使用各种蓝藻细菌或其变体的原卟啉原IX氧化酶赋予和/或增强除草剂耐受性的方法和组合物与流程

使用各种蓝藻细菌或其变体的原卟啉原ix氧化酶赋予和/或增强除草剂耐受性的方法和组合物
技术领域
1.提供了源自各种生物体或其变体的原卟啉原ix氧化酶及其用于赋予和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的用途。


背景技术：

2.卟啉生物合成途径用于合成在植物的新陈代谢中起着至关重要的作用的叶绿素和血红素，并且其发生在叶绿体中。在该途径中，原卟啉原ix氧化酶(以下称为ppo；ec：1.3.3.4)催化原卟啉原ix氧化为原卟啉ix。原卟啉原ix氧化为原卟啉ix后，原卟啉ix通过镁螯合酶与镁结合以合成叶绿素，或通过fe螯合酶与铁结合以合成血红素。
3.因此，当ppo活性被抑制时，叶绿素和血红素的合成被抑制，底物原卟啉原ix离开正常的卟啉生物合成途径，导致原卟啉原ix从叶绿体快速输出到细胞质，并且通过非特异性过氧化物酶和自氧化而氧化的原卟啉ix在细胞质积累。积累的原卟啉ix在存在光和氧分子的情况下会产生高反应性的单线态氧(1o2)，它们会破坏细胞膜并迅速导致植物细胞死亡。基于该原理，已经开发了抑制ppo活性的除草剂。到目前为止，按化学结构分类，已有10个ppo抑制性除草剂家族，包括嘧啶二酮类、二苯醚类、苯基吡唑类、n-苯基邻苯二甲酰亚胺类、噻二唑类、噁二唑类、三嗪酮类、三唑啉酮类、噁唑烷二酮类和其他除草剂。
4.进一步地，为了防止在使用除草剂时这些除草剂对农作物的生长的影响，需要对农作物提供除草剂耐受性。
5.同时，藻类是光合作用生物，其可将光能转化为可用于合成各种有用的化合物的化学能。例如，藻类可以通过光合作用固定碳，并将二氧化碳转化为糖、淀粉、脂质、脂肪或其他生物分子，从而从大气中去除温室气体。另外，藻类的大规模种植可以产生多种物质，例如工业酶、治疗性化合物和蛋白、营养素、商业物质和燃料物质。
6.然而，在生物反应器中或在开放或封闭的池塘中大规模种植藻类的情况下，可能会由于不希望的竞争性生物(例如，不希望的藻类、真菌、轮虫或浮游动物)而发生污染。
7.因此，需要一种技术在将除草剂耐受性赋予希望的植物和/或藻类之后，通过以会抑制竞争性生物的生长而无除草剂耐受性的浓度处理除草剂来大规模收获所希望的植物和/或藻类。
8.(专利文献1)us 6,308,458(2001年10月30日)


技术实现要素：

9.技术问题
10.在本公开中，发现源自原核生物及其变体的hemy型ppo基因对原卟啉原ix氧化酶(ppo)抑制性除草剂显示出广泛的除草剂耐受性，从而表明hemy型ppo基因在导入物和/或藻类中时可以赋予和/或增强除草剂耐受性。
11.一种实施方式提供了包含seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序
列的多肽。
12.另一种实施方式提供了一种多肽变体，所述多肽变体包含：
13.(1)对seq id no:1具有修饰的氨基酸序列，其中所述修饰包括选自参与seq id no:1的多肽与ppo抑制性除草剂相互作用的氨基酸中的一种或多种氨基酸(例如，选自位于与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:1的多肽结合位点上的氨基酸中的至少一种氨基酸)的缺失和/或用与原始氨基酸不同的氨基酸取代，或
14.(2)与氨基酸序列(1)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
15.例如，选自由参与与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:1的多肽的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸可以是选自由seq id no:1的氨基酸序列的n59、s60、r89、f161、v165、a167、q184、p303、v305、f324、l327、i340、f360和i408组成的组中的至少一种氨基酸。
16.另一种实施方式提供了一种多肽变体，所述变体包含：
17.(1)对seq id no:2具有修饰的氨基酸序列，其中所述修饰包括选自参与seq id no:2的多肽与ppo抑制性除草剂相互作用的氨基酸中的一种或多种氨基酸(例如，选自位于与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:2的多肽的结合位点上的氨基酸中的至少一种氨基酸)的缺失和/或用与原始氨基酸不同的氨基酸取代，或
18.(2)与氨基酸序列(1)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
19.例如，选自由参与到与ppo抑制性除草剂相互作用中的seq id no:2的多肽的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸可以是选自由seq id no:2的氨基酸序列的n59、s60、r89、f161、v165、a167、q184、p303、v305、f324、l327、i340、f360和i408组成的组中的至少一种氨基酸。
20.另一种实施方式提供了一种多肽变体，所述多肽变体包含：
21.(1)对seq id no:3具有修饰的氨基酸序列，其中所述修饰包括选自参与seq id no:3的多肽与ppo抑制性除草剂相互作用的氨基酸中的一种或多种氨基酸(例如，选自位于与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:3的多肽结合位点上的氨基酸中的至少一种氨基酸)的缺失和/或用与原始氨基酸不同的氨基酸取代，或
22.(2)与氨基酸序列(1)具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
23.例如，选自由参与到与ppo抑制性除草剂的相互作用中的seq id no:3的多肽的氨基酸组成的组中的至少一种氨基酸可以是选自由seq id no:3的氨基酸序列的n59、s60、r89、f161、v165、a167、q184、p303、v305、f324、l327、i340、f360和i408组成的组中的至少一种氨基酸。
24.另一种实施方式提供了编码所述多肽或所述多肽变体的多核苷酸。
25.另一种实施方式提供了包含所述多核苷酸的重组载体。重组载体可用作用于在适当的宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体。
26.另一种实施方式提供了包含所述重组载体的重组细胞。
27.另一种实施方式提供了用于赋予和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的组
合物，其包含选自由以下组成的组中的至少一种：
28.(1)选自由seq id no:1的多肽、seq id no:2的多肽、seq id no:3的多肽、具有对seq id no:1的修饰的多肽变体、具有对seq id no:2的修饰的多肽变体、具有对seq id no:3的修饰的多肽变体和包含与所述多肽或所述多肽变体具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组中的至少一种；
29.(2)编码(1)的多肽或多肽变体的多核苷酸；
30.(3)包含(2)的多核苷酸的重组载体；和
31.(4)包含(3)的重组载体的重组细胞。
32.在具体的实施方式中，编码seq id no:1的多肽的多核苷酸可包含seq id no:80的核酸序列，编码seq id no:2的多肽的多核苷酸可包含seq id no:81的核酸序列，编码seq id no:3的多肽的多核苷酸可包含seq id no:82的核酸序列；但是多核苷酸可以不限于此。多核苷酸可包含能够根据密码子简并性编码所述氨基酸序列的各种核酸序列。
33.除草剂可以是抑制原卟啉原ix氧化酶活性的除草剂。
34.例如，除草剂可以是选自由嘧啶二酮、二苯醚、苯基吡唑、n-苯基邻苯二甲酰亚胺、苯酯、噻二唑、噁二唑、三嗪酮、三唑啉酮、噁唑烷二酮和其他除草剂组成的组中的至少一种，但不限于此。
35.在具体的实施方式中，除草剂可以是选自由以下组成的组中的至少一种：汰芬那(tiafenacil)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)、双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、苯草醚(aclonifen)、氟锁草醚(acifluorfen)、治草醚(bifenox)、氟乳醚(ethoxyfen)、乳氟禾草灵(lactofen)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、草枯醚(chlornitrofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、氟硝磺酰胺(halosafen)、吡草醚(pyraflufen-ethyl)、异丙吡草酯(fluazolate)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl)、嗪草酸(fluthiacet)、噻二唑草胺(thidiazimin)、丙炔噁草酮(oxadiargyl)、噁草酮(oxadiazon)、唑草酮(carfentrazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)、三氟草嗪(trifludimoxazin)、唑啶草酮(azafenidin)、环戊噁草酮(pentoxazone)、双唑草腈(pyraclonil)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)、氟唑草胺(profluazol)、吡落草(phenopylate)(2,4-二氯苯基1-吡咯烷羧酸酯)、吡落草的氨基甲酸酯类似物(例如o-苯基吡咯啉氨基甲酸酯和哌啶氨基甲酸酯类似物(参见“ujjana b.nandihalli,mary v.duke,stephen o.duke,o-苯基吡咯啉氨基甲酸酯和哌啶氨基甲酸酯除草剂的分子性质和生物活性之间的关系(relationships between molecular properties and biological activities of o-phenyl pyrrolidino-and piperidinocarbamate herbicides).,j.agric.food chem.,40(10)1993-2000,1992”))、其农业上可接受的盐以及它们的组合，但不限于此。
36.植物可以指具有光合能力的多细胞真核生物，其可以是单子叶植物或双子叶植物，或者可以是草本植物或木本植物。藻类可以指具有光合能力的生物，其可以是真核藻类。
37.在一种实施方式中，可以对植物或藻类进行遗传操作，以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或编码第二除草剂耐受性多肽的基因，从而可以赋予和/或增强对第二除草剂
的除草剂耐受性。为了包含第二除草剂耐受性多肽或编码第二除草剂耐受性多肽的基因而进行了遗传操作的植物或藻类，除了可以使用用于赋予和/或增强除草剂耐受性的上述组合物之外，还可以使用第二除草剂耐受性多肽或编码第二除草剂耐受性多肽的基因来制备。因此，用于赋予和/或增强除草剂耐受性的组合物可以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或编码第二除草剂耐受性多肽的基因。
