锌结合醇脱氢酶基因在调控昆虫求偶交配行为中的应用

1.本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及锌结合醇脱氢酶基因在调控昆虫求偶交配行为中的应用。


背景技术：

2.昆虫，隶属六足亚门(hexapoda)，昆虫纲(insecta)，是节肢动物门(arthropoda)中最大的纲。昆虫起源于早奥陶世(约4.79亿年前)，已有超过100万个记录在案的物种，包含了地球上所有被描述物种的50％以上。毋庸置疑，它们已成为生物多样性的典范，凭借体型小，有翅飞行和繁殖能力强的特征，几乎可以在任何环境中找到它们。
3.昆虫体内一些内生菌已成为昆虫多样化的重要驱动力，一些研究表明昆虫内生菌很大程度上促进了昆虫多样性，至少20％的昆虫物种拥有最常见的内共生细菌沃尔巴克氏菌体(wolbachia)，已发现它们的基因被水平转移进昆虫宿主基因组中。水平基因转移(horizontal gene transfer,hgt)又称横向基因转移(lateral gene transfer,lgt)，是指遗传物质在生殖隔离的远亲物种之间的转移。这种在亲缘关系较远的物种之间发生基因交流的现象，在细菌、真菌和病毒中很常见。
4.基因水平转移打破了物种间的壁垒，传播了遗传多样性。基因水平转移能帮助受体生物绕过基因从头合成的缓慢过程，从而加速了受体基因组的革新和进化。这一条新颖的基因产生途径引发研究人员对hgt基因更多的思考和讨论。对昆虫水平转移基因的研究，不仅能丰富人类对自然界的认识，还有助于解决实际生产和人类疾病防控中所面临的重大问题。尤其是对于昆虫基因功能的基础研究和应用研究一直都是热点而言，通过实验来研究hgt基因功能等问题，对害虫防治、益虫防病、药物开发等有着非常重要的现实意义。


技术实现要素：

5.本发明鉴定到了鳞翅目昆虫经过水平转移获得的外源基因(锌结合醇脱氢酶基因，zinc-binding alcohol dehydrogenase family)，发现它们是昆虫求偶及交配行为的重要基因，可应用于农业害虫防治，为加深昆虫求偶行为的研究及害虫治理提供基因资源及理论指导。
6.具体技术方案如下：
7.本发明提供了锌结合醇脱氢酶基因在调控昆虫求偶交配行为中的应用，所述锌结合醇脱氢酶基因为碱基序列如下所示ncbi gene id的同源基因中的一种：
8.obru01_00409；rr46_09879；rr46_09880；b5v51_2066；b5v51_8198；evar_28206_1；hw555_002958；hw555_002959；apla_locus1609；loc106106992；loc106107418；loc106142570；loc106718109；loc106718102；loc110998387；loc110998388；loc110378529；loc110378139；loc110378149；loc111359520；loc113396957；loc113228497；loc113228627；loc113492084；loc113492085；loc113511096；loc114253337；loc114354775；loc114359161；loc116773598；loc118264517；
loc118264683；loc118264652；loc119189093；loc115443671；loc101739568；loc112052862；loc117987506；loc105383139。
9.本发明还提供了一个具体方案，锌结合醇脱氢酶基因在调控昆虫求偶交配行为中的应用，所述锌结合醇脱氢酶基因的碱基序列如ncbi gene id：loc105383139所示。
10.本发明利用qrt-pcr统计雌雄loc105383139基因表达量，结果表明雄虫表达量明显高于雌虫。利用crisper-cas9基因敲除技术，敲除了小菜蛾中的锌结合醇脱氢酶基因，获得了稳定遗传、纯合体的转基因小菜蛾品系。该品系的雄性小菜蛾求偶次数明显减少，表现出低欲望的求偶行为，导致交配行为减少，卵孵化数量和受精卵数量降低。
11.进一步地，所述调控的途径为：利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术，使昆虫体内的锌结合醇脱氢酶基因缺失或表达量降低，从而降低昆虫的求偶指数和交配指数。
12.本发明还提供了锌结合醇脱氢酶基因在调控昆虫卵孵化中的应用，所述锌结合醇脱氢酶基因的碱基序列如ncbi gene id：loc105383139所示。
