抗n3pglu淀粉样蛋白
β
肽抗体及其用途
1.本技术是申请日为2017年1月10日的中国专利申请201780006700.3“抗n3pglu淀粉样蛋白β肽抗体及其用途”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及结合n3pglu淀粉样蛋白β肽的抗体和它们在治疗涉及淀粉样蛋白β(本文中称为aβ或abeta)肽的疾病中的用途。
背景技术：
3.淀粉样蛋白前体蛋白的切割产生了大小范围在38-43个氨基酸的aβ肽。aβ从可溶形式至具有高β折叠含量的不可溶形式的转变，以及这些不可溶形式作为脑中的神经炎斑块和脑血管斑块的沉积已经与多种病症和疾病相关，包括阿尔茨海默病(ad)、唐氏综合征和大脑淀粉样血管病(caa)。
4.在斑块中发现的沉积物由aβ肽的异质混合物构成。n3pglu aβ，也被称为n3pe、pe3-42或aβ
p3-42
，是aβ肽的截短形式并且仅发现于斑块中。n3pglu aβ缺乏位于人aβ的n-端的前两个氨基酸残基并且具有焦谷氨酸，其源自第三氨基酸位置的谷氨酸。尽管n3pglu aβ肽是脑中沉积的aβ的少量组分，但是研究已证实n3pglu aβ肽具有积极聚集特性并且在沉积级联早期积累。
5.针对n3pglu aβ的抗体是本领域已知的。例如，美国专利号8,679,498公开了人n3pglu aβ抗体(例如b12l)和使用所述抗体治疗疾病 (诸如阿尔茨海默病)的方法。但是，仍存在对具有更高亲和力、改善的热稳定性、降低的非特异性结合和较低水平的免疫原性的n3pglu aβ抗体的需求。这样的n3pglu aβ抗体将为潜在的人治疗剂提供改善的安全性概况，以及用于更佳给药时间表的药代动力学。
技术实现要素：
6.在本发明范围内的抗体具有这些期望的特征。本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(lcvr)，其具有seq id no: 9或10的氨基酸序列，和重链可变区(hcvr)，其具有seq id no: 8的氨基酸序列。在具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(lcvr)，其具有seq id no: 9的氨基酸序列，和重链可变区(hcvr)，其具有seq id no: 8的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(lcvr)，其具有seq id no: 10的氨基酸序列，和重链可变区(hcvr)，其具有seq id no: 8的氨基酸序列。
7.在一个实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其包含轻链(lc)和重链(hc)，其中所述lc的氨基酸序列是seq id no:12或13的氨基酸序列，且所述hc的氨基酸序列是seq id no:11的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其包含轻链(lc)和重链(hc)，其中所述lc的氨基酸序列是seq id no:12的氨基
酸序列，且所述hc的氨基酸序列是seq id no:11的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其包含轻链(lc)和重链(hc)，其中所述lc的氨基酸序列是seq id no:13的氨基酸序列，且所述hc的氨基酸序列是seq id no:11的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明提供了抗体，其包含两条lc和两条hc，其中每条lc的氨基酸序列是seq id no:12或13，且每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。在更具体的实施方案中，本发明提供了抗体，其包含两条lc和两条hc，其中每条lc的氨基酸序列是seq id no:12，且每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。在更具体的实施方案中，本发明提供了抗体，其包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:13，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
8.本发明还提供了n3pglu aβ抗体，其包含lcvr和hcvr，其中所述lcvr包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，且其中hcvr包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，且其中所述cdr的氨基酸序列对于lcdr1为seq id no:4、lcdr2为seq id no:6、lcdr3为seq id no:7、hcdr1为seq id no:1、hcdr2为seq id no:2和hcdr3为seq id no:3。
9.本发明进一步提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和一种或多种药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。进一步地，本发明提供了治疗疾病的方法，所述疾病特征在于aβ沉积，所述方法包括向有需要的患者施用本发明的药物组合物。具体地，本发明提供了治疗或预防临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前caa的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的抗体。更具体地，本发明提供了治疗或预防选自前驱ad (有时也被称为aβ相关轻度认知障碍，或mci)、轻度ad、中度ad和严重ad的病症，其包括向有需要的患者施用本发明的药物组合物。
10.在另一个实施方案中，本发明提供了在诊断为具有临床前阿尔茨海默病或临床阿尔茨海默病的患者中减缓认知减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。更具体地，本发明进一步提供了在诊断为具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中减缓认知减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
11.在另一个实施方案中，本发明提供了在诊断为具有临床前阿尔茨海默病或临床阿尔茨海默病的患者中减缓机能减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。更具体地，本发明提供了在诊断为具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中减缓机能减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
12.在另一个实施方案中，本发明提供了在诊断为具有临床前阿尔茨海默病或临床阿尔茨海默病的患者中减少脑aβ淀粉样蛋白斑负荷的方法，其包括施用本发明的药物组合物。更具体地，本发明提供了在诊断为具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中减少脑aβ淀粉样蛋白斑负荷的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
13.在另一个实施方案中，本发明提供了在具有低水平的脑脊液(csf)中aβ1-42或脑中aβ斑块的无症状患者中预防记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
14.在另一个实施方案中，本发明提供了治疗已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了治疗已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变psen1 e280a (paisa突变)的无症状患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在另一个具体实施方案中，
本发明提供了治疗具有导致常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
15.在另一个实施方案中，本发明提供了预防已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了预防已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变psen1 e280a (paisa突变)的无症状患者的记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在另一个具体实施方案中，本发明提供了预防具有导致常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
