一种用于核酸提取的功能化磁性粒子、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及磁性粒子技术领域，具体涉及一种用于核酸提取的功能化 磁性粒子、制备方法及其应用。


背景技术：

2.在应对传染病的爆发过程中，对传染病病原体的早期筛查和检测十分 重要。越是早期检测越有利于后期的控制和治疗，而快速、方便和准确的 检测技术发挥着至关重要的作用。病原体检测是传染病防控的重要环节， 其中如何快速获取高质量病原体核酸十分重要。
3.病原体核酸的提取与纯化市面上已有大量的商业化试剂盒，主要分为 磁珠法提取，膜柱法提取两大类，目前使用比较普遍的为磁珠法，其主要 的工作原理是在磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰，使得磁性粒子 表面附有羟基、羧基等基团，并在高浓度离子化剂(盐酸胍、异硫氰酸胍) 的作用下，主要依靠疏水作用和氢键作用使得核酸与磁珠结合，最后在重 悬液即低盐缓冲液(te)或超纯水的作用下，核酸从磁性粒子上洗脱下来。 如公开号为cn109182327a的专利申请公开磁性纳米粒子在核酸提取中的 应用及其制备方法，其也需要通过洗脱溶液将磁性纳米粒子与核酸的复合 物进行洗脱分离，然后使用外部磁体进行磁分离，再将重悬液中提取的dna 进行扩增。
4.但是传统的核酸提取试剂盒提取核酸的方法在核酸富集阶段中会有少 量的蛋白质也会通过疏水作用或者氢键作用被磁性粒子捕捉，以及漂洗过 程中会有少量的胍盐残留在磁珠中，因此洗脱下来的核酸中会含有微量蛋 白以及胍盐；核酸中含有蛋白与胍盐可能会对下游的扩增反应产生影响， 降低扩增效率。另外无论磁珠法还是膜柱法核酸提取都会涉及到核酸洗脱 这一步骤，而核酸洗脱步骤也会损失部分核酸不能完全的从磁珠上或者硅 膜上洗脱不下来造成洗脱效率不高等问题，因此需要开发一种高质量的、 高效的、免洗脱核酸的病原体核酸提取纯化方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于核酸提取的磁性粒子、 制备方法及其应用。
6.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
7.一种用于核酸提取的功能化磁性粒子，所述磁性粒子表面标记酸性高 分子聚合物，所述磁性粒子表面带有正电荷，致使磁性粒子吸附负电性的 核酸；所述高分子聚合物为：聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)、3-氨丙 基三乙氧基硅烷(aptes)或壳聚糖。
8.有益效果：本发明中的功能化磁性粒子表面带有正电荷，从而可以吸 附带有负电性的核酸，对蛋白质的结合力较弱，使得吸附在磁性粒子上的 核酸较为纯净，只需经过简单清洗，即可洗去杂质；磁性粒子表面修饰高 分子聚合物，增加了高分子聚合物富集核酸的比表面积，吸附核酸效率提 高，达到快速进行核酸提取、富集的目的。
9.优选地，所述磁性粒子为fe3o4。
10.一种用于核酸提取的功能化磁性粒子的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)清洗磁性粒子；
12.(2)用酸性高分子聚合物溶液完全浸泡磁性粒子，然后清洗磁性粒子 外表面；所述高分子聚合物溶液为pdda、aptes或壳聚糖溶液；
13.(3)将已修饰高分子聚合物的磁性粒子进行干燥，得到用于核酸提取 的功能化磁性粒子。
14.有益效果：本发明通过高分子聚合物溶液修饰，带有特殊基团(-oh、
