用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物、检测方法和应用与流程

1.本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物、检测方法和应用。


背景技术：

2.肌萎缩性侧索硬化症(amyotrpnic lateral sclerosis，als)为致命性神经系统变性疾病，主要累及锥体束、脑干和脊髓前角细胞，临床表现为呈进行性加重的肌肉萎缩、无力及痉挛，以及认知损害等，与额颞叶痴呆的临床表现存在部分重叠，是运动神经元病中最常见的类型。
3.als发病年龄为50-60岁之间，发病率为2/100000，其特征为选择性的上、下运动神经元死亡，导致进行性肌肉萎缩、无力和僵硬。als从发病到死亡的生存中位数为39个月，大多数患者一般会在3-5年因呼吸衰竭而死亡。约有5-10％家族性als通常是常染色体显性遗传；90-95％的als病例属于散发性als(nat rev neurosci 2001；2:806-819；annu revneurosci 2004；27:723-749)。约有20％的家族性als是cu/zn超氧化物歧化酶(sod1)基因突变所致。因为散发性和家族性als临床表现类似，阐明家族性als潜在机制有利于研究两种形式的als。
4.另外，研究发现家族性als常染色体存在rna代谢蛋白tdp-43基因突变，同时绝大多数散发性als患者也存在tdp-43蛋白病理性改变，这暗示在理解散发性和家族性als中tdp-43可能具有极大的意义(proc natl acad sci u s a2007；104:12524-12529)。als发病机制复杂，目前的生物学假说包括氧化损伤、细胞内聚集物累积、线粒体功能失常、轴突运输缺失、生长因子缺乏、胶质细胞病理和谷氨酸兴奋毒性等(ann neurol.2009jan65suppl 1:s3-9)。
5.由于als的病因和发病机制尚不明确，目前临床治疗上缺乏有效的根治手段，亦没有特效方法/药物逆转和阻止病情进展，主要通过早期进行对症治疗，现有的治疗仅能改善症状，并不能组织或者逆转疾病的进展。因此，寻找与肌萎缩性侧索硬化症相关的基因标志物尤其是预警监测和早期诊断的标志物对提高早期肌萎缩性侧索硬化症的诊断率，实现早期诊断和干预显著减少als的危害，从而减轻社会和家庭的负担。