16.在另一个实施方案中，本发明提供了在已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者中减缓认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了在已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变psen1 e280a (paisa突变)的无症状患者中减缓的认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在另一个具体实施方案中，本发明提供了在具有导致常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者中减缓认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
17.本发明还提供了本发明的抗体，其用于疗法中。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于治疗临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于治疗选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于在被诊断具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退。
18.进一步地，本发明提供了包含本发明的抗体的药物组合物，其用于疗法中。在一个实施方案中，本发明提供了包含抗体的药物组合物，其用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。
19.本发明还提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病。在一个实施方案中，本发明还提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗前驱ad、轻度ad、中度ad或严重ad。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在被诊断具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退。
20.在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在进一步的
实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。
21.在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在进一步的实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在具体的实施方案中，编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:14和编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:15。在具体的实施方案中，编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:14和编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:16。
22.进一步地，本发明提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。优选地，所述哺乳动物细胞包含dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽和具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。本发明还提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。优选地，所述哺乳动物细胞包含dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽和具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(cho)或仓鼠胚胎肾(hek)细胞系。
23.本发明还提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子和/或包含编码具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，其中所述细胞能够表达包含具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr和具有seq id no:9的氨基酸序列的lcvr的抗体。优选地，所述哺乳动物细胞包含dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽和具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。本发明还提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子和/或包含编码具有seq id no:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，其中所述细胞能够表达包含具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr和具有seq id no:10的氨基酸序列的lcvr的抗体。优选地，所述哺乳动
conformations, journal of molecular biology, 406:228-256 (2011))，指定本发明抗体的lcvr和hcvr区域中的cdr的氨基酸。根据以上方法，确定本发明的cdr (表1)。
29.本发明的抗体包括κlc和igg hc。在具体的实施方案中，本发明的抗体是igg1。
30.本发明的抗体是单克隆抗体(“mab”)。单克隆抗体可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如cdr移植)或此类或其它本领域已知的技术的组合产生。在本发明的另一个实施方案中，所述抗体或编码其的核酸以分离的形式提供。如本文所用，术语“分离的”是指不见于在自然中且不含或基本不含见于细胞环境中的其它大分子物质的蛋白、肽或核酸。如本文所用，“基本不含”是指目标蛋白、肽或核酸占存在的大分子物质的大于80% (基于摩尔)，优选地大于90%且更优选地大于95%。
31.在表达和分泌所述抗体后，使培养基澄清以除去细胞，并使用许多常用技术中的任一种纯化澄清的培养基。可以根据配制用于胃肠外施用，特别是用于皮下、鞘内或静脉内施用的蛋白和抗体的熟知的方法，将纯化的抗体配制成药物组合物。抗体可以与合适的药物可接受的赋形剂一起冻干，并且随后在使用前使用基于水的稀释剂重构。可选地，可以将抗体配制为水溶液并在使用前储存至多1-3年。在任一情况下，储存形式和注射形式的抗体的药物组合物将含有一种或多种药物可接受的赋形剂，其为除抗体以外的成分。成分是否是药物可接受的，取决于其对安全性和功效的影响，或对药物组合物的安全性、纯度和效力的影响。如果成分被视为对安全或功效(或对安全、纯度或效力)具有足够的不利影响，以确保其不被用于施用至人的组合物中，则其不是药物可接受以用于所述抗体的药物组合物中的。
32.包含本发明的抗体的药物组合物可以通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内)施用于处于本文所述的疾病或病症的风险或展示出本文所述的疾病或病症的患者。皮下和静脉内途径是优选的。本发明的药物组合物含有“有效”量的本发明的抗体。有效量是指实现期望的治疗结果(按剂量，且对于时间段和对于施用方式)所需的量。抗体的有效量可以根据因素(诸如疾病状态、个体的年龄、性别和体重，以及抗体在个体中引起期望应答的能力)而变化。有效量可以容易地由作为本领域技术人员的主治诊断医生或健康护理专业人通过使用已知技术且通过观察结果而确定。给药的频率取决于在人中的实际药代动力学和药效动力学。治疗的持续时间将取决于诸多因素，并且将由患者的诊断医生或治疗的健康护理提供者基于经验和本领域技术而确定。治疗的频率和持续时间可以根据适应症而变化。术语“治疗”("treatment", "treating"或"to treat"等)包括抑制、减缓、阻止患者中存在的症状、病症、疾病或障碍的进展或严重性。术语“患者”指的是人。
33.术语“预防”是指本发明的抗体对无症状患者或具有临床前阿尔茨海默病的患者的预防性施用，以阻止疾病的进展。
34.术语“特征在于aβ沉积的疾病”是病理特征在于脑中或脑血管中aβ沉积的疾病。这包括诸如阿尔茨海默病、唐氏综合征和大脑淀粉样血管病的疾病。阿尔茨海默病的临床诊断、阶段或进程可以容易地由作为本领域技术人员的主治诊断医生或健康护理专业人通过使用已知技术且通过观察结果而确定。这通常包括一些形式的脑斑块成像、精神或认知评估(例如临床痴呆评定量表-总分(cdr-sb)、简易精神状态量表(mmse)或阿尔茨海默病评估量表-认知(adas-cog))或功能评估(例如阿尔茨海默病合作研究-日常生活活动(adcs-adl))。本文所用的“临床阿尔茨海默病”是阿尔茨海默病的诊断阶段。其包括诊断为前驱阿
尔茨海默病、轻度阿尔茨海默病、中度阿尔茨海默病和重度阿尔茨海默病的病症。术语“临床前阿尔茨海默病”是先于临床阿尔茨海默病的阶段，其中生物标记物(诸如csf aβ42水平或通过淀粉样蛋白pet的沉积脑斑块)的可检测的变化指示了具有阿尔茨海默病病理、向临床阿尔茨海默病进展的患者的最早迹象。这通常在可注意到诸如记忆丧失和混乱的症状之前。