38.第二除草剂的实例可以包括细胞分裂抑制性除草剂、光合作用抑制性除草剂、氨基酸合成抑制性除草剂、质体抑制性除草剂、细胞膜抑制性除草剂等，但不限于此。
39.在具体的实施方式中，第二除草剂可以例示为草甘膦、草铵膦、麦草畏、2,4-d(2,4-二氯苯氧基乙酸)、异噁唑草酮(isoxaflutole)、als(乙酰乳酸合酶)抑制性除草剂、光系统ii抑制性除草剂或苯脲类除草剂、溴苯腈类除草剂或其组合，但不限于此。
40.例如，第二除草剂耐受性多肽可以例示为选自由以下组成的组中的至少一种：草甘膦除草剂耐受性epsps(草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)、gox(草甘膦氧化酶)、gat(草甘膦-n-乙酰转移酶)或草甘膦脱羧酶；草铵膦除草剂耐受性pat(草丁膦-n-乙酰转移酶)；麦草畏除草剂耐受性dmo(麦草畏单加氧酶)；2,4-d除草剂耐受性2,4-d单加氧酶或aad(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)；als抑制性磺酰脲类除草剂耐受性als(乙酰乳酸合酶)、ahas(乙酰羟酸合酶)或atahasl(拟南芥(arabidopsis thaliana)乙酰羟酸合酶大亚基)；光系统ii抑制性除草剂耐受性光系统ii蛋白d1；苯脲类除草剂耐受性细胞色素p450；质体抑制性除草剂耐受性的hppd(羟基苯丙酮酸双加氧酶)；溴苯腈除草剂耐受性腈水解酶；及其组合，但不限于此。
41.另外，第二除草剂耐受性多肽的编码基因可以例示为选自由以下组成的组中的至少一种：草甘膦除草剂耐受性cp4 epsps、mepsps、2mepsps、goxv247、gat4601或gat4621基因；草铵膦除草剂耐受性bar、pat或pat(syn)基因；麦草畏除草剂耐受性dmo基因；2,4-d除草剂耐受性aad-1、aad-12基因；als抑制性磺酰脲类除草剂耐受性als、gm-hra、s4-hra、zm-hra、csr1、csr1-1、csr1-2、sura或surb；光系统ii抑制性除草剂耐受性psba基因；苯脲除草剂耐受性cyp76b1基因；异噁唑草酮除草剂耐受性hppdpf w336基因和溴苯腈除草剂耐受性bxn基因；及其组合，但不限于此。
42.另一种实施方式提供了用多核苷酸或其克隆或后代转化的具有除草剂耐受性的植物和/或藻类的转化体。
43.另一种实施方式提供了制备具有除草剂耐受性或增强的除草剂耐受性的转基因植物或转基因藻类的方法，包括用多核苷酸转化植物和/或藻类的步骤。
44.另一种实施方式提供了赋予或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的方法，包括用多核苷酸转化植物和/或藻类的步骤。
45.可以对藻类，和/或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽或整体进行转化。
46.转化体可以是藻类，和/或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽或整体。转化体可以包括从第一转化体获得的后代(例如，t1至t8代)。
47.另一种实施方式提供了一种控制农田中的杂草的方法，包括：
48.向农田提供植物，其中所述植物包含选自由所述多肽、所述多肽变体、编码所述多肽的多核苷酸、编码所述多肽变体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组载体和包含所述
重组载体的重组细胞组成的组中的至少一种；和
49.向农田(或向植物)施用有效量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂。
50.在具体的实施方式中，向农田(或向植物)施用有效量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂的步骤可以通过依次或同时施用有效量的至少两种原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂来进行。
51.在另一种实施方式中，可以对植物进行遗传操作以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或编码第二除草剂耐受性多肽的基因，并且有效量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂和第二除草剂可以依次或同时施加。
52.另一种实施方式提供了一种从培养介质中去除不希望的生物的方法，包括向所述培养介质提供藻类，其中所述藻类包括选自由所述多肽、所述多肽的变体、编码所述多肽的多核苷酸、编码所述变体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组载体和包含所述重组载体的重组细胞组成的组中的至少一种；以及向所述培养介质施用有效量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂。
53.技术方案
54.提供了赋予和/或增强植物或藻类的除草剂耐受性的技术。
55.如本文所用，“赋予和/或增强植物或藻类的除草剂耐受性”或“增强植物或藻类的除草剂耐受性”可以解释为对不具有除草剂耐受性的植物或藻类赋予除草剂耐受性和/或更加增强具有除草剂耐受性的植物或藻类的除草剂耐受性。
56.如本文中所使用的，可以使用“由序列组成”、“基本上由序列组成”或“包括序列”以涵盖包含所描述的序列和/或必须包含所述序列的两种情况，但是并不旨在排除包含除描述的序列之外的其他序列。
57.如本文所用，术语“包含由seq id no鉴别的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的蛋白质或多肽”和“包含seq id no鉴别的核酸序列或由该核酸序列组成的基因或多核苷酸”可指基本上由该氨基酸序列或核酸序列组成或者与该氨基酸序列或核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性同时保持其固有活性和/或功能的蛋白质(或多肽)或基因(或多核苷酸)，
58.一种实施方式提供了包含seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列的多肽。
59.另一种实施方式提供了一种多肽变体，所述多肽变体为选自由以下组成的组中的至少一种：
60.多肽变体，所述多肽变体包含：对seq id no:1具有修饰的氨基酸序列，其中所述修饰包括在选自参与seq id no:1的多肽与ppo抑制性除草剂相互作用的氨基酸中的一种或多种氨基酸(例如，选自位于与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:1的多肽结合位点上的氨基酸中的至少一种氨基酸)的缺失和/或用与原始氨基酸不同的氨基酸取代，或与所述氨基酸序列具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上序列同一性的氨基酸序列；
61.多肽变体，所述多肽变体包含：对seq id no:2具有修饰的氨基酸序列，其中所述修饰包括在选自参与seq id no:2的多肽与ppo抑制性除草剂相互作用的氨基酸中的一种
或多种氨基酸(例如，选自位于与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:2的多肽结合位点上的氨基酸中的至少一种氨基酸)的缺失和/或用与原始氨基酸不同的氨基酸取代，或与所述氨基酸序列具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上序列同一性的氨基酸序列；和
62.多肽变体，所述多肽变体包含：对seq id no:3具有修饰的氨基酸序列，其中所述修饰包括选自参与seq id no:3与ppo抑制性除草剂相互作用的氨基酸中的一种或多种氨基酸(例如，选自位于与ppo抑制性除草剂相互作用的seq id no:3的多肽结合位点上的氨基酸中的至少一种氨基酸)的缺失和/或用与原始氨基酸不同的氨基酸取代，或与所述氨基酸序列具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的氨基酸序列。
63.在其他实施方式中，提供了编码seq id no:1、2或3、或多肽变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的重组载体；和包含所述重组载体的重组细胞。可以设计多核苷酸以包含针对待转化细胞进行优化的密码子。本领域技术人员可以容易地知道优化的密码子(例如，参见“http://sg.idtdna.com/codonopt”等)。
64.另一种实施方式提供了用于赋予和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组中的至少一种：
65.(1)选自由seq id no:1的多肽、seq id no:2的多肽、seq id no:3的多肽、具有对seq id no:1的修饰的多肽变体、具有对seq id no:2的修饰的多肽变体、具有对seq id no:3的修饰的多肽变体和包含与所述多肽或所述多肽变体具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
66.(2)编码(1)的多肽或多肽变体的多核苷酸；
67.(3)包含(2)的多核苷酸的重组载体；和
68.(4)包含(3)的重组载体的重组细胞。
69.在具体的实施方式中，编码seq id no:1的多肽的多核苷酸可包含seq id no:80的核酸序列，编码seq id no:2的多肽的多核苷酸可包含seq id no:81的核酸序列，编码seq id no:3的多肽的多核苷酸可包含seq id no:82的核酸序列；但是多核苷酸可以不限于此。多核苷酸可包含能够根据密码子简并性编码所述氨基酸序列的各种核酸序列。
70.在其他实施方式中，提供了具有除草剂耐受性的植物和/或藻类的转化体，该转化体被编码所述多肽或所述多肽变体的多核苷酸转化。可以设计多核苷酸以包含针对待转化细胞进行优化的密码子。本领域技术人员可以容易地知道优化的密码子(例如，参见“http://sg.idtdna.com/codonopt”等)。
71.另一种实施方式提供了制备具有除草剂耐受性或除草剂耐受性增强的转基因植物或转基因藻类的方法，包括用多核苷酸转化藻类，或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽或整体的步骤。
72.另一种实施方式提供了赋予或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的方法，包括用多核苷酸转化藻类，或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽或整体的步骤。
73.下文中，更具体地描述本发明。
74.本文所述的seq id no:1、2和3的多肽是蓝藻细菌来源的对ppo抑制性除草剂具有
