一种具有促生长性能的复合菌剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种具有促生长性能的复合菌剂及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.在畜牧业生产中，由于抗生素过量使用而带来的副作用日渐突出。长期大量使用抗生素可破坏动物肠道菌群平衡，产生耐药性，同时造成畜产品药物残留严重超标。目前，已研究出多种抗生素替代品，常见的如：植物提取物、植物精油、低聚木糖、中草药制剂、酶制剂、酸味剂和微生物发酵饲料、微生态制剂等。近些年，随着研究的深入，微生态制剂在鸡生产中的应用日渐增多，并显示出良好的功效。目前，各研究中饲用微生物制剂作用机理总结如下，1.建立并稳定动物肠道内的健康菌群结构，形成有益菌屏障，与病原微生物竞争附着位点，夺取营养物质，抵制外来病原微生物定植；2.建立健康肠道环境，好氧和兼性厌氧饲用微生物可降低肠道及消化道内氧气浓度，抑制好氧病原菌生长；3.产生抑菌物质杀灭有害菌，例如乳酸菌类可产生多种有机酸降低肠道内ph，双歧杆菌可产生光谱抗菌素，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等有良好的抑制作用；4.激发增强动物免疫力，完整肠道菌群可以促进提升巨噬细胞活性和免疫球蛋白水平，乳酸菌可产生超氧化物歧化酶（sod），能增强机体体液免疫和细胞免疫能力；5.合成多种助消化酶系和营养物质，例如芽孢杆菌可分泌出纤维素酶、蛋白酶等帮助动物消化纤维素、蛋白质等，双歧杆菌可合成维生素b1、b12等促进动物生长；6.降解有害物质，芽孢杆菌产生降解硫化物的酶类，降低畜禽养殖过程中有害气体的排放，提高肠道的内环境质量和养殖环保度。目前，市场上的饲用微生物制剂的种类繁多，质量也良莠不齐，发酵工艺和菌种不同对发酵饲料的品质和使用效果会产生很大的影响。
3.生长激素（growth hormone，gh）是由脑垂体前叶中的嗜酸性细胞合成并分泌的一种多肽类蛋白质激素，对机体的生长发育具有至关重要的调节作用，能影响几乎所有类型的组织和细胞。目前人生长激素相关产品已被成功研制，主要用于内源性生长激素缺乏、慢性肾衰及特纳氏综合症所致儿童生长缓慢和重度烧伤的治疗。鸡生长激素（chicken growth hormone，cgh）基因位于1号常染色体的长臂末端，全长约4 kb，由5个外显子及4个内含子构成，共包含191个氨基酸，分子量约为22ku。cgh与鸭生长激素相比具有很高的同源性，只有4个氨基酸的差异，与火鸡生长激素的同源性也达到了96%。cgh不仅对鸡正常的生长发育起必要的调节作用，而且对鸡的多种生产性状也有显著影响，如体重、饲料转化率、脂肪蓄积、产蛋、抗病性等。此外，通过注射外源gh，可以在胚胎时期显著提高鸡胚重量，促进其长骨及软骨组织的发育，从而提高肉用型鸡的上市体重。相对于人和哺乳动物生长激素的研究，鸡生长激素的研究起步较晚，但作为对鸡的生长发育及各方面性状都极为重要的物质，其一直为人们所关注。
4.目前主要利用大肠杆菌以及酵母系统进行的生长激素表达。但以上表达系统，一方面是常常用抗生素抗性基因做为筛选标记，这样就存在很大的生物转基因引起抗生素耐药潜在危机；另外一方面是需在添加诱导物情况下才能不断地表达目的蛋白，大规模发酵
生产操作繁琐，成本高，因此限制了其在养殖业中的应用。另外，现有的微生物菌剂用于鸡的饲喂，对于鸡生长性能的促进作用较小。


技术实现要素：

5.针对上述的不足，本发明提供一种具有促生长性能的复合菌剂及其应用，实现以下发明目的：采用食品级干酪乳酸杆菌组成型表达系统，构建表达鸡生长激素的重组干酪乳酸杆菌，安全性较高；制备的复合菌剂对鸡生长性能的促进作用较好。
6.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种具有促生长性能的复合菌剂，所述复合菌剂由重组干酪乳酸杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉组成，所述重组干酪乳酸杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉的质量比为3：1：3；所述重组干酪乳酸杆菌的菌种保藏号为cctccno：m2022423，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；所述重组干酪乳酸杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉的菌浓度均为100亿cfu/g。