技术实现要素：

6.针对现有技术中肌萎缩性侧索硬化症检测和诊断中存在的问题，本发明提出一种用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物、检测方法和应用，通过高通量测序检测，同时检测一个样本的多个肌萎缩性侧索硬化症致病基因突变，具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物，包含一个或两个以上如
下基因的组合：sod1、als2、sqstm1、setx、fus、spg11、vapb、ang、tardbp、fig4、optn、vcp、ubqln2、sigmar1、chmp2b、pfn1、erbb4、hnrnpa1、dctn1、prph、nefh、spast、nipa1、pnpla6、smn1、chrna4、dao、hfe、apoe、diaph3、dpp6、mapt、park7、bcl6、ewsr1、taf15、ogg1、crym、grn、itpr2、vegfa、pon1、alad、pnpla6、slc52a3、slc52a2、sox5、srcap、hnrnpa2b1、apex1、lum、arhgef28、neto1、bcl11b、oma1、cdh13、pcp4、cdh22、pon2、chgb、pon3、cntn6、ramp3、crim1、ss18l1、doc2b、dpysl3、trpm2、elp3、ubqln1、epha4、unc13a、fezf2、susd1、fggy、zfp64、grb14、znf512b、kifap3、spg20、gbe1、hexa、trpm7、l1cam、plp1、atl1、cyp7b1、spg7、kiaa0196、kif5a、rtn2、hspd1、zfyv26、bscl2、c19orf12、dnmt1、atxn2。
9.作为优选方案，所述基因标志物包括cdh13。
10.本发明还提供所述用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物在制备诊断肌萎缩性侧索硬化症的药物或检测试剂中的应用。
11.作为优选方案，所述检测试剂采用试剂盒的形式。
12.本发明还提供一种与肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变的检测方法，包括以下步骤：
13.s1、提取检测对象的基因组dna；
14.s2、将基因组dna依次进行片段化、纯化和pre
–
pcr扩增反应，得到目标区域dna文库；
15.s3、通过芯片对目标区域dna文库的目标基因编码区和临近剪切区的dna进行捕获和富集，得到目标区域文库；
16.s4、用高通量测序平台对目标区域文库进行基因检测，得到测序数据；
17.s5、对所得测序数据与所述基因组dna的参考序列进行对比，发现存在的基因突变并进行数据分析，得到与肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变信息；
18.所述基因组dna选自如下基因形成的组：sod1、als2、sqstm1、setx、fus、spg11、vapb、ang、tardbp、fig4、optn、vcp、ubqln2、sigmar1、chmp2b、pfn1、erbb4、hnrnpa1、dctn1、prph、nefh、spast、nipa1、pnpla6、smn1、chrna4、dao、hfe、apoe、diaph3、dpp6、mapt、park7、bcl6、ewsr1、taf15、ogg1、crym、grn、itpr2、vegfa、pon1、alad、pnpla6、slc52a3、slc52a2、sox5、srcap、hnrnpa2b1、apex1、lum、arhgef28、neto1、bcl11b、oma1、cdh13、pcp4、cdh22、pon2、chgb、pon3、cntn6、ramp3、crim1、ss18l1、doc2b、dpysl3、trpm2、elp3、ubqln1、epha4、unc13a、fezf2、susd1、fggy、zfp64、grb14、znf512b、kifap3、spg20、gbe1、hexa、trpm7、l1cam、plp1、atl1、cyp7b1、spg7、kiaa0196、kif5a、rtn2、hspd1、zfyv26、bscl2、c19orf12、dnmt1、atxn2。
19.作为优选方案，所述基因组dna来源于人类的血液、唾液或离体组织。
20.作为优选方案，所述基因突变为点突变或20bp以内的缺失插入突变。
21.作为优选方案，所述基因突变位于cdh13。
22.作为优选方案，采用试剂盒的形式进行所述与肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变检测。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明以受检者血液、唾液或其他离体组织来源的基因组dna为检测材料，先将基因组dna打断并制备文库，然后通过芯片对目标基因编码区及临近剪切区的dna进行捕获和富集，用高通量测序平台进行基因外显子编
码区测序，最后与参考序列进行比较发现可能存在的基因突变，具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点，有助于发现和验证肌萎缩性侧索硬化症相关的目标基因和关键位点，用于延缓甚至阻止als的出现，在临床诊断和药物开发方面有巨大的应用空间。
附图说明
24.图1是实施例1中cdh13基因的参考序列(a)和测序结果(b)对比图。
具体实施方式
25.下面通过具体实例对本发明的技术方案做进一步的菌体说明。应当理解，以下描述的具体实例仅用于解释文本发明，并不用于限定本发明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员咋没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.以下实施例中用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物，包含一个或两个以上如下基因的组合：sod1、als2、sqstm1、setx、fus、spg11、vapb、ang、tardbp、fig4、optn、vcp、ubqln2、sigmar1、chmp2b、pfn1、erbb4、hnrnpa1、dctn1、prph、nefh、spast、nipa1、pnpla6、smn1、chrna4、dao、hfe、apoe、diaph3、dpp6、mapt、park7、bcl6、ewsr1、taf15、ogg1、crym、grn、itpr2、vegfa、pon1、alad、pnpla6、slc52a3、slc52a2、sox5、srcap、hnrnpa2b1、apex1、lum、arhgef28、neto1、bcl11b、oma1、cdh13、pcp4、cdh22、pon2、chgb、pon3、cntn6、ramp3、crim1、ss18l1、doc2b、dpysl3、trpm2、elp3、ubqln1、epha4、unc13a、fezf2、susd1、fggy、zfp64、grb14、znf512b、kifap3、spg20、gbe1、hexa、trpm7、l1cam、plp1、atl1、cyp7b1、spg7、kiaa0196、kif5a、rtn2、hspd1、zfyv26、bscl2、c19orf12、dnmt1、atxn2。