no:3的修饰的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，其中修饰包括在seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列中的以下氨基酸突变：r89a、v165c、v165s、a167c、a167i、a167l、v305l、v305m、l327t、f360m、f360i、f360l、f360v、f360t、i408r、i408w、r89a v165c(指包含第89位残基由r被取代为a和第165位残基由v被取代为c的全部的变体或突变；以下两种或更多种氨基酸突变的表述以此方式解释)、r89a v165s、r89a a167c、r89a a167i、r89a a167l、r89a v305l、r89a v305m、r89a l327t、r89a f360m、r89a f360i、r89a f360l、r89a f360v、r89a f360t、r89a i408r、v165c a167c、v165c a167i、v165c a167l、v165c v305l、v165c v305m、v165c l327t、v165c f360m、v165c f360i、v165c f360l、v165c f360v、v165c f360t、v165c i408r、v165s a167c、v165s a167i、v165s a167l、v165s v305l、v165s v305m、v165s l327t、v165s f360m、v165s f360i、v165s f360l、v165s f360v、v165s f360t、v165s i408w、a167c v305l、a167c v305m、a167c l327t、a167c f360m、a167c f360i、a167c f360l、a167c f360v、a167c f360t、a167c i408r、a167i v305l、a167i v305m、a167i l327t、a167i f360m、a167i f360i、a167i f360l、a167i f360v、a167i f360t、a167i i408w、a167l v305l、a167l v305m、a167l l327t、a167l f360m、a167l f360i、a167l f360l、a167l f360v、a167l f360t、a167l i408r、v305l l327t、v305l f360m、v305l f360i、v305l f360l、v305l f360v、v305l f360t、v305l i408w、v305m l327t、v305m f360m、v305m f360i、v305m f360l、v305m f360v、v305m f360t、v305m i408r、l327t f360m、l327t f360i、l327t f360l、l327t f360v、l327t f360t、l327t i408r、f360m i408r、f360i i408r、f360l i408w、f360v i408w、f360t i408w、r89a v165c a167c、r89a v165c a167i、r89a v165c a167l、r89a v165c v305l、r89a v165c v305m、r89a v165c l327t、r89a v165c f360m、r89a v165c f360i、r89a v165c f360l、r89a v165c f360v、r89a v165c f360t、r89a v165c i408r、r89a v165s a167c、r89a v165s a167i、r89a v165s a167l、r89a v165s v305l、r89a v165s v305m、r89a v165s l327t、r89a v165s f360m、r89a v165s f360i、r89a v165s f360l、r89a v165s f360v、r89a v165s f360t、r89a v165s i408w、r89a a167c v305l、r89a a167c v305m、r89a a167c l327t、r89a a167c f360m、r89a a167c f360i、r89a a167c f360l、r89a a167c f360v、r89a a167c f360t、r89a a167c i408r、r89a a167i v305l、r89a a167i v305m、r89a a167i l327t、r89a a167i f360m、r89a a167i f360i、r89a a167i f360l、r89a a167i f360v、r89a a167i f360t、r89a a167i i408w、r89a a167l v305l、r89a a167l v305m、r89a a167l l327t、r89a a167l f360m、r89a a167l f360i、r89a a167l f360l、r89a a167l f360v、r89a a167l f360t、r89a a167l i408r、r89a v305l l327t、r89a v305l f360m、r89a v305l f360i、r89a v305l f360l、r89a v305l f360v、r89a v305l f360t、r89a v305l i408w、r89a v305m l327t、r89a v305m f360m、r89a v305m f360i、r89a v305m f360l、r89a v305m f360v、r89a v305m f360t、r89a v305m i408r、r89a l327t f360m、r89a l327t f360i、r89a l327t f360l、r89a l327t f360v、r89a l327t f360t、r89a l327t i408r、r89a f360m i408r、r89a f360i i408r、r89a f360l i408w、r89a f360v i408w、r89a f360t i408w、v165c a167c v305l、v165c a167c v305m、v165c a167c l327t、v165c a167c f360m、v165c a167c f360i、v165c a167c
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97.例如，多肽变体可以包括：
98.对seq id no:1具有修饰的氨基酸序列，其中修饰可包括在seq id no:1的氨基酸序列中的以下氨基酸突变：r89a、v165c、v165s、a167c、a167i、a167l、v305m、v305l、l327t、f360m、f360i、f360l、f360v、f360t、i408r、i408w、r89a f360m、r89a f360v、r89a f360i、r89a f360l、r89a f360t、v165c f360i、v165c f360m、v165c f360v、v165c f360l、v165s f360v、v165s f360l、v165s f360t、a167c f360i、a167l f360m、a167i f360l、a167l f360t、a167c f360m、a167c f360l、a167c f360v、v305m f360i、v305l f360m、v305m f360m、v305m f360v、v305m f360l、v305l f360l、v305m f360t、l327t f360i、l327t f360m、l327t f360v、l327t f360l、l327t f360t、i408w f360i、i408r f360m、i408w f360v、i408r f360l、i408w f360t、r89a v165c f360i、r89a v165s f360m、r89a v165c f360v、r89a a167i f360v、r89a a167c f360l、r89a a167l f360t、r89a v305m f360i、r89a v305m f360v、r89a v305m f360t、r89a l327t f360i、r89a l327t f360m、r89a l327t f360t、r89a i408r f360m、r89a i408w f360v、r89a i408r f360l、v165s a167i f360m、v165s a167c f360l、v165c a167l f360t、v165c v305m f360i、v165c v305m
f360v、v165s v305l f360l、v165c l327t f360i、v165c l327t f360v、v165s l327t f360t、v165c i408w f360v、v165c i408w f360t、a167i v305m f360l、a167c v305l f360v、a167l v305m f360t、a167c l327t f360i、a167l l327t f360m、a167i l327t f360v、a167c i408w f360i、a167i i408w f360v、a167l i408r f360l、v305m l327t f360i、v305l l327t f360v、v305m l327t f360t、v305m i408w f360i、v305m i408w f360v、v305l i408r f360l、l327t i408r f360m、l327t i408w f360v、r89a v165c a167c f360i、r89a v165s v305m f360m、r89a v165c l327t f360v、r89a v165s i408r f360l、r89a a167l v305l f360t、r89a a167l l327t f360i、r89a a167c i408r f360m、v165c a167i v305m f360v、v165s a167c l327t f360m、v165c a167c i408w f360t、a167i v305l l327t f360v、a167l v305m i408r f360m或v305l l327t i408w f360v，或
99.与所述氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
100.例如，多肽变体可以包括：
101.对seq id no:3具有修饰的氨基酸序列，其中修饰可包括在seq id no:3的氨基酸序列中的以下氨基酸突变：f360m、f360v、f360i、f360l、a167c、a167l、a167i、v305m、r89a、v165s、v165c、l327t、r89a f360m、a167l f360m、l327t f360m、r89a f360v、a167l f360i、v305m f360i、r89a v165c f360i、v165c a167l f360i、v165c a167l f360m、a167l v305m f360m、v165s a167l v305m f360i、r89a v165s v305m f360i、v165s a167c l327t f360m、r89a v165s a167c l327t f360m、or r89a v165c a167l v305m f360i，或
102.与所述氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
103.本文描述的包含具有序列同一性(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的多肽变体可以保持与具有作为鉴定序列同一性的标准品的氨基酸序列的多肽(例如具有上述的氨基酸突变的ppo蛋白)等效的酶活性，例如保持植物中(整株植物中、植物细胞或细胞培养物中或植物组织中等)、藻类中和/或体外具有作为标准品的氨基酸序列的多肽的5％或更高、10％或更高、20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高或95％或更高的酶活性，并且具有赋予除草剂耐受性的功能。使用序列同一性描述是为了阐明本文所述的除草剂耐受性ppo蛋白(多肽)或其变体可以包含在能够满足上述条件(保持酶活性并具有赋予除草剂耐受性的功能)范围内的任何序列突变。
