一种能够预防和/或治疗特应性皮炎的婴儿双歧杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能够预防和/或治疗特应性皮炎的婴儿双歧杆菌及其应用。


背景技术：

2.特应性皮炎(atopic dermatitis，ad)是一种慢性、复发性、炎症性的皮肤病，病发时往往伴有剧烈瘙痒，同时伴有其他过敏性疾病的皮肤病。同时，ad是一种常见的非传染性皮肤疾病，在全球大多数国家影响高达20％的儿童以及2-8％的成年人，其临床表现形式多样化，依据其发生、发展以及分布特点，可分为婴儿期、儿童期、青少年与成人期三个阶段，其中，大多数ad患者在婴儿期发生，病情严重者甚至可持续至成年期，由于其反复性严重影响患者的生活质量，是世界性的公共卫生问题之一，也因此需要得到更广泛的关注。
3.ad的表现和哮喘和过敏性鼻炎类似，主要与分泌白细胞介-4(il-4)、白细胞介素-13(il-13)等的t淋巴细胞的局部浸润有关，而il-4、il-13与调节辅助性t细胞2(th2)的表型的发展相关，会导致免疫球蛋白(ig)超量产生以及嗜酸性粒细胞增多；同时，总ige和过敏原特异性ige水平增高也是ad的一个特征，至少50％以上的ad患者都具备这一特征，而且这种ige主要是针对外界环境致敏原。因此，ad的发生和发展过程中存在多个异常免疫反应环节，如：朗格汉斯细胞和皮肤树突细胞对变应原的提呈、th2为主的异常免疫反应、调节性t细胞功能障碍、ige过度产生和嗜酸性粒细胞升高等。
4.现阶段针对便秘，尚不存在针对ad的具有明确疗效的治疗药物，所采取的解决办法目前主要是通过外用药物如糖皮质激素类药物，钙调神经磷酸酶抑制剂，外用抗微生物制剂，抗组胺药和抗炎症介质药物，免疫抑制剂等缓解ad的症状。但是，上述药物存在较大的不良反应，并且，多数患者对激素类药物存在顾虑，这些不仅给ad治疗带来了极大的困难，同时，也给患者的生活带来了极大的困扰，此外，这些药物对于个别患者来说存在较差的耐受性。
5.因此，仍然需要一种药物或治疗方式，既不会给患者带来副作用，同时，也能够用于对抗过敏的发作和皮肤炎症的发展，缓解患者皮肤瘙痒、湿疹等症状，并且，还能够应用于各类别的患者，对患者具有良好的耐受性。益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。与普通的药物相比，益生菌具有安全性高、无副作用和成本低等优势。因此，通过使用益生菌来缓解ad的方法将会是一种可优先采取并且副作用较低的重要手段。通过对婴儿双歧杆菌缓解ad进行研究，将会对食品科学、微生物学以及预防医学等各方面产生巨大的影响，因此，筛选对ad具有缓解作用的婴儿双歧杆菌是十分必要的。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种能够预防和/或治疗特应性皮炎的婴儿双歧杆菌及其应用。
7.技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：一种婴儿双歧杆菌，经鉴定为婴儿双歧杆菌（bifidobacteriuminfantis），菌株名为rego，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年03月24日，保藏编号为cctccno: m2021268，保藏地址为中国武汉武汉大学。
8.所述婴儿双歧杆菌（bifidobacterium infantis）来源于健康女婴新鲜粪便样本，该菌株经测序分析，其16s rdna序列如seq id no.1所示，将测序得到的序列在ncb中进行核酸序列比对，结果显示菌株为婴儿双歧杆菌，命名为婴儿双歧杆菌rego(bifidobacterium infantisrego)。
9.所述婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)在mrs培养基上的菌落凸面至垫状，边缘完整，柔软，湿润，白色有光泽，其具有如下特性：。
10.(1)显著改善特应性皮炎小鼠的耳朵肿胀程度；(2)通过调节小鼠体内免疫系统进而显著降低特应性皮炎小鼠血清中总ige水平；(3)有利于降低小鼠体内肥大细胞脱颗粒现象进而显著改善特应性皮炎小鼠皮炎炎症；(4)显著降低小鼠局部组织中与th2细胞相关的细胞因子(il-4、il-13)水平进而恢复特应性皮炎小鼠局部组织中th1/th2之间的免疫平衡；(5)显著降低小鼠局部组织中组胺的释放，减轻特应性皮炎小鼠皮肤瘙痒症状，从而缓解特应性皮炎小鼠皮炎炎症。
11.本发明还提供了所述的婴儿双歧杆菌在制备预防和/或治疗特应性皮炎药物或食品中的应用。或者所述婴儿双歧杆菌在制备缓解特应性皮炎药物或食品中的应用。
12.优选的，所述药物或食品中，所述婴儿双歧杆菌的活菌数为不低于1
×
106cfu/g或1
×
106cfu/ml。
13.优选的，所述药物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液；所述食品为保健食品；或者所述食品包括乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品；或者所述食品为饮料或零食。
14.本发明还提供了一种组合物，包含所述的婴儿双歧杆菌。
15.优选的，所述组合物包含所述的婴儿双歧杆菌、药物载体和/或药用辅料。
16.进一步优选的，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体；所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
17.更优选的，所述赋形剂包含黏合剂、填充剂、崩解剂和/或润滑剂；所述附加剂包含增溶剂、助溶剂、潜溶剂和/或防腐剂。
18.优选的，所述组合物包含所述的婴儿双歧杆菌和食用辅料。
19.作为一种实施方案，所述组合物包括使用含有所述婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或者包括含有所述婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)的固体饮料。
20.优选的，所述发酵剂的制备方法为将婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)
按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37
±
2℃下培养16
±
2h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用ph为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
21.进一步优选的：所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
22.所述培养基包含占培养基总质量87.5%的水、12%的脱脂乳、0.6%的葡萄糖、1.4%的胰蛋白胨以及0.4%的酵母浸膏溶解。
23.所述培养基的ph为6.8。
24.所述保护剂包含100g/l的脱脂奶粉、150g/l的海藻糖以及10g/l的l-谷氨酸钠。
25.作为另一种实施方案，所述组合物还包括将含有所述婴儿双歧杆菌的菌液干燥得到的菌剂。进一步优选的，所述干燥采用真空冷冻干燥或其它菌液干燥工艺。
