一种固定化菌体以及烟酰胺的制备方法与流程

1.本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种固定化菌体，以及采用该固定化菌体制备烟酰胺的方法。


背景技术：

2.烟酰胺(nicotinamide)，又称尼克酰胺、维生素b3，分子式：c6h6n2o，分子量为122.13，为白色的结晶性粉末，无臭或几乎无臭，味苦。烟酰胺作为辅酶nadh和辅酶nadph的组成部分，参与包括atp合成在内的200多种酶促反应，为生物呼吸链的氧化过程传递氢原子，在生物的生命过程中发挥至关重要的作用。
3.烟酰胺在肉类、鱼类和小麦等食物中含量丰富，但在蔬菜中的含量较少。目前，烟酰胺主要作为饲料的营养性添加剂(水溶性维生素)，也可用于食品、医药和化妆品，还可用作染料的中间体、电镀液的添加剂和生化试剂等。
4.烟酰胺的合成方法主要包括化学法和生物法。其中，化学法是采用3-甲基吡啶、2-甲基-1,5-戊二胺、2-甲基-5-乙基吡啶等为初始原料，通过氧化剂直接氧化或催化氧化生成3-氰基吡啶，再经过碱液水解生产烟酰胺。化学法合成工艺比较成熟，但需要使用昂贵的催化剂，且需要高温条件和多步反应，反应后产物含量不高，组分不纯，不利于提取，且对环境的污染较大。生物法是采用产腈水合酶转化3-氰基吡啶生成烟酰胺，具有反应条件温和、成本低、对环境友好等优点。中国专利申请cn107916283a公开了一种生物催化合成烟酰胺的方法，包括：以水为溶剂，重悬包含seq id no.1或2所示序列的大肠杆菌，制成细胞悬液；向细胞悬液中分批加入底物3-氰基吡啶并控制浓度≤90g/l，反应生成烟酰胺。该专利使用的工程菌可以在水性悬浮液中保持高酶活，使制成的烟酰胺成品中杂质夹带较少，但是烟酰胺收率仍有待进一步提升。


技术实现要素：

5.本发明主要解决的技术问题是提供一种用于合成烟酰胺的固定化菌体，以及采用该固定化菌体制备烟酰胺的方法。本发明方法工艺流程简单，反应条件温和，对环境友好，所得烟酰胺产品的纯度高。
6.为解决上述技术问题，第一方面，本发明提供了一种固定化菌体，制备原料包括固定化用复合材料和菌体；
7.以质量百分含量计，所述固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇2.5％～3.5％，海藻酸钠2.0％～2.5％，二氧化硅0.1％～1％，活性炭0.1％～1％，余量为水。
8.进一步优选地，以质量百分含量计，所述固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇2.5％～3.5％，海藻酸钠2.0％～2.5％，二氧化硅0.1％～0.2％，活性炭0.1％～0.2％，余量为水。
9.作为本发明一种优选的实施方案，所述聚乙烯醇(pva)选自聚乙烯醇1799、聚乙烯醇1788中的任一种或两种的混合。
10.作为本发明一种优选的实施方案，所述海藻酸钠(sa)的粘度为500～1000map
·
s。
11.作为本发明一种优选的实施方案，所述固定化用复合材料与菌体的质量配比为1：(0.05～0.2)。
12.作为本发明一种优选的实施方案，所述菌体为产腈水合酶的菌体，可通过商业途径获得，也可参照文献或专利(如cn107916283a、cn103060397b等)中公开的方法筛选/制备得到。所述产腈水合酶为野生型酶或突变型酶。所述突变型酶的酶活性和/或耐受性(耐盐、温度、ph值等)明显优于野生型酶。优选地，所述菌体为产腈水合酶的丙酸棒杆菌，为市售商品。
13.作为本发明一种优选的实施方案，所述固定化菌体的制备步骤包括：将聚乙烯醇、海藻酸钠和水混合，制成水凝胶；在水凝胶中加入二氧化硅和活性炭，混合后制成固定化用复合材料；将菌体与固定化用复合材料混合，之后滴加到氯化钙水溶液中，制成小球状的固定化菌体。