27.一些实施例中，基因标志物包括cdh13，该基因编码钙粘蛋白超家族的成员，编码蛋白质位于细胞膜表面，并由gpi部分锚定，而不是由跨膜结构域锚定，该蛋白在神经分化过程中充当轴突生长的负调节剂，与cdh13相关的疾病包括慢波睡眠中持续棘慢波的癫痫和landau-kleffner综合征。
28.以下实施例中用于检测肌萎缩性侧索硬化症的基因标志物可用于制备诊断肌萎缩性侧索硬化症的药物或检测试剂，例如，检测试剂可以采用试剂盒的形式。
29.以下实施例中采用一种与肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变的检测方法(如试剂盒的形式)，主要技术流程包括提取基因组dna、文库制备、文库质检定量、上机测序及数据对比分析，步骤如下：
30.s1、提取检测对象的基因组dna，包括如下基因形成的组：sod1、als2、sqstm1、setx、fus、spg11、vapb、ang、tardbp、fig4、optn、vcp、ubqln2、sigmar1、chmp2b、pfn1、erbb4、hnrnpa1、dctn1、prph、nefh、spast、nipa1、pnpla6、smn1、chrna4、dao、hfe、apoe、diaph3、dpp6、mapt、park7、bcl6、ewsr1、taf15、ogg1、crym、grn、itpr2、vegfa、pon1、alad、pnpla6、slc52a3、slc52a2、sox5、srcap、hnrnpa2b1、apex1、lum、arhgef28、neto1、bcl11b、oma1、cdh13、pcp4、cdh22、pon2、chgb、pon3、cntn6、ramp3、crim1、ss18l1、doc2b、dpysl3、trpm2、elp3、ubqln1、epha4、unc13a、fezf2、susd1、fggy、zfp64、grb14、znf512b、kifap3、spg20、gbe1、hexa、trpm7、l1cam、plp1、atl1、cyp7b1、spg7、kiaa0196、kif5a、rtn2、hspd1、
zfyv26、bscl2、c19orf12、dnmt1、atxn2；
31.s2、将基因组dna依次进行片段化、纯化和pre
–
pcr扩增反应，得到目标区域dna文库；
32.s3、通过芯片对目标区域dna文库的目标基因编码区和临近剪切区的dna进行捕获和富集，得到目标区域文库；
33.s4、用高通量测序平台对目标区域文库进行基因检测，得到测序数据；
34.s5、对所得测序数据与基因组dna的参考序列进行对比，发现存在的基因突变并进行数据分析，得到与肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变信息。
35.一些实施例中，基因组dna可以来源于人类的血液、唾液或离体组织。
36.一些实施例中，基因突变为点突变或20bp以内的缺失插入突变。
37.一些实施例中，基因突变位于cdh13。
38.一些实施例中，可以采用采用试剂盒的形式进行与肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变检测。
39.以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行解释说明。
40.实施例1
41.先证者李**，男，63岁，送检医院：上海交通大学医学院附属瑞金医院。
42.样本类型：全血。
43.临床表现：四肢无力，行动不便多年。
44.检测项目：肌萎缩性侧索硬化症致病相关的基因突变。
45.检测编号：als-2021091802。
46.检测区域：人类基因组dna中约106个基因的外显子区。
47.检测策略：对omim数据库收录的明确致病关系基因进行分析。
48.检测方法：ngs芯片捕获高通量测序。
49.检测结果：在上述先证者中检测到1个与临床表型显著相关的单基因突变或变异，如表1和图1所示。
50.表1
[0051][0052]
图1为实施例1中cdh13基因的参考序列(图1a)和测序结果(图1b)对比。运用ngs测序的检测方法对受检者样本进行全外显子测序，并结合受检者临床表型进行生物信息学分析，发现受检者样本中cdh13基因第5号外显子上存在c.c502g碱基杂合改变，导致该基因编码的第168位密码子由酪氨酸变为半胱氨酸。生物信息学软件(sift)预测其致病(pp3)，该基因被发现与肌萎缩侧索硬化症额叶皮质钙粘附素结合蛋白改变相关，既往该位点无相关致病性报道。cdh13基因(mim:601364)与肌萎缩侧索硬化症、高脂联素水平、慢波睡眠中持续棘慢波的癫痫和landau-kleffner综合征相关，结合图1可知cdh13与als致病有关。
[0053]
综上所述，本发明以受检者血液、唾液或其他组织来源的基因组dna为检测材料，首先进行将dna打断并制备文库，然后通过芯片对目标基因编码区及临近剪切区的dna进行
捕获和富集，最后使用高通量测序平台进行突变检测，发现可能存在的基因突变。
[0054]
需要说明的是，本发明适用于点突变及20bp以内的缺失插入突变(微小突变)，不适用于杂合性基因大片段拷贝数变异、动态突变及复杂重组等特殊类型突变的检测，也不适用于检测基因组结构变异(例如大片段缺失、复制与倒位重排)、大片段杂合插入突变(如alu介导的插入)及位于基因调节区及深度内含子区的突变。另外，由于部分基因存在高重复低复杂度区域或假基因，以致检测不能完全覆盖其所有外显子区，但总体覆盖度可达95％以上，具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点，有助于发现和验证肌萎缩性侧索硬化症相关的目标基因和关键位点，用于延缓甚至阻止als的出现，在临床诊断和药物开发方面有巨大的应用空间。
[0055]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。