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cooh、-nh2等)，使得磁性粒子表面引入大量的羟基基团，在酸性条件 下使得高分子聚合物磁性粒子表面带有大量的正电荷，而核酸在酸性条件 下带有大量的负电荷，通过正负电荷相吸，就达到高分子聚合物磁性粒子 吸附分析核酸的作用。
15.本发明中的磁性粒子在吸附核酸后，可以直接将富集核酸的磁性粒子 用于核酸扩增反应，核酸无需洗脱。
16.优选地，所述清洗磁性粒子包括以下步骤：
17.a.用超声波清洗仪分散团聚的磁性粒子；
18.b.用盐酸清洗磁性粒子外表面；
19.c.用去离子水清洗磁性粒子外表面。
20.优选地，所述步骤a中分散时间为1～30min；所述步骤b和c中清洗 的时间为20min～1h；所述步骤b中盐酸的浓度为0.1m～3m。
21.优选地，所述步骤(2)中浸泡时间为40min～2h，清洗的次数为20～ 50次。
22.优选地，所述步骤(2)中酸性高分子聚合物溶液中含有盐酸，所述高 分子聚合物的浓度为0.1％～20％，高分子聚合物溶液中盐酸的浓度为 0.1m～1m，酸性高分子聚合物溶液的ph为3.5～4.5。
23.优选地，所述步骤(3)中干燥的条件为40～60℃干燥30min或以上。
24.一种包含上述功能化磁性粒子的核酸提取试剂盒，还包括裂解液、结 合液、漂洗液1、漂洗液2和重悬液；所述功能化磁性粒子重悬于乙醇中得 到磁性粒子悬浮液；
25.所述裂解液由以下浓度的原料组成：盐酸胍0.5～5m、十二烷基磺酸钠 0.5～500mm、edta 5～500mm、蛋白酶k 30～200mg/ml、pvp 2～80mm、 溶剂为水；所述裂解液在使用时调节ph至3.5～6；
26.所述结合液由以下浓度的原料组成：异硫氰酸胍2～6m、醋酸0.2～1m、 醋酸钠0.2～1m、dmso 1～100mm、溶剂为水；
27.所述漂洗液1由以下浓度的原料组成：盐酸胍1～3m、醋酸0.2～1m、 醋酸钠0.2～1m、溶剂为体积分数55％的乙醇；
28.所述漂洗液2由以下浓度的原料组成：醋酸钠0.5～2m、溶剂为体积分 数75％的乙醇；
29.所述重悬液由0.1～0.5x te缓冲液组成。
30.有益效果：本发明采用电荷吸附法，通过改变裂解液的ph值，使高分 子聚合物表面带正电，从而使磁性粒子表面带正电，核酸带浮点，可以特 异性、高效性地吸附核酸，同时漂洗液始终维持酸性条件，可以极大地减 少磁性粒子上的核酸在漂洗过程中产生损失，
从而提高核酸提取效率。
31.本发明中的裂解液可以让病原体裂解更加充分，操作简单，所用时间 短。
32.本发明对裂解液、结合液、漂洗液中各原料和浓度范围进行筛选，裂 解液中盐酸胍、十二烷基磺酸钠、edta和蛋白酶k可以有效的破坏细胞 或病毒的结构，pvp可以有效的中和样本中杂质，醋酸-醋酸钠维持裂解液 ph值范围，结合液中硫氰酸胍可以维持结合液中盐离子浓度，dmso可以 溶解裂解液中存在的有机物，醋酸-醋酸钠维持结合液ph值范围，漂洗液1 中盐酸胍可以维持漂洗液中离子浓度，无水乙醇溶解蛋白等有机物，醋酸
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醋酸钠维持裂漂洗液1的ph值范围，漂洗液2中无水乙醇溶解蛋白质等有 机物，醋酸钠维持漂洗液2的ph值范围。
33.一种采用上述功能化磁性粒子的核酸提取试剂提取核酸的方法，包括 以下步骤：
34.(1)往待提取物中加入裂解液，然后加入蛋白酶k溶液，混合后温浴；
35.(2)将温浴后的液体离心，取上清液，加入等体积的结合液，加入磁 性粒子悬浮液，混合振荡吸附；
36.(3)吸附完成后，去除废液，保留磁性粒子；加入漂洗液1，振荡后 重悬磁性粒子，去除废液，保留磁性粒子；再次加入漂洗液2，振荡后重悬 磁性粒子，去除废液，保留磁性粒子，干燥，得到外表面吸附核酸的磁性 粒子，置于重悬液中。
