一种快速促进纯羊粪腐熟的发酵菌剂及其应用

1.本发明涉及微生物菌剂技术领域，更具体的说是涉及一种快速促进纯羊粪腐熟的发酵菌剂及其应用。


背景技术：

2.羊属于草食动物，其粪便中含有大量有机质及n、p、k等元素，是制作有机肥的绝佳原料。但羊粪中含有的大量纤维素和半纤维素类物质是制约其腐熟进程及有机肥品质的瓶颈。
3.目前，传统羊粪发酵主要混以秸秆、稻草等农业废弃物按一定比例，接种菌剂或自然发酵，导致发酵腐熟周期长，高温维持时间短造成寄生虫卵杀灭不彻底，纤维素降解不彻底使得物料肥效降低等问题。
4.微生物固态发酵技术是利用功能菌剂产生的纤维素酶破坏羊粪中纤维素类结构，将其快速转化为植物根系易吸收的养分，同时产生阶段性持续高温可彻底杀灭物料中虫卵、致病菌、杂草种子等，解决目前纯羊粪发酵过程中堆肥周期长、寄生虫卵杀灭不彻底及纤维素降解率低，最终导致肥效下降的问题。
5.目前存在市售微生物堆肥促腐熟菌剂，由于羊粪发酵多混以含纤维素高的秸秆、稻草等农业废弃物以调整含水率，当用于羊粪堆肥发酵时往往存在发酵周期长、腐熟度低、纤维类物质降解不彻底，使得羊粪腐熟发酵肥效下降。
6.因此，如何提供一种快速促进纯羊粪腐熟的发酵菌剂及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种快速促进纯羊粪腐熟的发酵菌剂及其应用。羊粪腐熟发酵菌剂直接影响发酵周期、有机质的转化率及肥效的高低。本发明提供的菌剂包括纯羊粪发酵用稳定高产木质纤维素酶和蛋白酶的枯草芽孢杆菌，结合对纯羊粪发酵菌剂发酵过程控制，缩短羊粪腐熟周期，提高有机质转化率。
8.保藏信息：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)b-1，于2021年03月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.22064。
9.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)b-1，保藏编号为cgmcc no.22064。
11.本发明还提供了一种包括上述的枯草芽孢杆菌b-1的菌剂。
12.本发明还提供了一种包括上述的枯草芽孢杆菌b-1或上述菌剂的菌肥。
13.本发明还提供了一种羊粪的发酵方法，使用上述枯草芽孢杆菌b-1，保藏编号为cgmcc no.22064，或使用上述菌剂，或使用上述菌肥。
14.本发明还提供了上述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)摇瓶发酵：培养基接入权利要求1枯草芽孢杆菌b-1，培养，得发酵液a；
16.(2)种子培养：发酵液a接入培养基，发酵，得发酵液b；
17.(3)二次发酵：发酵液b接入培养基，发酵，离心浓缩、喷雾干燥，得菌剂。
18.优选的：步骤(1)中接种量占接种后总体积5～10％；培养条件：ph值7.5，培养时间45～55h；
19.步骤(2)中接种量占接种后总体积5～10％；发酵条件：种龄12～14h，发酵温度35～38℃，转速300r/min，通气量0.2～0.8vvm，发酵周期34～36h；
20.步骤(3)中接种量占接种后总体积5～10％；发酵条件：通风量1：0.8，发酵温度35～38℃，转速250～300r/min，发酵周期34～36h；离心：离心转速6900r/mim，流量1～1.5t/h，压力3kg/cm2；喷雾干燥：进风口温度170～180℃，尾风口温度120～130℃，进料速度30～50kg/h；
21.步骤(1)～(3)中培养基成分：按质量份数计，玉米粉1份、葡萄糖1.7份、mnso4·
h2o 0.4份、mgso4为0.02份、无菌水90.88份。
22.有益效果在于：步骤(1)发酵液a生物量达9.0
×
108cfu/ml；
23.步骤(2)中接种的为菌株生长对数期的菌液作为种子进行发酵；发酵液b生物量达1.8
×
108cfu/ml；
24.步骤(3)菌剂的总生物量为3.2
×
10
10
cfu/g。
25.进一步的，步骤(2)采用2m3种子罐；
26.步骤(2)采用20m3发酵罐。
27.优选的发酵方法：包括以下步骤：
28.(1)将上述制备的菌剂稀释接入羊粪中；
29.(2)将混合好的羊粪，构建小堆羊粪，控制堆体温度；