104.本描述中使用的氨基酸概述如下：
[0105][0106][0107]
多肽变体(除草剂耐受性ppo蛋白变体)可以保持其作为ppo蛋白的酶活性，并且与野生型相比表现出增加的除草剂耐受性。
[0108]
另外，多肽(除草剂耐受性ppo蛋白)和多肽变体(除草剂耐受性ppo蛋白变体)可包含表现出与由seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3或具有上述氨基酸突变的氨基酸序列组成的多肽的生物学活性相等的其他突变。例如，另外的突变可以是不完全改变分子活性的氨基酸取代，并且这种氨基酸取代可以由相关领域的技术人员适当地选择。在一种实例中，另外的取代可以是氨基酸残基ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu或asp/gly之间的取代，但不限于此。在某些情况下，除草剂耐受性ppo蛋白变体可
以进行选自由磷酸化、硫酸化、酰基化、糖基化、甲基化、法尼基化等组成的组中的至少一种修饰。另外，除草剂耐受性ppo蛋白变体可以是蛋白质的对热、ph等具有增加的结构稳定性的变体，或者通过氨基酸变异(突变)和/或修饰而具有增加的蛋白质活性的变体。
[0109]
术语“序列同一性”是指与野生型或参考氨基酸序列或核苷酸序列的相似程度，并且任何蛋白质可以被包括在本发明的范围内，只要它包括与上述除草剂耐受性ppo蛋白变体的氨基酸序列具有60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、或99％或更高的同一性的氨基酸残基，并且保持与除草剂耐受性ppo蛋白变体等效的生物学活性。这样的蛋白质同源物可以包含与靶蛋白质的活性位点等效的活性位点。这种同一性比较可以在可视地或借助容易获得的比较程序进行。两个或更多个序列之间的同一性可以使用在线可用的分析程序计算为百分比(％)。用于序列比较的序列比对可以通过相关领域已知的任何常规方法进行，例如，常规方法可以包括但不限于gap、bestfit、blast和clustal omega。
[0110]
除草剂耐受性ppo蛋白或其变体可以通过使用相关领域中熟知的方法从自然界中提取和/或纯化而获得。可供选择地，除草剂耐受性ppo蛋白或其变体可以使用基因重组技术作为重组蛋白而获得。在使用基因重组技术的情况下，通过将编码除草剂耐受性ppo蛋白或其变体的核酸导入合适的表达载体，并将该表达载体导入宿主细胞以表达除草剂耐受性ppo蛋白或其变体，然后从该宿主细胞收集表达的除草剂耐受性ppo蛋白或其变体的过程，收获除草剂耐受性ppo蛋白或其变体。在选择的宿主细胞中表达蛋白质后，可以通过常规生化分离技术分离和/或纯化蛋白质，例如，用蛋白质沉淀剂处理(盐析)、离心、超声破碎、超滤、透析、色谱法(例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱法等)，并且为了分离高纯度的蛋白质，可以组合使用这些方法。
[0111]
可以使用标准的分子生物学技术，例如化学合成或重组方法，分离或制备除草剂耐受性ppo核酸分子(编码ppo蛋白或其变体的多核苷酸)，或者作为除草剂耐受性ppo核酸分子，可以使用市售的。
[0112]
在本公开中，在使用ppo缺陷型大肠杆菌bt3(δppo)的除草剂耐受性测试系统中，发现ppo蛋白/核酸或其变体对根据化学结构分类的代表性的10个ppo抑制性除草剂家族表现出广泛的除草剂耐受性。还发现通过使用转运肽(tp)，蛋白质可以在植物的叶绿体中表达。进一步地，发现ppo蛋白/核酸或其变体还可以通过植物表达载体在单子叶植物(例如水稻(oryza sativa))或双子叶植物(例如拟南芥(arabidopsis thaliana)生态型哥伦比亚(columbia)-0(拟南芥))中表达。即使在用ppo抑制性除草剂处理转化的植物时，也观察到了植物的发芽和生长。此外，通过遗传研究证实，上述除草剂耐受性性状可以成功地遗传给下一代。
[0113]
因此，可以将本文提供的ppo蛋白及其变体导入植物或藻类中，从而赋予植物或藻类除草剂耐受性，和/或增强植物或藻类的除草剂耐受性。
[0114]
一种实施方式提供了用于赋予和/或增强植物和/或藻类的除草剂耐受性的组合物，该组合物包含选自由以下组成的组中的至少一种：
[0115]
(1)选自由seq id no:1的多肽、seq id no:2的多肽、seq id no:3的多肽、如上所述的其多肽变体和包含与所述多肽或所述多肽变体具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列的多肽组成的组中的至少一种；
[0116]
(2)编码(1)的多肽或多肽变体的多核苷酸；
[0117]
(3)包含(2)的多核苷酸的重组载体；和
[0118]
(4)包含(3)的重组载体的重组细胞。
[0119]
本文的除草剂是指杀死、控制或以其他方式不利地改变植物或藻类的生长的活性成分。另外，除草剂耐受性是即使处理通常杀死正常或野生型植物或通常抑制其生长的除草剂后，与正常或野生型植物相比，对植物生长的抑制作用也被减弱或消除，因此植物继续生长。除草剂包括抑制植物或藻类的原卟啉原ix氧化酶(ppo)的除草剂。根据ppo抑制性除草剂的化学结构，可以将这样的ppo抑制性除草剂分类为嘧啶二酮、二苯醚、苯基吡唑、n-苯基邻苯二甲酰亚胺、苯酯、噻二唑、噁二唑、三嗪酮、三唑啉酮、噁唑烷二酮和其他除草剂。
[0120]
作为具体的实施方式，嘧啶二酮类除草剂可包括氟丙嘧草酯、苯嘧磺草胺、双苯嘧草酮和汰芬那，但不限于此。
[0121]
二苯醚类除草剂可包括氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、苯草醚、氟锁草醚、治草醚、氟乳醚、乳氟禾草灵、甲氧除草醚、草枯醚、乙羧氟草醚和氟硝磺酰胺，但不限于此。
[0122]
苯基吡唑类除草剂可包括吡草醚和异丙吡草酯，但不限于此。
[0123]
苯基邻苯二甲酰亚胺类除草剂可包括丙炔氟草胺、吲哚酮草酯和氟烯草酸，但不限于此。
[0124]
苯酯除草剂可包括吡落草(2,4-二氯苯基1-吡咯烷羧酸酯)和吡落草的氨基甲酸酯类似物(例如o-苯基吡咯啉氨基甲酸酯类似物和哌啶氨基甲酸酯类似物(参见“ujjana b.nandihalli,mary v.duke,stephen o.duke,o-苯基吡咯啉氨基甲酸酯和哌啶氨基甲酸酯除草剂的分子性质和生物活性之间的关系.,j.agric.food chem.,40(10)1993-2000,1992”))等，但不限于此。在一种具体的实施方式中，吡落草的氨基甲酸酯类似物可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：吡咯烷-1-羧酸苯酯(cas号55379-71-0)、1-吡咯烷羧酸、2-氯苯酯(cas号143121-06-6)、4-氯苯基吡咯烷-1-羧酸酯(cas号1759-02-0)、氨基甲酸、二乙基-、2,4-二氯-5-(2-丙炔氧基)苯基酯(9ci)(cas号143121-07-7)、1-吡咯烷羧酸、2,4-二氯-5-羟基苯基酯(cas号143121-08-8)、2,4-二氯-5-(甲氧基羰基)苯基吡咯烷-1-羧酸酯(cas号133636-94-9)、2,4-二氯-5-[(丙-2-基氧基)羰基]苯基吡咯烷-1-羧酸酯(cas号133636-96-1)、1-哌啶羧酸、2,4-二氯-5-(2-丙炔氧基)苯酯(cas号87374-78-5)、2,4-二氯-5-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基吡咯烷-1-羧酸酯(cas号87365-63-7)、2,4-二氯-5-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基4,4-二氟哌啶-1-羧酸酯(cas号138926-22-4)、1-吡咯烷羧酸、3,3-二氟-、2,4-二氯-5-(2-丙炔-1-基氧基)苯基酯(cas号143121-10-2)、4-氯-2-氟-5-[(丙-2-基氧基)羰基]苯基吡咯烷-1-羧酸酯(cas号133636-98-3)等。
[0125]
噻二唑类除草剂可包括嗪草酸和噻二唑草胺，但不限于此。
[0126]
噁二唑类除草剂可包括丙炔噁草酮和噁草酮，但不限于此。
[0127]
三嗪酮类除草剂可包括三氟草嗪(trifludimoxazin)，但不限于此。
[0128]
三唑啉酮类除草剂可包括唑草酮、甲磺草胺和唑啶草酮，但不限于此。
[0129]
噁唑烷二酮类除草剂可包括环戊噁草酮，但不限于此。
[0130]
其他除草剂可包括双唑草腈、氟哒嗪草酯和氟唑草胺，但不限于此。
[0131]
可以通过本领域已知的多种方法，优选通过使用用于植物或藻类转化的表达载体，将本文提供的除草剂耐受性ppo基因或其变体导入植物或藻类中。
[0132]
在将基因导入植物的情况下，可以包含在载体中的合适的启动子可以是本领域中通常用于将基因导入植物的任何启动子。例如，该启动子可以包括sp6启动子、t7启动子、t3启动子、pm启动子、玉米泛素启动子、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、胭脂碱合酶(nos)启动子、玄参花叶病毒35s启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑病毒启动子、来自核糖-1,5-双磷酸羧化酶小亚基的光诱导型启动子(ssrubisco)、水稻胞质三糖磷酸丙糖异构酶(tpi)启动子、拟南芥(a.thaliana)的腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)启动子、章鱼碱合酶启动子和bcb(蓝铜结合蛋白)启动子，但不限于此。
[0133]
进一步地，载体可以包括引起3'末端多聚腺苷酸化的聚a信号序列，并且例如，它可以包括源自根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因的nos 3'末端、源自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的章鱼碱合酶终止子、番茄或马铃薯的蛋白酶抑制剂i或ii基因的3'-末端、camv 35s启动终止子、水稻α淀粉酶ramy1 a终止子和菜豆素终止子，但不限于此。
[0134]
另外，在将基因导入藻类的情况下，可以使用叶绿体特异性启动子、核启动子、组成型启动子或诱导型启动子作为启动子将基因导入藻类。可以设计本文提供的除草剂耐受性ppo基因或其变体，以便可操作地连接至5'utr或3'utr，从而在藻类细胞核中表达功能。另外，载体可以进一步包含适合于藻类转化的转录调控序列。赋予除草剂耐受性的重组基因可以整合到宿主藻类中的细胞核基因组或叶绿体基因组中，但不限于此。
[0135]
另外，在载体中，可将靶向叶绿体所需的转运肽连接至ppo基因或其变体的5'-末端，以在叶绿体中表达除草剂耐受性ppo基因或其变体。
[0136]
另外，任选地，载体可以进一步包括编码选择标记作为报告分子的基因，并且选择标记的实例可以包括对抗生素(例如，新霉素、羧苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、氨苄青霉素等)或除草剂(草甘膦、草铵膦、草丁膦等)具有耐受性的基因，但不限于此。