具体实施方式
35.本发明还涉及以下实施方案：1. 结合人n3pglu aβ的抗体，所述抗体包含具有seq id no: 9或seq id no: 10的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)，和具有seq id no: 8的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)。
36.2. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:9的氨基酸序列的lcvr，和具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr。
37.3. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcvr，和具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr。
38.4. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no: 12或seq id no: 13的氨基酸序列的轻链(lc)，和具有seq id no: 11的氨基酸序列的重链(hc)。
39.5. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:12的氨基酸序列的lc，和具有seq id no:11的氨基酸序列的hc。
40.6. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:13的氨基酸序列的lc，和具有seq id no:11的氨基酸序列的hc。
41.7. 实施方案1的抗体，所述抗体包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:12或seq id no:13，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
42.8. 实施方案1的抗体，所述抗体包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:12，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
43.9. 实施方案1的抗体，所述抗体包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:13，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
44.10. 药物组合物，其包含实施方案1-9中任一项的抗体和一种或多种药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
45.11. 治疗具有特征在于aβ沉积的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
46.12. 治疗具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
47.13. 治疗具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者的方法，所述方法包括施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
48.14. 治疗具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
49.15. 治疗具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
50.16. 在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
51.17. 在被诊断具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
52.18. 在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
53.19. 在被诊断具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
54.20. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于疗法中。
55.21. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。
56.22. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于治疗选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症。
57.23. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于治疗选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症。
58.24. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退。
59.25. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于在被诊断具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退。
60.26. 实施方案1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。
61.27. 实施方案1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症。
62.28. 实施方案1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症。
63.以下实施例和测定证实本发明的抗体可用于治疗特征在于aβ沉积的疾病，诸如阿尔茨海默病、唐氏综合征和caa。但是应当理解的是，以下实施例是通过说明的方式阐明而不是限制性的，并且本领域普通技术人员可以实现各种修改。
实施例
64.经工程改造的n3pglu aβ抗体的表达和纯化本发明的n3pglu aβ抗体可以基本如下表达和纯化。通过电穿孔，使用含有编码seq id no: 12或13的lc氨基酸序列的dna序列，和编码seq id no: 11的hc氨基酸序列的dna序列的谷氨酰氨合成酶(gs)表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞系(cho)。表达载体编码sv早期(猿猴病毒40e)启动子和gs的基因。转染后，细胞经历使用0-50
ꢀµ
m l-甲硫氨酸亚砜亚胺的混合选择。选择的大量细胞或主要孔随后在无血清、悬浮培养物中进行扩大培养以用
于生产。
65.将已分泌有抗体的澄清培养基加至蛋白a亲和柱，所述蛋白a亲和柱已使用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4))平衡。使用1m nacl洗涤柱，以移除非特异性结合的组分。将结合的n3pglu a
®
抗体使用例如在ph (大约) 3.5的柠檬酸钠洗脱，并将级分使用1m tris缓冲液中和。通过诸如sds-page或分析尺寸排阻检测n3pglu aβ抗体级分，并随后合并。在ph 7.4的pbs缓冲液或在ph约6的10 mm柠檬酸钠缓冲液、150 mm nacl中浓缩本发明的n3pglu aβ抗体。可以使用常规技术无菌过滤最终产物。n3pglu aβ抗体的纯度大于95%。本发明的n3pglu aβ抗体可以在-70℃立即冷冻或在4℃储存数月。下文显示了本发明的示例性抗体的氨基酸seq id no。
66.表1：示例性的n3pglu aβ抗体的氨基酸序列
67.结合亲和力和动力学使用biacore
®ꢀ
3000 (ge healthcare)通过表面等离子体共振测量n3pglu aβ抗体对pe3-42 aβ肽或对aβ 1-40肽的结合亲和力和动力学。通过经由biacore
®ꢀ
cm5芯片上固定的蛋白a捕获n3pglu aβ抗体，并流过pe3-42 aβ肽或aβ 1-40肽(从100 nm开始以2倍系列稀释降至3.125 nm)，来测量结合亲和力。在hbs-ep缓冲液(ge healthcare br100669; 10 mm hepes，150 mm nacl，3 mm edta，0.05%表面活性剂p20, ph 7.4)中，在25℃进行实验。
68.对于每个循环，以10 μl/min流速注射5 μl浓度为10 μg/ml的抗体溶液，来捕获抗体。以50 μl/min注射250 μl来结合肽，并随后解离10分钟。以10 μl/ml流速注射5 μl甘氨酸缓冲液(ph 1.5)，来再生芯片表面。将数据拟合至1:1 langmiur结合模型以导出k
on
, k
off
，并计算kd。根据基本如上文所述的方法，观察到以下参数(如表2所示)。
69.表2：结合亲和力和动力学抗体k
on
(x1051/ms)k
off
(x10-4
1/s)kd(nm)i1.391.310.71ii3.631.280.35
70.没有检测到对aβ 1-40的可评估的结合，指示相比aβ 1-40，抗体i和抗体ii特异性结合pe3-42 aβ肽。