7.所述枯草芽孢杆菌的菌种保藏号为cicc10148；所述地衣芽孢杆菌的菌种保藏号为cicc10037，均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，然后本公司经过发酵生产得到菌粉。
8.所述重组干酪乳酸杆菌菌粉的制备方法为将重组干酪乳酸杆菌发酵液与麦芽糊精混匀，经热预处理后喷雾干燥，调整浓度至100亿cfu/g；所述麦芽糊精与重组干酪乳酸杆菌发酵液的质量体积比为40:100；所述热预处理，温度为45℃，时间为45min；所述重组干酪乳酸杆菌发酵液的菌浓度≧4.0
×
109cfu/ml。
9.所述喷雾干燥，进口温度为110℃，出口温度为70℃，喷液速度为200l/h。
10.所述重组干酪乳酸杆菌不含红霉素抗性基因。
11.所述复合菌剂在鸡饲料中的应用。
12.所述复合菌剂在鸡饲料中添加量为1000g/t。
13.所述重组干酪乳酸杆菌，分类命名为干酪乳杆菌ghlactobacilluscaseigh，保藏编号为cctccno：m2022423；保藏日期为2022年4月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武汉大学。
14.与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：（1）本发明的复合菌剂直接添加入饲料，可以促进鸡的生长性能，显著提高鸡的平均日增重、平均采食量，降低料肉比，降低死淘率。本发明的复合菌剂按照1000g/t的添加量加入基础饲料中，饲喂40d后，鸡的平均日增重为68.59g，平均采食量为104.24g，料肉比为1.52，死淘率为5.34%。
15.（2）本发明采用食品级干酪乳酸杆菌组成型表达系统构建表达鸡生长激素的重组干酪乳酸杆菌，安全性较高。
16.（3）本发明复合菌为粉剂，制备方法简单，且通过对喷雾干燥工艺的优化，可使存
活率达到90%以上，大大降低了生产成本，易于大规模推广应用。
附图说明
17.图1为重组干酪乳酸杆菌的pcr产物的电泳图；图2为鸡生长激素在重组干酪乳酸杆菌表达的sds-page图；图3为重组干酪乳酸杆菌的生长曲线图。
18.具体实施方式：实施例1重组菌制备1.1鸡生长激素基因的获得在ncbi网站获取鸡生长激素基因序列(登录号：x17618.1)，并序列优化，并在3’端加上xbai内切酶的酶切位点和保护碱基，在5’端加上psti内切酶的酶切位点和保护碱基，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成鸡生长激素基因（具体序列见序列1）。
19.1.2pmg36e载体与鸡生长激素基因的连接以及重组质粒验证1）pmg36e载体与鸡生长激素基因的双酶切分别对pmg36e载体与鸡生长激素基因用xbai和psti进行双酶切。使用的双酶切体系，放置于37℃水浴中反应，酶切4h。双酶切体系为：基因/载体40μl（0.03μg/
µ
l），xbai2.5μl，psti2.5μl，10
×
mbuffer5μl。将酶切产物和上样缓冲液混合，电泳后切胶，采用胶回收试剂盒纯化出pmg36e载体与鸡生长激素基因片段。
20.2）酶切后pmg36e载体与鸡生长激素基因的连接将双酶切且纯化后的pmg36e载体与鸡生长激素基因片段进行连接，构建新的载体s-pmg36e-cgh。连接体系为：pmg36e载体2μl，鸡生长激素基因6μl，t4dna连接酶1μl，10
×
buffer1μl。将配置好反应体系置于16℃过夜连接。
21.3）重组pmg36e-cgh质粒验证取10μlpmg36e载体与鸡生长激素基因的连接液采用cacl2法转化大肠杆菌top10感受态细胞中，于37℃摇床上培养1h，取培养过的菌液涂布在含20mg/l的红霉素的lb固体培养基上，于37℃培养16h。挑取单菌落进行pcr鉴定，将出现正确条带的pcr产物的1个菌落接种于10ml含20mg/l红霉素lb液体培养基中进行过夜培养，按照质粒提取试剂盒提取重组质粒，并将质粒按照上述双酶切体系进行酶切，酶切出目的条带的为正确的重组pmg36e-gh质粒。