26.本发明最后提供了所述的组合物在制备预防和/或治疗特应性皮炎药物或食品中的应用。
27.有益效果：本发明提供的婴儿双歧杆菌生长特性好，能够改善特应性皮炎的肿胀程度，降低血清中总ige水平和肥大细胞脱颗粒现象，恢复局部组织中th1/th2之间的免疫平衡，显著降低局部组织中组胺的释放，减轻皮肤瘙痒症状，从而缓解特应性皮炎的炎症；将其制成相应的缓解特应性皮炎的产品，能够显著缓解症状和抑制炎症；因此，将本发明婴儿双歧杆菌制备能预防和/或治疗特应性皮炎的药品、功能食品、食品/药品添加成分，具有很高的应用价值。
附图说明
28.图1：不同组别降低特应性皮炎小鼠耳朵厚度的效果对比。
29.图2：不同组别降低特应性皮炎小鼠血清总ige水平的效果对比。
30.图3：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中il-4水平的效果对比。
31.图4：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中il-13水平的效果对比。
32.图5：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中组胺水平的效果对比。
具体实施方式
33.通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
34.下述实施例中涉及的培养基如下。
35.mrs固体培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、琼脂20g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
36.mrs液体培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o.1g/l、mnso4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。
37.实施例1：婴儿双歧杆菌的筛选及菌种鉴定。
38.1、筛选以来源于江苏省如皋市健康女婴粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5ml样本加到4.5ml，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的mrs固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至mrs固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至mrs液体培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株rego。
39.2、鉴定提取rego的基因组，将rego的16s rdna进行扩增和测序，rego的16s rdna扩增的核苷酸序列分别如seq id no .1所示，将该序列在ncbi中进行核酸序列比对，结果显示菌株为婴儿双歧杆菌，命名为婴儿双歧杆菌)rego (bifidobacterium infantisrego)。
40.上述所得一株婴儿双歧杆菌，其分类学命名为婴儿双歧杆菌rego (bifidobacteri
‑ꢀ
um infantisrego)，已于2021年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏编号为cctccno:m2021268，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
41.实施例2：婴儿双歧杆菌的培养将婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)rego接入mrs固体培养基 (含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落凸面至垫状，边缘完整，柔软，湿润，白色有光泽。
42.将婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)rego接入mrs液体培养基 (含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的mrs液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。实验结果：初始活菌数为1
×
10
11
cfu/ml，1周后活菌数为1
×
10
11
cfu/ml，数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。
43.实施例3：婴儿双歧杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠30只，随机分为5组，每组10只，3组分别为：空白组(对照组)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组、给药婴儿双歧杆菌rego的rego组，其中，rego组为治疗组。实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃婴儿双歧杆菌rego菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1
×
109cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μl浓度为0 .5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0 .2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
44.造模开始前(即第0天)利用数显螺旋测微尺测定5组小鼠的耳朵厚度，造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后立刻测定小鼠耳朵厚度，检测结果如图1。
45.由图1可知，婴儿双歧杆菌rego可显著降低特应性皮炎小鼠耳朵的厚度，缓解小鼠耳朵的肿胀程度。以上实验结果说明，婴儿双歧杆菌rego具有缓解特应性皮炎小鼠耳朵的
厚度及肿胀程度的作用。
46.实施例4：婴儿双歧杆菌对特应性皮炎小鼠嗜酸粒细胞浸润的影响取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠30只，随机分为5组，每组10只，3组分别为：空白组(对照组)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组、给药婴儿双歧杆菌rego的rego组，其中，rego组为治疗组。
47.实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃婴儿双歧杆菌rego菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1
×
109cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm
×