71.热稳定性为确定在胁迫条件(即升高的温度和低ph)下的抗体稳定性，分别使用pbs或100 mm柠檬酸钠将含有本发明抗体的澄清培养基调节至ph 7.4或ph 5.0。将样品密封并在65℃温育60分钟，并随后在冰上冷却。通过离心将样品中的蛋白聚集物沉淀，并将澄清上清液转移至新平板并通过在pbs缓冲液中50倍稀释中和至ph 7.4。针对未经胁迫的样品测量并计算抗原(pe3-42)结合活性以确定剩余活性百分比。
72.根据基本如上文所述的方法，获得以下数据。
73.表3：胁迫后抗原结合活性百分比抗体ph7.4(%)ph5.0(%)i未测定60.2ii91.671.2b12l62.111.1
74.如表3所证实的，相比b12l,抗体i和抗体ii具有增加的热稳定性。
75.离体靶标结合为确定在来自固定的pdapp脑的脑切片上的离体靶标结合，使用外源添加的本发明的n3pglu aβ抗体执行免疫组化分析。将来自老年pdapp小鼠(25月龄)的恒冷连续冠状切片与20
ꢀµ
g/ml本发明的示例性n3pglu aβ抗体(抗体i和抗体ii)一起温育。使用对人igg特异的二级hrp试剂并且使用dab-plus (dako)使得沉积斑块可视。使用继之以二级step-hrp的生物素化小鼠3d6抗体作为阳性对照。阳性对照抗体(生物素化的3d6)在pdapp海马区中标记了显著量的沉积aβ，并且本发明的示例性n3pglu aβ抗体标记了沉积物的子集。这些组织学研究证明本发明的示例性的n3pglu aβ抗体离体结合沉积的aβ靶标。
76.离体吞噬作用执行离体吞噬作用测定以研究本发明的n3pglu aβ抗体(抗体i和抗体ii)是否可以促进斑块的小胶质细胞吞噬作用。将来自人阿尔茨海默病脑的冷冻切片(20
ꢀµ
m)用10
ꢀµ
g/ml本发明的示例性n3pglu aβ抗体或对照在24孔板中在37℃下预温育1小时。每个处理有四个孔。随后添加原代鼠小胶质细胞(8x105; c57/bl6)并温育24小时。将每孔的组织在5.2m胍缓冲液中变性并且通过elisa评估a
β1-42
含量。因为aβ含量可以跨越多个切片变化，因此对每个测试孔实施姐妹切片对照并且将测试孔的含量归一化至姐妹切片的含量。
77.与阳性对照样品相比，本发明的示例性的n3pglu aβ抗体具有显著减少的aβ
1-42
。阴性对照样品具有可以忽略的沉积aβ
1-42
的清除。因此，离体吞噬作用分析显示本发明的示例性的n3pglu aβ抗体可以通过吞噬通清除离体斑块。
78.体内靶标结合测量了本发明的n3pg抗体在体内跨越血脑屏障并结合沉积斑块的能力。对18月龄的pdapp转基因小鼠给予n3pglu aβ抗体(抗体i或抗体ii)或阴性对照igg的腹膜内注射。每组6只小鼠在第1天和第3天接受40 mg/kg抗体注射。在第6天测定体内靶标结合，此时将小鼠处死并收集脑用于组织化学分析。
79.体内靶标结合的程度量化为对总斑块面积归一化的体内n3pglu aβ抗体结合阳性的区域百分比(te比)，其中所述总斑块面积如通过外源3d6在姐妹切片上的免疫染色所限定。通过测量抗体结合区域的百分比并将所述值针对可能靶标区域的总百分比归一化(通过在姐妹切片上使用阳性对照抗体(3d6)的外源免疫组织化学使总沉积aβ可视)产生te比。
80.根据基本如上文所述的方法，本发明的示例性的n3pglu aβ抗体证实在海马区中的体内靶标结合以及在皮质中有限程度的体内靶标结合，而使用对照igg注射的动物没有显示斑块特异性的染色。te比为1.95% (抗体i)和3.65% (抗体ii)。
81.使用抗体ii在平均24至26月龄的pdapp小鼠中进行了相似的研究。抗体ii具有9.41%的te比。
82.这些结果证实，当外周施用时，抗体i和抗体ii可以跨越血脑屏障并结合沉积的aβ。
83.体内斑块清除使用将抗体ii的lcvr和hcvr融合至鼠恒定κ区和igg2a fc的嵌合替换抗体执行研究，以评估在老年pdapp小鼠中的体内斑块清除。老年pdapp小鼠(22-24月龄，n=23/组)每周一次皮下注射12.5 mg/kg嵌合抗体ii或对照igg，持续7周。使用对照老年pdapp小鼠(在研
究开始时处死)以评估在治疗处理前预先存在的沉积的水平。
84.在研究结束时，在血浆中测量最终药物水平和通过elisa评估脑的aβ
1-42
水平。由使用对照igg经7周处理，aβ
1-42
的非显著的进一步增加，证明老年pdapp小鼠处于斑块上限。抗体ii嵌合抗体组显示了相比对照aβ
1-42
的显著减少(23%, p = 0.0174)。在7周给药时期结束时测量抗体暴露水平，且抗体ii具有31 μg/ml的水平。该研究证实示例性的嵌合n3pglu aβ抗体能够在体内减少斑块(aβ
1-42
)。
85.离体t-细胞增殖episcreen测定使用episcreen
tm
离体人t细胞测定测量响应本发明的示例性的n3pglu aβ抗体(抗体i和抗体ii)的人cd4 t细胞活化(增殖、细胞因子分泌)。episcreen
tm
利用来自50位健康供体的样品，其最好地代表了hla-dr和dq同种异型在欧洲/北美和世界人口中表达的数量和频率。测定中包括两种阳性对照：临床基准抗体人源化a33，其在临床中显示高水平的免疫原性(73%)且在episcreen测定中通常诱导20-30%的t细胞响应，和klh (钥孔虫戚血兰素)，一种含有新抗原的促分裂原样蛋白。匹配的缓冲液阴性对照也包括在测定中。
86.从在时间进程(5-8天)期间观察到的全部阳性供体响应的平均值计算t细胞增殖百分比。阳性对照a33和klh的t细胞增殖百分比分别为20%和98%。b12l、抗体i和抗体ii的t细胞增殖百分比分别为14%、6%和8%。这些数据证实本发明的示例性的n3pglu aβ抗体具有比阳性对照和b12l减少的t细胞响应率。
87.非特异性结合用过荧光活化细胞分选(facs)研究本发明的n3pglu aβ抗体对活cho细胞的非特异性结合，并且通过使用提供跨越宽动态范围的敏感、精确和准确结果的meso scale discovery (msd)技术，研究对人血清白蛋白、纤连蛋白和人ldl的非特异性结合。
88.为检测对活cho细胞的非特异性结合，执行facs分析。在facs 缓冲液 0.1% bsa中，将n3pglu aβ抗体(抗体i、抗体ii或b12l)稀释至200 μg/ml。在facs缓冲液 0.1% bsa中，将rpe标记的f(ab')2驴抗人igg (h l)二级抗体稀释至20 μg/ml。将cho细胞在1,000 rpm旋沉5分钟，并且随后使用facs缓冲液 0.1% bsa洗涤。将细胞在facs缓冲液 0.1% bsa中重悬至4 x 106细胞/ml，并将55 μl细胞悬液添加至96孔板的孔中。将二级抗体与n3pglu aβ抗体等体积混合并在室温温育1小时。将抗体混合物 (55 μl)添加至细胞悬液并在室温温育1小时。每个样品一式两份运行。将板离心，移除上清液，并且将细胞重悬在75 μl facs缓冲液 0.1% bsa中。将板再次离心，并且将细胞重悬在110 μl facs缓冲液 0.1% bsa中。向每孔添加生存力染料(sytox blue; 1.1 μl)并且在facs分析前混合。使用lsrfortessa
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facs机械(bd biosciences)，通过facs分析测量细胞结合活性。
89.为检测对人血清白蛋白、纤连蛋白和人ldl的非特异性结合，使用msd测定。在4℃下使用30 μl/孔的包被蛋白(pbs中20 μg/ml)包被板(msd multiarray 96孔板: msd 目录号l15xa-3)过夜。包被蛋白可以是ldl溶液(来自人血浆的低密度脂蛋白, sigma 目录号l7914)、来自牛血浆的纤连蛋白(sigma 目录号f1141)或hsa (5mg/ml, sigma 目录号a8763)。使用pbs 0.1% tween-20洗涤板3次，在pbs 0.5% bsa中阻断1小时，并随后洗涤。将抗体i或抗体ii (50 μg/ml;在pbs 0.5% bsa中稀释)添加至孔中。每个孔一式两份运行。将板在室温下温育１小时并随后洗涤。使用pbs 0.5% bsa将msd sulfo-tag抗人抗体(msd; 目录号r32aj-5)稀释至1 μg/ml并将50 μl添加至每孔中。将板在室温下温育１小
时并随后洗涤。在水中以1：4稀释msd读出缓冲液(msd;目录号r92tc-3)以获得1x工作溶液，并将150 μl添加至每孔中。读板，并计算平均信号。
90.根据基本如上文所述的方法，获得以下数据。
91.表4：非特异性结合概况抗体cho(mfi)白蛋白(ecil)纤连蛋白(ecil)ldl(ecil)总分i1071,6861,5122,9726,277ii1101,7222,7572,8057,394b12l28710,14076,05518,617105,099mfi=平均荧光强度；ecil=电化学发光。
92.表4中的数据证实相比b12l，抗体i和抗体ii对活cho细胞、人血清白蛋白、纤连蛋白和人ldl具有减少的非特异性结合。
β
肽抗体及其用途
1.本技术是申请日为2017年1月10日的中国专利申请201780006700.3“抗n3pglu淀粉样蛋白β肽抗体及其用途”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及结合n3pglu淀粉样蛋白β肽的抗体和它们在治疗涉及淀粉样蛋白β(本文中称为aβ或abeta)肽的疾病中的用途。
背景技术：