22.其中，lb固体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解，琼脂粉15g，加蒸馏水至1000ml，用5mol/lnaoh调ph至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
23.lb液体培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，摇动容器直至溶质溶解，加蒸馏水至1000ml，用5mol/lnaoh调ph至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
24.1.3不含红霉素抗性基因的s-pmg36e-cgh载体的制备设计一对引物，扩增pmg36e-cgh中除红霉素以外的其他序列s-pmg36e-cgh。引物如下：上游引物：5
’‑
tataaccctctttaatttg-3’，下游引物：5
’‑
gtttttcgtgtgcctatt-3’。以pmg36e-cgh质粒为模板，扩增s-pmg36e-cgh。反应体系：pcr预混液（premixtaq）12.5
µ
l，上游引物和下游引物各1
µ
l，pmg36e-cgh载体（1μg/
µ
l）1
µ
l，无核酸酶水9.5
µ
l。反应条件：94
℃，5min、1个循环，94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 3min、30个循环，72℃，10min，1个循环。pcr产物经1%电泳检测后，采用胶回收试剂盒进行切胶纯化。pcr产物经wgs连接酶连接形成s-pmg36e-cgh载体，体系如下：pcr产物80ng，2
×
wgs ligase buffer 10μl，wgs ligase 1μl，用无核酸酶水补足20μl反应体系。反应条件：16℃过夜。
25.1.4 重组干酪乳酸杆菌制备以及鉴定取10μl上述1.3中的s-pmg36e-cgh载体电转化干酪乳酸杆菌nc8感受态细胞。电击条件为：2500v，25μf，600ω。电转结束后取重悬过的菌液涂布在含mrs固体培养基上，30℃细菌培养箱中厌氧培养18h左右，挑取单菌落进行pcr鉴定，将出现正确条带的pcr产物（见图1）送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序。鉴定正确为重组干酪乳酸杆菌株。其中引物如下：上游引物：5
’‑
gctaacgctgttttacgtgct-3’，下游引物：5
’‑
gattcaccgaaacgacgaca-3’。反应体系：pcr预混液（premix taq）12.5
µ
l，上游引物和下游引物各1
µ
l，菌落1
µ
l，无核酸酶水9.5
µ
l。反应条件：94℃ 5min、1个循环，94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 3min、30个循环，72℃ 10min，1个循环。
26.将鉴定正确1个重组干酪乳酸杆菌单菌落，接种到10mlmrs液体培养基中，30℃细菌培养箱中厌氧培养18h后，于4℃，8 000
×
g离心20 min，去上清液，收集菌泥，加入适量生理盐水使菌悬液中菌泥质量浓度为1g/ml，与水苏糖(100 g/l)-酪蛋白酸钠(10g/l)混合溶液以体积比2：5混合均匀，取5ml分装至西林瓶中，置入冻干机样品腔，预冻至-50℃，保持5 h，再将样品置入干燥盘，一次干燥设置为-30℃，干燥30h，二次干燥设置为25℃，干燥20 h，制成重组干酪乳酸杆菌冻干粉进行保存。
27.其中mrs固体培养基为：葡萄糖20.00g，蛋白胨10.00g，牛肉膏5.00g，酵母粉4.00g，吐温80 1.00ml，七水磷酸氢二钾2.00g，七水硫酸镁0.20g，四水硫酸锰0.05g，柠檬酸三铵2.00g，三水合乙酸钠5.00g，琼脂粉15g，加蒸馏水至1000ml，调节ph值为6.2，115℃高压蒸汽灭菌15 min。