[0137]
进一步地，用于植物表达的重组载体可以包括农杆菌(agrobacterium)二元载体、共整合载体或不具有t-dna区域但是被设计为在植物中表达的通用载体。其中，二元载体是指包含两个独立的载体系统的载体，该载体系统带有一种负责迁移的质粒，所述质粒由ti(肿瘤诱导型)质粒中的左边界(lb)和右边界(rb)组成，另一种质粒用于靶基因-转移，该载体可以包括用于在植物中表达的启动子区和多聚腺苷酸化信号序列。
[0138]
当使用二元载体或共整合载体时，用于将重组载体转化到植物中的菌株优选为农杆菌属(农杆菌属介导的转化)。对于该转化，可以使用根癌农杆菌或发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes)。另外，当使用不具有t-dna区域的载体时，可以使用电穿孔、粒子轰击、聚乙二醇介导的摄取等将重组质粒导入植物中。
[0139]
使用相关技术中已知的标准技术，可以通过愈伤组织诱导、发根和土壤驯化，将通过上述方法用基因转化的植物再分化为植物。
[0140]
本文中进行转化的植物不仅可以覆盖成熟植物，还可以覆盖可以长成成熟植物的植物细胞(包含悬浮培养的细胞)、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽等。
[0141]
此外，转化体的范围可以包括导入了基因的转化体及其克隆或后代(t1代、t2代、t3代、t4代、t5代、t6代、t7代、t8代或任何后续代)。例如，转化的植物还包括具有遗传的除草剂耐受性特征的植物，所述植物是用本文提供的基因转化的植物的有性和无性后代。本发明
的范围还包括所有变体和显示初始转化的植物的特征的变体，以及用本文提供的基因转化的植物的所有杂交和融合产物。此外，本发明的范围还包括源自通过本发明的方法预先转化的转化植物或其后代以及由转化的细胞的至少一部分组成的植物的一部分，例如种子、花、茎、果实、叶、根、块茎和/或块根。
[0142]
应用本发明的植物不受特别限制，但可以是选自由单子叶植物或双子叶植物组成的组中的至少一种。此外，所述植物可以是选自由草本植物和木本植物组成的组中的至少一种。单子叶植物可以包括属于以下科的植物：泽泻科(alismataceae)、水鳖科(hydrocharitaceae)、水麦冬科(juncaginaceae)、芝菜科(scheuchzeriaceae)、眼子菜科(potamogetonaceae)、茨藻科(najadaceae)、大叶藻科(zosteraceae)、百合科(liliaceae)、血皮草科(haemodoraceae)、龙舌兰科(agavaceae)、石蒜科(amaryllidaceae)、薯蓣科(dioscoreaceae)、雨久花科(pontederiaceae)、鸢尾科(iridaceae)、水玉簪科(burmanniaceae)、灯芯草科(juncaceae)、鸭跖草科(commelinaceae)、谷精草科(eriocaulaceae)、禾本科(gramineae/poaceae)、天南星科(araceae)、浮萍科(lemnaceae)、黑三棱科(sparganiaceae)、香蒲科(typhaceae)、莎草科(cyperaceae)、芭蕉科(musaceae)、姜科(zingiberaceae)、美人蕉科(cannaceae)、兰科(orchidaceae)等，但不限于此。
[0143]
双子叶植物可以包括属于以下科的植物：岩梅科(diapensiaceae)、山柳科(clethraceae)、鹿蹄草科(pyrolaceae)、杜鹃花科(ericaceae)、紫金牛科(myrsinaceae)、报春花科(primulaceae)、蓝雪科(plumbaginaceae)、柿树科(ebenaceae)、安息香科(styracaceae)、山矾科(symplocaceae)、山矾科(symplocaceae)、木犀科(oleaceae)、马钱科(loganiaceae)、龙胆科(gentianaceae)、睡菜科(menyanthaceae)、夹竹桃科(apocynaceae)、萝藦科(asclepiadaceae)、茜草科(rubiaceae)、花荵科(polemoniaceae)、旋花科(convolvulaceae)、紫草科(boraginaceae)、马鞭草(verbenaceae)、唇形科(labiatae)、茄科(solanaceae)、玄参科(scrophulariaceae)、紫葳科(bignoniaceae)、爵床科(acanthaceae)、胡麻科(pedaliaceae)、列当科(orobanchaceae)、苦苣苔科(gesneriaceae)、狸藻科(lentibulariaceae)、透骨草科(phrymaceae)、车前科(plantaginaceae)、忍冬科(caprifoliaceae)、五福花科(adoxaceae)、败酱科(valerianaceae)、川续断科(dipsacaceae)、桔梗科(campanulaceae)、菊科(compositae)、杨梅科(myricaceae)、胡桃科(juglandaceae)、杨柳科(salicaceae)、桦科(betulaceae)、壳斗科(fagaceae)、榆科(ulmaceae)、桑科(moraceae)、荨麻科(urticaceae)、檀香科(santalaceae)、桑寄生科(loranthaceae)、蓼科(polygonaceae)、商陆科(phytolaccaceae)、紫茉莉科(nyctaginaceae)、番杏科(aizoaceae)、马齿苋科(portulacaceae)、石竹科(caryophyllaceae)、藜亚科(chenopodiaceae)、苋科(amaranthaceae)、仙人掌科(cactaceae)、木兰科(magnoliaceae)、八角茴香科(illiciaceae)、樟科(lauraceae)、连香树科(cercidiphyllaceae)、毛茛科(ranunculaceae)、小檗科(berberidaceae)、木通科(lardizabalaceae)、防己科(menispermaceae)、睡莲科(nymphaeaceae)、金鱼藻科(ceratophyllaceae)、莼菜科(cabombaceae)、三白草科(saururaceae)、胡椒科(piperaceae)、金粟兰科(chloranthaceae)、马兜铃科(aristolochiaceae)、猕猴桃科(actinidiaceae)、山茶科
(theaceae)、藤黄科(guttiferae)、茅膏菜(droseraceae)、罂粟科(papaveraceae)、白花菜科(capparidaceae)、十字花科(cruciferae)、悬铃木科(platanaceae)、金缕梅科(hamamelidaceae)、景天科(crassulaceae)、虎耳草科(saxifragaceae)、杜仲科(eucommiaceae)、海桐花科(pittosporaceae)、蔷薇科(rosaceae)、豆科(leguminosae)、酢浆草科(oxalidaceae)、牻牛儿苗科(geraniaceae)、旱金莲科(tropaeolaceae)、蒺藜科(zygophyllaceae)、亚麻科(linaceae)、大戟科(euphorbiaceae)、水马齿科(callitrichaceae)、芸香科(rutaceae)、苦木科(simaroubaceae)、楝科(meliaceae)、远志科(polygalaceae)、漆树科(anacardiaceae)、槭树科(aceraceae)、无患子科(sapindaceae)、七叶树科(hippocastanaceae)、清风藤科(sabiaceae)、凤仙花科(balsaminaceae)、冬青科(aquifoliaceae)、卫矛科(celastraceae)、省沽油科(staphyleaceae)、黄杨科(buxaceae)、岩高兰科(empetraceae)、鼠李科(rhamnaceae)、葡萄科(vitaceae)、杜英科(elaeocarpaceae)、椴树(tiliaceae)、锦葵科(malvaceae)、梧桐科(sterculiaceae)、瑞香科(thymelaeaceae)、胡颓子科(elaeagnaceae)、大风子科(flacourtiaceae)、堇菜科(violaceae)、西番莲科(passifloraceae)、柽柳科(tamaricaceae)、沟繁缕科(elatinaceae)、秋海棠科(begoniaceae)、葫芦科(cucurbitaceae)、千屈菜科(lythraceae)、石榴科(punicaceae)、柳叶菜科(onaraceae)、小二仙草科(haloragaceae)、八角枫科(alangiaceae)、山茱萸科(cornaceae)、五加科(araliaceae)、伞形科(umbelliferae/apiaceae)等，但不限于此。
[0144]
在具体的实施方式中，植物可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：粮食作物，例如水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和高粱；蔬菜作物，例如大白菜、萝卜、红辣椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、卷心菜、薄皮甜瓜、南瓜、大葱、洋葱和胡萝卜；特殊用途作物，例如人参、烟草、棉花、马草(soilage)、牧草、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏属(perilla sp.)、花生、油菜、草和蓖麻油植物；果树，例如苹果树、梨树、枣树、桃树、猕猴桃果树、葡萄树、柑橘果树、柿子树、李子树、杏树和香蕉树；木本植物，例如松树、棕榈油和桉树；开花作物，例如玫瑰、唐菖蒲、非洲菊、康乃馨、菊花、百合和郁金香；饲料作物，例如黑麦草、红三叶草、果树草、苜蓿、高羊茅和多年生黑麦草，但不限于此。作为具体实施方式，植物可以是选自由以下组成的组中的一种或多种：双子叶植物，例如拟南芥、马铃薯、茄子、烟草、红辣椒、番茄、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗花、菠菜、甜菜、红薯、芹菜、胡萝卜、水芹、欧芹、大白菜、卷心菜、萝卜、西瓜、薄皮甜瓜、黄瓜、南瓜、葫芦、草莓、大豆、绿豆、芸豆和豌豆；以及单子叶植物，例如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等，但不限于此。
[0145]
施用本发明的藻类不受特别限制，但可以是至少一种原核藻类和/或真核藻类。例如，藻类可以是选自由蓝藻细菌、绿藻、红藻、棕藻、大型藻、微藻等组成的组中的至少一种。
[0146]
蓝藻细菌包括：色球藻目(chroococcales)(例如，隐球藻属(aphanocapsa)、隐杆藻属(aphanothece)、管孢藻属(chamaesiphon)、骨囊藻属(chondrocystis)、色球藻属(chroococcus)、色粘囊藻属(chroogloeocystis)、鳄球藻属(crocosphaera)、藻青菌属(cyanobacterium)、蓝菌属(cyanobium)、蓝网藻属(cyanodictyon)、蓝八联藻属(cyanosarcina)、蓝杆藻属(cyanothece)、蓝纤维藻属(dactylococcopsis)、粘球藻属(gloeocapsa)、粘杆藻属(gloeothece)、盐杆藻属(halothece)、拟丝藻属属(johannesbaptistia)、平裂藻属(merismopedia)、微囊藻属(microcystis)、放射囊藻属