37.有益效果：本发明中的裂解液和结合液可以使高分子聚合物磁性粒子 表面带有大量正电荷，且该环境还可以使核酸带有负电性，本发明外表面 吸附核酸的磁性粒子可直接用于核酸扩增反应，核酸无需洗脱下来，可直 接在磁性粒子上进行pcr或等温扩增反应，简化了操作步骤，节省了提取 时间。
38.本发明通过悬浮液对磁性粒子进行悬浮，然后可以将带有核酸的磁性 粒子加入到扩增反应液中进行直接扩增，可以节省洗脱时间，且免去了普 通核酸提取时洗脱步骤中不能完全洗脱磁性粒子上的核酸而造成核酸的损 失。
39.本发明的核酸提取或纯化过程一直在酸性条件下，可以有效的对蛋白 质、抑制性离子与表面带有正电荷的改性磁性粒子进行分离，这样得到的 核酸比较纯净，有利于核酸提取纯化后的扩增与分析。
40.优选地，将悬浮后的磁性粒子用于核酸扩增反应，采用等温扩增技术 (rpa、lamp、sda等)方法。
41.优选地，将悬浮后的磁性粒子用于核酸扩增反应，采用荧光定量pcr 扩增方法。
42.本发明的优点在于：本发明通过高分子聚合物溶液修饰，带有特殊基 团(-oh、-cooh、-nh2等)，使得磁性粒子表面引入大量的羟基基团， 在酸性条件下使得高分子聚合物磁性粒子表面带有大量的正电荷，而核酸 在酸性条件下带有大量的负电荷，通过正负电荷相吸，就达到高分子聚合 物磁性粒子吸附分析核酸的作用。
43.本发明中的磁性粒子在吸附核酸后，可以直接将富集核酸的磁性粒子 用于核酸扩增反应，核酸无需洗脱。
44.本发明采用电荷吸附法，通过改变裂解液的ph值，使高分子聚合物表 面带正电，从而使磁性粒子表面带正电，核酸带浮点，可以特异性、高效 性地吸附核酸，同时漂洗液始终维持酸性条件，可以极大地减少磁性粒子 上的核酸在漂洗过程中产生损失，从而提高核酸提取效率。
45.本发明中的裂解液可以让病原体裂解更加充分，操作简单，所用时间 短。
46.本发明中的裂解液和结合液可以使高分子聚合物磁性粒子表面带有大 量正电荷，且该环境还可以使核酸带有负电性，本发明外表面吸附核酸的 磁性粒子可直接用于核酸扩增反应，核酸无需洗脱下来，可直接在磁性粒 子上进行pcr或等温扩增反应，简化了操作步骤，节省了提取时间。
47.本发明通过悬浮液对磁性粒子进行悬浮，然后可以将带有核酸的磁性 粒子加入到扩增反应液中进行直接扩增，可以节省洗脱时间，且免去了普 通核酸提取时洗脱步骤中不能完全洗脱磁性粒子上的核酸而造成核酸的损 失。
48.本发明的核酸提取或纯化过程一直在酸性条件下，可以有效的对蛋白 质、抑制性离子与表面带有正电荷的改性磁性粒子进行分离，这样得到的 核酸比较纯净，有利于核酸提取纯化后的扩增与分析。
附图说明
49.图1为本发明实施例中基本原理图，即磁性粒子外表面标记方法示意 图；
50.图2为本发明实施例1和实施例2中两种不同的具体实施方式核酸提 取后rpa扩增曲线；
51.图3为本发明实施例1和实施例2中两种不同的具体实施方式核酸提 取后pcr扩增曲线。
具体实施方式
52.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本 发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业 途径获得。
54.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描 述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
55.实施例中所用试剂均购自上海生工生物技术公司，扩增试剂分别购自 twistdx公司、bioline公司，磁性粒子购金准智造生物科技(吉林)有限公 司，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus) 由安徽医科大学提供，为公知公用材料。
