端粒长度作为职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变生物标志物的用途的制作方法

p0，核糖体磷酸化蛋白大亚基p0)基因；所述扩增内参基因的引物以该内参基因序列为靶序列进行引物设计。
18.可选的，扩增端粒基因的引物以“ttaggg”为单位的重复序列为目标序列进行设计得到。
19.可选的，所述易感性分析检测产品为试剂或试剂盒。
20.本技术还提供一种职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变易感性分析检测试剂或试剂盒，包括扩增端粒基因和内参基因的引物；
21.所述扩增端粒基因的引物包括：
22.上游引物序列(5'
→
3')
23.cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt(seq id no：1)，
24.下游引物序列(5'
→
3')
25.ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct(seq id no：2)；
26.所述扩增内参基因的引物包括：
27.上游引物序列(5'
→
3')
28.cagcaagtgggaaggtgtaatcc(seq id no：3)，
29.下游引物序列(5'
→
3')
30.cccattctatcatcaacgggtacaa(seq id no：4)。
31.所述试剂盒为实时荧光定量pcr试剂盒，所述的试剂盒中还包括：荧光定量pcr反应体系试剂(2
×
tb green ii mix和50
×
rox reference dye)、无核酸酶双蒸水等常规组分。
32.本技术还提供一种端粒长度作为生物标志物在制备职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变易感性分析检测产品中的用途。
33.可选的，所述端粒长度变化的计算公式为：
34.端粒相对长度(t/s)＝2
^(-δct)
，其中δct＝ct
端粒-ct
内参
；
35.ct
端粒
指扩增受试者端粒基因并达到设定荧光信号阈值时的最终ct值；
36.ct
内参
指扩增受试者内参基因并达到设定荧光信号阈值时的最终ct值。
37.本技术经研究发现，端粒长度可作为生物标志物用于职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸改变的易感性分析，端粒长度缩短的职业性农药接触人群更容易游离三碘甲状腺原氨酸异常。有望在职业性农药接触人群甲状腺功能紊乱监测方面提供实践参考指标。
附图说明
38.图1为农药接触者a01的内参基因表达和端粒基因表达的扩增曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。
39.图2为农药接触者a01的内参基因表达和端粒基因表达的溶解曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。
40.图3为非农药接触者c07的内参基因表达和端粒基因表达的扩增曲线(其中(a)为内参基因，(b)为端粒基因)。
41.图4为非农药接触者c07的内参基因表达和端粒基因表达的溶解曲线(其中(a)为
内参基因，(b)为端粒基因)。
具体实施方式
42.下面将结合本技术对本技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
43.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
44.游离三碘甲状腺原氨酸水平升高一定程度反映甲状腺病变，而甲状腺又是农药的作用靶器官。当甲状腺功能正常状态时，端粒长度改变通常见于年长者。当甲状腺出现生理异常和(或)病理状态，端粒长度发生改变可能取决于个体基因遗传性状。
45.本技术经研究发现，端粒长度可作为生物标志物用于职业性农药接触人群游离三碘甲状腺原氨酸异常的易感性分析，端粒长度缩短的职业性农药接触人群更容易游离三碘甲状腺原氨酸异常。
46.以下以实施例进行具体说明：
47.实施例1
48.(1)研究对象
49.本实验纳入150名农业从业者，包括72名农药使用者和78名非农药使用对照者。所有研究对象均签署知情同意书，完成相应流行病学调查，并提供1-3ml外周血标本。
50.(2)外周血基因组dna提取与检测
51.采用基因组dna柱式小量提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)提取外周血中基因组dna。随后，使用nanodrop微量核酸浓度定量仪(fisher公司)进行dna样本浓度测定，以琼脂糖凝胶电泳法进行dna样本质量检查。
52.(3)端粒基因和内参基因引物设计和合成
53.端粒基因引物设计：
54.以“ttaggg”为单位的重复序列(seq id no：5)为靶序列进行引物设计：
55.应用primer3引物设计软件，对端粒基因序列设计引物，其中引物长度设为40bp，tm值设定80度左右，gc含量《55％，引物设计对应靶序列描述如下：tagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttacggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggttagggttagggtaagggtaagggtaagggtaagggtaaggcaagccttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggtt(seq id no：5)
56.筛选出的扩增端粒基因的引物如下：
57.上游引物序列(5'
→
3')
58.cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt(seq id no：1)
59.下游引物序列(5'
→
3')
60.ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct(seq id no：2)
61.内参基因引物设计：以“rplp0，ribosomal protein lateral stalk subunit p0，基因(seq id no：6)为靶序列进行引物设计。
