈现一定的浓度比依赖性变化趋势。加酶量过饱和时，反而会导致酶效果的下降。从节约成本的角度，综合考虑水解度和鲜味评分的情况下，0.4g(80ku/l)的加酶量能达到较好的水准。
[0202]
实施例17风味酶酶解条件正交实验分析
[0203]
一、实验方法
[0204]
在实施例13～16的基础上，以酶解温度(a)、ph值(b)、酶解时间(c)和加酶量(d)为变量，进行四因素三水平的正交实验分析，采用spss 21.0进行实验数据分析，讨论酶解温度(a)、ph值(b)、酶解时间(c)和加酶量(d)对水解度和鲜味评分的影响，确定了最佳酶解工艺参数，水解度和蛋白回收率计算方法同实施例6，鲜味感官评价方法见实施例2。
[0205]
表9风味酶正交试验分析因子及水平表
[0206][0207]
二、实验结果
[0208]
风味蛋白酶正交分析结果如表10所示，由风味蛋白酶正交实验可以得出水解度最佳的方案应该为a3b1c3d2，主次因素次序分别为b＞a＞d＞c，感官评价最佳方案为a3b2c1d2，主次因素次序为a＞b＞c＞d，按照综合评分的原则，参考酶解温度(a)对提升蛋白质水解度和感官评价指标的影响显著明显，酶解温度(a)优先考虑55℃。酶解ph(b)在ph＝7.0的条件下，能达到水解度适中且能降低调节ph所需的成本，ph为中性条件下进行酶处理，含鲜味肽的黄花菜酶解液的感官评分也相对更高。酶解时间(c)是对感官评分变化的影响都较高，优先考虑感官要求和降低成本的需求，6h能更好的提高水解度和感官评分，是最佳的作为最佳酶解时间。加酶量(d)两项指标的选择相同，最佳的酶添加量为0.4g(80ku/l)。因此最佳的工艺为a3b2c1d2，在此条件下测得水解度和鲜味评分分别为22.80％和7.86，蛋白回收率为24.86％。风味蛋白酶主要是用于将蛋白酶解成肽，缩短多肽的肽链长度，主要用于风味处理，提升鲜味，也可提升蛋白水解度。
[0209]
表10黄花菜蛋白风味蛋白酶酶解实验方案及结果
[0210][0211]
实施例18双酶复合水解条件的选择及响应面分析
[0212]
一、实验方法
[0213]
选择最佳的酶解条件进行双酶水解实验，选择最佳的条件后，对其结果进行响应面优化，通过调节酶解时间，酶解温度和酶解ph的关系制作三因素三水平的响应面，响应面试验因素表见表11，以水解度和鲜味评分作为评价指标，筛选出复合酶水解的最佳条件，统计分析使用软件designexport12对响应面进行分析，最后测定含鲜味肽的黄花菜酶解液中的多肽含量，水解度计算方法同实施例6，鲜味感官评价方法见实施例2。
[0214]
表11响应面试验因素表
[0215][0216]
采用双缩脲比色法测定多肽含量，取0.6ml含鲜味肽的黄花菜酶解液加入0.4ml三氯乙酸(15％)，混合静置10min，后离心10min(9600r/min；4℃)，取上清液0.7ml于小烧杯中，再加入蒸馏水0.3ml超纯水和4ml的双缩脲试剂，摇匀，在常温下显色30min，于540nm波长下进行吸光度测定分别测定3次。
[0217]
标准曲线的配制及定量方法:配制牛血清蛋白(bsa)溶液浓度分别为10、8、6、4、2和0mg/ml，共6个浓度，取1ml加入双缩脲试剂4ml，摇匀，在常温下显色30min，于540nm波长下进行吸光度测定，水为空白对照，将得到吸光度对浓度作图，绘制标准曲线。
[0218]
分析实施例8～17可知，酶解时间、酶解温度、酶解ph值对黄花菜蛋白酶酶解效果影响大于酶添加量，因此选取酶解时间、酶解温度、ph值为考察因素，进行三因素三水平的响应面试验设计，考察指标分别是水解度和鲜味评价指标。
[0219]
复合蛋白酶水解黄花菜蛋白的工艺条件优化根据box-behnken design(bbd)实验设计进行了17组实验，5组为中心点重复实验，以水解度和鲜味评分作为响应值，利用design-expert 12软件对各因素进行多元回归拟合。水解度的二次多项式拟合方程为：