13.进一步地，所述调控的途径为：利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术，使昆虫体内的锌结合醇脱氢酶基因缺失或表达量降低，从而降低昆虫的卵孵化数量和受精数量。
14.进一步地，所述昆虫为鳞翅目昆虫。
15.更进一步地，所述昆虫为小菜蛾。
16.更进一步地，所述昆虫为雄性小菜蛾。
17.本发明还提供了锌结合醇脱氢酶基因在制备求偶交配异常小菜蛾模型中的应用，所述锌结合醇脱氢酶基因的碱基序列如ncbi gene id：loc105383139所示。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.(1)本发明首次公开loc105383139基因编码的锌结合醇脱氢酶对昆虫求偶交配行为的影响，loc105383139基因纯合突变体造成求偶和交配行为异常。
20.(2)本发明为加深锌结合醇脱氢酶基因的研究，以及昆虫求偶和交配行为等性状的研究和应用提供了新的基因资源及理论指导。
附图说明
21.图1为实施例1中构建loc105383139基因敲除品系流程图(a)及pcr验证结果(b)；其中，wt为野生型小菜蛾，mt-139为小菜蛾纯合突变系，nc为阴性对照，marker为标准条带。
22.图2为实施例1中锌结合醇脱氢酶基因系统发育进化树示意图。
23.图3为实施例1中crispr-case9系统产生纯合突变系(mt-139)的示意图。
24.图4为实施例1中qrt-pcr检测loc105383139基因在小菜蛾不同发育阶段的表达谱；
25.其中，egg为卵；l1为第1-2天幼虫；l2为第3天幼虫；l3为第4天幼虫；l4e为第5天幼虫；l4l-m为第7天雄幼虫；l4l-f为第7天雌幼虫；pe-m为第1-2天雄蛹，蛹早期；pe-f为第1-2天雌蛹，蛹早期；pl-m为第4-5天雄蛹，蛹晚期；pl-f为第4-5天雌蛹，蛹晚期；a-m为雄性成虫；a-f为雌性成虫。
26.图5为实施例2中雌雄小菜蛾求偶指数和交配指数观测示意图。
27.图6为实施例2中不同处理组在48小时内产卵量比较结果。
28.图7为实施例2中小菜蛾卵在70小时内四个不同发育阶段比较结果。
29.图8为实施例2中雄性和雌性在48小时内求偶和交尾交配比较结果。
具体实施方式
30.为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，且仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
31.基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
32.除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的实验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法使按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
33.实施例1
34.1.锌结合醇脱氢酶基因的筛选和鉴定
35.为了筛选中从非后生动物门经过水平转移获得的hgt基因，采用了一种稳健和保守的并且是基于系统发育生物学的方法。首先，对从基因组里注解得到的所有基因，使用diamond(v2.0.9)在整个ncbi参考数据库中进行序列对比，查找是否有与细菌，真菌，病毒，植物等其它界相似的序列，基于同源序列构建基因系统发育树，将构建得到的进化树与已知的物种进化关系进行比较，若基因树与物种树的拓扑结构严重不一致，且进化枝牢牢地嵌套在基因树中的供体谱系中，则推断该基因是经过水平转移而获得的。
36.在筛选结果中，鉴定到了锌结合醇脱氢酶基因，该基因是从一个李斯特菌属(listeria)中来，被引入到蛾子和蝴蝶的一个共同祖先中。该基因属于细菌来源的水平转移基因，但对其在供体李斯特菌和受体昆虫中的功能知之甚少。对其基因家族进化分析表明，除二化螟(chilo suppressalis)和条纹小粉蝶(leptidea sinapis)外，几乎所有的蛾类和蝴蝶都含有其直系同源基因，其中该基因在12个蛾子和蝴蝶(如金凤蝶)中发生了多拷贝，而在13种物种中(如小菜蛾)是单拷贝。
37.为了评估该水平转移基因的生物学功能，选择十字花科蔬菜的重要农业害虫—小菜蛾作为研究对象。经鉴定，该基因在小菜蛾的ncbi基因号为loc105383139，并且是单外显子，设计针对该基因外显子上的两个靶点的sgrna序列(sgrna1和sgrna2)，利用crispr-cas9系统对该基因进行编辑。在突变体第二代成功筛选到了一个纯合突变系(mt-139)，经过测序发现该基因缺失了191bp。