56.实施例1
57.1、高分子聚合物标记磁性粒子
58.1)用超声波清洗仪分散团聚的磁性粒子，分散时间为10min；
59.2)用0.5m盐酸清洗磁性粒子外表面，清洗时间为20min；
60.3)用去离子水清洗磁性粒子外表面，清洗时间为20min；
61.4)用浓度为5％的壳聚糖水溶液、并含有0.2m盐酸，ph 3.5，完全浸 泡磁性粒子，浸泡磁性粒子5h；
62.5)用去离子水清洗磁性粒子外表面，清洗次数为30次；
63.6)修饰上高分子聚合物磁性粒子置于50℃恒温箱内干燥30min；得到 用于核酸提取的功能化磁性粒子。
64.7)将烘干后的高分子聚合物磁性粒子加入90％的酒精进行重悬浮保 存，得到纳米磁性粒子悬浮液。
65.2、用于核酸快速提取、富集的功能化磁性粒子的核酸提取试剂盒：
66.其中，裂解液组成为：盐酸胍0.5m、十二烷基磺酸钠20mm、edta 50mm、蛋白酶k 30mg/ml、pvp 10mm、溶剂为超纯水；所述的裂解液在 使用时，使用醋酸0.2m、醋酸钠0.2m缓冲液调节ph值范围为4；
67.结合液组成为：异硫氰酸胍3m、醋酸0.2m、醋酸钠0.2m、dmso 10mm、 溶剂为超纯水；
68.漂洗液1组成为：盐酸胍1m、无水乙醇体积百分比55％，醋酸0.2m、 醋酸钠0.3m、溶剂为体积分数为55％的乙醇；
69.漂洗液2组成为：醋酸钠0.5m，无水乙醇体积百分比75％、溶剂为体 积分数为75％的乙醇；
70.重悬液组成为0.5x te。
71.按照上述各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、 纳米磁性粒子悬浮液和重悬液。
72.3、用于微量复杂性物证检材dna提取纯化的试剂盒的提取方法，包 括如下步骤：
73.1)取待提取物100μl放入离心管中，向离心管中加入200μl裂解液， 接着加入40mg/ml的蛋白酶k溶液10μl，涡旋混匀后，放入56℃恒温摇 床温浴5min；
74.2)温浴后，离心10000rpm，1min；取出上清液于新的离心管中，向 上清液中等体积加入结合液，再加入10μl纳米磁性粒子悬浮液，室温，放 于振荡器中连续振荡吸附2min；
75.3)吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置3min，吸弃管中废液， 保留磁性粒子；
76.4)向离心管中加入500μl漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁 性粒子后置于磁力架，吸弃液体保留磁性粒子；
77.5)向离心管中加入500μl漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁 性粒子后置于磁力架，吸弃液体保留磁性粒子；
78.6)将离心管置于室温干燥3min；
79.7)加入50μl重悬液，涡旋振荡，使磁性粒子重悬至重悬液中进行保 存待用。
80.8)分别配制等温扩增检测试剂rpa、荧光定量pcr检测试剂进行检 测，其中等温扩增检测试剂rpa、荧光定量pcr检测试剂均为现有技术。
81.实施例2
82.1、高分子聚合物标记磁性粒子
83.1)用超声波清洗仪分散团聚的磁性粒子，分散时间为20min；
84.2)用0.5m盐酸清洗磁性粒子外表面，清洗时间为30min；
85.3)用去离子水清洗磁性粒子外表面，清洗时间为30min；
86.4)用浓度为5％的aptes水溶液，并含有0.5m盐酸，ph 4，完全浸 泡磁性粒子，浸泡磁性粒子20h；
87.5)用去离子水清洗磁性粒子外表面，清洗次数为50次；