[0220]
y＝ 25.40 0.3150a-0.11b-0.1775c-0.0050ab-0.4050ac-0.5050ac-0.5210a
2-0.7610b
2-1.14c2[0221]
项式拟合方程为：
[0222]
y＝ 7.61 0.2763a-0.1937b 0.8300c 0.0725ab-0.4100ac 0.2850ac-0.6173a
2-0.5673b
2-0.6547c2。
[0223]
二、实验结果
[0224]
表12 bbd实验设计及结果
[0225][0226][0227]
表13水解度的方差分析
[0228]
[0229]
模型显著性概率p＝0.0012＜0.05具有显著性，失拟态率p＝0.0969＞0.05不显著，则模型差异显著，次方程拟合较好。r2＝0.9456，校正系数adj r-squared＝87.64％，能表征87.96％的响应值变化，此方程可用于估计各因素与响应值之间的变化，并评价其显著性。bbd实验设计及结果见表12，通过水解度二次多项式回归方程绘制的响应面图和等高线如图42～44所示。由图所示，参考方差分析表(表13)可以看出b，c一次项回归不显著，a显著。交互项ac，bc回归显著，ab不显著，二次项均显著。其中可以看出影响因素时间＞温度＞ph。
[0230]
从图42可以看出当酶解温度及酶解时间在两端范围时，数值差异较大，中间趋于椭圆形平面。等高线图与坐标轴存在一定的角度，分析可以得出酶解时间和酶解温度具有交互促进作用。轴线与坐标轴夹角较小，且椭圆与横轴比例较低，二者交互作用显著性较大。
[0231]
由图43所示，当酶解时间及酶解ph处于低区间时，等高线较平缓，其数值变化对最终水解度影响较小；在较高范围内，等高线逐渐变得陡峭，说明因素数值变化引起了水解度的变化，由此可知酶解时间和酶解ph之间存在交互作用，但由于等高线区域椭圆，与坐标轴形成的夹角较小，说明其影响结果远远低于其他两个响应条件带来的响应值变化。
[0232]
由图44所示，酶解温度和酶解ph交互作用对水解度影响是最大的；在较低交互区间内，等高线与坐标轴夹角很小，等高线密度随着温度和ph的提高，各数值之间差异明显。这说明温度和ph对水解度有较好的相互促进和协同作用，其交互值bc＞ac＞ab，数据符合分析结果，响应面的坡度变化也能很好的证明这一点。
[0233]
表14鲜味评价的方差分析
[0234][0235]
模型显著性概率p＜0.0001，具有极显著性，失拟态率p＝0.9628＞0.05不显著，则模型差异显著，次方程拟合较好。r2＝0.9906，校正系数adj r-squared＝97.85％，能表征97.96％的响应值变化，次方程可用于估计各因素与响应值之间的变化，并评价其显著性。
通过鲜味评价二次多项式回归方程绘制的响应面图和等高线如图45～47所示。由图所示，参考方差分析表(表14)可以看出a、b和c一次项均显著。交互项ac，bc回归显著，ab不显著，二次项均极显著。其中可以看出影响因素温度＞时间＞ph。与水解度指标进行对比后发现，三个影响因素对感官评价的影响更为显著。
[0236]
从图45所示，酶解ph与酶解时间形成的等高线图形成了一个形态较好的椭圆，其等高线密度较小且与坐标轴形成的夹角较小，说明影响因素对感官评价的影响较小，比酶解温度与酶解ph的交互作用更弱，这与表14中给出的ab》bc相符。在6h和ph＝6.0区段能达到交互效果最好的平面。温度的对鲜味评分的影响最强。
[0237]
从图46可以看出当酶解温度及酶解时间在两端范围时，数值差异较大，中间趋于椭圆形平面，从等高线图热度可以看出各区间因素差异较大，等高线与坐标轴夹角较大，分析可以得出酶解时间和酶解温度具有交互作用明显，酶解时间与酶解温度的交互作用显著性是三个指标中最强的，调节温度和时间的条件平衡对鲜味评分的影响最大。
[0238]