(radiocystis)、棒条藻属(rhabdoderma)、小雪藻属(snowella)、聚球藻属(synechococcus)、集胞藻属(synechocystis)、嗜热聚球藻属(thermosynechococcus)、乌龙藻属(woronichinia))，粘菌藻目(gloeobacteria)，念珠藻目(nostocales)(例如，微毛藻科(microchaetaceae)、念珠藻科(nostocaceae)、胶须藻科(rivulariaceae)、伪枝藻科(scytonemataceae))，颤藻目(oscillatoriales)(例如，节藻属(arthronema)、节旋藻属(arthrospira)、布棱藻属(blennothrix)、发毛针藻属(crinalium)、盖丝藻属(geitlerinema)、盐微藻(halomicronema)、盐螺旋藻属(halospirulina)、水鞘藻属(hydrocoleum)、贾丝藻属(jaaginema)、假膜藻(katagnymene)、柯孟藻(komvophoron)、细鞘丝藻属(leptolyngbya)、湖丝藻属(limnothrix)、鞘丝藻属(lyngbya)、微鞘藻属(microcoleus)、颤藻属(oscillatoria)、席藻属(phormidium)、拟浮丝藻属(planktothricoides)、浮丝藻属(planktothrix)、织线藻属(plectonema)、假鱼腥藻属(pseudanabaena)、假席藻属(pseudophormidium)、裂须藻属(schizothrix)、螺旋藻属(spirulina)、斯特藻属(starria)、束藻属(symploca)、束毛藻属(trichodesmium)、常丝藻属(tychonema))，宽球藻目(pleurocapsales)(例如，拟色球藻属(chroococcidiopsis)、皮果藻属(dermocarpa)、小皮果藻属(dermocarpella)、粘囊藻属(myxosarcina)、厚皮藻属(pleurocapsa)、索伦藻属(solentia)、立毛藻属(stanieria)、异球藻属(xenococcus))，原绿藻目(prochlorales)或真枝藻目(stigonematales)(例如，蒴链藻属(capsosira)、拟绿粘藻属(chlorogloeopsis)、侧生藻属(fischerella)、软管藻属(hapalosiphon)、拟鞭枝藻属(mastigocladopsis)、鞭枝藻属(mastigocladus)、拟念珠藻属(nostochopsis)、真枝藻属(stigonema)、聚线藻属(symphyonema)、拟聚线藻属(symphonemopsis)、梅崎藻属(umezakia)、拟惠氏藻属(westiellopsis))等。
[0147]
作为藻类的另一个实例，可以例示绿藻门(chlorophyta)、衣藻属(chlamydomonas)、团藻目(volvacales)、杜氏藻属(dunaliella)、栅藻属(scenedesmus)、小球藻属(chlorella)或红球藻属(hematococcm)。
[0148]
作为藻类的其他实例，可以例示三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)、透明茧形藻(amphiprora hyaline)、双眉藻属(amphora spp.)、牟氏角毛藻(chaetoceros muelleri)、腐生舟形藻(navicula saprophila)、普通菱形藻(nitzschia communis)、二形栅藻(scenedesmus dimorphus)、斜生栅藻(scenedesmus obliquus)、瑞典四爿藻(tetraselmis suecica)、莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)、普通小球藻(chlorella vulgaris)、雨生红球藻(haematococcus pluvialis)、富油新绿藻(neochloris oleoabundans)、细长聚球藻(synechococcus elongatus)、布朗葡萄藻(botryococcus braunii)、紫色粘菌藻(gloeobacter violaceus)、集胞藻属(synechocystis)、细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)、眼点微拟球藻(nannochloropsis oculata)、盐微拟球藻(nannochloropsis salina)、海洋富油微拟球藻(nannochloropsis gaditana)、球等鞭金藻(isochrysis galbana)、苏德台葡萄藻(botryococcus sudeticus)、纤细眼虫藻(euglena gracilis)、富油新绿藻(neochloris oleoabundans)、谷皮菱形藻(nitzschia palea)、卡特颗石藻(pleurochrysis carterae)、朱氏四爿藻(tetraselmis chuii)、巴夫藻属(pavlova spp.)、隐球藻属(aphanocapsa spp.)、集胞藻属(synechosystis spp.)、微绿藻属(nannochloris spp.)等。然而，不仅限
于以上列出的种类，可以包括属于其他不同的属和科的藻类。
[0149]
在一种实施方式中，具有本文提供的除草剂耐受性ppo或其变体的植物或藻类可表现出对两种或更多种ppo抑制性除草剂的耐受性。
[0150]
因此，通过依次或同时使用至少两种ppo抑制性除草剂，本公开提供的技术可用于控制杂草或去除不希望的水生生物。
[0151]
一种实施方式提供了一种控制农田中的杂草的方法，包括：
[0152]
向农田提供植物，所述植物包含如上所述的除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因，以及
[0153]
向农田和/或植物施用有效剂量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂。
[0154]
另一种实施方式提供了一种从培养介质中去除不希望的水生生物的方法，包括：
[0155]
向培养介质提供藻类，所述藻类包含如上所述的除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因，以及
[0156]
向培养介质施用有效剂量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂。
[0157]
另外，本文提供的除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因可以与第二除草剂耐受性多肽或其编码基因组合使用。
[0158]
因此，导入本文提供的除草剂耐受性ppo的植物或藻类可以表现出对作用机理上彼此不同的两种或更多种除草剂的耐受性。在本发明中，可以依次或同时使用作用机理上彼此不同的两种或更多种不同的除草剂(包括ppo抑制性除草剂)，从而控制杂草和/或除去不希望的水生生物。在下文中，作用机理上与ppo抑制性除草剂不同的除草剂被称为“第二除草剂”。
[0159]
一种实施方式提供了用于赋予或增强植物或藻类的除草剂耐受性的组合物，其包含上述除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因；和第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。
[0160]
另一种实施方式提供了具有除草剂耐受性的植物或藻类的转化体或其克隆或后代，所述转化体或其克隆或后代包含上述的除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因；和第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。
[0161]
另一种实施方式提供了制备具有除草剂耐受性的植物或藻类的方法，所述方法包括将以下导入藻类，或植物的细胞、原生质体、愈伤组织、下胚轴、种子、子叶、芽或整株植物的步骤：上述除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因，和第二除草剂耐受性多肽或其编码基因。
[0162]
另一种实施方式提供了一种控制农田中的杂草的方法，包括
[0163]
向农田提供植物，所述植物包含上述除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因，以及第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，和
[0164]
向农田同时或以任何顺序依次施用有效剂量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除草剂和第二除草剂。
[0165]
另一种实施方式提供了从培养介质中去除不希望的水生生物的方法，包括
[0166]
向培养介质提供藻类，所述藻类包含除草剂耐受性ppo蛋白、其变体或其编码基因以及第二除草剂耐性多肽或其编码基因，以及
[0167]
向培养介质同时或以任何顺序依次施用有效剂量的原卟啉原ix氧化酶抑制性除
草剂和第二除草剂。
[0168]
例如，植物或藻类可以进一步包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，从而对第二除草剂具有获得的和/或增强的耐受性。
[0169]
例如，植物或藻类进一步包含第二除草剂耐受性多肽或其编码基因，从而对第二除草剂具有新的和/或增强的耐受性。
[0170]
例如，第二除草剂可包括细胞分裂抑制性除草剂、光合作用抑制性除草剂、氨基酸合成抑制性除草剂、质体抑制性除草剂、细胞膜抑制性除草剂和/或其任何组合，但不限于此。第二除草剂可以例示为草甘膦、草铵膦、麦草畏、2,4-d(2,4-二氯苯氧基乙酸)、als(乙酰乳酸合酶)抑制性除草剂(例如，咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺苯胺、嘧啶硫代苯甲酸等)、光系统ii抑制性除草剂、苯脲类除草剂、质体抑制性除草剂，溴苯腈类除草剂，和/或其任意组合，但不限于此。
[0171]
例如，第二除草剂耐受性多肽可以例示为选自由以下组成的组中的一种或多种：草甘膦除草剂耐受性epsps(草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)、gox(草甘膦氧化酶)、gat(草甘膦-n-乙酰转移酶)或草甘膦脱羧酶；草铵膦除草剂耐受性pat(草丁膦-n-乙酰转移酶)；麦草畏除草剂耐受性dmo(麦草畏单加氧酶)；2,4-d除草剂耐受性2,4-d单加氧酶或aad(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)；als抑制性磺酰脲类除草剂耐受性als(乙酰乳酸合酶)、ahas(乙酰羟酸合酶)或atahasl(拟南芥乙酰羟酸合酶大亚基)；光系统ii抑制性除草剂耐受性光系统ii蛋白d1；苯脲类除草剂耐受性细胞色素p450；质体抑制性除草剂耐受性hppd(羟基苯丙酮酸双加氧酶)；溴苯腈除草剂耐受性腈水解酶；及其任意组合，但不限于此。