2.5cm，并用50μl浓度为0.5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0.2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
48.造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠血清，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清总ige水平(结果如图2)。
49.由图2可知，与模型组相比，婴儿双歧杆菌rego显著降低了小鼠血清总ige水平，有利于抑制th2型免疫反应，从而有助于缓解特应性皮炎的病理炎症。以上实验表明，婴儿双歧杆菌rego可显著降低了小鼠血清总ige水平，有利于缓解特应性皮炎的病理炎症。
50.实施例5：婴儿双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中il-4、il-13水平的影响取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠30只，随机分为5组，每组10只，3组分别为：空白组(对照组)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组、给药婴儿双歧杆菌rego的rego组，其中，rego组为治疗组。
51.实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃婴儿双歧杆菌rego菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1
×
109cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm
×
2.5cm，并用50μl浓度为0 .5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0 .2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
52.造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定th2型免疫反应细胞因子il-4、il-13的水平(结果如图3-4)。
53.由图3-4可知，与模型组相比，婴儿双歧杆菌rego显著降低了小鼠皮肤组织il-4，il-13水平，显著地抑制了th2型免疫反应，从而有助于缓解由th2型异常免疫反应引起的病理炎症状态。以上实验表明，婴儿双歧杆菌rego可显著降低th2型免疫反应相关细胞因子il-4，il-13的水平，有助于缓解由th2型异常免疫反应引起的病理炎症状态。
54.实施例6：婴儿双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中组胺水平的影响取体重在18-20g的健康雌性c57bl/6小鼠30只，随机分为5组，每组10只，3组分别为：空白组(对照组)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，dnfb)的模型组、
给药婴儿双歧杆菌rego的rego组，其中，rego组为治疗组。
55.实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃婴儿双歧杆菌rego菌液，以0.2ml菌液(单次灌胃活菌总量为1
×
109cfu)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对5组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm
×
2.5cm，并用50μl浓度为0 .5％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μl浓度为0 .2％的dnfb溶液涂搽模型组与治疗组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
56.造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定与肥大细胞脱颗粒情况相关的炎症因子：组胺(结果如图5)。
57.由图5可知，与模型组相比，婴儿双歧杆菌rego显著降低了小鼠皮肤组织组胺的水平，从而可推断出婴儿双歧杆菌rego显著地降低了肥大细胞的脱颗粒情况，阻止了皮肤损伤组织中组胺的释放，缓解小鼠的皮肤瘙痒情况。以上实验表明，婴儿双歧杆菌rego可显著降低皮肤组织中组胺的水平，抑制了皮肤组织中肥大细胞的脱颗粒情况，从而缓解了小鼠皮肤的瘙痒，阻止了特应性皮炎的进一步发展。
58.实施例7：含有婴儿双歧杆菌rego固体饮料的制备将婴儿双歧杆菌rego按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将培养液离心，得到菌体；将菌体用ph为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/l的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到婴儿双歧杆菌rego菌粉；其中，所述培养基包含占培养基总质量87 .7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的ph为6.8；将含有1
×
10
10
cfu的婴儿双歧杆菌rego菌粉同麦芽糊精进行混合，菌粉和麦芽糊精总质量为1克，得到富含婴儿双歧杆菌rego的固体饮料。取10克上述含有婴儿双歧杆菌rego的固体饮料，用生理盐水复溶，定容到20ml，每只小鼠每天灌胃0.2ml，连续三周，可有效缓解小鼠特应性皮炎的症状，在预防和/或治疗特应性皮炎有极好的效果。
59.实施例8：利用本发明婴儿双歧杆菌rego制造含该菌的发酵食品选用新鲜蔬菜或水果洗净后榨汁，包括白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃制品中的一种或上述多种的混合物为原料。对榨汁后的原料进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明的婴儿双歧杆菌rego或含有该菌株的菌剂发酵剂，使婴儿双歧杆菌rego浓度达到108cfu/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明婴儿双歧杆菌rego活菌的果蔬饮料。利用婴儿双歧杆菌rego作为发酵微生物生产发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括发酵乳制品、奶油、乳酪、含乳饮料以及乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳粉；所述果蔬制品包括白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃制品。制备的发酵食品可有效缓解小鼠特应性皮炎的症状，在预防和/或治疗特应性皮炎有极好的效果。
60.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的
技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。