3.淀粉样蛋白前体蛋白的切割产生了大小范围在38-43个氨基酸的aβ肽。aβ从可溶形式至具有高β折叠含量的不可溶形式的转变，以及这些不可溶形式作为脑中的神经炎斑块和脑血管斑块的沉积已经与多种病症和疾病相关，包括阿尔茨海默病(ad)、唐氏综合征和大脑淀粉样血管病(caa)。
4.在斑块中发现的沉积物由aβ肽的异质混合物构成。n3pglu aβ，也被称为n3pe、pe3-42或aβ
p3-42
，是aβ肽的截短形式并且仅发现于斑块中。n3pglu aβ缺乏位于人aβ的n-端的前两个氨基酸残基并且具有焦谷氨酸，其源自第三氨基酸位置的谷氨酸。尽管n3pglu aβ肽是脑中沉积的aβ的少量组分，但是研究已证实n3pglu aβ肽具有积极聚集特性并且在沉积级联早期积累。
5.针对n3pglu aβ的抗体是本领域已知的。例如，美国专利号8,679,498公开了人n3pglu aβ抗体(例如b12l)和使用所述抗体治疗疾病 (诸如阿尔茨海默病)的方法。但是，仍存在对具有更高亲和力、改善的热稳定性、降低的非特异性结合和较低水平的免疫原性的n3pglu aβ抗体的需求。这样的n3pglu aβ抗体将为潜在的人治疗剂提供改善的安全性概况，以及用于更佳给药时间表的药代动力学。
技术实现要素：
6.在本发明范围内的抗体具有这些期望的特征。本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(lcvr)，其具有seq id no: 9或10的氨基酸序列，和重链可变区(hcvr)，其具有seq id no: 8的氨基酸序列。在具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(lcvr)，其具有seq id no: 9的氨基酸序列，和重链可变区(hcvr)，其具有seq id no: 8的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(lcvr)，其具有seq id no: 10的氨基酸序列，和重链可变区(hcvr)，其具有seq id no: 8的氨基酸序列。
7.在一个实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其包含轻链(lc)和重链(hc)，其中所述lc的氨基酸序列是seq id no:12或13的氨基酸序列，且所述hc的氨基酸序列是seq id no:11的氨基酸序列。在更具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其包含轻链(lc)和重链(hc)，其中所述lc的氨基酸序列是seq id no:12的氨基
酸序列，且所述hc的氨基酸序列是seq id no:11的氨基酸序列。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了结合人n3pglu aβ的抗体，其包含轻链(lc)和重链(hc)，其中所述lc的氨基酸序列是seq id no:13的氨基酸序列，且所述hc的氨基酸序列是seq id no:11的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明提供了抗体，其包含两条lc和两条hc，其中每条lc的氨基酸序列是seq id no:12或13，且每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。在更具体的实施方案中，本发明提供了抗体，其包含两条lc和两条hc，其中每条lc的氨基酸序列是seq id no:12，且每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。在更具体的实施方案中，本发明提供了抗体，其包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:13，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
8.本发明还提供了n3pglu aβ抗体，其包含lcvr和hcvr，其中所述lcvr包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，且其中hcvr包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，且其中所述cdr的氨基酸序列对于lcdr1为seq id no:4、lcdr2为seq id no:6、lcdr3为seq id no:7、hcdr1为seq id no:1、hcdr2为seq id no:2和hcdr3为seq id no:3。
9.本发明进一步提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和一种或多种药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。进一步地，本发明提供了治疗疾病的方法，所述疾病特征在于aβ沉积，所述方法包括向有需要的患者施用本发明的药物组合物。具体地，本发明提供了治疗或预防临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前caa的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的抗体。更具体地，本发明提供了治疗或预防选自前驱ad (有时也被称为aβ相关轻度认知障碍，或mci)、轻度ad、中度ad和严重ad的病症，其包括向有需要的患者施用本发明的药物组合物。
10.在另一个实施方案中，本发明提供了在诊断为具有临床前阿尔茨海默病或临床阿尔茨海默病的患者中减缓认知减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。更具体地，本发明进一步提供了在诊断为具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中减缓认知减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
11.在另一个实施方案中，本发明提供了在诊断为具有临床前阿尔茨海默病或临床阿尔茨海默病的患者中减缓机能减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。更具体地，本发明提供了在诊断为具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中减缓机能减退的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
12.在另一个实施方案中，本发明提供了在诊断为具有临床前阿尔茨海默病或临床阿尔茨海默病的患者中减少脑aβ淀粉样蛋白斑负荷的方法，其包括施用本发明的药物组合物。更具体地，本发明提供了在诊断为具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中减少脑aβ淀粉样蛋白斑负荷的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
13.在另一个实施方案中，本发明提供了在具有低水平的脑脊液(csf)中aβ1-42或脑中aβ斑块的无症状患者中预防记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
14.在另一个实施方案中，本发明提供了治疗已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了治疗已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变psen1 e280a (paisa突变)的无症状患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在另一个具体实施方案中，
本发明提供了治疗具有导致常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
15.在另一个实施方案中，本发明提供了预防已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了预防已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变psen1 e280a (paisa突变)的无症状患者的记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在另一个具体实施方案中，本发明提供了预防具有导致常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者的记忆丧失或认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
16.在另一个实施方案中，本发明提供了在已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者中减缓认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明提供了在已知具有导致阿尔茨海默病的遗传突变psen1 e280a (paisa突变)的无症状患者中减缓的认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。在另一个具体实施方案中，本发明提供了在具有导致常染色体显性阿尔茨海默病的遗传突变的无症状患者中减缓认知减退的方法，其包括向所述患者施用本发明的药物组合物。