28.水苏糖(100 g/l)-酪蛋白酸钠(10 g/l)的配置：称取适量水苏糖溶于去离子水中，质量浓度达到100 g/l。称取10 g酪蛋白酸钠溶于1 l水苏糖溶液中，65℃灭菌30 min，冷却后于4℃保存备用。
29.1.5 sds-page测定重组干酪乳酸杆菌鸡生长激素的表达将鉴定正确1个重组干酪乳酸杆菌单菌落，接种到10mlmrs液体培养基中，30℃细菌培养箱中厌氧培养18h进行活化，然后按照接种量2%（体积比）比例接入100ml mrs中，30℃细菌培养箱中厌氧培养18h，取发酵液进行sds-page电泳。结果初步判定生长激素基因在重组干酪乳酸杆菌中表达，表达产物分泌到发酵液中，其大小为24.72 kda，具体见图2。
30.其中mrs液体培养基为：葡萄糖20.00g，蛋白胨10.00g，牛肉膏5.00g，酵母粉4.00g，吐温80 1.00ml，七水磷酸氢二钾2.00g，七水硫酸镁0.20g，四水硫酸锰0.05g，柠檬酸三铵2.00g，三水合乙酸钠5.00g，加蒸馏水至1000 ml，调节ph值为6.2，115℃高压蒸汽灭菌15 min。
31.1.6 绘制重组干酪乳酸杆菌的生长曲线，确定发酵时间将鉴定正确1株重组干酪乳酸杆菌，接种到10mlmrs液体培养基中，30℃细菌培养箱中厌氧培养18h进行活化，然后按照接种量2%（体积比）接种于200ml mrs液体培养基，在30℃进行发酵，每隔2h取样检测其od600nm值，每个时间点做三个平行，绘制出重组干酪乳
酸杆菌在mrs液体培养基的生长曲线。结果：培养24h后进入稳定期，od600nm值达到3.89。因此，重组干酪乳酸杆菌的最佳发酵时间为24h。具体见图3。
32.实施例2 重组菌发酵取实施例1制备的重组干酪乳酸杆菌冻干粉1.0g，溶于1ml mrs液体无菌培养基中，取菌液在mrs平板培养基上划线，全程无菌操作。划线后的培养基置于30℃恒温培养箱中培养24h进行活化。挑取单菌落，接种在10ml无菌mrs液体培养基中，30℃细菌培养箱中厌氧培养24h，按照接种量2%接种到500ml mrs液体培养基中，30℃细菌培养箱中厌氧培养24h，然后按照接种量2%（体积比）接种于2.5l mrs液体培养基，30℃细菌培养箱中厌氧培养24h后为一级种子液。
33.然后按照接种量2%（体积比）接种于含有125l mrs液体培养基200l种子罐液体中，30℃细菌培养箱中厌氧，通气比为1:0.8，转速为150 r/min；发酵温度为30
±
0.5℃；罐压是0.06mpa；培养24h后得到二级种子液，最后按照接种量2%（体积比）接种于含有6250l mrs液体培养基10000l发酵罐液体中，30℃细菌培养箱中厌氧，通气比为1:0.8，转速为150r/min；发酵温度为30
±
0.5℃；罐压是0.06mpa；培养24h后得到重组干酪乳酸杆菌发酵液（活菌浓度≧4.0
×
109cfu/ml），最后调节发酵罐压力至0.03mpa，调节储料罐压力为零，利用压力差将经过发酵的重组干酪乳酸杆菌发酵液压到储料罐中。
34.实施例3 喷雾干燥工艺的优化将在储料罐重组干酪乳酸杆菌发酵液与麦芽糊精混匀，热预处理后喷雾。
35.喷雾时，先将喷雾干燥仪用蒸馏水洗涤，通入200℃空气中灭菌处理20min，待设备冷却后，将预处理的液体放入进料口，开始喷雾干燥，控制喷雾干燥机的进口温度为110℃，出口温度为70℃，喷液速度为200l/h。
36.麦芽糊精的浓度=麦芽糊精质量与发酵菌液体积比。
37.其中，以存活率为标准，考察指标麦芽糊精浓度（20%、30%、40%）、热预处理的加热温度（35℃、40℃、45℃）、热预处理的加热时间（30min，45min，60min）进行正交试验（3个因素3水平），试验均重复3次。存活率=喷雾干燥菌粉计数结果（cfu/g）
×
麦芽糊精浓度(g/ml)/放罐时发酵液活菌数（cfu/ml）
×
100%。
38.表1 正交试验因素水平表表2 正交试验结果与分析表
表3方差分析表结果表明，对制备的重组干酪乳酸杆菌存活率的影响程度由大到小为麦芽糊精浓度＞加热温度＞加热时间；经试验，麦芽糊精浓度选为40%，加热温度选为45℃，加热时间优选为45min。