62.应用primer3引物设计软件，对内参基因序列设计引物，其中引物长度设为《30bp，tm值设定在65度左右，gc含量《53％，引物设计对应靶序列描述如下：
63.atgagatgaaatggcctctcttgagactgagctgccaacctggcaattattgtctgctaagggttctctttattcacccttacttggacttcctttcctgtagggaatctcacgtaaaatgaaatcttccctcccccagggtgtccgcaatgttgccagtgtctgtctgcagattggctacccaactgttgcatcagtaccccattctatcatcaacgggtacaaacgagtcctggccttgtctgtggagacggattacaccttcccacttgctgaaaaggtaaaaggatcccaccaggaccacagtgggcctgactgtgacaaattagcagggtgatgtggccttctaccttactgcttttatagttgtattttatatagcagataattttgtgaggggatatttgagaggttgggaggcagggaaggcgtttctcacttgagaaatgacaagagacccaaagagggggttaat(seq id no：6)。
64.筛选出的扩增内参基因的引物如下：
65.上游引物序列(5'
→
3')
66.cagcaagtgggaaggtgtaatcc(seq id no：3)
67.下游引物序列(5'
→
3')
68.cccattctatcatcaacgggtacaa(seq id no：4)
69.端粒基因和内参基因引物合成：委托上海生工公司合成。
70.(4)端粒基因和内参基因表达量的pcr检测
71.定量pcr反应体系：按表1试剂配置pcr反应体系。
72.表1定量pcr反应体系
[0073][0074]
定量pcr反应程序：按表2设置pcr反应程序。
[0075]
表2定量pcr反应程序
[0076][0077]
端粒引物检测体系和内参引物检测体系均以受试者的外周血基因组dna为模板。
[0078]
实验数据处理与分析
[0079]
读取下载端粒(即以受试者dna为模板，利用端粒引物扩增出的端粒基因)和内参
基因(即以受试者dna为模板，利用内参引物扩增出的内参基因)的最终ct值。
[0080]
计算端粒相对长度，端粒相对长度(t/s)＝2
^(-δct)
，其中δct＝ct
端粒-ct
内参
；ct
端粒
指扩增受试者端粒基因并达到设定荧光信号阈值时的最终ct值；ct
内参
指扩增受试者内参基因并达到设定荧光信号阈值时的最终ct值。
[0081]
结果
[0082]
以其中农药接触者a01和非农药接触者c07为例，农药接触者a01的内参基因表达的扩增曲线如图1中(a)所示，农药接触者a01的端粒基因表达的扩增曲线如图1中(b)所示；农药接触者a01的内参基因表达的溶解曲线如图2中(a)所示，农药接触者a01的端粒基因表达扩增曲线如图2中(b)所示；非农药接触者c07的内参基因表达的扩增曲线如图3中(a)所示，非农药接触者c07的端粒基因表达的扩增曲线如图3中(b)所示；非农药接触者c07的内参基因表达的溶解曲线如图4中(a)所示，非农药接触者c07的端粒基因表达扩增曲线如图4中(b)所示。
[0083]
在150名农业从业者中，端粒长度的最小值和最大值分别为0.16和3.57，平均值为0.86。其中，78名非农药使用人群和72名农药使用人群的端粒长度均值分别为0.95
±
0.54和0.76
±
0.28(p＝0.010)，而两组人群的平均年龄分别为42
±
11和45
±
11岁(p＝0.061)。以0.86作为长端粒或短端粒的分类截断值，非农药使用和农药使用人群的短端粒检出率分别为53.8％和76.4％(p＝0.004)。
[0084]
在150名农业从业者中，游离三碘甲状腺原氨酸的最小值和最大值分别为3.48和6.79pmol/l，平均值为4.82pmol/l。其中，78名非农药使用人群和72名农药使用人群的均值分别为4.62
±
0.53和5.03
±
0.54pmol/l(p《0.001)。以》4.82pmol/l作为游离三碘甲状腺原氨酸相对升高的截断值，非农药使用和农药使用人群的游离三碘甲状腺原氨酸升高检出率分别为33.3％和62.5％(p《0.001)。
[0085]
在短端粒亚组人群中，非农药使用和农药使用人群的游离三碘甲状腺原氨酸升高检出率分别为33.3％(14/42)和63.6％(35/55)(p＝0.003)；在长端粒亚组中，非农药使用和农药使用人群的游离三碘甲状腺原氨酸升高检出率分别为33.3％(12/36)和58.8％(10/17)(p＝0.079)。
[0086]
多因素logistic回归分析表明，在矫正年龄、性别和体重指数等因素的条件下，对于短端粒人群而言，农药接触造成游离三碘甲状腺原氨酸水平升高的风险是非接触者的15.66倍(95％置信区间:3.79-64.64)。然而，在长端粒人群中，农药接触并非是造成游离三碘甲状腺原氨酸水平升高的独立风险因素。
[0087]
结果如表3所示：
[0088]
表3不同端粒长度对农药接触所致游离三碘甲状腺原氨酸水平升高风险的影响
[0089] 短端粒 长端粒
ꢀꢀ
优势比(95％置信区间)p优势比(95％置信区间)p农药接触(否为参照)15.66(3.79-64.64)《0.0012.64(0.47-14.75)0.268年龄，岁0.95(0.90-1.00)0.0460.87(0.79-0.97)0.008性别10.47(2.78-39.46)0.00111.52(1.76-75.51)0.011体重指数，kg/cm21.18(1.01-1.38)0.0331.61(1.17-2.21)0.003
[0090]
由以上结果可知，农业从业者的农药接触可能升高外周血游离三碘甲状腺原氨酸
水平，并取决于端粒长短的改变；外周血短端粒的农业从业人群的农药接触更易出现游离三碘甲状腺原氨酸水平升高；由此，农药接触农业从业者的游离三碘甲状腺原氨酸水平监测需同时考虑端粒长度检测，以期早期识别和筛选甲状腺激素紊乱高危人群。
[0091]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。