17.本发明还提供了本发明的抗体，其用于疗法中。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于治疗临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于治疗选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体，其用于在被诊断具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退。
18.进一步地，本发明提供了包含本发明的抗体的药物组合物，其用于疗法中。在一个实施方案中，本发明提供了包含抗体的药物组合物，其用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。
19.本发明还提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病。在一个实施方案中，本发明还提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗前驱ad、轻度ad、中度ad或严重ad。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在被诊断具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退。
20.在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在进一步的
实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。
21.在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在进一步的实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，且包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。在具体的实施方案中，编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:14和编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:15。在具体的实施方案中，编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:14和编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多核苷酸序列为seq id no:16。
22.进一步地，本发明提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。优选地，所述哺乳动物细胞包含dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽和具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。本发明还提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，和包含编码具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子。优选地，所述哺乳动物细胞包含dna分子，其包含编码具有seq id no:11的氨基酸序列的多肽和具有seq id no:13的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(cho)或仓鼠胚胎肾(hek)细胞系。
23.本发明还提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子和/或包含编码具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，其中所述细胞能够表达包含具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr和具有seq id no:9的氨基酸序列的lcvr的抗体。优选地，所述哺乳动物细胞包含dna分子，其包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽和具有seq id no:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。本发明还提供了哺乳动物细胞，其包括包含编码具有seq id no:8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子和/或包含编码具有seq id no:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的dna分子，其中所述细胞能够表达包含具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr和具有seq id no:10的氨基酸序列的lcvr的抗体。优选地，所述哺乳动
conformations, journal of molecular biology, 406:228-256 (2011))，指定本发明抗体的lcvr和hcvr区域中的cdr的氨基酸。根据以上方法，确定本发明的cdr (表1)。
29.本发明的抗体包括κlc和igg hc。在具体的实施方案中，本发明的抗体是igg1。
30.本发明的抗体是单克隆抗体(“mab”)。单克隆抗体可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如cdr移植)或此类或其它本领域已知的技术的组合产生。在本发明的另一个实施方案中，所述抗体或编码其的核酸以分离的形式提供。如本文所用，术语“分离的”是指不见于在自然中且不含或基本不含见于细胞环境中的其它大分子物质的蛋白、肽或核酸。如本文所用，“基本不含”是指目标蛋白、肽或核酸占存在的大分子物质的大于80% (基于摩尔)，优选地大于90%且更优选地大于95%。
31.在表达和分泌所述抗体后，使培养基澄清以除去细胞，并使用许多常用技术中的任一种纯化澄清的培养基。可以根据配制用于胃肠外施用，特别是用于皮下、鞘内或静脉内施用的蛋白和抗体的熟知的方法，将纯化的抗体配制成药物组合物。抗体可以与合适的药物可接受的赋形剂一起冻干，并且随后在使用前使用基于水的稀释剂重构。可选地，可以将抗体配制为水溶液并在使用前储存至多1-3年。在任一情况下，储存形式和注射形式的抗体的药物组合物将含有一种或多种药物可接受的赋形剂，其为除抗体以外的成分。成分是否是药物可接受的，取决于其对安全性和功效的影响，或对药物组合物的安全性、纯度和效力的影响。如果成分被视为对安全或功效(或对安全、纯度或效力)具有足够的不利影响，以确保其不被用于施用至人的组合物中，则其不是药物可接受以用于所述抗体的药物组合物中的。
32.包含本发明的抗体的药物组合物可以通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内)施用于处于本文所述的疾病或病症的风险或展示出本文所述的疾病或病症的患者。皮下和静脉内途径是优选的。本发明的药物组合物含有“有效”量的本发明的抗体。有效量是指实现期望的治疗结果(按剂量，且对于时间段和对于施用方式)所需的量。抗体的有效量可以根据因素(诸如疾病状态、个体的年龄、性别和体重，以及抗体在个体中引起期望应答的能力)而变化。有效量可以容易地由作为本领域技术人员的主治诊断医生或健康护理专业人通过使用已知技术且通过观察结果而确定。给药的频率取决于在人中的实际药代动力学和药效动力学。治疗的持续时间将取决于诸多因素，并且将由患者的诊断医生或治疗的健康护理提供者基于经验和本领域技术而确定。治疗的频率和持续时间可以根据适应症而变化。术语“治疗”("treatment", "treating"或"to treat"等)包括抑制、减缓、阻止患者中存在的症状、病症、疾病或障碍的进展或严重性。术语“患者”指的是人。
33.术语“预防”是指本发明的抗体对无症状患者或具有临床前阿尔茨海默病的患者的预防性施用，以阻止疾病的进展。
34.术语“特征在于aβ沉积的疾病”是病理特征在于脑中或脑血管中aβ沉积的疾病。这包括诸如阿尔茨海默病、唐氏综合征和大脑淀粉样血管病的疾病。阿尔茨海默病的临床诊断、阶段或进程可以容易地由作为本领域技术人员的主治诊断医生或健康护理专业人通过使用已知技术且通过观察结果而确定。这通常包括一些形式的脑斑块成像、精神或认知评估(例如临床痴呆评定量表-总分(cdr-sb)、简易精神状态量表(mmse)或阿尔茨海默病评估量表-认知(adas-cog))或功能评估(例如阿尔茨海默病合作研究-日常生活活动(adcs-adl))。本文所用的“临床阿尔茨海默病”是阿尔茨海默病的诊断阶段。其包括诊断为前驱阿
尔茨海默病、轻度阿尔茨海默病、中度阿尔茨海默病和重度阿尔茨海默病的病症。术语“临床前阿尔茨海默病”是先于临床阿尔茨海默病的阶段，其中生物标记物(诸如csf aβ42水平或通过淀粉样蛋白pet的沉积脑斑块)的可检测的变化指示了具有阿尔茨海默病病理、向临床阿尔茨海默病进展的患者的最早迹象。这通常在可注意到诸如记忆丧失和混乱的症状之前。
具体实施方式