88.6)修饰高分子聚合物的磁性粒子置于56℃恒温箱内干燥40min；得到 用于核酸提取的功能化高分子聚合物磁性粒子。
89.7)将烘干后的高分子聚合物磁性粒子加入95％的酒精进行重悬浮保 存，得到纳米磁性粒子悬浮液。
90.2、所述的用于核酸快速提取、富集的功能化磁性粒子配套试剂的制备 方法如下步骤；
91.其中，裂解液组成为：盐酸胍0.8m、十二烷基磺酸钠30mm、edta 70mm、蛋白酶k 40mg/ml、pvp 20mm、溶剂为超纯水；所述的裂解液在 使用时，使用醋酸0.3m、醋酸钠0.3m、缓冲液调节ph值范围为4.5；
92.结合液组成为：异硫氰酸胍4m、醋酸0.4m、醋酸钠0.4m、dmso 20mm、 溶剂为超纯水；
93.漂洗液1组成为：盐酸胍2m、无水乙醇体积百分比55％，醋酸0.3m、 醋酸钠0.4m、溶剂为体积分数55％的乙醇；
94.所述漂洗液2组成为：醋酸钠0.6m，无水乙醇体积百分比75％、溶剂 为体积分数75％的乙醇；
95.所述重悬液组成为0.1x te。
96.按照上述各组分含量分别配制裂解液、结合液、漂洗液1、漂洗液2、 纳米磁性粒子悬浮液和重悬液。
97.3、用于微量复杂性物证检材dna提取纯化的试剂盒的提取方法，其 特征在于，包括如下步骤：
98.1)取待提取物50μl放入离心管中，向离心管中加入200μl裂解液， 接着加入40mg/ml的蛋白酶k溶液10μl，涡旋混匀后，放入56℃恒温摇 床温浴5min；
99.2)温浴后，离心10000rpm，1min；取出上清液于新的离心管中，向 上清液中等体积加入结合液，再加入10μl纳米磁性粒子悬浮液，室温，放 于振荡器中连续振荡吸附2min；
100.3)吸附完成后，将离心管置于磁力架上，静置3min，吸弃管中废液， 保留磁性粒子；
101.4)向离心管中加入500μl漂洗液1，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁 性粒子后置于磁力架，吸弃液体保留磁性粒子；
102.5)向离心管中加入500μl漂洗液2，盖上离心管盖，涡旋振荡重悬磁 性粒子后置于磁力架，吸弃液体保留磁性粒子；
103.6)将离心管置于室温干燥3min；
104.7)加入50μl重悬液，涡旋振荡，使磁性粒子重悬至重悬液中进行保 存待用。
105.8)分别配制等温扩增检测试剂rpa、荧光定量pcr检测试剂进行检 测，其中等温扩增检测试剂rpa、荧光定量pcr检测试剂均为现有技术。
106.本发明实施例1、2采用的样本均为同一管样本分装出来的。采用同一 批次配置的rpa扩增检测试剂，经过检测结果发现高分子聚合物磁性粒子 提取的核酸经过原位rpa扩增检测、在5分钟左右就能明显看到扩增，整 个检测提取加检测结果判断可以控制在30min左右就可以出结果。由实验 结果可以看出本发明的一种集核酸提取、富集和原位扩增于一
体的高分子 聚合物磁性粒子制备方法及其应用优势突出。
107.本发明实施例1、2采用的样本均为同一管样本分装出来的。采用同一 批次配置的荧光定量pcr扩增检测试剂，经过检测结果发现高分子聚合物 磁性粒子提取的核酸经过原位荧光定量pcr扩增检测、经过一个小时扩增 检测可以有扩增曲线。由实验结果可以看出本发明的一种集核酸提取、富 集和原位扩增于一体的高分子聚合物磁性粒子制备方法及其应用优势突 出。
108.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分 技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本 质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。