14.优选地，所述氯化钙水溶液的质量百分比浓度为2％～5％。
15.所述滴加可以采用滴球器，均速滴加即可，以制成固定化菌体小球，经过滤、清洗后，得到的固定化菌体小球置于2～5℃下保存备用。
16.作为本发明一种优选的实施方案，所述固定化菌体小球的尺寸大小为直径0.1～0.3cm。
17.第二方面，本发明提供了一种采用所述固定化菌体小球制备烟酰胺的方法，包括步骤：
18.将3-氰基吡啶与固定化菌体接触反应，控制反应温度为20～25℃，制成烟酰胺。
19.作为本发明一种优选的实施方案，所述与固定化菌体接触之前，将3-氰基吡啶的水溶液在30～35℃下保温备用。
20.优选地，所述水溶液中3-氰基吡啶的质量百分比浓度为50％～60％。
21.作为本发明一种优选的实施方案，所述接触为将3-氰基吡啶的水溶液滴加或流加到固定化菌体的悬浊液中。
22.优选地，所述悬浊液中固定化菌体的质量百分比浓度为50％～60％。
23.优选地，所述3-氰基吡啶在反应体系中的终浓度为25～26％。此浓度为质量百分比浓度。
24.作为本发明一种优选的实施方案，所述反应的时间为4～6小时。反应结束后，过滤除去固定化菌体，得到含有烟酰胺的水溶液，经干燥，制成烟酰胺产品。所述干燥优选喷雾干燥。
25.本发明提供了一种用于合成烟酰胺的固定化菌体，采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸钠(sa)作为固定化凝胶材料，制备得到高柔韧性、高含水率的互穿网络水凝胶，在保证合适网络结构的同时提高水凝胶的机械强度和传质性能，与菌体混合制成固定化菌体小球使用，对微生物的损伤小，能够促进载体内菌体细胞的正常生长和底物的完全转化，加快烟酰胺的合成速率，有效解决固定化菌体相较游离细胞比活力低的问题。
26.本发明提供的固定化菌体能够增强微生物对底物和产物的耐受性，提高其持续转化能力。并且，还能简化生产工艺，缩短反应时间，大幅提高烟酰胺产品的收率和纯度。本发明的固定化菌体对微生物损伤小、固定化细胞机械强度高，使用寿命长；在生产中可以循环
套用，使用寿命长，在多批次(至少30批次)套用后还能实现底物的完全转化，保持良好的机械性能，无破损、溶胀现象。采用本发明制备的固定化菌体制备烟酰胺，具有环境污染小、分离提纯简单、产品纯度高，条件环境友好安全，反应时间短，未使用有机溶剂，步骤简单，产品收率高的优点，可以降低生产成本，节约资源和能耗。
27.本发明还提供了一种采用上述固定化菌体制备烟酰胺的方法，将固定化菌体与3-氰基吡啶接触，在20～25℃下反应制备烟酰胺。该方法工艺简单，原料价廉易得，反应条件温和且时间短，对环境友好、安全，所得烟酰胺产品的收率和纯度高，相较现有方法大幅降低了生产成本，节约了资源和能源，具有较高的工业应用价值。
具体实施方式
28.下面将结合具体实施方案对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。但是本领域技术人员应当理解，下文所述的实施方案仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方案，例如修改、替换后得到的实施方案，都属于本发明保护的范围。
29.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
30.下述实施例和对比例中使用的湿菌体为含菌种为产腈水合酶的丙酸棒杆菌的湿菌体，购自丰原生物，货号fy-sh-407，酶活性≥20000iu/g。
31.聚乙烯醇(pva-1799、pva-1788)、以及海藻酸钠(粘度600～1000map
·
s)均为采购的市售商品。
32.实施例1
33.本实施例提供了一种用于合成烟酰胺的固定化菌体，制备步骤包括：
34.(1)制备固定化用复合材料