30.(3)将小堆羊粪作为菌种转入大堆羊粪，进行二次羊粪的发酵。
31.优选的：步骤(1)中稀释至1.0
×
10
10
cfu/g；接种量占接种后总体积0.05％；步骤(2)小堆羊粪规格：长
×
宽
×
高为5m
×
2m
×
1.5m；堆体温度控制在45～60℃；步骤(3)大堆羊粪规格：长
×
宽
×
高为15m
×
8m
×
3m；二次羊粪的发酵时间共15～20天。
32.有益效果在于：步骤(2)4天后水分含量下降到20％～25％；
33.步骤(3)在大堆发酵的第2天堆体温度上升至60℃，最高温度达到75℃，并持续了10～12天。
34.进一步的，步骤(1)羊粪为纯羊粪，含水量45％-55％。
35.本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌b-1、上述菌剂、上述菌肥在农业、工业生产中的应用。
36.有益效果在于：本发明提供的菌剂，发酵高温阶段纤维素酶、滤纸酶、和β-葡聚糖苷酶活性最高为138.78u/ml、60.01u/ml和80.11u/ml，纤维素和半纤维素的降解率分别为59.62％和46.13％。最终制备得到的有机肥品质：有机质55.70％，钾3.33％，ph值8.4，总养分6.77％，寄生虫卵死亡率100％，粪大肠菌群数＜10个/g。
37.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种快速促进纯羊粪腐熟的发酵菌剂及其应用，取得的技术效果为本发明提供的纯羊粪腐熟用菌剂，产纤维素酶活力138.78u/ml，蛋白酶活力197.21u/ml。可在高温阶段快速降解羊粪中的纤维素
类物质，产生小分子有机质，促进发酵过程中有机质和总养分含量增加，同时发酵过程中菌株耗氧产热，明显缩短二次羊粪发酵时间，可使寄生虫卵死亡率达到100％和粪大肠杆菌数量＜10个/g，提高有机肥品质。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.本发明实施例公开了一种快速促进纯羊粪腐熟的发酵菌剂及其应用。
40.实施例中，采用羧甲基纤维素法(cmc法)测定纤维素酶、滤纸酶活法(fpa法)滤纸酶、比色法测定β-葡聚糖苷酶。
41.未提及的原料、实验、工业设备均为市售，在此不再一一赘述。
42.实施例1
43.一种枯草芽孢杆菌b-1，保藏编号为cgmcc no.22064。
44.一种包括上述的枯草芽孢杆菌b-1的菌剂。
45.一种包括上述的枯草芽孢杆菌b-1或上述菌剂的菌肥。
46.实施例2
47.一种羊粪的发酵方法，使用上述枯草芽孢杆菌b-1，保藏编号为cgmcc no.22064，或使用上述菌剂，或使用上述菌肥。
48.为进一步优化技术方案：包括以下步骤：
49.(1)将制备的菌剂稀释接入羊粪中；
50.(2)将混合好的羊粪，构建小堆羊粪，控制堆体温度；
51.(3)将小堆羊粪作为菌种转入大堆羊粪，进行二次羊粪的发酵。
52.为进一步优化技术方案：步骤(1)中稀释至1.0
×
10
10
cfu/g；接种量占接种后总体积0.05％；
53.步骤(2)小堆羊粪规格：长
×
宽
×
高为5m
×
2m
×
1.5m；堆体温度控制在45～60℃；
54.步骤(3)大堆羊粪规格：长
×
宽
×
高为15m
×
8m
×
3m；二次羊粪的发酵时间共15～20天。
55.实施例3
56.菌剂的制备方法，包括以下步骤：
57.(1)摇瓶发酵：培养基接入上述枯草芽孢杆菌b-1，培养，得发酵液a；
58.(2)种子培养：发酵液a接入培养基，发酵，得发酵液b；
59.(3)二次发酵：发酵液b接入培养基，发酵，离心浓缩、喷雾干燥，得菌剂。
60.为进一步优化技术方案：步骤(1)中接种量占接种后总体积5％；培养条件：ph值7.5，培养时间45h；
61.步骤(2)中接种量占接种后总体积5％；发酵条件：种龄12h，发酵温度35℃，转速300r/min，通气量0.2vvm，发酵周期34h；
62.步骤(3)中接种量占接种后总体积5％；发酵条件：通风量1：0.8，发酵温度35℃，转
速250r/min，发酵周期34h；离心：离心转速6900r/mim，流量1t/h，压力3kg/cm2；喷雾干燥：进风口温度170℃，尾风口温度120℃，进料速度30kg/h；