35.本发明还涉及以下实施方案：1. 结合人n3pglu aβ的抗体，所述抗体包含具有seq id no: 9或seq id no: 10的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)，和具有seq id no: 8的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)。
36.2. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:9的氨基酸序列的lcvr，和具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr。
37.3. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcvr，和具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr。
38.4. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no: 12或seq id no: 13的氨基酸序列的轻链(lc)，和具有seq id no: 11的氨基酸序列的重链(hc)。
39.5. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:12的氨基酸序列的lc，和具有seq id no:11的氨基酸序列的hc。
40.6. 实施方案1的抗体，所述抗体包含具有seq id no:13的氨基酸序列的lc，和具有seq id no:11的氨基酸序列的hc。
41.7. 实施方案1的抗体，所述抗体包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:12或seq id no:13，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
42.8. 实施方案1的抗体，所述抗体包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:12，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
43.9. 实施方案1的抗体，所述抗体包含两条lc和两条hc，其中所述每条lc的氨基酸序列是seq id no:13，且所述每条hc的氨基酸序列是seq id no:11。
44.10. 药物组合物，其包含实施方案1-9中任一项的抗体和一种或多种药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
45.11. 治疗具有特征在于aβ沉积的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
46.12. 治疗具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
47.13. 治疗具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者的方法，所述方法包括施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
48.14. 治疗具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
49.15. 治疗具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
50.16. 在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
51.17. 在被诊断具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案1-9中任一项的抗体。
52.18. 在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
53.19. 在被诊断具有选自治疗前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的实施方案10的药物组合物。
54.20. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于疗法中。
55.21. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。
56.22. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于治疗选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症。
57.23. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于治疗选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症。
58.24. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于在被诊断具有选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症的患者中缓解认知减退。
59.25. 实施方案1-9中任一项的抗体，其用于在被诊断具有选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症的患者中缓解认知减退。
60.26. 实施方案1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗特征在于aβ沉积的疾病。
61.27. 实施方案1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征和临床或临床前大脑淀粉样血管病的病症。
62.28. 实施方案1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自前驱ad、轻度ad、中度ad和严重ad的病症。
63.以下实施例和测定证实本发明的抗体可用于治疗特征在于aβ沉积的疾病，诸如阿尔茨海默病、唐氏综合征和caa。但是应当理解的是，以下实施例是通过说明的方式阐明而不是限制性的，并且本领域普通技术人员可以实现各种修改。
实施例
64.经工程改造的n3pglu aβ抗体的表达和纯化本发明的n3pglu aβ抗体可以基本如下表达和纯化。通过电穿孔，使用含有编码seq id no: 12或13的lc氨基酸序列的dna序列，和编码seq id no: 11的hc氨基酸序列的dna序列的谷氨酰氨合成酶(gs)表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞系(cho)。表达载体编码sv早期(猿猴病毒40e)启动子和gs的基因。转染后，细胞经历使用0-50
ꢀµ
m l-甲硫氨酸亚砜亚胺的混合选择。选择的大量细胞或主要孔随后在无血清、悬浮培养物中进行扩大培养以用
于生产。
65.将已分泌有抗体的澄清培养基加至蛋白a亲和柱，所述蛋白a亲和柱已使用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4))平衡。使用1m nacl洗涤柱，以移除非特异性结合的组分。将结合的n3pglu a
®
抗体使用例如在ph (大约) 3.5的柠檬酸钠洗脱，并将级分使用1m tris缓冲液中和。通过诸如sds-page或分析尺寸排阻检测n3pglu aβ抗体级分，并随后合并。在ph 7.4的pbs缓冲液或在ph约6的10 mm柠檬酸钠缓冲液、150 mm nacl中浓缩本发明的n3pglu aβ抗体。可以使用常规技术无菌过滤最终产物。n3pglu aβ抗体的纯度大于95%。本发明的n3pglu aβ抗体可以在-70℃立即冷冻或在4℃储存数月。下文显示了本发明的示例性抗体的氨基酸seq id no。
66.表1：示例性的n3pglu aβ抗体的氨基酸序列
67.结合亲和力和动力学使用biacore
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3000 (ge healthcare)通过表面等离子体共振测量n3pglu aβ抗体对pe3-42 aβ肽或对aβ 1-40肽的结合亲和力和动力学。通过经由biacore
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cm5芯片上固定的蛋白a捕获n3pglu aβ抗体，并流过pe3-42 aβ肽或aβ 1-40肽(从100 nm开始以2倍系列稀释降至3.125 nm)，来测量结合亲和力。在hbs-ep缓冲液(ge healthcare br100669; 10 mm hepes，150 mm nacl，3 mm edta，0.05%表面活性剂p20, ph 7.4)中，在25℃进行实验。
68.对于每个循环，以10 μl/min流速注射5 μl浓度为10 μg/ml的抗体溶液，来捕获抗体。以50 μl/min注射250 μl来结合肽，并随后解离10分钟。以10 μl/ml流速注射5 μl甘氨酸缓冲液(ph 1.5)，来再生芯片表面。将数据拟合至1:1 langmiur结合模型以导出k
on
, k
off
，并计算kd。根据基本如上文所述的方法，观察到以下参数(如表2所示)。