在图47中看出，酶解温度及酶解ph在两端范围时，数值差异较大，中间趋于椭圆形平面，从等高线图热度可以看出各区间因素差异较大，等高线与坐标轴夹角较大，交互作用显著性仅次于温度与时间的引起的变化。随着温度和ph的升高，两端的夹角变小，平面坡度变缓。在50℃以上的温度区间，更有利于鲜味评分的提升。
[0239]
实施例19响应面验证实验
[0240]
根据box-behnken design试验设计所得的结果以及二次多项式回归方程，利用design-expert 12软件获得最佳酶解条件的各因素组合，选择最佳的酶水解度和感官评价的得分，得到的最佳条件组合为酶解时间6.37h，酶解温度49.14℃，酶解ph＝5.87，加酶量为中性蛋白酶0.3g(300ku/l)和风味蛋白酶0.4g(80ku/l)，得到的最佳水解度为25.49％，最佳感官评分为7.51，期望值0.950。
[0241]
为了检验模型预测的准确性，选取相应的酶解条件进行优化，最后在选择酶解时间6.4h，酶解温度49℃，酶解ph＝5.87的条件下进行平行实验三组，得到平均水解度为25.67
±
0.15％，鲜味评分为7.68
±
0.18，相较未酶解前(鲜味评价2.0)提升了2倍以上，蛋白回收率为41.37％。图48为酶解前后蛋白回收率对比，可见最佳酶解条件的蛋白回收率比未经酶处理的黄花菜水提液(蛋白回收率为11.68％)、用实施例12确定的最佳中性蛋白酶条件酶解(蛋白回收率为34.67％)或用实施例17确定的最佳风味蛋白酶条件酶解(蛋白回收率为24.86％)，有明显的提升。此结果与最佳理论条件下的模型预测值通过spss 18.0软件分析后，没有显著性差异。因此，以水解度和感官评价为参数指标，采用响应面法对双酶酶解黄花菜蛋白的工艺设计是合理的。
[0242]
实施例20不同酶解方法对多肽含量的影响
[0243]
一、实验方法
[0244]
以表15的6种方法分别酶解黄花菜，其中复合酶酶解方法及其他黄花菜前处理方法同实施例1，酶解后测定酶解后的多肽含量。
[0245]
方法1为醇提酶解，即不采用纤维素酶，用乙醇沉淀蛋白后加入复合酶酶解。方法2为沸水浴处理酶解，不采用纤维素酶，使用20min沸水浴后，加入复合酶酶解。方法3为无纤维素酶处理，即不采用纤维素酶，直接使用复合酶酶解。方法4为连续酶解(不灭酶)，即纤维素酶处理后，中性蛋白酶6h处理结束后，再加入风味蛋白酶7h酶解。方法5为连续酶解(灭
酶)，即纤维素酶处理后，中性蛋白酶6h处理结束后，沸水浴灭酶5min，再加入风味蛋白酶7h酶解。方法6为实施例1的酶解方法。
[0246]
计算方法见实施例6。以540nm处测得的吸光值为纵坐标，牛血清蛋白标准溶液的浓度为横坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线，如图49，相关系数r2＝0.9992，线性关系良好。
[0247]
二、实验结果
[0248]
由表15可知，不同的前处理过程，其多肽含量都不尽相同。传统的酶解方法使用连续酶解，不受两种酶最佳条件的限制，用正交试验确定的最佳的中性蛋白酶和风味酶条件进行酶解，耗费的时间较长，叠加超声提取和纤维素酶酶解的过程需要16h。同时也可以看出，不同的酶酶解后再灭酶效果更好。其中最好的方法是采用超声破碎辅助提取并采用纤维素酶破壁。使用实施例1确定的最佳复合酶解条件，只需要10h就能达到预期的效果，同时多肽含量是三种处理方法中最高的，达到3.520mg/ml，是方法2多肽含量的3倍。因此，用复合酶解能获得更高经济效益。
[0249]
表15含鲜味肽的黄花菜酶解液多肽含量测定情况
[0250]
酶解方法序号酶解液组分多肽含量(mg/ml)1醇提酶解1.0372沸水浴处理酶解1.0763无纤维素酶处理2.3464连续酶解(不灭酶)3.0425连续酶解(灭酶)3.2576复合酶酶解(实施例1的酶解条件)3.520
[0251]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。