[0172]
进一步地，第二除草剂耐受性多肽的编码基因可以例示为选自由以下组成的组中的一种或多种：草甘膦除草剂耐受性cp4 epsps、epsps(ag)、mepsps、2mepsps、goxv247、gat4601或gat4621基因；草铵膦除草剂耐受性bar、pat或pat(syn)基因；麦草畏除草剂耐受性dmo基因；2,4-d除草剂耐受性aad-1或aad-12基因；als抑制性磺酰脲类除草剂耐受性als、gm-hra、s4-hra、zm-hra、csr1、csr1-1、csr1-2、sura或surb；光系统ii抑制性除草剂耐受性psba基因；苯脲除草剂耐受性cyp76b1基因；异噁唑草酮除草剂耐受性hppdpf w336基因；溴苯腈除草剂耐受性bxn基因；及其任意组合，但不限于此。
[0173]
发明有益效果
[0174]
可将本文提供的除草剂耐受性ppo蛋白的变体或编码其的基因施用于植物或藻类，从而赋予植物或藻类优异的除草剂耐受性特征和/或增强植物或藻类的除草剂耐受性特征。另外，可以使用除草剂进行选择性控制，从而经济地控制杂草或去除水生生物。
附图说明
[0175]
图1是pmal-c2x载体的图谱。
[0176]
图2是pet303-ct-his载体的图谱。
[0177]
图3至图30显示了当用各种浓度的各种除草剂处理时，用cyppo19野生型基因(由cyppo19wt表示)或cyppo19变体基因转化的ppo缺陷型bt3大肠杆菌(δppo)的细胞生长水平。
[0178]
图31和图32显示了当用各种浓度的各种除草剂处理时，用cyppo18野生型基因(由
cyppo18wt表示)或cyppo18变体基因转化的ppo缺陷型bt3大肠杆菌(δppo)的细胞生长水平。
[0179]
图33示意性地显示了用于制备融合蛋白的重组载体，其中融合了麦芽糖结合蛋白(mbp)和ppo蛋白。
[0180]
图34和图35显示了与野生型拟南芥(col-0)相比，在向用cyppo19 wt或其变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)基因转化的转基因拟南芥(t2)喷洒1μm的汰芬那或1μm的丙炔氟草胺后第7天观察到的结果。
[0181]
图36和图37显示了与野生型拟南芥(col-0)相比，在向用cyppo19变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)基因转化的转基因拟南芥(t2)喷洒5μm的汰芬那或5μm的丙炔氟草胺后第7天观察到的结果。
[0182]
图38显示了与野生型拟南芥(col-0)相比，在向用cyppo18 wt基因转化的转基因拟南芥(t2)喷洒1μm的汰芬那后第7天观察到的结果。
[0183]
图39显示了与野生型拟南芥(col-0)相比，在向用cyppo18变体(l327t f360m)基因转化的转基因拟南芥(t2)喷洒1μm的汰芬那后第7天观察到的结果。
具体实施方式
[0184]
在下文中，将参考实施例详细描述本发明。但是，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明不受这些实施例的限制。
[0185]
实施例1.从原核物种中分离ppo基因
[0186]
ppo序列信息从包括细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)pkuac-scte542、蓝藻细菌(cyanobacteria bacterium)j003和火神嗜热聚球藻(thermosynechococcus vulcanus)nies-2134的物种的genebank数据库中获得。合成ppo基因(integrated dna technologies)。在表2的条件下使用表1所列引物扩增ppo基因，以将ppo基因克隆到pmal-c2x载体中(图1)。
[0187]
pcr混合物
[0188]
模板(cyppo19、cyppo20和cyppo18各自的合成dna)1μl
[0189]
10x缓冲液5μl
[0190]
dntp混合物(每种10mm)1μl
[0191]
正向引物(10μm，参考表1)1μl
[0192]
反向引物(10μm，参考表1)1μl
[0193]
ddw 40μl
[0194]
pfu-x(solgent，2.5单位/μl)1μl
[0195]
总计50μl
[0196]
每个ppo基因被命名为：cyppo19，分离自细长嗜热聚球藻pkuac-scte542；cyppo20，分离自蓝藻细菌j003；cyppo18，分离自火神嗜热聚球藻nies-2134。
[0197]
[表1]
[0198][0199]
[表2]pcr条件
[0200][0201]
实施例2.ppo变体的构建
[0202]
为了增强cyppo19、cyppo20和cyppo18的ppo抑制性除草剂耐受性，在与除草剂相互作用的位置引入突变，以制备cyppo19、cyppo20和cyppo18的变体。
[0203]
详细的实验过程如下：
[0204]
使用表3所列引物，在表4所示的条件下进行pcr以扩增ppo基因。
[0205]
pcr反应混合物:
[0206]
模板(cyppo19、cyppo20或cyppo18各自的合成dna)1μl
[0207]
10x缓冲液5μl
[0208]
dntp混合物(每种10mm)1μl
[0209]
正向引物(10μm)1μl
[0210]
反向引物(10μm)1μl
[0211]
ddw 40μl
[0212]
pfu-x(solgent，2.5单位/μl)1μl
[0213]
总计50μl
[0214]
[表3]用于将基因克隆到pet303-ct his载体的引物序列信息
[0215]
将上述扩增的pcr产物和pet303-ct his载体(invitrogen；图2)用xbai和xhoi限制酶消化，并使用t4 dna连接酶(rbc，3单位/μl)连接以构建pet303-cyppo19、pet303-cyppo20和pet303-cyppo18质粒。cyppo19、cyppo20和cyppo18的变体是使用克隆在pet303-cthis载体中的cyppo19、cyppo20和cyppo18基因，以及表5至7中列出的引物，在以下条件下构建的。
[0216]
pcr反应混合物
[0217]
模板1μl
[0218]
10x缓冲液5μl
[0219]
dntp混合物(各10mm)1μl
[0220]
正向引物(10μm)1μl
[0221]
反向引物(10μm)1μl
[0222]
ddw 40μl
[0223]
pfu-x(solgent,2.5单位/μl)1μl
[0224]
总共50μl
[0225]
[表4]pcr反应条件
[0226][0227]
[表5]用于cyppo19变体构建的引物列表
[0228][0229][0230]
[表6]用于cyppo20变体构建的引物列表
[0231][0232][0233]
[表7]用于cyppo18变体构建的引物列表
[0234][0235][0236]
实施例3.ppo变体的ppo抑制性除草剂耐受性的验证(在大肠杆菌中测试)
[0237]
为了增强cyppo19和cyppo18的ppo抑制性除草剂抗性，构建了上述实施例2的ppo变异基因。将它们转化至缺乏ppo活性的bt3(δppo)菌株，并在lb培养基中与ppo抑制性除草剂一起培养，从而检查转化的bt3的生长是否未被抑制。
[0238]
详细的实验程序如下：
[0239]
参考实施例2，通过热激法用构建的pet303-cyppo19(野生型)和pet303-cyppo18(野生型)质粒以及具有突变的质粒分别转化bt3感受态细胞，并在含有氨苄青霉素的lb琼脂培养基中进行培养。
[0240]
将用每种cyppo基因转化的单个菌落在3ml含有氨苄青霉素的lb肉汤(lpss)中培养超过12小时，然后在lb肉汤中继代培养直至吸光度(od
600
)达到0.5至1。然后，用lb肉汤稀释至od
600
＝0.5。再次，将稀释溶液连续稀释四倍至十分之一。
[0241]
制备了含有氨苄青霉素(100μg/ml)和0至2,000μm各种除草剂的lb琼脂培养基(lb 25g/l，细菌用琼脂12g/l)。除草剂溶液储备液均在dmso中制备。
[0242]
接着，将10μl大肠杆菌的每种稀释溶液滴在板上，并在37℃在黑暗下培养16至20小时。然后，观察以含有每种基因的大肠杆菌生长程度，评估ppo抑制性除草剂抗性。
[0243]
用于测试的除草剂列于表8。
[0244]
[表8]
[0245][0246]
除草剂抗性的程度通过变体与野生型的相对生长来评估，并列于表9和10以及图3至32。
[0247]
[表9]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251][0252]
[表10]
[0253][0254]
在表9和10中，显示变体的耐受水平等同于野生型的抗性水平表示为
“‑”
，每十倍增的耐受性以“ ”表示，直到“ ”为最大的耐受性。图3至图30以及图31和图32分别显示了cyppo19 wt及其变体以及cyppo18 wt及其变体的转化的大肠杆菌生长结果。除草剂的浓度写在耐受性测试照片上。从最左边点的od
600
＝0.5到最右边点的od
600
＝0.00005，显示点的10倍稀释系列。
[0255]
如表9至表10和图3至图32所示，用cyppo19或cyppo18的变体转化的所有bt3菌株显示出比野生型显著更高(至少10倍)的对各种ppo抑制性除草剂的耐受水平。
[0256]
实施例4：除草剂的ppo酶活性和ic
50
值的测量
[0257]
测量ppo蛋白的某些位置的氨基酸突变的变体的酶活性，并用ppo抑制性除草剂进行抑制测定。尽管ppo蛋白在水性条件下的溶解度明显较低，但是当麦芽糖结合蛋白(mbp)
与ppo蛋白融合时，ppo蛋白的溶解度大大提高。因此，野生型和变体的ppo蛋白表达为与mbp融合并用于实验(图33)。
[0258]
为了表达cyppo19和cyppo18的野生型和变体蛋白(参见实施例1和2)，将这些基因分别导入pmal-c2x载体(参见图1)并各自被转化到bl21codonplus(de3)大肠杆菌中。
[0259]
在以下条件下培养上述转化的大肠杆菌以表达ppo蛋白：
[0260]
诱导：od
600
＝0.2，加入0.3mm iptg(终浓度)；
[0261]
培养温度：23℃，伴随200rpm振摇；
[0262]
培养时间：16小时；
[0263]
培养体积：200ml/1,000ml烧瓶。
[0264]
裂解培养的转化大肠杆菌细胞并提取蛋白质如下：
[0265]
提取缓冲液：柱缓冲液(50mm tris-cl，ph 8.0，200mm nacl)5ml缓冲液/g细胞；
[0266]
超声：sonics&materials vcx130(130瓦)；
[0267]
在冰上超声15秒，停止10秒，持续5分钟；
[0268]
在4℃下离心20分钟(20,000
×
g)；
[0269]
离心后得到的上清液用柱缓冲液按1:6的比例稀释。
[0270]
在4℃冷室中进行以下纯化ppo蛋白的过程。将直链淀粉树脂(new england biolabs)装到1.5x15cm的色谱柱(bio-rad，econo色谱柱1.5x15cm，玻璃色谱柱，最大体积)中，将获得的蛋白质提取物以0.2ml/分钟的流速上样至色谱柱。用3倍柱体积的缓冲液洗涤柱，并检查洗涤溶液中蛋白质的存在。当不再检测到蛋白质时，终止洗涤程序。然后，用大约2倍柱体积的含20mm麦芽糖的缓冲液洗脱mbp-ppo蛋白。确定每种洗脱液的蛋白质浓度，并在不再检测到蛋白质时停止洗脱。研究了10μl每种级分的蛋白质定量和sds-page分析。使用ppo蛋白变体的高纯度级分进行酶测定。