39.实施例4 重组干酪乳酸杆菌粉的制备将重组干酪乳酸杆菌发酵液与麦芽糊精混匀，热预处理后喷雾干燥，调整浓度得到100亿cfu/g的重组干酪乳酸杆菌菌粉。
40.所述麦芽糊精与重组干酪乳酸杆菌发酵液的质量体积比为40:100；所述热预处理，温度为45℃，时间为45min；所述喷雾干燥，进口温度为110℃，出口温度为70℃，喷液速度为200l/h。
41.实施例5 复合菌剂制备选择重组干酪乳酸杆菌菌粉(100亿cfu/g)、枯草芽孢杆菌菌粉（100亿cfu/g）和地衣芽孢杆菌菌粉（100亿cfu/g）复配得到复合菌剂，置2～8℃保存。
42.所述枯草芽孢杆菌，菌种保藏号为cicc 10148；所述地衣芽孢杆菌，菌种保藏号为cicc 10037，均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，然后本公司经过发酵生产得到菌粉。
43.其中，通过正交试验确定菌剂中各菌粉的添加比例，采用l9（33）正交表，以重组干酪乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌作为a、b、c 3个考察因素，选取3个添加量水平（质量份）配制菌剂（表1）。将优化后的混合菌剂按照添加量1000g/t添加到饲料中进行鸡生长性能试验，以平均日增重为指标考察复合菌剂的促生长效果。鸡生长性能试验是将1800
羽1日龄的健康白羽鸡，随机分为9个处理组，每组200羽。按照正交试验表的分组进行添加复合菌剂进行饲养，试验周期为40d。试验均重复3次。平均日增重计算：试验结束前的重量减去试验开始前的重量再除以试验天数，表示为：（末重-初重）/试验天数。
44.表4 正交试验因素水平表表5 正交试验结果与分析表表6方差分析表结果表明，对平均日增重的影响程度由大到小为重组干酪乳酸杆菌＞地衣芽孢杆菌＞枯草芽孢杆菌；经试验，重组干酪乳酸杆菌：枯草芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌按照质量比为3：1：3进行复配得到复合菌剂。
45.实施例6 应用案例将1000羽1日龄的健康白羽鸡，随机分为对照组和实验组5个组，每组200羽。对照组给予正常饲料进行饲养，其中1-21d 日粮组成：玉米（52.69%，质量占比）、豆粕（40.00%，质量占比）、豆油（3.00%，质量占比）、石粉（1.10%，质量占比）、磷酸氢钙（1.90%，质量占比）、食盐（0.37%，质量占比）、蛋氨酸（0.19%，质量占比）、赖氨酸（0.05%，质量占比）、微元素预混
剂（0.5%，质量占比）、维生素预混剂（0.2%，质量占比）。
46.22-40d 日粮组成：玉米（59.03%，质量占比）、豆粕（33.8%，质量占比）、豆油（3.00%，质量占比）、石粉（1.30%，质量占比）、磷酸氢钙（1.70%，质量占比）、食盐（0.37%，质量占比）、蛋氨酸（0.07%，质量占比）、赖氨酸（0.03%，质量占比）、微元素预混剂（0.5%，质量占比）、维生素预混剂（0.2%，质量占比）。
47.复合菌剂组在对照组的基础上按照添加复合菌剂（添加量1000g/t），枯草芽孢杆菌剂组在对照组的基础上按照添加枯草芽孢杆菌菌粉（添加量1000g/t），地衣芽孢杆菌剂组在对照组的基础上按照添加地衣芽孢杆菌菌粉（添加量1000g/t），重组干酪乳酸杆菌剂组在对照组的基础上按照添加重组干酪乳酸杆菌菌粉（添加量1000g/t）。
48.重组干酪乳酸杆菌菌粉为实施例4制备的菌粉，枯草芽孢杆菌的菌种保藏号为cicc 10148，菌浓度为100亿cfu/g，地衣芽孢杆菌的菌种保藏号为cicc 10037，菌浓度为100亿cfu/g；复合菌剂为实施例5制备得到。
49.试验周期为40d。试验均重复3次。其中平均日增重：试验期间食用饲料总量再除以试验天数，表示为：食用饲料总量/试验天数。料肉比=平均采食量/平均日增重。结果表明：复合菌剂组平均日增重明显高于其余组（p《0.05），而复合菌剂组死淘数明显低于其余组（p《0.05）。具体数据见表7。
50.表7 复合菌剂和各单独的菌粉对白羽鸡生长性能的影响通过上表可见，复合菌剂组相对于枯草芽孢杆菌剂组、地衣芽孢杆菌剂组、重组干酪乳酸杆菌剂组，平均日增重明显提高，料肉比降低，死淘数更少，死淘率仅为5.34%。