一种幽门螺杆菌四环素耐药的高分辨溶解曲线检测方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于幽门螺杆菌四环素耐药检测的高分辨溶解曲线方法的引物，本发明还涉及利用所述的引物检测hp四环素耐药的方法和试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，简称hp)是世界卫生组织癌症研究机构 (who/iarc)规定的第ⅰ类致癌因子，细菌中唯一的一个。hp是各种消化道 疾病的主要病因，它与慢性胃炎、胃/十二指肠溃疡、微粘膜组织相关淋巴瘤 (malt)和胃癌密切相关。。迄今为止，我国一共发布了五次《全国幽门螺杆 菌感染处理共识》，从最初的三联疗法，到现在的四联疗法，抗生素的使用是必 不可少的。目前在使用的第五次共识中，采用了7种抗生素的组合，并且不推 荐一线方案，根据患者情况和当地hp的耐药情况具体选择。其中包含四环素的 方案有三种，因此四环素在幽门螺杆菌治疗中有着重要的作用，特别是对于阿 莫西林过敏者，只能选择包含四环素的方案。虽然根治幽门螺杆菌是治疗其引 发胃部疾病的根本办法，但是近年来我国的hp根治率却在不断的下降，这其中 的主要原因就是抗生素耐药不断上升的结果。虽然四环在我国耐药率目前处于 较低水平，平均为8.8％，但是研究显示有逐年上升的趋势，所以需要我们密切 的关注，特别是对于hp个体化治疗，必须对四环素的耐药性进行检测。
3.幽门螺杆菌对四环素的耐药主要是由于其16s rdna的四环素结合位点发生突变导致的，虽然推测还有抗菌素灭活酶、外排泵机制、膜通透性改变和生物膜等原因，但是大量的研究显示这些都是辅助作用，其耐药的根本原因还是四环素结合位点的突变。国内外的研究显示，四环素耐药的幽门螺杆菌的16srdna突变位点为aga926-928。其三碱基突变引起hp对四环素高水平耐药，单碱基或者两碱基突变导致低水平耐药。我们分析多个研究结果显示，这三个碱基的突变有多种方式，单一位置可能有多种突变，再加上两种或者三种交叉组合，实际中会出现多种突变组合。
4.对于hp对四环素的耐药检测，传统的分离培养虽然是金标准，但是这一方法耗时耗力，分离率低，对实验室和技术人员要求高，因此在实际中无法开展。目前使用最多的突变检测方法是实时荧光pcr探针法，但是对于hp四环素耐药这种连续突变，并且存在多种组合，需要使用多种探针和组合，因此难以实现。


技术实现要素：

5.针对以上情况，发现高分辨溶解曲线(high-resolution melt,hrm)比较适合hp 16s rdna四环素耐药相关突变检测，这一方法的原理在于通过一对引物的扩增，经过高分辨溶解曲线，能够同时检测多种突变，同时具有很高的灵敏度和特异性。为此，研发了一种用于检测幽门螺杆菌四环素16s rdna耐药突变的hrm方法。该方法灵敏度高、特异性好，并
且可以用于实际样本直接检测。
6.本发明的目的在于提供幽门螺杆菌四环素耐药16s rdna突变基因检测的 hrm方法特异性引物；本发明的目的还在于提供上述引物的用途，从而实现更快更准确地检测hp对四环耐药的能力。
7.本发明的第二个目的还在于提供hp四环素耐药检测的hrm方法的试剂盒，该试剂盒在实际样本检测中具备高灵敏度，高特异性的优点，能够为临床提供一种快速判断幽门螺杆菌对四环素耐药的方法。
8.为达到以上目的，针对幽门螺杆菌16s rdna 296-298突变的位置，设计了一对高分辨溶解曲线引物。引物长度在15-30bp之间，要求引物尽量没有二聚体，引物本身无发卡结构，所扩展产物长度要适中，既要保证扩增效率，又要排除二聚体的干扰。本发明的引物不但可以用于检测幽门螺杆菌菌株，也可以直接用于实际样本，比如胃粘膜的检测。
9.本发明实施方案中，优选的引物序列为：
10.hp-16s rdna-hrmf:5
’‑
aaaggaatagacggggaccc-3’11.hp-16s rdna-hrmr:5
’‑
gattctctcaatgtcaagcctaggt-3’12.本发明中高分辨溶解曲线扩增所用的饱和染料，可以为lc green，ly green 或者eva green，优选地使用eva green。