[0271]
酶活性用上述野生型及cyppo19和cyppo18的变体的纯化蛋白测量如下：
[0272]
首先，在实验室化学合成原卟啉原ix。整个过程在氮气流下进行。将6微克原卟啉ix溶解在20ml的20％(v/v)etoh中，并在黑暗条件下搅拌30分钟。将获得的原卟啉ix溶液以1000μl的量放入15ml的螺旋管中，并用氮气冲洗5分钟。向其中添加1g钠汞齐，并剧烈摇动2分钟。打开盖子以排出管中的氢气。然后，盖上盖子并温育3分钟。使用注射器和纤维素膜滤器过滤原卟啉原ix溶液。向800μl获得的原卟啉原ix溶液中，添加约1600μl的2m mops[3-(n-吗啉代)丙磺酸]以将ph调节至7.5。为了确定ppo蛋白的酶活性，制备具有以下组成的反应混合物(基于10ml)：50mm tris-cl(ph 7.5)；50mm nacl；0.04％(v/v)吐温20；40mm葡萄糖(0.072g)；5单位葡萄糖氧化酶(16.6mg)；和10单位过氧化氢酶(1μl)。
[0273]
180μl的反应混合物放置在96孔板，并添加20μl上述纯化的ppo蛋白质(mbp-融合的ppo蛋白的纯化产物)。50μl矿物油分层后，通过添加底物原卟啉原ix溶液至终浓度为50μm来引发反应。反应在室温下进行30分钟，并使用酶标仪(sense，hidex)测量原卟啉ix的荧光(激发：405nm；发射：633nm)。为了计算ppo酶的活性，原卟啉原ix溶液保持在空气中开放超过12小时以氧化该溶液。向其中添加2.7n hcl，并测量在408nm处的吸光度。使用标准原卟啉ix来生成标准曲线，并使用原卟啉ix的标准曲线通过对原卟啉ix的校准来测量ppo活性。
[0274]
针对每种除草剂，测量了ppo抑制性除草剂使ppo酶活性抑制50％的浓度(ic
50
)。每
种除草剂的最终浓度如下：
[0275]-汰芬那、苯嘧磺草胺、氟磺胺草醚、丙炔氟草胺、甲磺草胺、乙氧氟草醚和唑草酮的浓度：0、10、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000nm
[0276]
通过将上述浓度的除草剂添加到反应混合物来计算ic
50
值，即将ppo酶活性抑制到50％的除草剂的浓度。
[0277]
每种除草剂的ic
50
值示于下表11和表12。
[0278]
[表11]cyppo19野生型和变体对各种除草剂的ic
50
值(nm)
[0279]
[0280][0281]
[表12]cyppo18野生型和变体对各种除草剂的ic
50
值(nm)
[0282][0283]
(在上表11和12中，ic
50
值
‘
5,000’或ic
50
值
‘
10,000’意味着等于或高于ic
50
值5,000或ic
50
值10,000，因为即使在5,000nm或10,000nm的每种除草剂浓度下，酶活性也未被抑制到50％)如表11和表12所示，证明了与野生型相比，cyppo蛋白的变体对每种除草剂显示出显著提高的ic
50
值。这样的结果表明除草剂耐受性通过ppo蛋白特定位置的氨基酸取代而增加。尽管数据显示cyppo蛋白变体与野生型相比具有降低的酶活性，但这可能是由蛋白之间的蛋白折叠和疏水性的差异引起的。植物来源的ppo蛋白位于叶绿体膜中并且是疏水的，但是与mbp融合的重组ppo蛋白是亲水的。因此，当ppo变体在植物叶绿体中正确组装和表达时，变体和野生型之间的酶活性不会有很大差异。
[0284]
实施例5.源自各种蓝藻细菌、藻类或细菌的ppo蛋白变体
[0285]
基于在上述实施例3和4中得到验证的cyppo19和cyppo18的对抗性增加的作用的突变位点，通过对cyppo19和cyppo18变体的除草剂抗性具有相似作用的源自各种蓝藻细菌、藻类或细菌的ppo蛋白的3d蛋白结构分析，对它们的突变位点进行了分析，如表13所示：
[0286]
[表13]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290][0291]
实施例6.使用cyppo及变体和ppo抑制性除草剂耐受性测试产生拟南芥转化体
[0292]
6-1.拟南芥转化载体的构建和拟南芥转化体的产生
[0293]
用具有选择标记的orf、bar基因(耐草铵膦的基因)以及cyppo19和cyppo18的每种变体基因的orf的二元载体转化拟南芥。检测转基因植物对草铵膦和ppo抑制性除草剂的交叉耐受性。bar基因还用于检测转基因在各代中是否稳定遗传。nos启动子和e9终止子用于bar基因表达。
[0294]
为了在植物中表达cyppo19、cyppo19变体、cyppo18和cyppo18变体的蛋白质，使用了camv35s启动子和nos终止子。将cyppo19、cyppo19变体、cyppo18和cyppo18变体的编码基因通过pcr并用表14中的引物对扩增，然后使用xhoi和bamhi限制酶导入二元载体。
[0295]
[表14]引物序列
[0296][0297]
此外，为了确认蛋白表达，使用bamhi和saci限制酶将血凝素(ha)标签融合到ppo蛋白编码基因的3’末端区域。nos终止子插入到ha标签的3’末端，以诱导ppo基因的转录终止。另外，为了使蛋白质转运至叶绿体，使用xbai和xhoi限制酶将atppo1基因(seq id no:302)的转运肽(tp)基因(seq id no:301)融合到ppo蛋白质编码基因的5’末端区域。通过冻融法将每种构建的载体转化到根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)gv3101感受态细
胞中。通过以下步骤制备农杆菌gv3101感受态细胞，将农杆菌gv3101菌株在5ml lb培养基中于30℃，200rpm下培养12小时。将细胞在200ml lb培养基中于30℃，200rpm下传代培养3至4小时，并以3,000x g在4℃下离心20分钟。用无菌蒸馏水洗涤细胞沉淀物，然后重悬于20ml lb培养基中。将用液氮速冻的200μl等分试样保存在深冷冰箱中。
[0298]
在含有壮观霉素的lb培养基中筛选每种转化的农杆菌。在lb肉汤中培养筛选的菌落。从培养基中收获农杆菌细胞后，将其以0.8的吸光度(od
600
)重悬于含有5％蔗糖(w/v)和0.05％silwet l-77(v/v)的溶液(momentive performance materials co.,ltd.)中。通过浸花法转化了拟南芥野生型(col-0)，并在1至2个月后收获了种子(t1)。
[0299]
用由二元载体中的bar基因表达赋予的草铵膦耐受性筛选转基因植物。将获得的t1种子播种在补充有50μm草铵膦的1/2ms培养基(2.25g/l ms盐，10g/l蔗糖，7g/l琼脂)中，播种7天后选择存活的植物。然后将它们移植到土壤中并生长以获得t1植物。
[0300]
为了检测转基因植物的ppo抑制性除草剂耐受性，在40x60厘米区域(0.24m2)中，用除草剂(100ml的1μm汰芬那和0.05％silwet l-77(v/v))均匀地喷洒3至4周龄的植物。野生型拟南芥(col-0)在以相同浓度的汰芬那处理后7天内完全死亡，而每种转基因植物显示对ppo抑制性除草剂处理的耐受性并存活。
[0301]
从耐受且存活的t1转基因植物中收获t2种子，并播种到补充有50μm草铵膦的1/2ms培养基(2.25g/l ms盐，10g/l蔗糖，7g/l琼脂)中。一周后，将存活的植物移植到土壤中。
[0302]
6-2.转化的拟南芥植物(t2)的除草剂耐受性的验证
[0303]
测试了用包括cyppo19、cyppo19变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)、cyppo18或cyppo18变体(l327t f360m)在内的基因转化的拟南芥植物(t2)对除草剂的耐受性。
[0304]
为了检查转基因植物的ppo抑制性除草剂耐受性，在40x60cm区域(0.24m2)中用除草剂(100ml的1μm汰芬那和0.05％silwet l-77(v/v))/(100ml的1μm丙炔氟草胺和0.05％silwet l-77(v/v))均匀喷洒cyppo19 wt及其变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)转基因植物。处理后7天评价除草剂耐受性。野生型拟南芥植物(col-0)用作对照。
[0305]
转基因拟南芥(t2)植物在1μm汰芬那或1μm丙炔氟草胺处理后的耐受性评估示于图34和35中。
[0306]
为了检查转基因植物的ppo抑制性除草剂的耐受性，在40x60cm区域(0.24m2)，用除草剂(100ml的5μm汰芬那和0.05％silwet l-77(v/v))/(100ml的5μm丙炔氟草胺和0.05％silwet l-77(v/v))均匀喷洒cyppo19 wt及其变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)转基因植物。处理后7天评价除草剂耐受性。野生型拟南芥植物(col-0)用作对照。
[0307]
转基因拟南芥(t2)植物在5μm汰芬那或5μm丙炔氟草胺处理后的耐受性评估示于在图36和37中。
[0308]
为了检查转基因植物的ppo抑制性除草剂耐受性，在40x60cm区域(0.24m2)用除草剂(100ml的1μm汰芬那和0.05％silwet l-77(v/v))均匀喷洒cyppo18野生型的转基因植物。处理后7天评价除草剂耐受性。野生型拟南芥植物(col-0)用作对照。
[0309]
转基因拟南芥(t2)植物在1μm汰芬那处理后的耐受性评估示于在图38中。
[0310]
为了检查转基因植物的ppo抑制性除草剂耐受性，在40x60cm区域(0.24m2)用除草剂(100ml的1μm汰芬那和0.05％silwet l-77(v/v))均匀喷洒cyppo18变体(l327t f360m)的转基因植物。处理后7天评价除草剂耐受性。野生型拟南芥植物(col-0)用作对照。
[0311]
转基因拟南芥(t2)植物在1μm汰芬那处理后的耐受性评估示于图39中。
[0312]
基于图34至图39所示的结果，用表15中定义的损伤指数评估转基因植物的除草剂耐受性。
[0313]
[表15]损伤指数定义
[0314][0315]
根据损伤指数定义评估转基因植物的耐受水平，并示于表16至19中。
[0316]
[表16]
[0317]
cyppo19 wt及其变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)的转基因植物在1μm汰芬那或1μm丙炔氟草胺处理后的损伤指数
[0318][0319]
[表17]
[0320]
cyppo19 wt及其变体(f360m、f360v、f360l、v165c f360m、v165s f360v)的转基因植物在5μm汰芬那或5μm丙炔氟草胺处理后的损伤指数
[0321][0322]
[表18]
[0323]
cyppo18 wt转基因植物在1μm汰芬那处理后的损伤指数
[0324][0325]
[表19]
[0326]
cyppo18 wt变体(l327t f360m)的转基因植物在1μm汰芬那处理后的损伤指数
[0327][0328]
如以上结果所证明的，与非转基因植物相比，用cyppo19 wt或cyppo18 wt转化的转基因植物表现出增加的除草剂耐受性。此外，与非转基因植物相比，用cyppo19变体或cyppo18变体转化的转基因植物表现出显著增加的除草剂耐受性。