63.步骤(1)～(3)中培养基成分：按质量份数计，玉米粉1份、葡萄糖1.7份、mnso4·
h2o 0.4份、mgso4为0.02份、无菌水90.88份。
64.实施例4
65.菌剂的制备方法，包括以下步骤：
66.(1)摇瓶发酵：培养基接入上述枯草芽孢杆菌b-1，培养，得发酵液a；
67.(2)种子培养：发酵液a接入培养基，发酵，得发酵液b；
68.(3)二次发酵：发酵液b接入培养基，发酵，离心浓缩、喷雾干燥，得菌剂。
69.为进一步优化技术方案：步骤(1)中接种量占接种后总体积8％；培养条件：ph值7.5，培养时间50h；
70.步骤(2)中接种量占接种后总体积5～10％；发酵条件：种龄13h，发酵温度36℃，转速300r/min，通气量0.5vvm，发酵周期35h；
71.步骤(3)中接种量占接种后总体积8％；发酵条件：通风量1：0.8，发酵温度37℃，转速280r/min，发酵周期35h；离心：离心转速6900r/mim，流量1.2t/h，压力3kg/cm2；喷雾干燥：进风口温度175℃，尾风口温度125℃，进料速度40kg/h；
72.步骤(1)～(3)中培养基成分：按质量份数计，玉米粉1份、葡萄糖1.7份、mnso4·
h2o 0.4份、mgso4为0.02份、无菌水90.88份。
73.实施例5
74.菌剂的制备方法，包括以下步骤：
75.(1)摇瓶发酵：培养基接入上述枯草芽孢杆菌b-1，培养，得发酵液a；
76.(2)种子培养：发酵液a接入培养基，发酵，得发酵液b；
77.(3)二次发酵：发酵液b接入培养基，发酵，离心浓缩、喷雾干燥，得菌剂。
78.为进一步优化技术方案：步骤(1)中接种量占接种后总体积10％；培养条件：ph值7.5，培养时间55h；
79.步骤(2)中接种量占接种后总体积10％；发酵条件：种龄14h，发酵温度38℃，转速300r/min，通气量0.8vvm，发酵周期36h；
80.步骤(3)中接种量占接种后总体积10％；发酵条件：通风量1：0.8，发酵温度38℃，转速300r/min，发酵周期36h；离心：离心转速6900r/mim，流量1.5t/h，压力3kg/cm2；喷雾干燥：进风口温度180℃，尾风口温度130℃，进料速度50kg/h；
81.步骤(1)～(3)中培养基成分：按质量份数计，玉米粉1份、葡萄糖1.7份、mnso4·
h2o 0.4份、mgso4为0.02份、无菌水90.88份。
82.对比实验
83.对照组：市售枯草芽孢杆菌(1.0
×
108cfu/g)，发酵纯羊粪，接种量0.05％，大堆发酵第7天温度上升至60℃，最高温度65℃，持续时间6天，发酵高温阶段纤维素酶、滤纸酶、β-葡聚糖苷酶活性最高为110.32u/ml、45.03u/ml、72.45u/g，纤维素和半纤维素降解率36.57％和38.75％。二次羊粪发酵时间35～40天，制备的有机肥品质：有机质约43.39～50.45％，总养分约4.29～4.45％，总钾约1.65～1.71％，粪大肠杆菌＜30个/g，蛔虫卵死亡率95.12％。
84.取实施例4制备的菌剂(粉剂，稀释至1.0
×
10
10
cfu/g)接种量0.05％，大堆发酵时第2天堆体温度上升至60℃，最高温度在75℃左右，持续12天。发酵高温阶段纤维素酶、滤纸酶、β-葡聚糖苷酶活性最高为138.78u/ml、60.01u/ml和80.11u/ml，纤维素和半纤维素的降解率分别为59.62％和46.13％。发酵时间二次羊粪发酵15天，制备的有机肥品质：有机质55.70％，总钾3.33％，总养分6.77％，寄生虫卵死亡率100％，粪大肠菌群数＜10个/g。
85.结果表明：
86.由于本发明提供的菌剂产纤维素酶、滤纸酶和β-葡聚糖酶活力较高，可在高温阶段快速降解羊粪中的纤维素类物质，产生小分子有机质，促进发酵过程中有机质和总养分含量增加，同时发酵过程中菌株耗氧产热，使发酵在第2天堆体温度上升至60℃，最高上升至75℃，持续时间12天，明显缩短二次羊粪发酵时间，可使寄生虫卵死亡率达到100％和粪大肠杆菌数量＜10个/g，良好的解决了现有技术缺陷。
87.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
88.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。