35.以质量百分含量计，固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇1799 3％，海藻酸钠(粘度600map
·
s)2％，二氧化硅0.1％，活性炭0.1％，余量为水。
36.将聚乙烯醇1799、海藻酸钠和水混合，加热到85℃，搅拌使其充分溶解，制成水凝胶；在水凝胶中依次加入二氧化硅、活性炭，充分搅拌均匀后冷却至室温(25-30℃)，制成固定化用复合材料。
37.(2)制备固定化菌体小球
38.按照固定化用复合材料和湿菌体质量配比为1：0.1取固定化用复合材料和购买的湿菌体，充分搅拌使二者混合均匀；之后用滴球器将混合后的料液滴加到质量百分比浓度为3％的氯化钙水溶液中，制成固定化菌体小球，过滤取出小球并用清水漂洗，放置于2-5℃保存备用。固定化菌体小球的尺寸大小为直径0.1～0.3cm。
39.本实施例还提供了一种采用上述固定化菌体制备烟酰胺的方法，步骤如下：
40.将150g水加入到2000ml玻璃反应釜中，再加入100g制备的固定化菌体小球，开启搅拌并通过夹套控制体系内温度为20℃左右，连续流加质量百分比浓度为60％的3-氰基吡啶的水溶液，使最终混合体系中3-氰基吡啶的终浓度为25.4％(质量百分比浓度，下同)，流加完成后，控制反应温度为20～25℃，继续反应4小时，取样检测体系中3-氰基吡啶的残留
量，完全反应后放料，过滤除去固定化菌体小球，得到含有烟酰胺的水溶液，经过喷雾干燥，得到烟酰胺成品。
41.本实施例采用hplc法检测含有烟酰胺的水溶液中经水解得到的烟酰胺的质量百分比浓度为29.7％。经检测烟酰胺成品的纯度为99.5％，熔点128～131℃。
42.本实施例制备的固定化菌体小球经过30批次的套用后仍能实现3-氰基吡啶的完全转化，并且固定化菌体小球本身仍保持良好的机械性能，无破损、溶胀现象。
43.实施例2
44.本实施例提供了一种用于合成烟酰胺的固定化菌体，制备步骤包括：
45.(1)制备固定化用复合材料
46.以质量百分含量计，固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇1799 3.5％，海藻酸钠(粘度600map
·
s)2.5％，二氧化硅0.2％，活性炭0.1％，余量为水。
47.将聚乙烯醇1799、海藻酸钠和水混合，加热到85℃，搅拌使其充分溶解，制成水凝胶；在水凝胶中依次加入二氧化硅、活性炭，充分搅拌均匀后冷却至室温(25-30℃)，制成固定化用复合材料。
48.制备固定化菌体小球，制备步骤同实施例1。制得的固定化菌体小球的尺寸大小为直径0.1～0.3cm。
49.本实施例还提供了一种采用上述固定化菌体制备烟酰胺的方法，步骤如下：
50.将150g水加入到2000ml玻璃反应釜中，再加入110g制得的固定化菌体小球，开启搅拌并通过夹套控制温度为20℃，连续流加质量百分比浓度为60％的3-氰基吡啶的水溶液，使最终混合体系中3-氰基吡啶的终浓度为25.2％，流加完成后，控制反应温度为20～25℃，继续反应6小时，取样检测体系中3-氰基吡啶的残留量，完全反应后放料，过滤除去固定化菌体小球，得到含有烟酰胺的水溶液，经过喷雾干燥，得到烟酰胺成品。
51.本实施例采用hplc法检测含有烟酰胺的水溶液中经水解得到的烟酰胺的质量百分比浓度为29.3％。经检测烟酰胺成品的纯度为99.6％，熔点128～131℃。
52.本实施例制备的固定化菌体小球经过33批次的套用后仍能实现完全转化，并且固定化菌体小球本身仍保持良好的机械性能，无破损、溶胀现象。
53.实施例3
54.本实施例提供了一种用于合成烟酰胺的固定化菌体，制备步骤包括：
55.(1)制备固定化用复合材料
56.以质量百分含量计，固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇1799 2.5％，海藻酸钠(粘度800map
·