13.本发明提供了一种用于幽门螺杆菌四环素耐药的高分辨溶解曲线检测方法，包括以样品dna为模板，以hp 16s rdna为靶序列，利用本发明提供的引物进行hrm检测，同时设立阴性对照和阳性对照，最后根据溶解曲线来判定结果。
14.在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
15.溶解曲线与阴性对照一致判断为四环素敏感
16.溶解曲线与阴性对照不一致判断为耐药，具体分为几种情况：
①
a926g,
②ꢀ
a926t,
③
a926c,
④
a928c,
⑤
a926g/a928c,
⑥
ag926-927gt,
⑦ꢀ
a926t/a928c,
⑧
aga926-928ttc。
17.本发明的高分辨溶解曲线反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：
18.成分浓度加入量终浓度hrm analysis premix2x10μl hp 16s rdna-hrm-f10μm0.6μl300nmhp 16s rdna-hrm-r10μm0.6μl300nmdd水 3.8μl 模板 5.0μl 总体积 20μl 19.本发明高分辨溶解曲线反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃变性10s，54℃～60℃退火30s，40个循环；溶解曲线分析。
20.本发明优选的高分辨溶解曲线反应程序为：95℃预变性2min，1个循环； 95℃变性10s，58℃退火30s，40个循环；溶解曲线分析。
21.本发明优选的高分辨溶解曲线方法，每次扩增必须设立阴性对照和阳性对照，两种对照对于结果判读起决定性作用。
22.本发明提供了一种用于幽门螺杆菌四环素耐药检测的试剂盒，其包括上述高分辨
溶解曲线引物一对。
23.本发明试剂盒的引物序列为：
24.hp-16s rdna-hrmf:5
’‑
aaaggaatagacggggaccc-3’25.hp-16s rdna-hrmr:5
’‑
gattctctcaatgtcaagcctaggt-3’26.本发明提供的试剂盒，还包括高分辨溶解曲线反应液，阴性模板和阳性模板，上述阴性模板为四环素敏感的hp菌株，所述阳性模板为四环素耐药的hp 菌株。
27.本发明提供用于幽门螺杆菌四环素耐药检测的高分辨溶解曲线扩增的引物，该引物灵敏度高，特异性好，能够准确判断hp四环素耐药。所述的引物可以检测幽门螺杆菌菌株dna，也可以直接检测胃粘膜标本，其检测通量高，速度快，准确性好。本发明提供的hp四环素耐药检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针、阴性对照和阳性对照，该试剂盒的推广应用有利临床快速检测幽门螺杆菌四环素耐药。
附图说明
28.图1为不同退火温度体系优化检测结果；
29.图2为对其他非幽门螺杆菌扩增；
30.图3为临床分离幽门螺杆菌菌株扩增结果(s为敏感)。
具体实施方式
31.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
32.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.实施例1
34.幽门螺杆菌四环素耐药高分辨溶解曲线体系退火温度优化：体系退火温度从55℃～62℃改变，结果显示58℃左右体系扩增效果最好(图1)
35.体系配制表
[0036][0037]
扩增条件：
[0038]
95℃预变性2min，1个循环；95℃变性10s，55℃～62℃退火30s，40个循环；溶解曲线分析。
[0039]
实施例2
[0040]
对其他胃部及消化道可能出现的非幽门螺杆菌菌株的扩增验证。选择除了幽门螺杆菌以外的其他21种胃肠道可能出现的细菌，采用所构建好的hp 16srdna hrm检测体系进行检测，结果除了幽门螺杆菌之外，其余菌株没有扩增。
[0041]
表1用于检测16s rdna hrm体系特异性模板
[0042]
[0043][0044]
实施例3
[0045]
用优化好的幽门螺杆菌四环素耐药高分辨溶解曲线检测体系，对120株临床分离的hp进行检测，结果显示有6株显示为耐药，与我国报道的四环素耐药比例接近(图3)。
[0046]
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。