38.2.构建锌结合醇脱氢酶基因的系统发育树
39.将筛选得到的锌结合醇脱氢酶基因(表格1)与李斯特菌属等细菌来源的同源序列构建系统发育树。具体而言，使用mafft(v 7.299)对它们进行序列比对，并使用trimal v1.4修剪模糊对齐的区域，基于比对结果，使用iq-tree(1.6.12)及其最佳的氨基酸进化模型(lg g4 f)和bootstrap＝1000来推断系统发育进化树(最大似然法)(如图2)；
40.表1实施例1锌结合醇脱氢酶基因列表
[0041][0042][0043]
由表1可知，该基因是细菌来源的锌结合醇脱氢酶基因，经水平基因转移引入进鳞翅目昆虫基因组中。该在整个鳞翅目昆虫中分布较为广泛，并且在个别物种如草地贪夜蛾，棉铃虫等害虫中发生多拷贝，也暗示着其可能具有重要的生物学功能。
[0044]
实施例2
[0045]
1.crispr/cas9系统构建loc105383139基因突变体
[0046]
根据ggn19gg规则，通过crispdirect在线工具(http://crispr.dbcls.jp)设计了
两个针对小菜蛾基因loc105383139的sgrna；并通过在整个小菜蛾基因组中进行blastn，消除了这两个sgrnas潜在的脱靶效应(图3)。
[0047]
sgrna1:5
’‑
ggaggtgagtttgccggcggtgg-3’；
[0048]
sgrna2:5
’‑
ggcgaccacgtctacttctccgg-3’；
[0049]
正向引物：
[0050]
px139-sg1-f：5
’‑
taatacgactcactataggaggtgagtttgccggcgggttttagagctagaaatagcaagttaaataaggctagtcc-3’；
[0051]
px139-sg2-f：5
’‑
taatacgactcactataggcgaccacgtctacttctcgttttagagctagaaatcaagttaaataaggctagtcc-3’；
[0052]
反向引物：
[0053]
sgrna-r：5
’‑
aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctaaaa-3’。
[0054]
该引物用于体外合成sgrna的模板。pcr产物用takara minibest琼脂糖凝胶dna提取试剂盒(takara)纯化，然后用t7高产率rna转录试剂盒(vazyme)转录。
[0055]
将sgrna1(500ng/μl)、sgrna2(500ng/μl)和cas9蛋白(500ng/μl，gencrispr nls-cas9-nls核酸酶，genscript)的混合物在37℃孵育10min，以形成稳定的sgrnas/cas9复合物。
[0056]
为了建立稳定的loc105383139基因敲除的纯合突变株系，我们设计一系列杂交及筛选方案。使用femtojet 4i和injectman 4微量注射系统(eppendorf)将sgrnas/cas9溶液注射到小菜蛾卵中(产卵后1h内采集)。注射的卵立即恢复正常饲养条件，并作为g0发育到成虫。随后，g0成虫与野生型成虫(wt)配对交配，产生g1后代。然后用fastpure细胞/组织dna分离小型试剂盒(vazyme)提取g0个体的基因组dna。pcr扩增含有sgrna靶位点的区域，并对产生的pcr产物进行测序，检测突变情况。基因分型后，重点研究g0突变产生的g1代；保留的g1交叉杂交产生的g2后代。然后，进行g2交叉杂交，通过pcr基因分型，仅保留纯合突变体g2亲本的后代g3，两个pcr引物：pcr-f：5
’‑
cgtcaagtgtagtgattgcgtt-3’；pcr-r：5
’‑
tacaagtaaaaacatattttttattcaacttg-3’。最终，得到loc105383139基因敲除株系(mt-139)(如图1)。
[0057]
2.定量pcr
[0058]