s)2％，二氧化硅0.2％，活性炭0.2％，余量为水。
57.将聚乙烯醇、海藻酸钠和水混合，加热到85℃，搅拌使其充分溶解，制成水凝胶；在水凝胶中依次加入二氧化硅、活性炭，充分搅拌均匀后冷却至室温(25-30℃)，制成固定化用复合材料。
58.制备固定化菌体小球，制备步骤同实施例1。制得的固定化菌体小球的尺寸大小为直径0.1～0.3cm。
59.本实施例还提供了一种采用上述固定化菌体制备烟酰胺的方法，步骤如下：
60.将150g水加入到2000ml玻璃反应釜中，再加入110g制备的固定化菌体小球，开启搅拌并通过夹套控制温度为20℃，连续流加质量百分比浓度为60％的3-氰基吡啶的水溶
液，使最终混合体系中3-氰基吡啶的终浓度为25.2％，流加完成后，控制反应温度为20～25℃，继续反应6小时，取样检测体系中3-氰基吡啶的残留量，完全反应后放料，过滤除去固定化菌体小球，得到含有烟酰胺的水溶液，经过喷雾干燥，得到烟酰胺成品。
61.本实施例采用hplc法检测含有烟酰胺的水溶液中经水解得到的烟酰胺的质量百分比浓度为29.5％。经检测烟酰胺成品的纯度为99.3％，熔点128～131℃。
62.本实施例制备的固定化菌体小球经过33批次的套用后仍能实现完全转化，并且固定化菌体小球本身仍保持良好的机械性能，无破损、溶胀现象。
63.对比例1
64.本对比例提供了一种固定化菌体，改变了聚乙烯醇和海藻酸钠的用量，制备步骤包括：
65.(1)制备固定化用复合材料
66.以质量百分含量计，固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇1799 1％，海藻酸钠(粘度600map
·
s)2％，二氧化硅0.1％，活性炭0.1％，余量为水。
67.将聚乙烯醇、海藻酸钠和水混合，加热到85℃，搅拌使其充分溶解，制成水凝胶；在水凝胶中依次加入二氧化硅、活性炭，充分搅拌均匀后冷却至室温(25-30℃)，制成固定化用复合材料。
68.(2)制备固定化菌体小球
69.按照固定化用复合材料和湿菌体质量配比为1：0.1取固定化用复合材料和湿菌体，充分搅拌使二者混合均匀；之后利用滴球器将混合后的料液滴加到质量百分比浓度为3％的氯化钙水溶液中。本对比例制成的固定化菌体小球形状不规则，在搅拌过程很容易破损失效。
70.对比例2
71.本对比例提供了一种固定化菌体，改变了聚乙烯醇和海藻酸钠的用量，制备步骤包括：
72.(1)制备固定化用复合材料
73.以质量百分含量计，固定化用复合材料的原料组成为：聚乙烯醇1799 4％，海藻酸钠(粘度600map
·
s)4％，二氧化硅0.1％，活性炭0.1％，余量为水。
74.将聚乙烯醇、海藻酸钠和水混合，加热到85℃，搅拌使其充分溶解，制成水凝胶；在水凝胶中依次加入二氧化硅、活性炭，充分搅拌均匀后冷却至室温(25-30℃)，制成固定化用复合材料。
75.(2)制备固定化菌体小球
76.按照固定化用复合材料和湿菌体质量配比为1：0.1取固定化用复合材料和湿菌体，充分搅拌使二者混合均匀；之后利用滴球器将混合后的料液滴加到质量百分比浓度为3％的氯化钙水溶液中。本对比例不能形成固定化菌体小球，溶液呈絮状。
77.以上对比结果表明，通过控制原料聚乙烯醇和海藻酸钠的用量，可以获得性能稳定的固定化菌体小球。采用提供的固定化菌体小球能够转化3-氰基吡啶生成烟酰胺，底物转化率高，有利于提高产物收率和纯度。该固定化菌体在生产中可以循环套用，在多批次(至少30批次)套用后还能实现底物的完全转化，并保持良好的机械性能，无破损、溶胀现象。采用该固定化菌体生产烟酰胺，反应条件温和且时间短，工艺简单，原料价廉易得，不使
用有机溶剂，对环境友好、安全，烟酰胺产品的收率和纯度高，相较现有方法大幅降低了生产成本，节约了资源和能源。
78.虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。