69.表2：结合亲和力和动力学抗体k
on
(x1051/ms)k
off
(x10-4
1/s)kd(nm)i1.391.310.71ii3.631.280.35
70.没有检测到对aβ 1-40的可评估的结合，指示相比aβ 1-40，抗体i和抗体ii特异性结合pe3-42 aβ肽。
71.热稳定性为确定在胁迫条件(即升高的温度和低ph)下的抗体稳定性，分别使用pbs或100 mm柠檬酸钠将含有本发明抗体的澄清培养基调节至ph 7.4或ph 5.0。将样品密封并在65℃温育60分钟，并随后在冰上冷却。通过离心将样品中的蛋白聚集物沉淀，并将澄清上清液转移至新平板并通过在pbs缓冲液中50倍稀释中和至ph 7.4。针对未经胁迫的样品测量并计算抗原(pe3-42)结合活性以确定剩余活性百分比。
72.根据基本如上文所述的方法，获得以下数据。
73.表3：胁迫后抗原结合活性百分比抗体ph7.4(%)ph5.0(%)i未测定60.2ii91.671.2b12l62.111.1
74.如表3所证实的，相比b12l,抗体i和抗体ii具有增加的热稳定性。
75.离体靶标结合为确定在来自固定的pdapp脑的脑切片上的离体靶标结合，使用外源添加的本发明的n3pglu aβ抗体执行免疫组化分析。将来自老年pdapp小鼠(25月龄)的恒冷连续冠状切片与20
ꢀµ
g/ml本发明的示例性n3pglu aβ抗体(抗体i和抗体ii)一起温育。使用对人igg特异的二级hrp试剂并且使用dab-plus (dako)使得沉积斑块可视。使用继之以二级step-hrp的生物素化小鼠3d6抗体作为阳性对照。阳性对照抗体(生物素化的3d6)在pdapp海马区中标记了显著量的沉积aβ，并且本发明的示例性n3pglu aβ抗体标记了沉积物的子集。这些组织学研究证明本发明的示例性的n3pglu aβ抗体离体结合沉积的aβ靶标。
76.离体吞噬作用执行离体吞噬作用测定以研究本发明的n3pglu aβ抗体(抗体i和抗体ii)是否可以促进斑块的小胶质细胞吞噬作用。将来自人阿尔茨海默病脑的冷冻切片(20
ꢀµ
m)用10
ꢀµ
g/ml本发明的示例性n3pglu aβ抗体或对照在24孔板中在37℃下预温育1小时。每个处理有四个孔。随后添加原代鼠小胶质细胞(8x105; c57/bl6)并温育24小时。将每孔的组织在5.2m胍缓冲液中变性并且通过elisa评估a
β1-42
含量。因为aβ含量可以跨越多个切片变化，因此对每个测试孔实施姐妹切片对照并且将测试孔的含量归一化至姐妹切片的含量。
77.与阳性对照样品相比，本发明的示例性的n3pglu aβ抗体具有显著减少的aβ
1-42
。阴性对照样品具有可以忽略的沉积aβ
1-42
的清除。因此，离体吞噬作用分析显示本发明的示例性的n3pglu aβ抗体可以通过吞噬通清除离体斑块。
78.体内靶标结合测量了本发明的n3pg抗体在体内跨越血脑屏障并结合沉积斑块的能力。对18月龄的pdapp转基因小鼠给予n3pglu aβ抗体(抗体i或抗体ii)或阴性对照igg的腹膜内注射。每组6只小鼠在第1天和第3天接受40 mg/kg抗体注射。在第6天测定体内靶标结合，此时将小鼠处死并收集脑用于组织化学分析。
79.体内靶标结合的程度量化为对总斑块面积归一化的体内n3pglu aβ抗体结合阳性的区域百分比(te比)，其中所述总斑块面积如通过外源3d6在姐妹切片上的免疫染色所限定。通过测量抗体结合区域的百分比并将所述值针对可能靶标区域的总百分比归一化(通过在姐妹切片上使用阳性对照抗体(3d6)的外源免疫组织化学使总沉积aβ可视)产生te比。
80.根据基本如上文所述的方法，本发明的示例性的n3pglu aβ抗体证实在海马区中的体内靶标结合以及在皮质中有限程度的体内靶标结合，而使用对照igg注射的动物没有显示斑块特异性的染色。te比为1.95% (抗体i)和3.65% (抗体ii)。
81.使用抗体ii在平均24至26月龄的pdapp小鼠中进行了相似的研究。抗体ii具有9.41%的te比。
82.这些结果证实，当外周施用时，抗体i和抗体ii可以跨越血脑屏障并结合沉积的aβ。
83.体内斑块清除使用将抗体ii的lcvr和hcvr融合至鼠恒定κ区和igg2a fc的嵌合替换抗体执行研究，以评估在老年pdapp小鼠中的体内斑块清除。老年pdapp小鼠(22-24月龄，n=23/组)每周一次皮下注射12.5 mg/kg嵌合抗体ii或对照igg，持续7周。使用对照老年pdapp小鼠(在研
究开始时处死)以评估在治疗处理前预先存在的沉积的水平。
84.在研究结束时，在血浆中测量最终药物水平和通过elisa评估脑的aβ
1-42
水平。由使用对照igg经7周处理，aβ
1-42
的非显著的进一步增加，证明老年pdapp小鼠处于斑块上限。抗体ii嵌合抗体组显示了相比对照aβ
1-42
的显著减少(23%, p = 0.0174)。在7周给药时期结束时测量抗体暴露水平，且抗体ii具有31 μg/ml的水平。该研究证实示例性的嵌合n3pglu aβ抗体能够在体内减少斑块(aβ
1-42
)。
85.离体t-细胞增殖episcreen测定使用episcreen
tm
离体人t细胞测定测量响应本发明的示例性的n3pglu aβ抗体(抗体i和抗体ii)的人cd4 t细胞活化(增殖、细胞因子分泌)。episcreen
tm
利用来自50位健康供体的样品，其最好地代表了hla-dr和dq同种异型在欧洲/北美和世界人口中表达的数量和频率。测定中包括两种阳性对照：临床基准抗体人源化a33，其在临床中显示高水平的免疫原性(73%)且在episcreen测定中通常诱导20-30%的t细胞响应，和klh (钥孔虫戚血兰素)，一种含有新抗原的促分裂原样蛋白。匹配的缓冲液阴性对照也包括在测定中。
86.从在时间进程(5-8天)期间观察到的全部阳性供体响应的平均值计算t细胞增殖百分比。阳性对照a33和klh的t细胞增殖百分比分别为20%和98%。b12l、抗体i和抗体ii的t细胞增殖百分比分别为14%、6%和8%。这些数据证实本发明的示例性的n3pglu aβ抗体具有比阳性对照和b12l减少的t细胞响应率。
87.非特异性结合用过荧光活化细胞分选(facs)研究本发明的n3pglu aβ抗体对活cho细胞的非特异性结合，并且通过使用提供跨越宽动态范围的敏感、精确和准确结果的meso scale discovery (msd)技术，研究对人血清白蛋白、纤连蛋白和人ldl的非特异性结合。
88.为检测对活cho细胞的非特异性结合，执行facs分析。在facs 缓冲液 0.1% bsa中，将n3pglu aβ抗体(抗体i、抗体ii或b12l)稀释至200 μg/ml。在facs缓冲液 0.1% bsa中，将rpe标记的f(ab')2驴抗人igg (h l)二级抗体稀释至20 μg/ml。将cho细胞在1,000 rpm旋沉5分钟，并且随后使用facs缓冲液 0.1% bsa洗涤。将细胞在facs缓冲液 0.1% bsa中重悬至4 x 106细胞/ml，并将55 μl细胞悬液添加至96孔板的孔中。将二级抗体与n3pglu aβ抗体等体积混合并在室温温育1小时。将抗体混合物 (55 μl)添加至细胞悬液并在室温温育1小时。每个样品一式两份运行。将板离心，移除上清液，并且将细胞重悬在75 μl facs缓冲液 0.1% bsa中。将板再次离心，并且将细胞重悬在110 μl facs缓冲液 0.1% bsa中。向每孔添加生存力染料(sytox blue; 1.1 μl)并且在facs分析前混合。使用lsrfortessa
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facs机械(bd biosciences)，通过facs分析测量细胞结合活性。
89.为检测对人血清白蛋白、纤连蛋白和人ldl的非特异性结合，使用msd测定。在4℃下使用30 μl/孔的包被蛋白(pbs中20 μg/ml)包被板(msd multiarray 96孔板: msd 目录号l15xa-3)过夜。包被蛋白可以是ldl溶液(来自人血浆的低密度脂蛋白, sigma 目录号l7914)、来自牛血浆的纤连蛋白(sigma 目录号f1141)或hsa (5mg/ml, sigma 目录号a8763)。使用pbs 0.1% tween-20洗涤板3次，在pbs 0.5% bsa中阻断1小时，并随后洗涤。将抗体i或抗体ii (50 μg/ml;在pbs 0.5% bsa中稀释)添加至孔中。每个孔一式两份运行。将板在室温下温育１小时并随后洗涤。使用pbs 0.5% bsa将msd sulfo-tag抗人抗体(msd; 目录号r32aj-5)稀释至1 μg/ml并将50 μl添加至每孔中。将板在室温下温育１小
时并随后洗涤。在水中以1：4稀释msd读出缓冲液(msd;目录号r92tc-3)以获得1x工作溶液，并将150 μl添加至每孔中。读板，并计算平均信号。
90.根据基本如上文所述的方法，获得以下数据。
91.表4：非特异性结合概况抗体cho(mfi)白蛋白(ecil)纤连蛋白(ecil)ldl(ecil)总分i1071,6861,5122,9726,277ii1101,7222,7572,8057,394b12l28710,14076,05518,617105,099mfi=平均荧光强度；ecil=电化学发光。
92.表4中的数据证实相比b12l，抗体i和抗体ii对活cho细胞、人血清白蛋白、纤连蛋白和人ldl具有减少的非特异性结合。
再多了解一些
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