qrt-pcr检测未做基因敲除的正常小菜蛾在不同发育时期的loc105383139基因的表达量；各发育时期分别为卵、l1(第1-2天幼虫)、l2(第3天幼虫)、l3(第4天幼虫)、l4e(第5天幼虫)、l4l-m(第7天雄幼虫)、l4l-f(第7天雌幼虫)、pe-m(第1-2天雄蛹；蛹早期)、pe-f(第1-2天雌蛹；蛹早期)、pl-m(第4-5天雄蛹；蛹晚期)、pl-f(第4-5天雌蛹；蛹晚期)、a-m(雄性成虫)和a-f(雌性成虫)。用rna提取试剂盒(fastpure cell/tissue total rna isolation kit,vazyme)提取总rna，然后用反转录试剂盒(hiscript iii rt supermix for qpcr,vazyme)反转录成cdna。使用定量pcr试剂盒(chamq sybr qpcr master mix kit,vazyme)在定量pcr仪中(ariamx real-time pcr,agilent technologies)中进行qrt-pcr。在95℃下反应30s，然后进行45个循环的三步聚合酶链反应，分别在95℃、55℃和72℃下分别进行10s、20s和20s的扩增，以β-tubulin作为内参基因将定量pcr结果标准化，并用2-δδct
法测定相对浓度(如图4)。
[0059]
定量pcr特异性引物：
[0060]
px139-qf:5
’‑
gaacccgatcgacacgaagc-3’；
[0061]
px139-qr:5
’‑
ccggagaagtagacgtggtc-3’；
[0062]
px-β-tubulin-f:5
’‑
gacgcatgtccatgaaggag-3’；
[0063]
px-β-tubulin-r:5
’‑
ccaatgcaagaaagccttgc-3’。
[0064]
结果如图4所示，qrt-pcr结果表明该基因在野生型雄蛾和雌蛾的不同发育阶段的表达水平存在差异，与其他不同发育阶段相比，成年雄蛾的表达量明显最高，暗示其在成虫阶段特别是雄性个体中发挥着重要的功能。
[0065]
实施例2
[0066]
1.卵孵化数量统计
[0067]
产卵试验皆为新羽化的小菜蛾共设4组，分别为雌虫
×
雄虫15对(wt组)、mt-139雌虫
×
雄虫15对(mt-139组)、mt-139雌虫15对(wt未受精组)、mt-139雌虫15对(mt-139未受精组)。每一对或每一只雌性都被单独放在一个塑料盒里。24小时后，小菜蛾雌虫被转移到一个新的盒子里，里面有一张产卵纸。在小菜蛾雌虫产卵48h后，分别记录其产卵量。(图6)
[0068]
结果如图6所示，15对敲除型雄性
×
雌性(mt-139)的产卵量(wilcoxon秩检验，p＝2.3e-5
)显著低于15对野生型雄性
×
野生型雌性(mt-139：46粒，wt：101粒)。然而，15个未受精敲除型的昆虫产卵量与15个未受精野生型的产卵量几乎一致(mt-139-virgin：28个卵，wt-virgin：25个卵)。
[0069]
2.卵发育情况统计
[0070]
为了解上述不同条件下，雌虫产的卵发育情况，我们仔细监测了4个不同发育阶段卵孵化占比。分别为0～10h(ⅰ期，无原肠胚)、30h(ⅱ期，可见眼斑)、60h(ⅲ期，可见头囊)和70h(ⅳ期，孵化)。用szx2-illt(奥林巴斯)数码显微镜拍摄了小菜蛾卵发育过程中的形态特征。(图7)
[0071]
结果如图7所示，敲除型昆虫产卵的孵化率显著低于野生型昆虫产卵的孵化率(mt-139：孵化率＝9.5％；wt：孵化率＝56％)。在这些敲除型昆虫产生的未孵化的卵中，80％以上的卵滞育在i阶段(无原肠发育)，而在野生型昆中，只有35％的卵滞育在i阶段。这一发育缺陷与未受精的卵的观察到的结果是一致的。
[0072]
3.单对交配行为实验
[0073]
单对交配行为实验，1日龄雄性(wt或mt-139)和雌性(wt或mt-139)在冷麻醉后被放入到直径1.6cm，高度1.6cm的圆形区间。行为实验在25
±
1℃和65
±
5％相对湿度的正常光环境下进行，并用数码摄像机持续记录(fdr-ax700，索尼)48小时(图3)。在一段时间内，我们通过观察两个行为来定义和评估求偶：(1)持续拍打翅膀(2)雄性腹部向雌性移动并倾斜。求偶指数是成功求偶的占比。交配指数是指交配时间持续约一小时的占比。每组24对雄蛾和雌蛾，每组三个重复。(图8)
[0074]
结果如图8所示，基因敲除型雄蛾(mt-139
♂
)的求偶比例明显较低，而对应的野生型雄蛾(wt
♂
)在48小时内的平均百分比(mt-139
♂×
mt-139
♀
：46％；mt-139
♂×
wt-139
♀
：48％；wt
♂×
wt
♀
：86％；wt
♂×
mt-139
♀
：84％)。在48小时内，敲除型雄蛾与敲除型/野生型雌蛾交配的比例明显低于野生型雄蛾(mt-139
♂×
mt-139
♀
：11％；mt-139
♂×
wt-139
♀
：10％；wt
♂×
wt
♀
：65％；wt
♂×
mt-139
♀
：67％)。
[0075]
综上所述，在小菜蛾中，缺乏loc105383139基因的雄虫求偶和交配行为显著降低。更具体地说，缺乏loc105383139的雄性向雌性求偶的次数明显减少，导致交配行为减少，繁殖水平降低。